campilobacteriosis genital bovina

CAPÍTULO 2.3.2.
CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA
RESUMEN
La campilobacteriosis genital bovina es una enfermedad venérea caracterizada por infertilidad,
mortalidad embrionaria temprana y aborto. El agente causal de esta enfermedad de transmisión
sexual es Campylobacter fetus subespecie venerealis. El reservorio natural de esta bacteria es el
prepucio de toros sanos portadores. Campylobacter fetus se divide en dos subespecies: C. fetus
subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus.
La campilobacteriosis genital bovina está causada por C. fetus subes. venerealis, que es una
bacteria con un tropismo pronunciado para el sistema genital del ganado bovino. La transmisión
del agente causal se produce normalmente durante el apareamiento natural, pero la presencia de
C. fetus subes. venerealis en el semen de toros portadores crónicos origina el riesgo de extender
la enfermedad por inseminación artificial. Campylobacter fetus subesp. fetus se puede encontrar
en el tracto intestinal del ganado bovino y de otras especies animales. Su papel patógeno es
comparativamente menor que el de C. fetus subes. venerealis, aunque se aísla con frecuencia de
fetos bovinos abortados, lo que demuestra que esta subespecie tiene importancia clínica en el
ganado. Campylobacter fetus subes. fetus persiste en novillas vírgenes después de la infección
experimental durante al menos varias semanas y hasta 10 o más meses.
La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica a partir de muestras obtenidas de toros, vacas
o fetos abortados. El diagnóstico se lleva a cabo por demostración del microorganismo causante, o
de una respuesta inmune específica contra él. En el caso de los toros, se pueden recoger
muestras de semen o de secreciones del esmegma prepucial. En las vacas, las muestras de
mucus se obtienen por succión, lavado vaginal o mediante el uso de tampones. Se pueden
examinar los órganos internos de los fetos abortados para investigar la presencia de la bacteria
mediante cultivo, y analizar preparaciones en fresco del contenido estomacal para observar al
microorganismo por microscopía de campo oscuro y de contraste de fases.
Identificación del agente: El microorganismo es un bacilo Gram-negativo curvado en forma de
espirilo, de aproximadamente 1,5 µm de largo por 0,5 µm de ancho. Se puede cultivar por
incubación microerófila a 37°C por un mínimo de 3 días. La confirmación del aislamiento y la
diferenciación entre las subespecies de C. fetus se puede llevar a cabo por métodos bioquímicos o
moleculares.
También se puede utilizar inmunofluorescencia para identificar al microorganismo, pero esta
prueba no diferencia entre subespecies.
Se han descrito en la literatura pruebas específicas para C. fetus y para cada una de las dos
subespecies basadas en la reacción en cadena de la polimerasa.
Pruebas serológicas: La aglutinación con mucus vaginal constituyen una prueba útil para
poblaciones, aunque no son adecuadas para identificar animales individuales infectados. Los
animales deben ser seleccionados cuidadosamente para las pruebas, pues en manadas infectadas
se ven algunos animales libres de la infección. Después de la infección, existe una fase adaptativa
antes de que se desarrollen los anticuerpos. Además, las aglutininas tienden a desaparecer con el
estro.
El enzimoinmunoensayo es una prueba más sensible, pero debe utilizarse como prueba
poblacional más bien que para probar individuos.
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Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Una vacuna puede prepararse
con C. fetus subesp. venerealis o con C. fetus subesp. fetus, que comparte antígenos con C. fetus
subesp. venerealis. Esta vacuna se inactiva con formalina y se puede administrar con una
emulsión de aceite como adyuvante.
A. INTRODUCCIÓN
El género Campylobacter (antes incluido en el género Vibrio) (38) comprende muchas especies, de las que C.
fetus, C. sputorum, C. jejuni y C. coli pueden aislarse del ganado bovino. Existen dos subespecies de C. fetus: C.
fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. La que causa la campilobacteriosis genital bovina es C. fetus
subesp. venerealis (14, 42). Se han descrito y designado como C. fetus subesp. venerealis biotipo intermedius,
algunas variantes de C. fetus subesp. venerealis que toleran la glicina (34).
