Rev. Mex. Fis. S 50(1) - Revista Mexicana de Física

REVISTA MEXICANA DE FÍSICA 50 SUPLEMENTO 1, 75–79
JUNIO 2004
Focalización automática en microscopı́a óptica a través de
métodos de geometrı́a fractal
D. Calva Méndez, F. Manzano Licona y M. Lehman
Software Integral para Laboratorio (SOFILAB) S.A. de C.V.,
Lisboa 14-A, Col. Juárez, México D.F., 06600 México
e-mail: [email protected]
Recibido el 27 de marzo de 2003; aceptado el 24 de noviembre de 2003
Se estudia la relación entre la dimensión fractal de imágenes obtenidas por videomicroscopı́a y la correspondiente focalización de la muestra.
Este punto de vista es novedoso, pero tiene una ı́ntima relación con otros métodos ya implementados. Se consideran diferentes casos:
1) imágenes 2D de muestras biológicas y superficies metálicas; 2) imágenes 3D con focalización en diferentes planos.
Descriptores: Microscopı́a óptica; focalización automática; dimensión fractal.
The relationship between the fractal dimension of images obtained by video-microscopy and the corresponding focalization of the sample
is studied. This point of view is novel, but it has an intimate relationship with other implemented methods. Different cases are considered:
1) 2D images of biological and metallic surfaces samples; 2) 3D images with focalization at different planes.
Keywords: Optical microscopy; automatic focusing; fractal dimension.
PACS: 42.30.Va; 5.45.Df; 07.60.Pb
1.
Introducción
Existen algunos métodos interesantes para focalización
automática de imágenes de una muestra que pueden emplearse en microscopı́a óptica. Algunos ejemplos utilizan la entropı́a [1,2], la visibilidad local [3], el análisis estructural [4]
o la distribución de energı́a de la imagen [5]. En este último
caso se resaltan los bordes de la estructura que se visualiza. Algunos de estos resultados pueden extenderse para ser
utilizados en microscopı́a 3D, por ejemplo, en el caso de algoritmos para calcular profundidad de foco [6,7].
Por otra parte, los métodos de análisis fractal de imágenes
demuestran una gran potencialidad, salvo que pueden emplearse realmente en un cierto intervalo definido por la distancia entre los elementos básicos de la imagen y el tamaño
de las estructuras componentes (en número de tales pixels).
Además, dicho análisis fractal se aplica fundamentalmente a
estructuras complejas, las cuales pueden describirse mediante métodos matemáticos rigurosos [8] o a través del producto
de componentes más simples como son las funciones periódicas [9]. Sin embargo, se pueden encontrar aplicaciones interesantes en la ciencia de los materiales y biomedicina, que
emplean el formalismo fractal para la interpretación de algunos fenómenos [10,11], por lo cual el análisis de imágenes
mediante el uso de tales geometrı́as representa una interesante aplicación en estos campos de la ciencia y la tecnologı́a.
En el presente trabajo analizamos la relación que existe
entre la dimensión fractal, calculada a través del método de
“box-counting”, y la posición de focalización en imágenes de
estructuras complejas observadas en microscopı́a óptica. Los
resultados obtenidos son muy promisorios para el empleo de
este parámetro en la focalización de la muestra para un equipo de microscopı́a automatizado [12]. Se puede verificar, con
algunos ejemplos, la variación de las magnitudes involucradas y el error relativo de la medida para diferentes posiciones.
2.
Fundamentos teóricos
La posibilidad de tratar como fractales algunos tipos de
muestras en biologı́a y en ciencia de materiales, depende fundamentalmente del tipo de aproximación que queramos hacer
a los hechos reales. En las imágenes que presentamos aquı́ se
muestran estructuras muy irregulares que pueden representarse mucho mejor a través del tipo de geometrı́a fractal. Como
fundamento teórico empleamos la función entropı́a, que ya ha
sido utilizada en diversas aplicaciones ópticas [13-16], y que
nos permitirá deducir la posición de focalización para un sistema óptico. Como ejemplo de aplicación consideramos las
imágenes capturadas por un microscopio óptico automatizado [12] y verificamos los resultados generales con algunos
ejemplos.
