PREDICCIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA
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PREDICCIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA HIPOTÉTICA PA2481 DE Pseudomonas Aeruginosa PAO1 DAVID ALBERTO DÍAZ DE LOS RIOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA BOGOTÁ D. C. 2013 PREDICCIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA HIPOTÉTICA PA2481 DE Pseudomonas Aeruginosa PAO1 DAVID ALBERTO DÍAZ DE LOS RIOS __________________________ _____________________________ INGRID SCHULER PHD ANDREA FORERO RUÍZ DECANA ACADEMICA DIRECTORA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA PREDICCIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA PROTEÍNA HIPOTÉTICA PA2481 DE Pseudomonas Aeruginosa PAO1 DAVID ALBERTO DÍAZ DE LOS RIOS _____________________________ JANNETH GONZÁLEZ DIRECTORA TRABAJO DE GRADO __________________________ GEORGE BARRETO JURADO TRABAJO DE GRADO NOTA DE ADVERTENCIA "La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946. Resumen El género Pseudomonas sp., es un grupo muy diverso de bacilos Gram negativos aerobios, ubicuos y que causa más infecciones oportunistas en seres humanos, como otitis externa, foliculitis de tina y fibrosis quística, entre otras. Específicamente, la Pseudomonas aeruginosa PAO1, es un microorganismo con gran capacidad infecciosa en diferentes organismos y resistencia a sustancias antibióticas y desinfectantes. Puesto que los antígenos son los encargados de producir esta resistencia, y la mayoría de estos son proteínas, el objetivo de este trabajo fue predecir computacionalmente la estructura tridimensional y función de la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa, determinando su relación en la resistencia antibiótica de esta bacteria. Para esto, primero se realizó el análisis computacional de la estructura primaria, utilizando los servidores PROSITE, PFAM, BLAST, PROTPARAM, GLOBPLOT, y PROTSCALE; luego, se obtuvo la estructura secundaria por el consenso de los algoritmos SOPM, PREDATOR, DPM, DSC, y GOR4; y por último la estructura tridimensional de la proteína se obtuvo mediante el servidor I-TASSER y se evaluó su conformación estereoquímica con la herramienta STRUCTURE ASSESSMENT. El modelo final fue visualizado con el programa PyMOL. En el presente trabajo se presenta la estructura tridimensional de PA2481 y se identifican dos dominios correspondientes al citocromo c, encontrándose 2 regiones desordenadas en el domino más significativo. Se determina que la proteína presenta características propias de los citocromo c oxidasa, cbb3, subunidad III, y que su función posiblemente está relacionada con la cadena trasportadora de electrones y el bombeo de protones para la generación de ATP en Pseudomonas aeruginosa. La predicción estructural y funcional de PA2481 permite entender mejor el papel de esta proteína en la fisiología de esta bacteria. Palabras clave: Fibrosis quística, modelamiento estructural, otitis externa, Pseudomonas aeruginosa, Proteína hipotética. Introducción Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa que se caracteriza por su versatilidad ambiental, creciendo en suelos, pantanos y hábitats marinos costeros, incluso en tejidos vegetales y animales (Hardalo & Edberg 1997). Como consecuencia de su resistencia a los antibióticos y a los desinfectantes Pseudomonas .aeruginosa es una bacteria que se caracteriza por ser uno de los principales patógenos oportunistas en humanos, provocando serias complicaciones causadas por infecciones en pacientes particularmente susceptibles como personas con deficiencias del sistema inmunológico, víctimas de quemaduras de la piel, pacientes cateterizados los cuales sufren infecciones del tracto urinario y en pacientes con respiradores provocando neumonía nosocomial. También es la causa predominante de la morbilidad y la mortalidad en pacientes con fibrosis quística colonizando los pulmones (Stover et al. 2000). El campo de la genómica estructural consiste en determinar la estructura tridimensional de todas las proteínas de un determinado organismo por métodos experimentales como cristalografía de rayos x, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, o por medio de enfoques computacionales tales como modelamiento por homología. Esto plantea nuevos desafíos en bioinformática estructural, enfocados en determinar la función de las proteínas a partir de su estructura 3D. En la actualidad existe gran cantidad de proyectos de secuenciación de genomas, los