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Crecimiento y Cultivo Vegetal
Biorreactores
La explotación del cultivo de células vegetales como un proceso biotecnológico para
la producción comercial de compuestos de interés es uno de los objetivos de esta época. Los
primeros en discutir el uso de cultivos de células vegetales para la producción de compuestos
que generalmente se extraen de plantas fueron Routier y Nickell en 1956.
Teniendo en cuenta que este tipo de cultivos ha demostrado ser capaz de producir un
amplio rango de fitoquímicos, en particular fármacos y de la estimación de Farnsworth y
Morris (1976) que cerca del 25% de la prescripciones médicas en EEUU contenían
ingredientes bioactivos provenientes de plantas, es que este tipo de procesos ha sido
considerado como una alternativa importante para la producción de algunos compuestos.
Los cultivos de células vegetales a gran escala tuvieron sus comienzos en 1959 con
Tulecke y Nickell, los que iniciaron un gran número de líneas celulares en frascos agitados y
fue en 1965 con Bryme y Koch que se puso en funcionamiento los primeros biorreactores
comerciales de 7,5 y 15 litros, utilizando células de Daucus carota.
En la década de los 70, se mostró gran interés en el cultivo de células de tabaco así
como de Glycine max, las que llegaron a cultivarse en tanque agitados de 300 litros. En esta
misma época (1972) Mandels reconoció que las células vegetales eran más sensibles al
esfuerzo de corte que los microorganismos y Dalton en 1978 sugirió que el problema
encontrado en la utilización de tanques agitados podía tener su origen en esta sensibilidad, por
lo que diseñó un reactor de bajo esfuerzo de corte denominado “air lift”.
En la actualidad se encuentran desarrollados a escala industrial de producción los
procesos para obtención de Shikonina (colorante) por cultivo de células de Lithospermun
erythrohizon, puesto a punto por la Industrias Petroquímicas Mitsui, así como la producción
de berberina y biomasa de ginseng en otras industrias.
Los procesos industriales requieren de tres puntos fundamentales:
• Crecimiento eficiente en grandes volúmenes.
• Acumulación de metabolitos secundarios en el cultivo.
• Si el proceso implica bioconversión o producción de enzimas, que esto ocurra en las
condiciones de operación del proceso.
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Para el control de estos puntos es necesario ajustar algunos parámetros tales como,
tensión de oxígeno, dióxido de carbono, pH, agitación, mezclado y densidad del cultivo entre
otros.
Es importante tener en cuenta que si bien en varios aspectos las suspensiones celulares
vegetales pueden ser tratadas de la misma manera que los cultivos microbianos, existen
características particulares de estos cultivos que pueden afectar su crecimiento en
biorreactores, esto puede verse claramente en el cuadro siguiente:
Características
Tamaño
células
células vegetales
microbianas
dediferenciadas
2-10 µm
10-200 µm
consecuencias en el biorreactor
Rápida sedimentación, mayor
sensibilidad al corte
Células
pueden obtenerse
forman agregados
Rápida sedimentación
Velocidad de
Alta
Baja
Largos procesos, problemas
crecimiento
td 1-2 horas
td 2-5 días
para mantener esterilidad
Densidad del
pequeño
5-20 %
Problemas de manipuleo.
individuales
inóculo
Dificulta la posibilidad de
escalado
Sensibilidad al
no sensitivo
sensitivo/tolerancia
esfuerzo de corte
Aireación
Disminución de la velocidad
de agitación
alta
baja
Baja demanda de oxígeno,
bajo KLa
•
Tamaño celular: las células vegetales en su ciclo de crecimiento en principio son
pequeñas y redondeadas, con denso citoplasma y pequeña vacuola, sin embargo a medida que
crecen, se alargan y el tamaño de la vacuola aumenta hasta llegar a ocupar casi un 90 % del
volumen total de la célula. Durante este crecimiento, se producen polisacáridos extracelulares
que pueden ser los causantes de la formación de agregados.