Utilizando los modelos de bandas de las proteínas de células enteras, que aparecen mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (PAGE), no pueden distinguirse las dos subespecies de C. fetus (39). Mediante diferencias
antigénicas, se han descrito varios serotipos de C. fetus (3, 32).
Los estudios de homología de ADN no han podido revelar diferencias importantes entre las subespecies
venerealis y fetus (18). Sin embargo, mediante análisis numérico de los modelos electroforéticos en gel de
campo pulsante (PFGE) ha sido posible la separación de C. fetus en dos subespecies (28). Existe un acuerdo
considerable entre los resultados de la PFGE y la identificación basada en métodos fenotípicos o en la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). El análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción amplificados
(AFLP), recientemente desarrollado, también diferencia entre ambas subespecies (43), como lo hace un ensayo
de PCR de reciente aparición (21). No obstante, según se describe en el trabajo original, por este método de
PCR no se clasifican correctamente en subespecies hasta un 10% de las cepas (21), y esta observación se ha
confirmado en un estudio posterior (43). La diferenciación taxonómica de C. fetus en dos subespecies está
justificada debido a las diferencias clínicas y epidemiológicas entre ellas. Epidemiológicamente, C. fetus subesp.
venerealis es la más importante de las dos debido a su tropismo genital. Campylobacter fetus subesp. fetus se
puede recoger del tracto intestinal del ganado bovino y de otros animales. Su papel patogénico es menor
comparado con el de C. fetus subesp. venerealis, aunque C. fetus subesp. fetus se aísla con frecuencia de fetos
bovinos abortados indicando que esta subespecie tiene relevancia clínica en el ganado. Campylobacter fetus
subesp. fetus persiste en novillas vírgenes después de infección experimental durante al menos varias
semanas y hasta 10 meses o más (25, 29, 35).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Aislamiento e identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica bacteriológicamente mediante el aislamiento de C. fetus en
cultivo o por inmunofluorescencia. El cultivo bacteriológico puede llevarse a cabo directamente a partir de las
muestras, o después del transporte y/o enriquecimiento de las muestras. La utilización de un medio de transporte
es esencial si las muestras no se procesan en el laboratorio en las 6 horas siguientes a la recogida. Para envíos
al laboratorio, si las muestras no están en medio de transporte, deben colocarse en un recipiente con aislamiento
(dentro de un margen de temperatura de 4-18°C) y protegidas de la luz.
a)
Toma de muestras
i)
En el macho: mucus prepucial o secrecciones, y semen
En los toros, el esmegma o mucus prepucial puede obtenerse por raspado (36), por succión (con una
pipeta de Bartlett) (2), o por lavados prepuciales (10). También puede tomarse de una vagina artificial
después de recoger el semen, lavando la vagina artificial con 20-30 ml de solución salina tamponada
con fosfato (PBS).
Para lavados prepuciales, se introducen en el saco prepucial 20-30 ml de PBS estéril de
pH 7,2. Después de un masaje vigoroso de 15-20 segundos, el líquido se recoge en un recipiente
estéril, que se cierra inmediatamente y se envía al laboratorio.
El semen se recoge en condiciones tan asépticas como sea posible. Se transfiere a un tubo que se
cierra inmediatamente. Las muestras de esmegma, obtenidas por raspado o succión, y las de semen,
pueden diluirse con PBS o inocularse directamente en medio de cultivo, de transporte o de
enriquecimiento. Las muestras en medio de transporte se cierran y se envían al laboratorio en un
recipiente con aislamiento (dentro de un margen de temperatura de 4-18°C) y protegidas de la luz
(13).
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ii)
En la hembra: mucus vaginal y cérvicovaginal
Las muestras pueden obtenerse por frotis, succión (con pipeta de Bartlett) o por lavados de la cavidad
vaginal. El uso de un espéculo estéril, preferiblemente desechable, es importante para la obtención de
muestras de buena calidad (37).