cuales están produciendo secuencias lineales de aminoácidos que son almacenadas en bases de datos, sin embargo, para un entendimiento de la función biológica, se requiere del conocimiento de la estructura y la función (Baker & Sali 2001). El objetivo final de la genómica estructural es contribuir a los principios de organización de la estructura de las proteínas para la biología y la medicina a través de la anotación funcional (Skolnick et al. 2000), y a través de las aplicaciones de las estructuras de las proteínas tales como la detección virtual de drogas (Makino et al. 1999). Por su parte las herramientas bioinformáticas desempeña un papel crucial en la evaluación y clasificación de los nuevos datos estructurales obtenidos, y esta a su vez, se beneficia directamente del flujo de datos generados por los proyectos de genómica estructural, lo que resulta en la mejora de los algoritmos, softwares y bancos de datos (Terwilliger et al. 1998). Por otro parte, la genómica funcional hace el uso de la enorme riqueza de datos producida por los proyectos de secuenciación de genomas, para describir funciones e interacciones de genes y proteínas, su objetivo es descubrir la función biológica de genes particulares y cómo grupos de genes y sus productos trabajan juntos en la salud y enfermedad (Hieter & Boguski 1997). Durante las últimas décadas se han secuenciado muchos genomas completos de diversas bacterias, arqueas y eucariotas, dentro de los cuales Stover et al.(2000) describieron la secuencia completa del genoma de P. aeruginosa cepa PAO1, el cual se destacó por su diversa capacidad metabólica y gran tamaño con 6.3 millones de pares de bases, siendo el mayor genoma bacterial secuenciado, sin embargo, cerca del 30 al 40% de los genes no tienen asignada una función. Además, en los estudios de anotación de genes, una gran fracción de marcos de lectura abierta están etiquetados como proteínas hipotéticas conservadas y muchas de estas proteínas hipotéticas se encuentran en más de una especie bacteriana (Dunham 2000). Para la asignación de funciones a nuevas proteínas, la homología basada en anotaciones de genes ha sido el estándar durante las últimas décadas, pues infiere características moleculares mediante la trasferencia de información de proteínas caracterizadas experimentalmente (Roberts 2004). El conocimiento de la secuencia completa del genoma incluyendo las proteínas hipotéticas y los procesos de codificación, proporcionan una gran cantidad de información para el descubrimiento y explotación de nuevos blancos de antibióticos, y la esperanza para el desarrollo de estrategias más efectivas para el tratamiento de las infecciones oportunistas potencialmente mortales causadas por P. aeruginosa en los seres humanos (Stover et al. 2000). Por lo tanto en este estudio se realiza la predicción de la estructura tridimensional, y se realiza una aproximación funcional de la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa PAO1 a través de diferentes herramientas bioinformáticas y softwares, para determinar si está implicada en la resistencia antibiótica de este microorganismo, con el fin de entender mejor la fisiología de esta bacteria. Justificación y Planteamiento del problema La gran resistencia a los antibióticos por parte de la bacteria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa, hace que las enfermedades provocadas por este microorganismo como la fibrosis quística, foliculitis de tina, otitis externa, etc., en diferentes organismos incluyendo la especie humana, sean difíciles de tratar. Dentro de los mecanismos de resistencia de Pseudomonas aeruginosa se encuentran las bombas de expulsión, los cuales son complejos enzimáticos de membrana que expulsan de la célula detergentes y sustancias anfipáticas, que son perjudiciales para la sobrevivencia de la bacteria (Gómez et al. 2005). Estos complejos se componen de una proteína bomba en la membrana, una proteína ligadora y un canal de salida (Gómez et al. 2005). De acuerdo a esto es importante determinar cuáles proteínas están implicadas en estos mecanismos de resistencia, determinando su estructura y función, para poder desarrollar estrategias efectivas contra esta bacteria. Por otro lado, los avances en las técnicas de secuenciación de proteínas en los últimos años hace que se almacenen gran cantidad de secuencias en bases de datos, pertenecientes a genomas completos de diversas bacterias, arqueas y eucariotas, dentro de los cuales se encuentra la secuencia completa del