Ana´lisis cuantitativo de insulina mediante

Clinical Chemistry 59:9
1349–1356 (2013)
Endocrinologı́a y metabolismo
Análisis cuantitativo de insulina mediante cromatografı́a de
lı́quidos y espectrometrı́a de masas en tándem en un
laboratorio clı́nico de alta capacidad
Zhaohui Chen,1 Michael P. Caulfield,1 Michael J. McPhaul,1 Richard E. Reitz,1 Steven W. Taylor,1
y Nigel J. Clarke1*
ANTECEDENTES: Las concentraciones de insulina en
circulación reflejan la cantidad de insulina endógena
producida por el páncreas y puede supervisarse para
controlar la resistencia insulı́nica. La insulina se
mide habitualmente mediante análisis inmunoquimioluminimétricos (ICMA). Desafortunadamente,
las diversas reacciones cruzadas de los diferentes anticuerpos de ICMA han conducido a la variabilidad
en los resultados de los análisis. En contraste, los
métodos basados en cromatografı́a de lı́quidos y
espectrometrı́a de masas en tándem (LC-MS/MS)
pueden proporcionar una alternativa altamente
especı́fica al inmunoanálisis.
MÉTODOS:
Se extrajo la insulina del suero del paciente
y se la redujo para liberar la cadena B de la insulina.
La posterior resolución del péptido se alcanzó mediantecromatografı́adelı́quidos(LC)juntoconespectrometrı́a de masas MS) de triple cuadrupolo. Se utilizó
la supervisión de reacción seleccionada de las transiciones de cadena B para la cuantificación. Se utilizó insulina humana recombinante como calibrador y se
comparó con el patrón de referencia del National Institute for Biological Standards and Control (Instituto Nacional de Control y Normas Biológicas, NIBSC). Se utilizó insulina bovina y una cadena B de la insulina
humana con marcado radioactivo estable (13C/15N) y
se compararon como patrones internos.
RESULTADOS: El análisis de LC-MS/MS que se describe
en el presente se validó de acuerdo con las directrices de
CLIA (Enmiendas de Mejora de Laboratorios Clı́nicos)
con un lı́mite de detección de 1.8 ␮IU/ml (10.8 pmol/l)
y un lı́mite de cuantificación de 3 ␮IU/ml (18.0 pmol/
l). Se realizó una correlación entre el análisis de LCMS/MS y un análisis de ICMA aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de los EE.
UU. (FDA) para las muestras de los pacientes y la re-
1
Quest Diagnostics Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA.
* Dirigir correspondencia para estos autores a: Quest Diagnostics Nichols Institute, 33068 Ortega Hwy, San Juan Capistrano, CA, 92675. Fax 949-728-4872;
correo electrónico: [email protected].
gresión de Deming demostró una buena concordancia.
Se estableció un intervalo de referencia para el análisis.
CONCLUSIONES: Se desarrolló y validó de forma correcta
un análisis de insulina de LC-MS/MS cuantitativo,
simple y de alta capacidad certificado por patrón del
NIBSC.
© 2013 American Association for Clinical Chemistry
La detección de individuos con prediabetes y diabetes
puede realizarse al medir las concentraciones de glucosa en ayunas, glucohemoglobina e insulina en ayunas, y las concentraciones de glucosa luego de una
carga glucémica por vı́a oral. Cada uno de estos métodos es eficaz pero todos presentan inconvenientes. Las
concentraciones de glucosa en ayunas que no se encuentran dentro de los intervalos de referencia reflejan
un estado fisiológico en el cual ya se ha presentado la
diabetes temprana. Los incrementos en la hemoglobina
A1C pueden reflejar las últimas etapas de prediabetes o
diabetes sintomática. La prueba oral de tolerancia a la
glucosa puede identificar la resistencia insulı́nica más
temprano pero involucra una prueba dinámica más
complicada y no siempre es tributaria del entorno de
pruebas clı́nicas.
Se ha sugerido la medición de insulina en suero en
ayunas dado que puede proporcionar una prueba rápida y de fácil acceso para complementar otras
metodologı́as existentes. De hecho, diversos estudios
han demostrado mayores concentraciones de insulina
en ayunas en pacientes con prediabetes, incluso en ausencia de aumentos de glucosa y hemoglobina A1C en
ayunas (1–5 ). En un número limitado de casos, se ha
sugerido la utilidad de las mediciones de insulina en
ayunas para detectar la resistencia insulı́nica temprana
(2, 6 ).
Recibido para la publicación el 20 de noviembre de 2012; aceptado para la
publicación el 26 de abril de 2013.
Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2012.199794
1349
Las técnicas inmunológicas se han usado ampliamente para la cuantificación de la insulina, inicialmente a través del radioinmunoanálisis y más recientemente mediante análisis inmunoquimioluminimétricos
(ICMA)2 disponibles en el mercado en plataformas automatizadas (7 ). Sin embargo, aún no se ha establecido
un método de referencia internacional para la insulina.
El mayor obstáculo en el establecimiento de tal método
surge de la variabilidad en los valores de la insulina
medidos en comparación con diferentes inmunoanálisis y plataformas. Los valores medidos pueden diferir
por un factor de 2 para el mismo patrón de insulina
humana de la OMS (7 ). Las diferencias en los resultados de las diversas plataformas de ICMA con frecuencia están causadas por las diferentes reacciones
cruzadas de los anticuerpos utilizados del análisis. Asimismo, los autoanticuerpos o anticuerpos heterófilos
presentes en la muestra del paciente pueden causar sesgos en las concentraciones de insulina informadas.