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El tamaño y frecuencia de formación de agregados, puede encontrarse afectado por
constituyentes del medio o por la aireación. Los mismos pueden minimizarse por el agregado
de pectinasas, mediante la reducción de la concentración de calcio en el medio de cultivo, o
bien por métodos mecánicos como es la mayor velocidad de agitación.
Uno de los inconvenientes que pueden presentar los agregados de gran tamaño es la
generación de gradientes de nutrientes a través de los mismos, lo que trae aparejado una
disminución de oxígeno y glucosa, sin embargo esto puede resultar beneficioso en algunos
casos de producción de metabolitos secundarios en los que la misma aumente con la
formación de agregados.
•
Velocidad de crecimiento y densidad del inóculo: este es uno de los puntos críticos para
el trabajo en biorreactores. Se requiere de gran atención en el mantenimiento de la
esterilidad en el reactor y vasos accesorios que contienen medio de cultivo, muestras a
inocular y tamaño de muestreo en el proceso. En algunos casos es posible llegar a
diminuir el tiempo de proceso y aumentar la producción si se determina el tamaño de
inóculo adecuado, pero debe tenerse en cuenta que algunos metabolitos son acumulados
en la fase final de crecimiento, por lo que la disminución de tiempo de proceso se
encuentra sumamente limitada. El tamaño del inóculo generalmente debe ser de al menos
un 10%, este hecho es crítico ya que disminuye la posibilidad de escalado, por lo que se
trata de minimizarlo hasta su límite inferior o en algunos casos se recurre a la utilización
de medios condicionados que favorecen al proceso.
•
Producción de espuma: El cultivo de células vegetales en biorreactores y en particular en
los denominados air lift, está acompañado casi habitualmente de la formación de espuma
que constituye una costra que se denomina "merengue" en la parte superior del reactor,
este merengue puede cubrir la superficie del cultivo y afectar la circulación, entrampar
células o agregados celulares que quedan imposibilitados de acceder al fuente nutricia y
de oxigenación e imposibilitar las operaciones de muestreo. Esta espuma esta constituida
de polisacáridos y proteínas formando una red. La manera de controlarlo es mediante el
agregado de antiespumantes como las siliconas o el propilenglicol, pero es necesario
evaluar el efecto de ellos sobre el desarrollo del cultivo.
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Configuración de Biorreactores
Existen varias configuraciones básicas de biorreactores que pueden ser utilizadas en
cultivos de suspensiones aeróbicas, pero la elección de la óptima para un sistema depende de
varios factores. Entre
ellos presentan gran importancia la transferencia de oxígeno, el
mezclado y el esfuerzo de corte. Consecuentemente el diseño de un biorreactor involucra un
balance para lograr satisfacerlos en su conjunto. En el caso de suspensiones celulares es
necesario un buen mezclado, generalmente se requiere un bajo esfuerzo de corte y un
moderado suministro de oxígeno.
Dentro de los diseños básicos de biorreactores para múltiples propósitos encontramos:
• Tanque agitado
• Columna de burbujas
• Air lift
aire
aire
Tanque agitado
Columna de
burbujas
aire
air lift
Diseños básicos de reactores
Factores que afectan al diseño de reactores
•
Aireación o transferencia de oxígeno: La baja velocidad metabólica de los cultivos de
células vegetales conduce a bajos requerimientos de oxígeno. Estos están en el orden de
1-10 mmol.h-1l-1, mientras que para microorganismos oscilan entre 5-200 mmol.h-1 l-1.