genoma de P. aeruginosa cepa PAO1. Sin embargo, cerca del 30 al 40% de los genes no tienen asignada una función. Además, en su secuencia génica se encuentran gran cantidad de proteínas hipotéticas conservadas y muchas de estas se encuentran en más de una especie bacteriana (Dunham, 2000). El conocimiento de las estructuras tridimensionales de las proteínas hipotéticas y su función, tanto los procesos de codificación, proporcionan una gran cantidad de información para el descubrimiento y explotación de nuevos blancos de antibióticos, y la esperanza para el desarrollo de estrategias más efectivas para el tratamiento de las infecciones oportunistas potencialmente mortales causadas por P. aeruginosa en los seres humanos (Stover et al. 2000). Partiendo de la secuencia de residuos de aminoácidos de la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa PAO1, en el presente trabajo se realizará una predicción de su estructura secundaria y terciaria y, con el resultado obtenido, se buscará una aproximación funcional para determinar si está implicada en la resistencia antibiótica de este microorganismo. Marco teórico Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa que se caracteriza por su versatilidad ambiental, y su habilidad para causar enfermedades en individuos particularmente susceptibles, desarrollando resistencia a los antibióticos. La complicación más seria causada por este microorganismo es la fibrosis quística, una infección del tracto respiratorio. Los pacientes con cáncer, al igual que algunas otras personas con deficiencias del sistema inmunológico, sufren graves infecciones por este microorganismo (Winsor et al. 2011). P. aeruginosa tiene la capacidad para adaptarse y prosperar en muchos nichos ecológicos, desde el agua y el suelo hasta los tejidos vegetales y animales, esto gracias a su capacidad de utilizar una amplia gama de compuestos orgánicos como fuentes de alimento. En su secuencia génica se encuentran genes implicados en la locomoción, apego, transporte y utilización de nutrientes, flujo de salida de los antibióticos, y los sistemas de detección involucrados en la respuesta al estrés y cambio ambiental (Winsor et al. 2011). Pseudomonas aeruginosa PAO1 es la cepa más comúnmente utilizada en la investigación de este microorganismo como patógeno. La cepa PAO1, es un derivado de la cepa original aislada PAO, que se ha distribuido en todo el mundo para laboratorios y colecciones de cepas. En las últimas décadas han surgido fenotipos discordantes de PAO1 sublíneas. Estas difieren en su capacidad para hacer frente a la limitación de nutrientes y su virulencia, por ejemplo, en un modelo murino de infección aguda de vías respiratorias (Klockgether et al. 2010). Los mecanismos de resistencia antibiótica que presentan las bacterias Gram negativas como Pseudomonas aeruginosa, es consecuencia de una combinación de mecanismos inherentes a la especie y otros adquiridos (Gómez 2005). En términos generales, los principales mecanismos de resistencia antibiótica en Pseudomonas aeruginosa son: 1) modificación y desactivación del antibiótico por hidrólisis mediada por enzimas; 2) disminución de la permeabilidad del antibiótico a través de la membrana externa debido a la disminución en la expresión de porinas; 3) aumento de la expulsión del antibiótico mediada por la activación de las bombas de flujo, y 4) modificación o mutación del sitio blanco del antibiótico (Suarez et al. 2006). Por otro lado una de las tareas más difíciles en la era post genómica es la predicción de las funciones de los productos de los genes putativos codificados en los genomas. En general, aproximadamente entre el 30 al 40% de las secuencias en los datos genómicos corresponden a proteínas hipotéticas cuya estructura 3d y función es desconocida. (Dunham 2000). Generalmente la caracterización experimental de estas proteínas es demasiado laborioso y toma bastante tiempo. Es por esto que tener por lo menos una idea inicial aproximada de la función de una proteína puede ayudar enormemente en el diseño de experimentos. El uso de herramientas bioinformáticas permite el diseño racional de los experimentos para identificar las funciones de estas proteínas. Los enfoques tradicionales de la bioinformática para la anotación de la función incluyen la búsqueda de las funciones basadas en homología (Roy et al. 2009). En este proceso se utilizan diferentes algoritmos tales como FASTA (Pearson 2000), BLAST (Altschul y Gish 1996), PSI-BLAST (Altschul et al. 1997), HMM (Soding 2005), MulPSSM (Gowri et al. 2006), los cuales son conocidos para identificar relaciones de secuencias distantes en el espacio. Cuando las proteínas presentan una alta similitud en su secuencia y estructura, frecuentemente también muestran una buena similaridad funcional (Roy et al. 2009). Estas relaciones funcionales entre proteínas ya han sido estudiadas (Chothia & Lesk 1986; Russell & Barton 1994; Wood & Pearson 1999; Wilson et al. 2000). Los umbrales de similitud de secuencias para la transferencia de anotaciones funcionales también han sido propuestas (Wilson et al. 2000; Todd et al. 2001; Tian & Skolnick. 