Los análisis de péptidos y proteı́nas basados en espectometrı́a de masas (MS) se han desarrollado recientemente como importantes estrategias alternativas para
el análisis clı́nico de biomoléculas (8 ), incluida la insulina. Debido a que la insulina está presente en la sangre humana en concentraciones muy bajas, la mayorı́a
de los métodos de MS anteriormente desarrollados
para la detección y cuantificación de polipéptidos han
dependido de las metodologı́as de captura inmunológica (9 –15 ). Sin embargo, las recientes mejoras en
la sensibilidad de la MS niegan la necesidad del enriquecimiento basado en anticuerpos sin comprometer
la alta especificidad. En consecuencia, el método que
hemos desarrollado no requiere anticuerpos de captura
mientras aún proporciona un análisis altamente
especı́fico y sensible para la insulina humana a través
del análisis de control selectivo de reacción (SRM) en
un espectómetro de masas de triple cuadrupolo.
La insulina humana madura (peso molecular,
5808 Da) consta de 2 cadenas peptı́dicas (A y B) ligadas
por 2 enlaces disulfuro. Las cadenas A (peso molecular
2377 Da) y B (peso molecular, 3431 Da) de insulina
pueden separase mediante el uso de agentes reductores
adecuados. Se ha estudiado ampliamente la cadena B
de la insulina; sin embargo, no se ha desarrollado un
análisis cuantitativo para el péptido (12, 16, 17 ). Nuestro objetivo fue el de desarrollar un análisis para la cuantificación de las concentraciones de insulina total en el
2
Abreviaturas no estándar: ICMA, análisis inmunoquimioluminimétricos; MS,
espectrometrı́a de masas; SRM, control de la reacción seleccionada; LC-MS/MS,
cromatografı́a de lı́quidos y espectrometrı́a de masas en tándem; TCEP, tris-(2carboxietil)-fosfina; NIBSC, Instituto Nacional de Control y Normas Biológicas;
IS, estándar interno; FDA, Administración de Medicamentos y Alimentos de los
EE. UU; SPE, extracción en fase sólida; LOD, lı́mite de detección; LOQ, lı́mite de
cuantificación.
1350 Clinical Chemistry 59:9 (2013)
suero humano mediante la cuantificación de la cadena
B luego de la reducción y liberación de la molécula
intacta. En el presente, informamos la validación de
este análisis y los estudios del intervalo de referencia
para respaldar la medición clı́nica de alta capacidad
de la insulina mediante cromatografı́a de lı́quidos y
espectrometrı́a de masas en tándem (LC-MS/MS).
Materiales y métodos
PATRONES Y REACTIVOS
Se utilizó agua, acetona, etanol, isopropanol y acetonitrilo de calidad HPLC de Burdick and Jackson; el metanol y la solución inhibidora de la adhesión tris-(2carboxietil)-fosfina (TCEP) fueron de Thermo Fisher
Scientific. El ácido fórmico de alta pureza fue de Fluka.
El patrón de insulina humana de la OMS (código: 66/
304) fue del National Institute for Biological Standards
(Instituto Nacional de Control y Normas Biológicas,
NIBSC). La insulina humana recombinante fue de
Millipore. La insulina bovina (⬎95% de pureza) y la
solución de base de 1.5 mol/l Tris (Trizma) fueron de
Sigma. La cadena B de la insulina con marcado
isotópico totalmente sintética fue de Anaspec (consulte
la Fig. 1 de los Datos complementarios que acompañan
la versión en lı́nea de este informe en http://www.
clinchem.org/content/vol59/issue9). El suero humano
Hypo-Opticlear tratado sin insulina fue de los laboratorios Biocell. Todos los componentes proteicos se caracterizaron completamente mediante electroforesis
en gel, HPLC y MS por parte de los fabricantes. El análisis de aminoácidos estuvo a cargo de AAA Service Laboratory Inc. para confirmar el contenido proteico antes
del uso.
PREPARACIÓN DE CALIBRADORES, CONTROLES Y PATRONES
INTRENOS
Se preparó una solución matriz del patrón de insulina
humana (insulina humana recombinante excepto indicación en contrario) a 1 IU/ml (6 ␮mol/l) en 0.2% de
solvente de ácido fórmico y se almacenó a ⫺80 °C hasta
su uso. Inmediatamente antes del análisis, se descongeló la solución matriz y se diluyó una parte en el suero
humano tratado sin insulina a una concentración final
de 4000 ␮IU/ml (24 nmol/l). Las diluciones se realizaron posteriormente a fin de generar una serie de
calibración a concentraciones de 5.0, 10, 15, 25, 50, 100,
200 y 300 ␮IU/ml (30.0 –1800 pmol/l).
Las reservas de QC internas se realizaron mediante
el uso de insulina humana recombinante de Millipore,
disuelta en 0.2% de ácido fórmico y almacenada a
⫺80 °C. La concentración de insulina de estas reservas
se verificó mediante análisis de aminoácidos antes de la
dilución. Se realizaron cinco determinaciones durante
Análisis cuantitativo de la insulina
Figura 1. Ejemplo de cromatogramas en el suero de un paciente (40.6 ␮IU/ml o 243.6 pmol/l).
El tiempo de retención real es 4.8 min. RT: tiempo de retención; AA: área; SN: relación señal ruido; BP: pico de base; NL: mayor
normalizado; TIC: corriente total de iones
un perı́odo de 6 meses con un coeficiente de variación
(CV) del 3%. Los controles de QC (8, 16, 40 y 80
␮IU/ml o 48 – 480 pmol/l) se realizaron al agregar suero humano tratado Hypo-Opticlear a las concentraciones objetivo y luego almacenarlas en partes a ⫺80 °C.