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El oxígeno es un nutriente poco soluble, lo que lo transforma en un sustrato limitante
para el crecimiento. Por lo general se trata de satisfacer el necesario suministro del mismo
conjuntamente con la
agitación necesaria para homogeneizar un cultivo. La medida de
transferencia de oxigeno es el Kla (coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno) que
puede ser calculado a partir de la ecuación que describe la concentración de oxigeno disuelto
dCL/dt = K La (C* - CL)
de donde se llega a que:
ln (C* - CL ) = KLa . t
Donde:
CL es la concentración de oxigeno disuelto en el medio de cultivo (mmol. l-1)
C* es la concentración de saturación de oxígeno (mmol. l-1)
KL es el coeficiente de transferencia de masa (cm/ tiempo)
a es el área de la interfase gas/líquido por volumen de líquido ( cm2/volumen)
dCL / dt es la variación de la concentración de oxígeno en el tiempo (mmoles.l-1.hora-1)
El valor de KLa se encuentra afectado por diferentes factores entre los que se cuentan,
la velocidad del flujo de aire, el grado de agitación, las propiedades reológicas de un cultivo y
los antiespumantes.
La agitación asiste a la transferencia de oxígeno en los siguientes aspectos:
• Aumenta el área de transferencia de oxígeno por la formación de pequeñas burbujas.
• Retarda el escape de burbujas desde el líquido.
• Previene la coalescencia de las burbujas de aire.
• Disminuye el grosor de la interface gas/líquido al crear un flujo turbulento.
• Efecto de corte: En biorreactores del tipo tanque agitados, se ha encontrado como
inconveniente la sensibilidad de muchos cultivos de células vegetales al esfuerzo de corte,
que tiene su origen en el gran tamaño de las células o agregados celulares, la rigidez de la
pared celular y la gran vacuola que las mismas poseen.
Este esfuerzo o estrés de corte generado por las paletas de agitación en un tanque
agitado puede resultar en inconvenientes que afectan el crecimiento de las suspensiones
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celulares vegetales. Por ello se utilizan con gran frecuencia reactores "air lift" que presentan
un bajo estrés de corte y actualmente se están desarrollando para procesos a gran escala.
La sensibilidad al esfuerzo de corte se mide en función de la viabilidad celular, para lo
que se utilizan las técnicas descriptas con anterioridad para cultivos sumergidos en batch y
células inmovilizadas.
• El Mezclado: En los biorreactores tanque agitado el mezclado presenta un efecto dual,
diseminar las burbujas de aire y homogeneizar el cultivo, siendo el segundo el de mayor
importancia dados los bajos requerimientos de oxígeno
y la necesidad de que no se
generen marcados gradientes en el seno de un reactor.
El mezclado se encuentra afectado por dos puntos fundamentales, la viscosidad del
cultivo y la sensibilidad al esfuerzo de corte.
Cuando los cultivos presentan una alta densidad celular, es necesaria una elevada
velocidad de las paletas de agitación o de un gran caudal de aireación, para suplir las
necesidades de mezclado y oxígeno, pero esto trae como consecuencia un elevado daño
celular si la especie es sensible al esfuerzo de corte. De esto deriva que ningún tanque
agitado o air lift es completamente satisfactorio en cuanto a mezclado de suspensiones de alta
densidad.
Para disminuir los inconvenientes referidos a este punto se han diseñado una serie de
impellers o paletas de agitación entre los que
encontramos anclas, espirales, células
ascendentes y paletas planas.
ancla
espiral
paletas planas
celulas ascendente
Diferentes diseños de impellers
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Sin embargo, a pesar de la aparición de estos nuevos diseños de impellers, no siempre
es posible minimizar los inconvenientes provocados por los mismos, por lo que se han
desarrollado diseños alternativos de air-lift y tanques agitados para cultivos celulares
vegetales en pos de optimizar las condiciones de bajo esfuerzo de corte y un adecuado
mezclado. Entre esto puede ser citado el biorreactor tambor agitado, diseñado por Tanaka y
col. en 1983, que resulto mucho mas efectivo que el tanque agitado para la producción de
shikonina.
Biorreactores para cultivos de tejidos organizados y células inmovilizadas.