2.1.
Focalización de un sistema óptico
En este trabajo partimos de la maximización de la entropı́a de
Shannon, como base teórica que permite establecer un criterio para la focalización de un sistema óptico [2]. Dividimos
la imagen, que se obtiene a la salida de tal sistema óptico, en
N 1 × N 2 celdas de información (siendo N 1, N 2 ≥ 1 pixel),
las cuales están centradas en el punto (xi , yj ). Como se expone en en la Ref. 2, la entropı́a total se maximiza en un punto
a lo largo del eje de propagación z, esto es
dS(z)dz = 0,
S(z) =
siendo
N1 X
N2
X
IN (xi , yj ; z) log IN (xi , yj ; z), (1)
i=1 j=1
donde IN (xi , yj ; z) es la intensidad de la imagen en cada celda, normalizada con la intensidad total de la imagen. Entonces, debido a la conservación de la energı́a total (o intensidad
76
D. CALVA MÉNDEZ, F. MANZANO LICONA Y M. LEHMAN
total) de la imagen y por ser IN (xi , yj ; z) una función definida positiva, se llega finalmente a la condición


N2
N1 X
X
ddz 
IN (xi , yj ; z) = 0
i=1 j=1
⇒ dIn (xi , yj ; z)dz = 0. (2)
Esto significa claramente que, una condición general como la expresada en la Ec. (1) se transforma en una condición local como se muestra en la segunda igualdad de (2).
Si definimos ahora las componentes de frecuencia espacial
f = (µ, ξ) se tiene que
µ=xi λz, ξ=yj λz ⇒ ddz≡df dz ddf f =(µ, ξ),
(3)
entonces, la Ec. (2) se convierte en
dIN (xi , yj ; z)dz = dIN (f )df |xi ,yj = 0.
(4)
Éste es el criterio de focalización, como aquı́ lo utilizaremos,
para cada celda de la imagen centrada en la posición (xi , yj ).
Por otra parte, para poder hacer el tratamiento en el cual estamos interesados, consideramos en primer lugar el caso general de un sistema óptico, como el mostrado en la Fig. 1,
que sirve para tomar una imagen de una muestra M . Una
expresión sencilla que se puede obtener por simples consideraciones geométricas [17] para el diámetro de la porción de
imagen defocalizada es
d=
∆
,
F
F =
Z
,
D
(5)
siendo F el f-número del sistema, Z la distancia focal de la
lente y d el campo de vista. Este resultado también queda
justificado a partir del criterio de entropı́a máxima [2]. En la
Fig. 1, P representa el plano focal, es decir la posición donde
la muestra estarı́a correctamente focalizada.
La Ec. (4) es una condición local, que se cumple para cada celda de la imagen. Esto significa que se podrı́an considerar porciones de la imagen a través de las celdas que contienen a la estructura que se desea focalizar. El número de celdas
que contienen la estructura focalizada (o que se desea focalizar) será notado con N (f , δ) (donde δ es el tamaño de cada
celda) y con IE (k; f ) se denominará la intensidad total normalizada contenida en la celda k. La condición (4) también
se puede escribir (para porciones de la estructura completa)
como

 ¯
¯
N (f ,δ)
X
¯


d
IE (k; f ) df ¯¯
= 0,
¯
k=1
xi ,yj
con el caso particular:
IE (k; f ) = 1 ⇒ dN (f )df = 0, (6)
para un ciero tamaño de celda (δ) fijo. Entonces, cuando las
intensidades correspondientes a la porción de estructura focalizada tomen valores discretos mediante una binarización
F IGURA 1. Defocalización en un sistema óptico.
a valores 0 y 1, la condición de extremal se cumple para el
número de celdas que cubren la porción de imagen focalizada.
2.2.
Estructuras fractales
Un conjunto fractal puede ser definido como [18]:
1) aquel para el cual la dimensión de HausdorffBesicovich excede estrictamente a la dimensión topológica;
2) una forma que, de alguna manera, está constituı́da por
partes similares al todo.