Los controles y calibradores de QC de insulina recién
hechos se evaluaron mediante comparación con el material de referencia de NIBSC. Cada parte de QC se usó
solo una vez después del descongelamiento para evitar
los ciclos de congelamiento y descongelamiento.
Los patrones internos (IS) se prepararon en 0.2%
de ácido fórmico a una concentración de 10 ␮mol/l. Se
agregó insulina bovina (350 pmol) al suero durante la
extracción (antes de la reducción) y se agregó la cadena
B humana con marcado isotópico (115 pmol) al extracto reducido antes de la CL.
APROBACIÓN DE LOS PARTICIPANTES DEL ESTUDIO EN
HUMANOS
Las muestras de suero se obtuvieron de participantes
del estudio sanos luego del consentimiento informado
y se almacenaron a ⫺80 °C hasta su uso [aprobación
n.o 1085473 de Western Institutional Review Board
(Junta de Revisión Institucional Occidental)]. El uso de
muestras desechadas anónimas en estos estudios estuvo bajo la revisión del Western Institutional Review
Board y se consideró eximido.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS
Excepto indicación en contrario, la sangre se obtuvo en
tubos de preparación de suero sin separación (tapón
rojo) y se permitió la coagulación. El suero obtenido se
Clinical Chemistry 59:9 (2013) 1351
proceso inmediatamente y se almacenó a ⫺80 °C hasta
el análisis.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
El suero del paciente se descongeló y se mezcló en vórtex, y se mezclaron enérgicamente 150 ␮l con 350 ␮l de
etanol básico (85% etanol, 15% base Tris) y se permitió
la incubación durante 60 min a ⫺20 °C. El precipitado
obtenido se granuló mediante centrifugación durante10 min a 5200 g. Luego, se mezcló el supernadante
clarificado (250 ␮l) con 20 ␮l de solución inhibidora de
TCEP (Thermo Fisher Scientific), que se usó conforme
a las indicaciones del fabricante para liberar las cadenas
A y B de la insulina mediante la reducción de sus enlaces disulfuro.
CROMATOGRAFÍA ANALÍTICA Y PREPARATIVA AUTOMATIZADA
La separación analı́tica de la cadena B de la insulina de
los componentes de la matriz antes de espectometrı́a de
masas se realizó mediante TurboFlow Aria TLX-4
(Thermo Fisher), un sistema de cromatografı́a de
lı́quidos en lı́nea completamente automatizado. Las 4
columnas en este sistema de cromatografı́a de lı́quidos
se operan en paralelo y facilitan el alto rendimiento. Se
llevo a cabo la preparación y el enriquecimiento de las
muestras mediante extracción en fase sólida (SPE) en
lı́nea mediante una columna Oasis HLB tipo cartucho
(2.1 ⫻ 20 mm, 25 ␮m) (Waters) (consulte la Fig. 2
complementaria en lı́nea). La resolución cromatográfica se realizó con una columna Magic C4 (2.1 ⫻ 50
mm, 5 ␮m, 300 Å) (Bruker- Michrom). Para las columnas analı́ticas y de SPE, utilizamos el mismo solvente A
(agua, 0.2% ácido fórmico) y B (acetonitrilo, 0.2%
ácido fórmico). Después de la inyección del extracto
(225 ␮l) a 4 ml/min, se lavó el cartucho con solvente B
al 12% durante otros 60 s. A continuación, se realizó el
retrolavado de los analitos fuera del cartucho de extracción con un gradiente escalonado de solvente B al 35%
a 0.8 ml/min y volvió a centrarse la atención en la columna analı́tica mediante una válvula T con una proporción de flujo de 3:1 entre las bombas de elución (0.6
ml/min) y de carga (0.2 ml/min), respectivamente. Finalmente, la resolución de los analitos se realizó con un
gradiente lineal rápido de 12% a 42% del solvente B a
0.5 ml/min durante 3 min.
ADQUISICIÓN Y PROCESAMIENTO DE DATOS
Se utilizó un espectómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Vantage (ThermoFisher) interconectado al
sistema TLX-4 con una sonda ESI como detector de
MS/MS. Los datos se obtuvieron mediante SRM en
modo de iones positivos bajo las siguientes condiciones: voltaje de ionización: 4800 V; presión del gas de
impulsión: 50 (unidades arbitrarias); presión del gas
auxiliar: 25 (unidades arbitrarias); temperatura capilar:
1352 Clinical Chemistry 59:9 (2013)
250 °C. El ajuste de los instrumentos en Xcalibur incluyó el modo de exploración positivo con el filtro
Chrom activado y configurado en 10; amplitud de la
exploración: 0.5 m/z; tiempo de exploración: 0.1 s; gas
de colisión: 1.5 mTorr; y la amplitud de ambos valores
máximos Q1 y Q3 configurada en 0.7.
La naturaleza distintiva de la secuencia de aminoácidos para la cadena B de la insulina se confirmó al
realizar una búsqueda mediante la herramienta BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool, herramienta de
búsqueda de alineaciones locales básicas) (18 ) (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). En este análisis, consideramos el tiempo de retención y la proporción de las
transiciones de masas (1:1, con una tolerancia del
⫾20%) para admitir la identificación de la cadena B.