•
Cultivo de órganos: Los cultivos de estructuras como raíces, vástagos o embriones son
más susceptibles a sufrir daños cuando son cultivados en biorreactores debido a su
tamaño. Si bien no hay numerosas experiencias reportadas es evidente que este tipo de
órganos es sensible al efecto de corte. Los biorreactores diseñados para estos fines son los
denominados spin filter y mist system. En ambos diseños es posible reemplazar el medio
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sin remover las estructuras organizadas.
•
Cultivo de raíces: Los cultivos de raíces se comportan muchas veces como estructuras
miceliares. Las raíces largas suelen ser sensibles a ser seccionadas por los impellers y si
estos cortes son muy frecuentes pueden revertir en la formación de callos. Existen diseños
específicos que mantienen el desarrollo de raíces en cabellera separado del sistema de
agitación como mallas de acero inoxidable o espumas de poliuretano. Como en el caso de
cultivo de órganos es prácticamente imposible realizar muestreos representativos por lo
que los parámetros de desarrollo se toman en forma indirecta.
•
Cultivo de células inmovilizadas: La inmovilización
celular es una estrategia ideal para
permitir la
realización de sistemas de operación continua. Aquí la
biomasa permanece naturalmente separada del medio de
cultivo, su vida útil se extiende por períodos
prolongados y esta protegida de los esfuerzos de corte.
El método más utilizado son las perlas de alginato que
pueden aplicarse a reactores que funcionen en forma
empaquetada o fluidificada. También hay diseños de
reactores que permiten trabajar con células entrampadas
en poliuretano tanto en forma tubular como fluida si las
láminas de material inerte son contadas en pequeños
cubos.
Operación de Biorreactores
Para que un proceso de producción resulte económicamente rentable es necesario que
presente una alta productividad, o sea un alto rendimiento y concentración de producto. La
productividad esta determinada por el tamaño del biorreactor y la acumulación del producto
determina la manera de operar el mismo.
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Los procesos pueden ser simples o en dos etapas. Si el producto de interés es un
metabolito que se obtiene una vez culminada la fase de crecimiento exponencial, resulta más
ventajoso trabajar con en dos etapas.
Los bioreactores pueden ser operados de diferentes maneras de acuerdo al tipo de
cultivo o condiciones necesarias para la producción. Dentro de las formas de operar los
biorreactores se tienen batch, batch alimentado, draw-fill y continuo.
• Batch: El caso más común los frascos agitados. Son sistemas cerrados que se
caracterizan por cambiar las condiciones fisiológicas y ambientales. No hay entrada ni
salida de medio de cultivo.
• Batch alimentado: Estos sistemas operan adicionando medio fresco, pero sin remoción
del existente. Son muy útiles cuando se requiere una elevada densidad celular en la
etapa de iniciación del proceso que implica un alto consumo de nutrientes,
especialmente de fuente hidrocarbonada que suele funcionar como sustrato limitante.
• Draw-fill o semicontínuo: Consiste en remover, al final de la operación entre un 80 y
un 90 % del cultivo y reemplazarlo por medio fresco. De esta manera puede eliminarse
el período lag, satisfacerse sencillamente la necesidad de contar con inóculos de gran
tamaño y a su vez evitar la esterilización del reactor entre dos ciclos.
• Continuo: Son sistemas donde el caudal de entrada de medio fresco es igual al de salida
de medio utilizado. Son utilizados en cultivos donde la velocidad de crecimiento celular
es constante por lo que existe un suministro constante de nutrientes o para la remoción
permanente de producto sobre todo en sistemas inmovilizados. Este tipo de operación
presenta grandes inconvenientes con respecto al mantenimiento de las condiciones de
asepsia del proceso, y se dificulta debido a la tendencia a formar agregados de las
células vegetales en cultivo, la formación de merengue y el lento crecimiento celular.
Para su buena aplicación se requiere del diseño de sistemas que permitan suplementar
continuamente el medio de cultivo evitando la remoción de las células y así minimizar
lo que se denomina lavado del cultivo. Un buen sistema es el de Perfusión que implica
la remoción y suministro de medio dejando la biomasa ocluida en una malla.
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