Aquı́ utilizamos la dimensión fractal aplicada a diferentes casos de enfoque, relacionada con cada canal de color (rojo,
azul y verde) [19], para mostrar el comportamiento de la dimensión de box-counting en diferentes casos [20]. De todas
maneras, este método puede ser generalizado para cualquier
tipo de estructura, sea fractal o no.
A partir de la definición de dimensión generalizada introducida en las Refs. 21 y 22, dada mediante
"
#
NP
(f ,δ)
q
log
[Pk ]
Dg = 1q − 1 lı́m
δ→0
k=1
log(δ)
,
(7)
donde δ es el tamaño (o lado, variable) de una celda cuadrada
(o caja, para el método de box-counting) y Pk es una función
de medida de probabilidad sobre las cajas o celdas cuadradas en que se dividió la imagen. Esta ecuación tiene que ver
con el tipo de definiciones de dimensión fractal utilizada en
Ref. 8, donde se emplean conjuntos o funciones de medida.
En este caso la probabilidad es una función de medida, y es
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FOCALIZACIÓN AUTOMÁTICA EN MICROSCOPÍA ÓPTICA A TRAVÉS DE MÉTODOS DE GEOMETRÍA FRACTAL
válida una definición del tipo dado en la Ec. (7) para la intensidad normalizada, la cual es también una función de medida.
Entonces,
Pk = IE (k; z),
N (f ,δ)
IT (f )=
X
[IE (k; z)]q ⇒ IT (f )=δ (q−1) DS (f ) ,
(8)
k=1
siendo IT (f ) la intensidad total de la estructura focalizada (contenida en las N (f , δ) celdas).
3.
Resultados obtenidos
El criterio generalmente aceptado para determinar el grado
de focalización de un sistema es la energı́a relativa contenida
en la imagen como función de la frecuencia espacial. Cuando
existe defocalización, elementos adyacentes de la imagen se
ven borrosos o promediados juntos, debido a la pérdida de altas frecuencias espaciales. Muchos detalles no se ven claros
y las irregularidades aparecen con menores variaciones.
Para nuestro caso, el método de box-counting [17,21] relaciona los niveles de intensidad en cada celda de la imagen
con el tamaño de las celdas consideradas. Estos niveles de
intensidad IT (f ) son tomados en tonos de grises (o binarizados), ya que si la imagen es color se convierte a tonos de
grises, o bien se analiza para cada canal, como ya la adelantamos. Entonces, para el caso de box-counting, con q = 0, se
deduce a partir de la Eq. (8) que:
IT (f ) = N (f )
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la imagen original con los casos de una imagen desenfocada
y otra movida. Utilizamos la definición de dimensión fractal, calculada para un cierto tamaño de caja δ (variable). En
este caso, la dimensión fractal depende de las frecuencias espaciales, tal como se puede ver en la Ec. (8), y su derivada
está dada por
¯
¯
1
1
dIT (f ) ¯¯
dDb (f ) ¯¯
=−
, (10)
df ¯xi ,yj
ln 10 IT (f ) log(δ) df ¯xi ,yj
donde ahora no se ha tenido en cuenta el lı́mite (9) debido a
la resolución finita de la imagen [22]. De las Ecs. (9) y (10)
se obtiene que habrá un valor máximo cuando se dan las siguientes condiciones:
¯
dIT (f ) ¯¯
=0,
df ¯xi ,yj
¯
¯
dN (f , δ) ¯¯
dDb (f ) ¯¯
=0 ⇒
=0. (11)
¯
df
df ¯xi ,yj
xi ,yj
En los resultados obtenidos, de aplicación a ejemplos
concretos, podremos observar claramente que la dimensión
fractal tiene un valor máximo cuando existe enfoque. A partir de los puntos obtenidos en la gráfica log(δ)− log N (f , δ),
donde se cuentan el número de celdas (o cajas) para diferentes valores de δ, se traza la recta por regresión, con lo cual se
obtiene el error ε. La pendiente de esta recta es el valor de
entonces
log N (f , δ)
, (9)
δ→0
log(δ)
dN (f )=δ −Db (f ) ⇒ Db (f )= − lı́m
donde f representa las frecuencias espaciales ópticas, Db (f )
es la dimensión fractal de box-counting y δ es un cierto tamaño de caja. Esta es la ecuación conocida para el método de
box-counting y, teniendo en cuenta el resultado de la Ec. (6),
nos da la idea que en el punto de entropı́a máxima, o punto
de focalización, la dimensión fractal de la imagen también
debe tener un valor máximo. La obtención de la dimensión
fractal de una imagen por el método de box-counting se realiza gráficamente a partir del cálculo de la pendiente de la
recta que se obtiene en el plano log(δ)− log N (f , δ), como
veremos a continuación.