Para el análisis cuantitativo, se utilizó el pico isotópico
más intenso del ion MH5⫹5 de la cadena B de la insulina [m/z 686.9 (0.2)] como ion precursor (consulte
la Fig. 3 complementaria en lı́nea). Las transiciones a
b14⫹2 [768.5 (0.2)] y a y13⫹2 [753.2 (0.2)] de la cadena
B de la insulina, con óptimas energı́as de colisión de
21 y 19 V, respectivamente, se supervisaron mediante
SRM para mejorar la selectividad. Las correspondientes transiciones para los IS fueron de 680.8 (0.2) a 768.5
(0.2), 738.3 (0.2) para la insulina bovina y de 688.1
(0.2) a 768.5 (0.2), 756.0 (0.2) para la cadena B de la
insulina humana con marcado isotópico. Para mejorar
la sensibilidad, se resumieron las áreas de valor
máximo de cada transición para cada péptido. Se utilizó la proporción del área de valor máximo del analito
respecto del IS (excepto indicación en contrario, se empleó la cadena B de la insulina humana con marcado
isotópico como IS) para calcular las concentraciones de
la curva estándar. Se utilizó un modelo lineal (1/x) para
la generación de la curva estándar mediante regresión
lineal. Los resultados se informaron como la concentración de insulina (␮IU/ml o pmol/l; 1 ␮IU/ml ⫽ 6
pmol/l). Las herramientas de software utilizadas fueron TSQ Vantage 2.0.0, Tune Master V 2.0.0, Xcalibur
V 2.0.7. SP1, LC Quan V 2.5.6. SP1 y XReport 2.0.7. Se
utilizó SP1 y ARIA OS V 1.6.1 (ThermoFisher) para la
adquisición y el procesamiento de datos.
COMPARACIÓN DEL MÉTODO
El método de LC-MS/MS se comparó con una plataforma comercial (Beckman Access® ICMA) aprobada
por la Administración de Medicamentos y Alimentos
de los EE. UU. (FDA) [limite de detección (LOD) 0.13
␮IU/ml; lı́mite de cuantificación (LOQ) 0.3 ␮IU/ml]
para la medición de la insulina en pacientes (n ⫽ 89).
Las muestras de estos pacientes fueron descartes sin
identificación presentados anteriormente para análisis
clı́nicos de rutina. Las concentraciones medidas cubrieron los intervalos de referencia de la insulina humana
previstos y los excedieron de concentraciones bajas a
Análisis cuantitativo de la insulina
Figura 2. Comparación del método (regresión de Deming) de LC-MS/MS y la plataforma de ICMA aprobada por la
FDA en 89 muestras de pacientes.
concentraciones muy altas de insulina. La correlación
de los 2 métodos se evaluó mediante el uso de la regresión de Deming.
DETERMINACIÓN DEL INTERVALO DE REFERENCIA
Se determinó un intervalo de referencia para el análisis
de LC-MS/MS mediante el uso de suero obtenido en
tubos de tapón rojo de 97 voluntarios sanos seleccio-
nados cuidadosamente (51 mujeres, 46 hombres de entre 18 a 65 años de edad, empleados de Quest Diagnostics y ajenos a la firma). Se utilizaron los siguientes
criterios de inclusión: adultos aparentemente sanos,
ambulatorios, no medicados que viven en la comunidad. Los criterios de exclusión fueron los siguientes:
cualquier trastorno endocrino, glucosa en ayunas
⬎100 mg/dl (⬎5.55 mmol/l) e insulina libre más alta
Clinical Chemistry 59:9 (2013) 1353
Figura 3. Un intervalo de referencia para la insulina
determinado mediante LC-MS/MS para 97 donantes
sanos.
de lo normal (⬎20 ␮IU/ml o 120 pmol/l) detectada por
la plataforma de ICMA actual.
TIPO DE MUESTRA Y ESTABILIDAD
Se evaluaron seis tipos de tubos de obtención de muestras (para suero con tapón rojo simple, tubos separadores de suero, plasma EDTA, plasma con heparina
sódica, plasma con heparina de litio y plasma con citrato de sodio) con muestras extraı́das de 10 individuos
y se analizaron mediante el análisis de LC-MS/MS. La
estabilidad de la muestra se evaluó en el suero a lo largo
del tiempo con los siguientes intervalos de temperatura: congelado ultrabajo (⫺60.0 a ⫺90.0 °C), congelado (⫺10.0 a ⫺30.0 °C), refrigerado (2.0 a 8.0 °C) y
temperatura ambiente (18.0 a 26.0 °C). La estabilidad
del congelamiento y descongelamiento se evaluó mediante el uso de muestras de suero de 10 pacientes individuales. Se obtuvo una muestra inicial sin congelamiento (ciclo 0) y 5 muestras adicionales estuvieron
sujetas a los ciclos de congelamiento y descongelamiento
de repetición (1–5 ). La estabilidad de la muestra se completó al evaluar la diferencia media entre el valor inicial y el
valor temporal/de temperatura de la muestra dentro de
un intervalo aceptable del 80% al 120%.
Resultados
EFICACIA DEL PATRÓN INTERNO
Se prefirió inicialmente la cadena B de la insulina marcada para el análisis dado que es quı́micamente una
correspondencia para la cadena B endógena. El péptido
1354 Clinical Chemistry 59:9 (2013)
marcado se agregó a todas las muestras extraı́das, QC y
calibradores conforme a la descripción en Materiales y
métodos antes del análisis en el sistema de LC-MS/MS
y se utilizó para normalizar los resultados de la
espectometrı́a de masas cuantitativa. Sin embargo, a fin
de corregir la posibilidad de la reducción incompleta de
la insulina, también utilizamos insulina bovina inalterada como IS indirecto agregado al inicio de la
preparación de la muestra para justificar cualquier pérdida de procedimiento durante los procesos de extracción y reducción. La Fig. 1 muestra los cromatogramas
de SRM correspondientes a la cadena B de la insulina
bovina coeluı́da, humana endógena y humana con
marcado isotópico, respectivamente. Ambos IS demostraron consistencia en la respuesta de la señal a lo
largo del tiempo y la regresión de Deming de 51 pacientes sugirió la misma idoneidad (consulte la Fig. 4
complementaria en lı́nea). Finalmente, elegimos la insulina bovina como el IS predeterminado dado que
presenta una intensidad superior de valor máximo y
costo además de corregir la posibilidad de la reducción
incompleta. El beneficio de la utilización de un IS está
demostrada en la Fig. 5 complementaria en lı́nea. Se
observó la correlación de los resultados de LC-MS/MS
con los resultados del análisis de ICMA mediante regresión de Deming para mejorar de forma considerable
la curva, con una reducción de 1.36 (sin IS) a 1.07 (IS
bovino).