Después de lavar la región vulvar, la cavidad vaginal se lava con 20-30 ml de PBS estéril mediante
una jeringa unida a un catéter estéril. El líquido se aspira y se reintroduce cuatro o cinco veces antes
de recogerlo en un recipiente estéril, que se cierra inmediatamente y se envía al laboratorio. También
se puede recoger líquido de lavado de la cavidad vaginal con un tampón de gasa estéril mantenido en
la vagina durante 5-10 minutos después de introducir PBS. Las muestras de mucus vaginal obtenidas
por succión pueden diluirse con PBS, o sembrarse directamente en medio de cultivo, de transporte o
de enriquecimiento.
iii)
Fetos abortados, placentas
Cuando se produce un aborto, las mejores muestras son la placenta, el contenido estomacal, los
pulmones y el hígado del feto. Se extraen bajo condiciones lo más asépticas posibles y se envían al
laboratorio en un contenedor frío y aislado (a 4-8°C).
b)
Transporte de muestras
i)
Medios de transporte y de enriquecimiento
Se dispone de varios medios de transporte y de enriquecimiento, como el de Clark (Australia), Lander
(Inglaterra), medio SBL (Francia) o medios de Foley y de Clark (utilizados en EE.UU.) (16, 20, 24).
Recientemente se ha publicado una comparación de otros medios de transporte y de cultivo (26).
Algunos de los medios de transporte y enriquecimiento mencionados arriba contienen cicloheximida.
Debido a su toxicidad potencial, este agente antifúngico no estará disponible pronto. El aislamiento de
C. fetus subesp. fetus es posible en medios con anfotericina B (1).
•
Medio de Clark
El medio de Clark es un medio excelente, pero su preparación es larga y difícil, lo que limita su uso
rutinario cuando hay que procesar muchas muestras. Contiene suero bovino estéril más 5-fluorouracilo
(300 µg/ml), sulfato de polimixina B (100 UI/ml), verde brillante (50µg/ml), ácido nalidíxico (3 µg/ml) y
cicloheximida (100 µg/ml). La mezcla se distribuye en botellas de 10 ml con tapón de goma y una
tapadera metálica con un hueco central a través del cual se puede insertar una aguja en el tapón. Las
botellas llenas se colocan en un baño de agua a 100°C. Cuando el medio se solidifica se atraviesa el
tapón de goma con una aguja hipodérmica y se reemplaza el aire interior por una mezcla de 5% de
oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 90% de nitrógeno. Este paso se realiza dentro de una jarra para
anaerobios. El medio preparado debe mantenerse durante 1 semana en un refrigerador antes de
usarlo. Su duración es de 3 meses a 4°C.
Se inyecta aproximadamente 1 ml de la muestra problema en el medio empleando una jeringa, con la
aguja atravesando el tapón de goma. La botella se mantiene aproximadamente a 18°C y se envía al
laboratorio. El tiempo de transporte al laboratorio no debe superar las 48 horas.
Cuando la botella llega al laboratorio, se incuba 4 días a 37°C y después se introducen 3 ml de
solución salina normal. Después de agitar vigorosamente el medio se extrae 1 ml de líquido para
pruebas posteriores de aislamiento de Campylobacter en cultivo o por inmunofluoresecencia.
•
Medio de Lander
Se trata de caldo de Mueller-Hinton con 5 g de carbón vegetal bacteriológico/litro, añadido antes de la
esterilización. Cuando se emplea, se añade a cada litro lo siguiente en condiciones estériles: dos
botellas de "suplemento para crecimiento de Campylobacter" (Oxoid), sangre hemolizada de caballo
(70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.00 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprim
(20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg). El medio se distribuye en volúmenes de 10 ml en recipientes de
28 ml. Pueden mantenerse por lo menos durante 2 semanas a 4°C.
Este medio se inocula con muestras problema después de pasar éstas por filtros de 0,65 µm de
tamaño de poro. Después de incubar a 37°C durante 3 días el medio se distribuye en medios de
cultivo y de aislamiento.