2003). A parte de inferir la función a través de proteínas homologas con estructura y función conocida, se puede inferir la función por medio de la búsqueda de patrones o motivos, y utilizando procedimientos de coincidencias de patrones, sin embargo este método solo es aplicable cuando se conoce la estructura de las proteínas (Via & Helmer 2004). Las proteínas presentan dominios que se definen como unidades autónomas de plegado con independencia evolutiva y funcional (Doolittle 1995). La búsqueda de estos dominios en bases de datos es más efectiva en comparación con la secuencia completa (George y Heriga. 2002). Entre las bases de datos de dominios estructurales de las proteínas disponibles en la actualidad se encuentran SCOP (Clasificación Estructural de Proteínas) (Murzin et al.1995), CATH (Clase, Arquitectura, Topología y homología) (Orengo et al. 2003), FSSP (Familias de Proteínas Estructuralmente Similares) (Holm & Sander 1996) y PFAM (Protein Database Familias) (Bateman et al. 2002). En las bases de datos CATH y FSSP las proteínas se agrupan en función de los resultados de los algoritmos de comparación estructural y no reflejan ninguna similitud funcional o una relación evolutiva. Los resultados de PFAM están derivados de los alineamientos de secuencias de proteínas y de perfiles HMMs (Roy et al. 2009). Objetivo General Predecir la estructura tridimensional y la función de la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa PA01. Objetivos específicos 1. Predecir in silico la estructura secundaria y terciaria de la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa PA01. 2. Predecir la función de la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa PA01 con relación a su posible participación en los mecanismos de resistencia que presenta este microorganismo. Metodología Análisis computacional de la estructura primaria de PA2481 El análisis de la secuencia de PA2481 de 291 residuos de aminoácidos con función y estructura desconocida se realizó a través de diversas herramientas bioinformáticas y bases de datos disponibles en la red. La secuencia de la proteína hipotética PA2481 (Acc. No. AAG05869.1) fue obtenida a través del GenBank en el Centro Nacional de Información para la Biotecnología (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La búsqueda de similitud con otras secuencias reportadas se realizó por medio de BLAST disponible en NCBI. Debido a que las proteínas se componen generalmente de una o más regiones funcionales denominadas comúnmente como dominios, y la identificación de estos permiten inferir su posible función, la predicción de familias, motivos, dominios y sitios funcionales se realizó tomando como referencia las coincidencias encontradas en la base de datos PROSITE (Sigrist et al. 2010), del portal de recursos bioinformaticos EXPASY (Artimo et al. 2012) y la base de datos de familias proteicas PFAM (Finn et al. 2012) del Trust Sanger Institute de Inglaterra. Estas bases de datos representan las familias proteicas por alineamientos múltiples de la secuencia y modelos ocultos de Markov. Adicionalmente por medio de BLAST se realizó un alineamiento con proteínas de estructura conocida en PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), determinar posibles homólogos con estructura y función conocida. para Para la caracterización fisicoquímica de la proteína, se determinó el punto isoeléctrico, peso molecular, coeficiente de extinción (Gill & Von Hippel 1989), índice de inestabilidad (Guruprasad et al. 1990), índice alifático (Ikai 1980) y promedio general de la hidropatía (Kyte & Doolittle 1982), mediante la herramienta PROTPARAM (Gasteiger et al. 2005) del portal de recursos bioinformaticos EXPASY (http://EXPASY.org/tools), la cual realiza estos cálculos basándose en la composición de aminoácidos y en el residuo N-terminal. En cuanto al análisis de hidrofobicidad se utilizó