RENDIMIENTO DEL ANÁLISIS
Las especificaciones del rendimiento analı́tico se resumen en la Tabla 1. El análisis demuestra una relación
lineal dentro del lı́mite de declaración obligatoria de 5 a
300 ␮IU/ml (30 –1800 pmol/l), con R2 de 0.9989. Determinamos el LOQ de la insulina mediante el análisis
de 6 muestras diferentes a concentraciones próximas al
LOQ previsto [1.25, 2.5, 5, 10, 15 y 25 ␮IU/ml (1 ␮IU/
ml ⫽ 6 pmol/l)] y la posterior evaluación de la reproducibilidad intranalı́tica en 7 series. La menor concentración que arrojó un rendimiento aceptable fue 3
␮IU/ml (18 pmol/l), para la cual el IC de 95% para el
CV se mantuvo por debajo del 20%. Se midió un
blanco 14 veces y los cocientes de área obtenidos se
calcularon nuevamente para establecer un LOD (4 SD
de la concentración cero) de 1.8 ␮IU/ml (10.8 pmol/l)
para la insulina y un lı́mite de blanco (2 SD de la concentración cero) de 1.4 ␮IU/ml (8.4 pmol/l) para la
insulina en suero tratado. La confirmación la identificación de la cadena B de la insulina se estableció como
se describe en Métodos. Las proporciones de transición
de masas fuera de los lı́mites de tolerancia definidos se
encontraron en ⬍3% de las muestras de pacientes. No
se observó arrastre detectable para las concentraciones
por debajo de 500 ␮IU/ml (3000 pmol/l). La precisión
y exactitud intranalı́ticas para QC se generaron me-
Análisis cuantitativo de la insulina
Tabula 1. Rendimiento del análisis de LC-MS/MS para la insulina.
LOBa
Sensibilidad
Precisión
LOD
1.4 ␮IU/ml (8.4 pmol/l)
1.8 ␮IU/ml (10.8 pmol)
3.0 ␮IU/ml (18.0 pmol)
Insulina en suero tratado, ␮IU/ml
(pmol/l)
% CV interanalı́tico, exactitud
(n ⴝ 8)
% CV intranalı́tico, exactitud
(n ⴝ 8)
8 (48)
14.0, 91.3
7.0, 80.0
12 (72)
10.2, 91.2
7.9, 92.2
20 (120)
10.0, 87.0
6.0, 86.5
40 (240)
7.5, 87.7
4.0, 87.6
7.1, 96.3
3.0, 92.1
80 (480)
Recuperación
a
LOQ
Insulina en suero, ␮IU/ml (pmol/l)
% recuperación media (SD)
(n ⴝ 3)
8 (48)
93.8
20 (120)
113.3
48 (288)
99.4
LOB, lı́mite de blanco.
diante el análisis de 8 reproducciones. Los CV variaron
del 3.0% al 7.9%, con una exactitud intranalı́tica que
varió del 80% al 92%. La variación intranalı́tica durante 5 dı́as varió del 7.1% al 14.0% y la exactitud
intranalı́tica varió del 87% al 96%. El rendimiento del
análisis también se evaluó mediante experimentos de
enriquecimiento y recuperación en el suero del paciente y se detectó una recuperación general del 94% al
113% en el intervalo medido (Tabla 1).
COMPARACIÓN DEL MÉTODO
Para hacer referencia al análisis, realizamos un análisis
de correlaciones entre el análisis de LC-MS/MS y un
análisis de ICMA aprobado por la FDA mediante la
utilización de 89 descartes de pacientes sin identificación en todo el intervalo de concentración de la insulina de 3 a 180 ␮IU/ml (18 a 1080 pmol/l). La regresión de Deming de este estudio demostró una buena
concordancia entre el nuevo método de LC-MS/MS y
el análisis de ICMA (y ⫽ 1.15x ⫺ 0.89) (Fig. 2).
DETERMINACIÓN DEL INTERVALO DE REFERENCIA
En esta investigación, usamos muestras de 97 donantes
sanos cuidadosamente seleccionados para realizar un
estudio de intervalo de referencia (Fig. 3). Se demostró
que los datos fueron no gausianos. Los datos del porcentil 95 se usaron para establecer un intervalo de referencia de ⬍13.7 ␮IU/ml (82.2 pmol/l).
QC DEL ANÁLISIS
Utilizamos procedimientos de QC conforme a las
reglas de Westgard en el análisis para determinar las
series correctas en comparación con las incorrectas, ası́
como para identificar los sesgos en los datos atribuibles
a los problemas analı́ticos. Se evaluaron los controles
de QC desde 2 fuentes diferentes. La primera fueron
controles de TDM/inmunoanálisis Bio-Rad, muestras
de suero de QC con concentraciones conocidas de insulina. El segundo tipo de muestra de QC fue una
reserva de suero interna con baja concentración de insulina que preparamos al determinar la concentración
de insulina luego de combinar el suero de una amplia
población de donantes. Los márgenes para los controles Bio-Rad y suero de QC interno se determinaron
para cada lote nuevo. Los márgenes de trabajo para los
QC se establecieron al medir algunas observaciones de
50 –70 por nivel y en varias reproducciones durante 5
dı́as. Los resultados se analizaron estadı́sticamente para
obtener los valores medios (16.1, 46.5 y 189.5 ␮IU/ml o
96.6, 279 y 1137 pmol/l) y los CV para cada nivel de QC
(17.4%, 12.4% y 8.2%, respectivamente). Estos datos se
utilizaron posteriormente para definir los lı́mites de SD
2 y 3 para la aceptabilidad del QC.
