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Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) I. Objetivos Producir la hidrólisis de la urea por medio de la enzima amidohidrolosa denominada ureasa. Cuantificar la actividad ureásica (AU) en muestras de origen biológico , mediante la técnica volumétrica de Berthelot II. Conceptos Previos ¿Oué significan los siguientes términos: Biocatalizador; proteína; Enzima; Cinética química; Velocidad de reacción; ureasa ; actividad ureásica ; Energía de activación; Sustrato; Hidrólisis; Incubación; pH; Solución buffer; Tilulación; lnhibidores enzimáticos? III.Fundamento Teórico La ureasa es una enzima amidohidrolosa de peso molecular: 480.kD, punto isoeléctrico: 5.0 y pH óptimo entre 6 y 7, cataliza la hidrólisis de la urea produciendo gas carbónico, hidróxido de amonio, seqún la reacción Ureasa H2 N-CO-NH2 + 3H 2 O 2NH 4 OH + CO 2 pH=7.0 ; T=37°C En presencia de una solución buffer de_fosfatos con pH = 7.0 y a una temperatura de incubación de 25°C, la ureasa presenta una constante de Michaelis de 10,5 mmol/L. Los principales inhibidores de su actividad enzimática son los iones metálicos pesados tales corno la plata (Ag+1) el mercurio (Hg+2) e igualmente el ácido hidroxámico y la tiourea Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) La ureasa , se encuentra en varios tejidos vegetales como en el haba de soya, lo cual implica que pueda ser usada en análisis de alimentos para determinar urea, ya sea por el método de Kjeldhal o por titulación del amonio liberado. De esta forma, al titular el hidróxido de amonio producido por la hidrólisis, se puede calcular la cantidad de urea hidrolizada, utilizando el método estequiométrico, puesto que se producen 2 moles de NH4OH por cada mol de urea desdoblada. Por lo tanto, esta reacción puede utilizarse con éxito en la determinación de urea en sangre, orina, suelos y otros materiales orgánicos. IV.Metodología 1. Lista de Materiales:Tubos de ensayo con gradilla, pinzas para bureta, erlenmeyer de 125mL , pipetas de 5 y 10mL, matraz aforado de 100mL , baño termostatado , beaker de 400mL ,bureta de 25mL , soporte universal. 2. Lista de Reactivos:Ureasa al 0,1 % en buffer fosfato de pH = 7.0, Urea 0,25M , HgCl2 al 1% , HCl 0,1N , indicador de Tashiro Procedimiento 1. EXTRACCIÓN Y SOLUBILIZACIÓN DE UREASA EN HARINAS , SUELOS Ó FORRAJE (MÉTODO “SALTING OUT”) Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) 1,0 g de Harina , forraje ó suelo 10 mL de NaCl 1% Centrifugar 3500 rpm t= 5 min Agitar 3 minutos Tubo de centrífuga Se obtiene mL NaCl hasta 25 mL Fase líquida medir Agitar 30 seg ROTULAR Sobrenadante sobrenadante V medir s V ss ss Precipitado Fase sólida probeta Se descarta EHAU Indica EXTRACTO DE HARINA PARA ACTIVIDAD UREÁSICA En el caso de suelo , se rotula :ESAU:Extracto de suelo para actividad ureásica y para forraje :EFAU:Extracto de forraje para actividad ureásica 2 .CUANTIFICACIÓN DE LA AU. 2.1 Mezcla de reactivos Reactivos(mL) / Tubos B St 1 2 3 4 Urea 0,25M 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Buffer fosfatos pH=7,0 5,0 4,5 4,5 4,5 4,5 4,0 HgCl2 (Gotas)* 4 - - - - - Ureasa 0,5% - 0,5 - - - - Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) EHAU (mL) - - 0,5 - - - ESAU(mL) - - - 0,5 - 1,0 :EFAU(mL) - - - - 0,5 - Agitar los tubos (10 seg) ,dejar en baño de maría a 37°C, durante 20 min, al final adicionar: HgCl2 (Gotas) - 4 4 4 4 Agitar vigorosamente los tubos(10seg) ,adicionar 2 gotas de indicador de Tashiro y volver a mezclar(15 seg). Un color azul- verdoso indicará prueba positiva para la actividad ureásica(AU) en las muestras ; posteriormente, sacar el blanco y depositar la solución en un erlenmeyer ó vaso de precipitado. 2.2 Titulación Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) Alistar el montaje de titulación: lavar, purgar ,cargar y enrasar la bureta con HCl 0,1N Colocar el erlenmeyer que contiene la solución blanco, debajo la bureta y adicionar lentamente el HCl, hasta que aparezca y permanezaca un color rosado-violáceo. Esto indica que los equivalentes-gramo del hidróxido de amonio fueron neutralizados por los equivalentes-gramo del ácido clorhídrico. Registrar en su tabla de datos, los mL de HCl gastados en la titulación del blanco. Repetir el procedimiento anterior, con el tubo St y anotar los mL empleados de HCl Continuar el proceso con los tubos 1, 2, 3 y 4 ; registrar los mL gastados de HCl en la tabla de datos. 2.3 Tabla de Datos Tabla 1.Volúmenes de HCl 0,1N,empleados en la titulación del NH4OH Tubos B St 1 2 3 Tipo de Muestra mL gastados de HCl 0,1N Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) 4 3.Cálculos 3.1 Actividad Ureásica en el tubo estándar AU= 3.2. Actividad Ureásica de la harina AU= Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU) 3.3 Actividad Ureásica en el suelo (tubo 2) AU= 3.4 Actividad Ureásica del forraje AU= 3.5 Actividad Ureásica en el suelo (tubo 4) AU= Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM Prof: Jairo Granados.,MSc DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD UREÁSICA (AU)