la herramienta PROTSCALE y el algoritmo de Kyte y Doolittle del servidor EXPASY Proteomic tools, basándose en las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos que componen la proteína. La predicción de las regiones globulares y regiones desordenadas o no estructurales de la proteína fueron determinadas con GLOBPLOT (Imer & Cavas 2009). Predicción de la estructura secundaria Para predecir la estructura secundaria de la proteína hipotética PA2481 se utilizó el servidor NSP@ (Combet et al. 2000), en donde se usó el consenso de cinco algoritmos, dentro de los cuales se seleccionaron dos métodos fundamentados en el uso de parámetros de probabilidad determinados por las frecuencias relativas de las apariciones de cada aminoácido en cada tipo de estructura secundaria (SOPM y PREDATOR) y tres métodos basados en probabilidad de inferencia bayesiana (GOR4, DPM y DSC). Predicción de la estructura tridimensional Para la generación de la estructura tridimensional de la proteína hipotética PA2481 se utilizó el algoritmo I-TASSER (Roy et al. 2010). Los modelos 3d se construyen a partir de alineamientos múltiples con secuencias de proteínas con estructura y función conocida. La evaluación del modelo se realizó por medio de la herramienta “structure assessment” de SWISSMODEL (Arnold et al 2006), determinando la correcta conformación geométrica de la proteína por medio del análisis estereoquímico presentado en el gráfico de Ramachandran. El modelo final fue visualizado con PyMOL (Delano 2008) y se determinaron las regiones en donde hubo coincidencias con la estructura secundaria predicha. Resultados y Discusión Análisis computacional de la estructura primaria de PA2481 Al realizar el alineamiento local de secuencias con BLAST, se identificaron 6 proteínas con una secuencia de aminoácidos similar en un 99% y 98% a la secuencia de PA2481 (Tabla 1). Puesto que la identidad de cada proteína se basa en el orden especifico de cada uno de sus aminoácidos (Claverie & Notredame 2007), el porcentaje de identidad de la proteína PA2481 con cada una de las 6 proteínas identificadas, permite inferir que estas son probablemente homologas y casi idénticas en la conformación de su estructura tridimensional y por consiguiente en su función. Teniendo en cuenta que las proteínas son hipotéticas, no presentan una estructura ni función definida a pesar de presentar anotaciones en el NCBI con respecto a dominios conservados correspondientes al citocromo c, lo cual es un buen indicio para predecir su posible función biológica. TABLA 1. Resultados del alineamiento local con BLAST para la búsqueda de similitud con secuencias reportadas. Descripción Id secuencia Max identidad Proteína hipotética PACG_01397 [Pseudomonas aeruginosa ref|ZP_04928804.1| 99% ref|ZP_06878575.1| 99% ref|YP_790756.1| 99% ref|ZP_09052785.1| 98% C3719] Proteína hipotéticaPaerPAb_13161 [Pseudomonas aeruginosa PAb1] Proteína hipotéticaPA14_32540 [Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14] Proteína hipotéticaHMPREF1030_01871 [Pseudomonas sp. 2_1_26] Proteína hipotéticaG655_12625 [Pseudomonas aeruginosa ref|YP_007709370.1| 98% B136-33] Proteína hipotéticaPSPA7_2757 [Pseudomonas aeruginosa ref|YP_001348117.1| PA7] 98% En cuanto a la predicción de familias, motivos, dominios y sitios funcionales, los resultados arrojados por las bases de datos PROSITE y PFAM a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína PA2481 (Tabla 2), coinciden en que hay dos dominios correspondientes a la superfamilia del citocromo c, en donde el dominio de mayor puntaje se encuentra entre los residuos 165 y 250. Además se encontraron 2 sitios de unión covalente al grupo hemo en los residuos (178 y 181) y (70 y 73), y uno de unión al ligando que para esta proteína es el hierro en el residuo 182 y 74 respectivamente en cada domino, característica común en los citocromos de tipo c, los cuales presentan unión covalente al grupo hemo en uno o más motivos Cys-XX-Cys-H (Barker & Ferguson 1999). Además la incorporación de dichos grupos hemo es un requisito imprescindible para el ensamblaje de la oxidasa (Zufferey et al. 1996) En PFAM este dominio presento coincidencias significativas específicamente con el Citocromo c oxidasa, tipo cbb3, subunidad III, lo cual es corroborado al realizar el alineamiento de secuencias con BLAST utilizando únicamente proteínas de estructura conocida depositadas en el PDB, en donde la secuencia que obtuvo el mejor alineamiento con un score de 37.4, E value de 0.008 e identidad