Durante el análisis de las muestras, se probaron todos
los niveles de QC al inicio de cada análisis con varias reproducciones de los QC intercaladas en todo el análisis y,
de ese modo, se asociaron las muestras de pacientes.
TIPO DE MUESTRA Y ESTABILIDAD
Se realizó la validación del análisis de insulina para el
suero humano obtenido en tubos con tapón rojo simples. Una comparación de concentraciones de insulina
determinada en la sangre obtenida en diferentes tipos
de tubos demostró que la heparina sódica y de litio
arrojaron resultados equivalentes y; por lo tanto, son
tipos de muestras aceptables (no se muestran datos).
Clinical Chemistry 59:9 (2013) 1355
Las condiciones de almacenamiento de las muestras se
evaluaronentérminosdelareproducibilidadenlacuantificación a lo largo del tiempo y las mediciones
aceptables estuvieron comprendidas entre ⫾20% del
dı́a 0 (consulte la Fig. 6 complementaria en lı́nea). La
insulina en el suero de los pacientes fue estable durante
al menos 86 dı́as a ⫺80 °C. Sin embargo, a ⫺20 °C se
observó que las concentraciones de insulina medidas
en una porción de las muestras de suero se redujeron
después del almacenamiento de las muestras durante
35 dı́as. La insulina fue estable en suero durante solo 1
dı́a a temperatura ambiente. Además, las concentraciones de insulina en algunas muestras parecieron disminuir el segundo dı́a de almacenamiento a temperaturas refrigeradas, como lo indica el aumento de SD,
mientras que las muestras de otros pacientes demostraron una estabilidad ejemplar. Después de analizar
los resultados de estabilidad, se determinó que las
muestras del análisis de insulina de LC-MS/MS debı́an
almacenarse y enviarse congeladas a ⫺20 °C o una temperatura inferior para el corto plazo (menos de 1 mes).
El almacenamiento a más largo plazo debe ser a ⫺80 °C
o una temperatura inferior. Finalmente, los datos indican que las concentraciones de insulina no sufrieron
alteraciones en los 5 ciclos de congelamiento y descongelamiento (consulte la Fig. 6 complementaria en lı́nea).
ESTUDIOS DE INTERFERENCIA
Llevamos a cabo estudios de interferencia mediante la realización de exámenes del suero tratado de diferentes
fuentes ası́ como las pruebas de más de 100 muestras de
pacientes para buscar interferencias no especı́ficas. También se investigaron los efectos de los diferentes grados de
hemólisis, lipemia y bilirrubina (leve, moderada o grave)
en la exactitud de las mediciones de la insulina. Los efectos
de la hemólisis, lipemia y bilirrubina en las determinaciones de la insulina se evaluaron al agregar diferentes concentraciones de insulina en muestras de pacientes con
hemólisis, lipemia y bilirrubina baja, media y alta. Se utilizó un nivel de aceptación del 80% al 120% de recuperación para evaluar si el análisis se vio afectado de forma
adversa por la interferencia. No se observó dependencia
entre las concentraciones de insulina y el nivel de lipemia
o concentración de bilirrubina. En contraste, hubo recuperaciones no aceptables de insulina de suero totalmente
hemolizado. Por lo tanto, la hemólisis constituyó un criterio para el rechazo de la muestra (no se muestran datos).
Análisis
La aplicación de HPLC interconectada con la MS para el
análisis de proteı́nas y péptidos en el entorno de laboratorio clı́nico siempre ha representado un gran desafı́o en
comparación con los inmunoanálisis automatizados actuales basados en anticuerpos. La insulina demostró no
1356 Clinical Chemistry 59:9 (2013)
ser una excepción a esta observación. Primero, cualquier
nuevo análisis debe proporcionar una excelente selectividad y especificidad independientemente de la complejidad del suero humano. Segundo, el intervalo usual de
concentración de insulina en la sangre humana es bastante bajo; algunos inmunoanálisis tienen menores LOQ
hasta de 2 ␮IU/ml, equivalente a 1.8 fmol de insulina en
150 ␮l de suero que utilizamos para nuestro análisis. Tercero, cualquier análisis que vaya a utilizarse de forma habitual en un laboratorio clı́nico debe ser simple y altamente reproducible ası́ como sólido y capaz de adaptar un
elevado número de muestras. Cada serie de LC demora
⬍8 min y al realizar la multiplexación del análisis, pueden
obtenerse los datos para cada muestra en 2 min. En promedio, una placa de 96 pocillos demora ⬍4 h en ejecutarse. El rendimiento en la preparación de las muestras
está determinado por los pasos de extracción y reducción
e incubación (aproximadamente 2 h). Por lo tanto, hemos desarrollado un método de LC-MS/MS que cumple
con todos los criterios para el uso habitual en un laboratorio clı́nico.