3.1.
Dimension fractal y focalización
Existen algunos trabajos que tratan sobre estudios de dimensión fractal en microscopı́a [9,23,24]. La dimensión fractal
está relacionada con las irregularidades que presenta una estructura, entonces, intuitivamente, se entiende que estas irregularidades aparecen más claras cuando la imagen está focalizada. Es de esperar que, en la posición de focalización, la
dimensión fractal tome un valor máximo. Verificaremos esto para diferentes tipos de imágenes. Para esto comparamos
F IGURA 2. Cálculo de la dimensión fractal y su error, para la imagen de una muestra, en diferentes casos: (a) focalizada, (b) con defocalización gaussiana, (c) con movimiento de la muestra.
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D. CALVA MÉNDEZ, F. MANZANO LICONA Y M. LEHMAN
4.
Conclusiones
En el presente trabajo se desarrolló el fundamento teórico que
nos permite afirmar que, en el punto de focalización de un
F IGURA 3. Aplicaciones del método de box-counting en la imagen (con diferentes niveles de grises) de una superficie metálica
rugosa.
dimensión fractal de la imagen. Por ejemplo, en la Fig. 2 se
analiza el caso de un gran número de leucocitos con una alta
magnificación (400X). Se utiliza la binarización de la imagen para luego determinar la dimensión fractal y se ve la diferencia para los tres casos considerados. El resultado de la
Fig. 2a es para la imagen enfocada, en la Fig. 2b se puede ver
la imagen desenfocada (con diferente posición a lo largo del
eje z del microscopio), y en la Fig. 2c se puede observar un
desenfoque debido a movimiento de la muestra. Los cálculos
de dimensión fractal indican que tiene un valor máximo para
la imagen enfocada, tal como se determinó en la Ec. (11). En
la Fig. 3 se ha aplicado el método al caso de una superficie
metálica (con 40X), calculando la dimensión fractal total para una imagen con niveles de grises. Nuevamente se observa
que el valor de la dimensión fractal es mayor en la posición
de enfoque de la muestra (ver Fig. 3a), si se compara con
el correspondiente valor obtenido en uno de los casos de desenfoque (el cual se muestra en la Fig. 3b). En la Fig. 4 se
estudia la irregularidad sobre una superficie biológica, como
es el caso de una naranja con una magnificación de 40X, y se
ve que existen varios planos de enfoque. Se ha descompuesto el color de la imagen en sus colores básicos (rojo, verde,
azul), midiendo la dimensión fractal para el canal rojo. En la
Fig 4a, el cálculo se desarrolla para toda la imagen y luego
se calcula la dimensión fractal para el sector que se corresponde con la segunda imagen, donde se focaliza otro plano.
Este mismo proceso se repite para la Figs. 4b y 4c. Se observa que en tales sectores la dimensión fractal también toma
un valor mayor cuando hay focalización. Esto significa que
puede calcularse este parámetro a nivel local y obtener igualmente buenos resultados a los fines de diferenciar planos de
focalización. En todos los casos que hemos mostrado se puede verificar también que el error relativo (ε/D) es mı́nimo
para la posición de focalización.
F IGURA 4. Diferentes planos de focalización para las irregularidades de una superficie biológica y cálculo de la dimensión fractal
correspondiente para el color rojo.