del 50%, fue precisamente la cadena c de la estructura del citocromo cbb3 oxidasa, secuencia identificada en el PDB con 3MK7_C. Estos resultados indican que la función de la proteína hipotética PA2481, podría estar relacionada con la cadena trasportadora de electrones y el bombeo de protones en Pseudomonas aeruginosa para la generación de ATP, ya que el citocromo cbb3 oxidasa cumple estas funciones en bacterias y mitocondrias (Buschmann et al. 2010). TABLA 2. Resultados encontrados a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína PA2481 con las herramientas PROSITE y PFAM. Programa Descripción Aminoácidos Puntaje PROSITE Dominio Citocromo c 165 a 250 9.309 PROSITE Sitio de unión covalente al grupo hemo 178 y 181 PROSITE Hierro (hemo 1 ligando axial) 182 PROSITE Dominio Citocromo c 44 a 141 PROSITE Sitio de unión covalente al grupo hemo 70 y 73 PROSITE Hierro (hemo 1 ligando axial) 74 PFAM Dominio de Citocromo c oxidasa, cbb3, 165 a 246 42.6 46 a 135 11 6.95 subunidad III PFAM Dominio Citocromo c En las proteínas pertenecientes a la familia de los Citocromos c, el grupo hemo se une covalentemente por enlaces tioeter a dos residuos de cisteína conservados localizados en el centro del Citocromo c. Los Citocromos c, cumplen un papel importante en la transferencia de electrones (Lee 2009); además, en los centros de los Citocromos c también se encuentran sitios activos de muchas enzimas que cumplen un papel importante en la apoptosis de células eucariotas (Martinou 2000). En las estructuras conocidas de los Citocromos de tipo c, hay cerca de 6 clases que varían en sus pliegues (Allen 2003). Las especies del género Pseudomonas fueron consideradas tradicionalmente como organismos no fermentadores con respiración aeróbica. Los elementos involucrados en la respiración, en estas especies comprenden un pool de 17 deshidrogenasas respiratorias responsables del pasaje de los electrones desde las coenzimas hacia las quinonas. P. aeruginosa posee cinco oxidasas terminales que catalizan la reducción del oxígeno en agua: Tres de ellas son Citocromo c oxidasas (Cbb3-1, Cbb3-2 y Aa3), mientras que las dos restantes: el Citocromo bo3 (Cyo) y la oxidasa insensible al cianuro (Cio), son quinol oxidasas. Las distintas oxidasas terminales poseen diferente afinidad por el oxígeno y capacidad para el bombeo de protones (Tribelli 2011), como podría ser el caso de la proteína PA2481. Las propiedades fisicoquímicas obtenidas mediante PROTPARAM (Tabla 3), permitieron determinar el peso molecular de PA2481 el cual coincide con el peso molecular de la cadena c del citocromo cbb3 oxidasa, subunidad III, reportado por Zufferey et al. (1996) el cual es de 31 kDa. El punto isoeléctrico es donde las cargas positivas y negativas se igualan anulando la existencia de movimiento en un campo eléctrico, representando el pH de la proteína PA2481, el cual podría presentar un mínimo de solubilidad en ensayos experimentales facilitando su aislamiento en un campo eléctrico (Werner 2007). En cuanto al tiempo de vida de PA2481, este hace referencia al tiempo (in vitro) que tarda una proteína en desaparecer una vez es sintetizada por la célula. De acuerdo al tiempo de vida de la proteína PA2481, se puede determinar que el residuo N terminal corresponde a metionina, serina o alanina, treonina, valina o lisina, pues estos aminoácidos son específicos para proteínas con tiempo de vida superiores a 20 horas, ya que se ha demostrado que el último aminoácido de la cadena determina la sobrevivencia de la proteína (Bachmair et al. 1986). Experimentalmente también se puede determinar el residuo N terminal para saber con exactitud cuál aminoácido de los anteriores mencionados es el N terminal (Jinling et al. 2011). TABLA 3. Propiedades fisicoquímicas de PA2481 encontradas mediante PROTPARAM Peso molecular (Da) 31249.4 Índice de estabilidad 41.06 Punto isoeléctrico 8.56 Tiempo de vida (horas) 30 Índice alifático 71.51 Promedio general de la hidropatía (GRAVY) 0.271 El índice alifático determina el volumen relativo ocupado por las cadenas laterales alifáticas, en donde las proteínas con un alto índice alifático como es el caso de la proteína PA2481, tienden a ser más termoestables. En cuanto al promedio general de la hidropatía para PA2481, este indica la capacidad de la proteína para establecer interacciones con el agua, sugiriendo que puede estar altamente hidratada en medios acuosos, ya que entre más bajo sea este valor hay mayor posibilidad de establecer dicha interacción. Esta