Una caracterı́stica distintiva del análisis de insulina de LC-MS/MS es la uniformidad y armonización
de la norma para la insulina del NIBSC y la insulina
humana recombinante sintetizada. La mención al reactivo de referencia de la OMS como criterio de referencia adquirido directamente del NIBSC con una actividad biológica designada de 3 IU por frasco deberı́a
ayudar a evitar los problemas de estandarización que
han plagado los inmunoanálisis basados en anticuerpos actualmente disponibles, cada uno de los cuales
utiliza sus propias normas de trabajo desarrolladas por
los fabricantes. El análisis se ha validado y cumple con
la polı́tica interna conforme a las directrices 88
493.1253 de CLIA, con un LOD de 1.8 ␮IU/ml (10.8
pmol/l) y un menor LOQ de 3 ␮IU/ml (18.0 pmol/l).
Para confirmar la aplicabilidad de este análisis, se realizó una correlación entre el análisis de LC-MS/MS y un
análisis de ICMA aprobado por la FDA, y la regresión
de Deming obtenida demostró una buena concordancia entre ambos métodos en el intervalo de concentración menor. También se estableció un nuevo intervalo de referencia para el análisis de LC-MS/MS.
La metodologı́a para este análisis involucra la reducción de la insulina inalterada y la medición de la
cadena B libre. Este método proporciona información
valiosa para la distinción de la insulina endógena de los
análogos de la insulina terapéutica. Todas las formas
sintéticas comerciales de insulina tienen alteraciones
que afectan los aminoácidos C-terminal en la cadena B.
Los filtros de masa de SRM usados proporcionan detalles estructurales moleculares que confirman la autenticidad de la señal de la cadena B de la insulina medida, mientras que ignoran los análogos sintéticos,
habitualmente detectados como insulina con el uso de
Análisis cuantitativo de la insulina
métodos inmunológicos (inédito). Asimismo, el requisito de que los inmunoanálisis no reconozcan la proinsulina también se lleva a cabo por la selectividad del
método de cuantificación basado en SRM (19 ).
plido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significativas a la concepción y el diseño, la adquisición de datos o el análisis e
interpretación de estos; (b) redacción o revisión del artı́culo en relación
con su contenido intelectual; y (c) aprobación final del artı́culo
publicado.
Conclusión
Declaración de los autores o posibles conflictos de interés: Tras la
presentación del manuscrito, todos los autores completaron el formulario de declaración del autor. Declaraciones o posibles conflictos de
interés:
Se desarrolló y validó de forma correcta un análisis de
insulina cuantitativo, simple y de alta capacidad con
cromatografı́a de lı́quidos y espectrometrı́a de masas
en tándem certificado por patrón del NIBSC conforme
a las directrices de CLIA. El método combina la especificidad molecular con el rendimiento cuantitativo
y el análisis estandarizado y proporciona intervalos de
referencia, lo que convierte a este método en un candidato para considerar como método de referencia para
las pruebas de insulina (19, 20 ).
Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que
han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cum-
Empleo o liderazgo: Z. Chen, Quest Diagnostics; M.P. Caulfield,
Quest Diagnostics; M.J. McPhaul, Quest Diagnostics Nichols Institute; R.E. Reitz, Quest Diagnostics Nichols Institute; S.W. Taylor,
Quest Diagnostics; N.J. Clarke, Quest Diagnostics.
Papel del consultor o asesor: No se declara.
Propiedad de acciones: Z. Chen, Quest Diagnostics; M.P. Caulfield,
Quest Diagnostics; R.E. Reitz, Quest Diagnostics; N.J. Clarke, Quest
Diagnostics.
Honorarios: No se declara.
Financiamiento de la investigación: No se declara.
Testimonio de expertos: No se declara.
Patentes: Z. Chen, Quest Diagnostics, 20120164741 (solicitud); N.J.
Clarke, Quest Diagnostics, 20120164741 (solicitud).
Papel del patrocinador: No se declaró ningún patrocinador.
Referencias
1. Dankner R, Chetrit A, Shanik MH, Raz I, Roth J.
Basal-state hyperinsulinemia in healthy normoglycemic adults is predictive of type 2 diabetes
over a 24-year follow-up: a preliminary report. (La
hiperinsulinemia basal en adultos normoglucémicos sanos indica diabetes tipo 2 durante un seguimiento de 24 horas: un informe preliminar). Diabetes Care 2009;32:1464 – 6.
2. Johnson JL, Duick DS, Chui MA, Aldasouqi SA.
Identifying prediabetes using fasting insulin levels. (Identificación de la prediabetes mediante la
utilización de niveles de insulina en ayunas). Endocr Pract 2010;16:47–52.
3. Wang H, Shara NM, Calhoun D, Umans JG, Lee
ET, Howard BV. Incidence rates and predictors of
diabetes in those with prediabetes: the Strong
Heart Study. (Tasas de incidencia y predictores de
la diabetes en aquellas personas con prediabetes:
el estudio Strong Heart Study). Diabetes Metab
Res Rev 2010;26:378 – 85.
4. Drzewoski J, Czupryniak L. Concordance between
fasting and 2-h post-glucose challenge criteria for
the diagnosis of diabetes mellitus and glucose
intolerance in high risk individuals. (Acuerdo entre criterios de discusión sobre glucosa en ayunas
y dos horas luego de la ingesta para el diagnóstico de la diabetes mellitus y la intolerancia glucémica en individuos con alto riesgo). Diabet Med
2001;18:29 –31.
5. Kim SH, Abbasi F, Reaven GM. Impact of degree
of obesity on surrogate estimates of insulin resistance. (Impacto del grado de obesidad en estimaciones indirectas de resistencia insulı́nica). Diabetes Care 2004;27:1998 –2002.
6. Dankner R, Chetrit A, Shanik MH, Raz I, Roth J.
Basal state hyperinsulinemia in healthy normoglycemic adults heralds dysglycemia after
more than two decades of follow up. (La hiperinsulinemia basal en adultos normoglucémicos
sanos anuncia disglucemia luego de un segui-
7.