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FOCALIZACIÓN AUTOMÁTICA EN MICROSCOPÍA ÓPTICA A TRAVÉS DE MÉTODOS DE GEOMETRÍA FRACTAL
sistema óptico, la dimensión fractal de una imagen tiene un
valor máximo. Se aplica este resultado al cálculo de la dimensión fractal de una imagen obtenida por videomicroscopı́a y la obtención de la correspondiente focalización del
sistema. Se demuestra que, cuando hay enfoque total o local (sobre una parte de la imagen), existe un máximo en el
correspondiente valor de la dimensión calculada mediante
box-counting. Además, un método basado en geometrı́a fractal engloba, en cierta forma, otros métodos de focalización
mencionados y son, en alguna medida, métodos equivalentes.
La ventaja del método presentado aquı́ es que no es necesario calcular toda la energı́a dentro de la imagen, sino dentro
de una o varias cajas de tamaño δ, o efectuando cálculos a
nivel local. Esto brinda la posibilidad de obtener un algoritmo mucho más rápido para enfocar la imagen en un equipo
automatizado para microscopı́a óptica.
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Si bien en el presente trabajo hemos empleado aplicaciones especı́ficas a superficies metálicas y biológicas, se tiene
contemplado en el futuro, y como aplicación adicional, el estudio de profundidad de campo y la posibilidad de extender
los resultados para microscopı́a 3D.
Agradecimientos
Este trabajo se desarrolló con el apoyo de la empresa Software Integral para Laboratorio S. A. de C. V. (México DF,
México) a través del Proyecto de Investigación y Desarrollo
NeuroSofilab (Ref. SOF-971021-I75/2001-1) aprobado por
el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologı́a (CONACyT)
y la Secretarı́a de Hacienda y Crédito Público (México).
1. C. Thum, Opt. Acta 31 (1984) 203.
13. M. A. Porras y R. Medina, Appl. Opt. 34 (1995) 8247.
2. R. Torroba, V. Climent y P. Andrés, Optik 107 (1997) 39.
3. P. Torroba, N. Cap y H. Rabal, J. Mod. Opt. 41 (1994) 111.
14. E. Alberdi, M. Lehman, R. Torroba y M. Garavaglia, Optics
Comm. 175 (2000) 1.
4. C. Dahne y F. Lanzel, Optik 55 (1980) 437.
15. M. Lehman, Optik 107 (1997) 73.
5. L.F. McKeogh, J.P. Sharpe y K.M. Johnson, Meas. Sci. Technol.
6 (1995) 583.
16. F.T.S. Yu, Entropy and Information Optics (Marcel Dekker,
Inc., New York, 2000).
6. A.G. Valdecasas, D. Marshall, J. M. Becerra, Microscopy and
Analysis 56 (2002) 11.
17. M. Born y E. Wolf, Principles of Optics: Electromagnetic
Theory of Propagation, Interference and Diffraction of Light
(Cambridge University Press, Cambridge, 1999).
7. H.S. Wu, J. Barba y J. Gil, J. Microscopy 184 (1996) 133.
8. Y.B. Pesin, Dimension theory in dynamical systems (The University Chicago Press, Chicago, USA, 1997).
9. M. Lehman, Optics Comm. 195 (2001) 11.
10. J.C. Russ, Fractal surfaces (Plenum Press, New York, 1994).
11. G.A. Losa, D. Merlini, T.F. Nonnenmacher y E.R. Weibel, eds.,
Fractals in biology and medicine (Birkhäuser, Basel, Suiza,
1998).
12. A. Landa Quezada, D. Calva Méndez, M. Lehman, Memorias
del XXV Congreso Nacional de Ingenierı́a Biomédica (Monterrey, México, 2002) 92.
18. J. Feder, Fractals (Plenum Press, New York, 1989).
19. M.F. Barnsley y L.P. Hurd, Fractal image compression (AK Peters, Ltd., Wellesley, Massachusetts, USA, 1993).
20. S. Kyriacos, S. Buczkowski, F. Nekka y L. Cartilier, Fractals 2
(1994) 321.
21. P. Grassberger, Phys. Lett. A 97 (1983) 227.
22. J. Theiler, J. Opt. Soc. Am. 7 (1990) 1055.
23. K. Sandau y H. Kurz, J. Microscopy 186 (1997) 164.
24. J.C. Russ, J. Comp. Assisted Microscopy 3 (1991) 127.
Rev. Mex. Fı́s. 50 S1 (2004) 75–79