medida se basa en la cantidad de energía (k/mol) que se usa para transferir un segmento de secuencia de longitud definida de un medio hidrofóbico a un medio hidrofílico (Lieberman et al. 2009). Los resultados arrojados por ProtScale (Figura 1), permiten identificar las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de la proteína PA2481, en donde se observa el puntaje en función del residuo. Los picos más altos indican regiones hidrofóbicas y los más bajos cercanos a -2 indican regiones hidrofílicas. Utilizando una ventana de 9, se determinó que PA2481 es una proteína altamente hidrofílica, es decir gran parte de su estructura se encuentra en contacto con un medio acuoso, lo que coincide con los resultados del promedio general de la hidropatía. PA2481 también presenta 3 regiones hidrofóbicas que podrían estar en contacto con la parte interna de la membrana celular. Las regiones donde hay bajos niveles de aminoácidos hidrofóbicos junto con largos tramos de residuos hidrofílicos pero con cargas netas altas y a pH neutro, están teóricamente asociadas con la falta de compactación de las proteínas bajo condiciones fisiológicas normales resultando en estructuras nativas estructuralmente desordenadas (Uversky & Dunker 2010). Se sabe que los segmentos desordenados de las proteínas contienen importantes sitios funcionales predichos como motivos lineales (Uversky & Dunker 2010). Las regiones desordenadas de la proteína PA2481 fueron analizadas para predecir su comportamiento en solución e identificar regiones que pueden ser funcionalmente importantes. La predicción de dominios globulares y regiones desordenadas de la proteína, se realizó con GLOBPLOT, el cual permite predecir dominios estructurales; no está limitado por la búsqueda de secuencias homólogas estructuralmente conocidas (Uversky et al 2007). Figura 1. Análisis hidropático de la proteína PA2481 con base en los valores de Kyte y Doolittle. Las regiones desordenadas reveladas por GLOBPLOT (Figura 2) muestran 7 regiones con desordenes intrínsecos entre la posición de aminoácidos del 1-7, 24-40, 119-123, 145-165, 201206, 225-236 y 251-257, las cuales están posiblemente involucradas en funciones importantes de Pseudomonas aeruginosa. Además, 2 de las 7 regiones desordenadas (residuos 201-206 y 225236) se encuentran en el dominio del citocromo cbb3 oxidasa revelado en los resultados de PFAM (Tabla 2), lo cual corrobora la importancia de este dominio. Figura 2. Análisis de GLOBPLOT para la proteína PA2481. Las regiones con desordenes intrínsecos corresponden a las regiones de color azul, mientras que las regiones globulares están en verde. Predicción de la estructura secundaria La predicción de la estructura secundaria (figura 3) se realizó con el servidor NPSA, el cual arroja los resultados basados en un consenso de varios algoritmos (SOPM, PREDATOR, GORIV, DSC y DPM), ya que la calidad de la predicción de la estructura secundaria puede ser de mejor calidad si se realiza por clasificaciones basadas en consensos para obtener una predicción más confiable que utilizando solo uno de los métodos (Pollastri et al. 2007). Los algoritmos SOPM y PREDATOR están fundamentados en la probabilidad condicional de que determinado aminoácido haga parte de una estructura secundaria considerando que los aminoácidos adyacentes adquieran la misma estructura, mientras que los algoritmos GORIV, DSC, y DPM utilizan conjuntos de entrenamiento cuyos elementos son estructuras resueltas para identificar secuencias motivo comunes asociadas a disposiciones particulares de estructuras secundarias (Barreto et al. 2012). Figura 3. Estructura secundaria de la proteína PA2481 generado por NPS@. La secuencia consenso se pude ver en la parte inferior, indicando las regiones con hélices α en azul, bucles en naranja y hebras no plegadas en rojo. De acuerdo con lo anterior, la estructura secundaria de PA2481 revelo la existencia de 8 hélices α entre los residuos de aminoácidos: 5-14, 42-57, 104-113, 129-141, 171-179, 215-222, 239-247 y 263-269 representados en un 29.90%; 11 bucles entre los aminoácidos: 17-41, 57-62, 65-94, 118-128, 142-165, 182-189, 197-213, 225-238, 248-261, 270-276 y 278-284 con un 60.82%; y hebras no plegadas representadas con tan solo el 4.12%. La prevalencia de conformación en bucle hace a estas moléculas más dúctiles y se explica por la necesidad funcional de establecer fácilmente interacciones con proteínas (Sáenz et al. 2011). Predicción de la Estructura Tridimensional La predicción de la