8.
9.
10.
11.
12.
miento durante más de dos décadas). Diabetes
Metab Res Rev 2012;28:618 –24.
Manley SE, Stratton IM, Clark PM, Luzio SD.
Comparison of 11 human insulin assays: implications for clinical investigation and research.
(Comparación de 11 análisis de insulina humana:
repercusiones en la investigación clı́nica y la investigación). Clin Chem 2007;53:922–32.
Hoofnagle AN, Wener MH. The fundamental
flaws of immunoassays and potential solutions
using tandem mass spectrometry. (Las principales
fallas de los inmunoanálisis y posibles soluciones
mediante el uso de espectometrı́a de masas en
tándem). J Immunol Methods 2009;347:3–11.
Kippen AD, Cerini F, Vadas L, Stocklin R, Vu L,
Offord RE, Rose K. Development of an isotope
dilution assay for precise determination of insulin,
C-peptide, and proinsulin levels in non-diabetic
and type II diabetic individuals with comparison
to immunoassay. (Desarrollo de un análisis de
dilución isotópica para la determinación precisa
de los niveles de insulina, péptido-C y proinsulina
en individuos no diabéticos y diabéticos de tipo II
mediante comparación en inmunoanálisis). J Biol
Chem 1997;272:12513–22.
Stocklin R, Vu L, Vadas L, Cerini F, Kippen AD,
Offord RE, Rose K. A stable isotope dilution assay
for the in vivo determination of insulin levels in
humans by mass spectrometry. (Un análisis de
dilución isotópica estable para la determinación
in vivo de los niveles de insulina en humanos
mediante espectometrı́a de masas). Diabetes
1997;46:44 –50.
Darby SM, Miller ML, Allen RO, LeBeau M. A
mass spectrometric method for quantitation of
intact insulin in blood samples. (Un método de
espectometrı́a de masas para la cuantificación de
la insulina inalterada en muestras de sangre).
J Anal Toxicol 2001;25:8 –14.
Thevis M, Thomas A, Delahaut P, Bosseloir A,
Schanzer W. Qualitative determination of synthetic analogues of insulin in human plasma
by immunoaffinity purification and liquid
chromatography-tandem mass spectrometry
for doping control purposes. (Determinación
cualitativa de análogos sintéticos de insulina
en plasma humano mediante purificación por
inmunoafinidad y cromatografı́a de lı́quidos y
espectrometrı́a de masas en tándem con
propósitos de análisis de dopaje). Anal Chem
2005;77:3579 – 85.
13. Rodriguez-Cabaleiro D, Van Uytfanghe K, Stove
V, Fiers T, Thienpont LM. Pilot study for the
standardization of insulin immunoassays with
isotope dilution liquid chromatography/tandem
mass spectrometry. (Estudio piloto para la estandarización de los inmunoanálisis de insulina con
cromatografı́a de lı́quidos y espectrometrı́a de
masas en tándem de dilución isotópica). Clin
Chem 2007;53:1462–9.
14. Van Uytfanghe K, Rodriguez-Cabaleiro D, Stockl
D, Thienpont LM. New liquid chromatography/
electrospray ionisation tandem mass spectrometry measurement procedure for quantitative
analysis of human insulin in serum. (Nuevo procedimiento de medición mediante cromatografı́a
de lı́quidos/ionización por electronebulización y
espectometrı́a de masas en tándem para el análisis cuantitativo de la insulina humana en suero). Rapid Commun Mass Spectrom 2007;21:
819 –21.
15. Hess C, Thomas A, Thevis M, Stratmann B,
Quester W, Tschoepe D y cols. Simultaneous determination and validated quantification of human insulin and its synthetic analogues in human
blood serum by immunoaffinity purification and
liquid chromatography-mass spectrometry. (Determinación simultánea y cuantificación validada
de la insulina humana y sus análogos sintéticos
en suero de sangre humana mediante purifi-
Clinical Chemistry 59:9 (2013) 1357
cación por inmunoafinidad y cromatografı́a de
lı́quidos y espectrometrı́a de masas). Anal Bioanal
Chem 2012;404:1813–22.
16. Thevis M, Thomas A, Schanzer W. Mass spectrometric determination of insulins and their degradation products in sports drug testing. (Determinación de espectometrı́a de masas de insulinas y
sus productos de degradación en pruebas de
antidopaje deportivas). Mass Spectrom Rev 2008;
27:35–50.
17. Thieme D, Hemmersbach P, Thevis M, Thomas A,
1358 Clinical Chemistry 59:9 (2013)
Schanzer W. Insulin. (Insulina). En: Thieme D,
Hemmersbach P, ed. Handbook of experimental
pharmacology. (Manual de farmacologı́a experimental). Berlı́n: Springer-Verlag; 2010. p 209 –26.
Vol. 195.
18. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman
DJ. Basic local alignment search tool. (Herramienta de búsqueda de alineación local básica).
J Mol Biol 1990;215:403–10.
19. Miller WG, Thienpont LM, Van Uytfanghe K, Clark
PM, Lindstedt P, Nilsson G y cols. Toward stan-
dardization of insulin immunoassays. (Hacia la
estandarización de los inmunoanálisis de insulina). Clin Chem 2009;55:1011– 8.
20. Marcovina S, Bowsher RR, Miller WG, Staten M,
Myers G, Caudill SP y cols. Standardization of
insulin immunoassays: report of the American
Diabetes Association Workgroup. (Estandarización de los inmunoanálisis de insulina: informe del grupo de trabajo de la Asociación
Americana de la Diabetes). Clin Chem 2007;53:
711– 6.