estructura tridimensional de la proteína PA2481se realizó utilizando el servidor I-TASSER, el cual es una plataforma unificada para la predicción automatizada de la estructura y función de las proteínas. La estructura tridimensional de la proteína PA2481 (figura 4), se determinó por el método de modelamiento por homología, el cual utiliza proteínas molde que son derivadas de alineamientos con secuencias de estructura conocida en PDB. Los criterios de validación de la estructura tridimensional de una proteína estable, dependen de parámetros estereoquímicos correspondientes a los ángulos de torsión que determinan su plegamiento. Puesto que el rango permitido de ángulos dentro de una estructura es muy restrictivo, las variaciones en el ángulo de torsión son muy pocas y han hecho posible la identificación de ángulos que permiten una aproximación a la probabilidad de que la conformación estructural de la proteína sea correcta (Tosatto & Battistutta 2007). Figura 4. Modelo tridimensional de PA2481 generado por I-TASSER y visualizado con PyMOL. Las hélices mostradas de color azul agua marina y los bucles mostrados en naranja, corresponden a las regiones donde hay coincidencia con la predicción de la estructura secundaria. Las regiones en color salmón mostradas en “sticks” corresponden a los motivos de unión covalente al grupo hemo el cual se presenta en color rojo. De acuerdo con lo anterior, la validación del modelo tridimensional de PA2481 fue realizada por medio de la evaluación con la herramienta “structure assesment” de SWISSMODEL, el cual cumplió esencialmente con los parámetros estereoquímicos de una estructura estable con 204 (86.1%) residuos en las regiones más favorables, 30 (12.7%) residuos en regiones adicionales permitidas, 2 (0.8%) residuos en regiones generosamente permitidas y solo 1 (0.4%) residuo se encuentra en regiones no permitidas (figura 5). Los sitios donde hay mayor probabilidad de que los ángulos que conforman la estructura proteica sean posibles corresponden a las regiones más favorables y a las adicionalmente permitidas, mientras que las regiones generosamente permitidas y las no permitidas corresponden a sitios con menor probabilidad de acercamiento al ángulo correcto. Al analizar los resultados de la evaluación, es posible deducir que el modelo constituye un buen acercamiento a la estructura real de la proteína PA2481, además el modelo coincide en gran parte con la predicción de la estructura secundaria predicha anteriormente. Figura 5. Plot de Ramachandran que muestra la conformación estereoquímica de los ángulos phi y psi de la estructura tridimensional de la proteína PA2481. Se muestran las regiones más favorables (Rojo), adicionalmente permitidas (Amarillo), generosamente permitidas (amarillo opaco) y no permitidas (Blanco). Los residuos de Glicina se muestran como triángulos y generalmente son residuos altamente conservados que permiten la combinación de ángulos que no son posibles para otros aminoácidos. Conclusiones El modelo tridimensional predicho constituye un buen acercamiento a la posible estructura real de la proteína PA2481, pues este coincide en gran parte con la estructura secundaria predicha y además se aseguró su correcta conformación por medio de la evaluación geométrica (Grafico Ramachandran).A través de las diferentes herramientas bioinformáticas usadas en el presente estudio, se determinó que la proteína hipotética PA2481 de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pertenece a la superfamilia de los Citocromos c, presentando las características más significativas de este tipo de proteínas como los dos sitios de unión covalente al grupo hemo. Esto indica que posiblemente PA2481 participa en procesos biológicos metabólicos celulares, de óxidoreducción, en la cadena trasportadora de electrones y en la generación de precursores de metabolitos y energía, contribuyendo con los mecanismos de resistencia antibiótica de esta bacteria, por el bombeo de este tipo de sustancias al exterior, lo cual requiere ATP, o por procesos de óxido-reducción que llevan a su degradación. Referencias Allen J.W, Daltrop O, Stevens J.M, Ferguson S.J.(2003). C-type cytochromes: diverse structures and biogenesis Systems pose evolutionary problems. Philios. Trans. R. Soc. Lond, B, Biol. Sci. 358:255-266. Altschul, S. F. and Gish, W. (1996). Local alignment statistics. Methods Enzymol. 266, 460-480. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. 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