•
Medio SBL modificado
El medio SBL, modificado por Clark (9), contiene por cada litro: agar (8 g), tioglicolato sódico (0,5 g),
glicerofosfato sódico (10 g), 1% de cloruro cálcico acuoso (10 ml), hidrocloridrato de cisteína (250 mg)
y solución acuosa de azul de metileno al 0,1% (2 ml). Después de esterilizar en autoclave, el medio se
convierte en selectivo por adición, por cada ml, de polimixina (1 UI), novobiocina (5 µg), bacitracina
(15 unidades), y cicloheximida (20 µg). El medio se distribuye a continuación en condiciones estériles
en tubos anaeróbicos completamente llenos.
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Los frotis de varias muestras se colocan en este medio de transporte y se envían en un recipiente con
aislamiento (a 18-30°C) para que lleguen al laboratorio en 24-48 horas.
c)
Tratamiento de muestras
Cuando llegan al laboratorio, las muestras deben inocularse directamente en medio de cultivo o procesarse
si se requiere (por ejemplo, mediante filtración por membrana para reducir la contaminación).
i)
Muestras del tracto genital
Como el mucus vaginal puede ser muy viscoso, puede ser necesario licuarlo añadiendo un volumen
igual de solución de cisteína (solución acuosa de hidrocloruro de cisteína a 0,25 g/100 ml, pH 7,2,
esterilizada por filtración). A los 15-20 minutos, el mucus diluido y licuado puede inocularse en el
medio de aislamiento. Si el mucus no es muy viscoso, se puede inocular directamente o diluir con el
mismo volumen de PBS, pH 7,2.
Los lavados prepuciales pueden centrifugarse a 3.500 g para concentrar la muestra. La muestra final
(reducida a 250 µl) puede inocularse en el medio de cultivo (directamente o utilizando el método de
filtración).
ii)
Fetos abortados, placentas
El contenido del estómago de fetos se inocula directamente en un medio de cultivo adecuado. Los
órganos internos, o trozos de órganos, se flamean para esterilizar la superficie, y luego se
homogenizan. El homogenado se inocula en medio de cultivo.
Después de lavar las membranas placentarias con solución salina estéril o con PBS estéril para
eliminar la mayoría de la contaminación superficial, se raspan las vellosidades coriónicas y el raspado
se transfiere a los medios de cultivo.
d)
Aislamiento de Campylobacter fetus
i)
Medio de cultivo para aislamiento
Actualmente hay muchos medios en uso para el diagnóstico bacteriológico de la campilobacteriosis
genital bovina (7). La mayor parte de ellos contienen cicloheximida. Debido a su toxicidad potencial,
este agente antifúngico no estará disponible pronto. El aislamiento de C. fetus es posible en medios
con anfotericina B (1).
Los siguientes son ejemplos de medios:
•
Medio Skirrow con cicloheximida
Este medio contiene como agentes selectivos: sulfato de polimixina B (2,5 UI/ml), trimetoprim (5 µg
/ml), vancomicina (10 µg/ml), y cicloheximida (50 µg/ml). Contiene 5-7% de un lisado de sangre
desfibrinada de caballo. Sin embargo, la adición de sangre desfibrinada de oveja al 5-7% da buenos
resultados.
•
Medio selectivo de Clark
Contiene peptona (10 g), cloruro sódico (5 g), extracto de carne (5 g), agar (15 g) y agua destilada
(1000 ml). Disolver los ingredientes en agua, excepto el agar, con agitación si es necesaria. Ajustar el
pH a 7,4-7,6, después añadir el agar y calentar a ebullición. Esterilizar en autoclave (121°C durante
15 minutos). Enfriar a 55°C y añadir 10% de sangre estéril desfibrinada de origen ovino o bovino, y
después bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml), novobiocina (sal sódica) (5 µg/ml) y
cicloheximida (10 µg/ml).
•
Medios no selectivos
Se puede utilizar cualquier medio basado en sangre (agar Columbia, agar sangre base No. 2) como
medio no selectivo suplementado con sangre de oveja o de caballo.
ii)
Inoculación de los medios e incubación
Cada muestra se inocula directamente en un medio selectivo o, después de pasar por un filtro de
tamaño de poro de 0,65µ, en un medio selectivo y/o en un medio base. El material se extiende con un
asa de siembra para facilitar el aislamiento de colonias individualizadas.
Las placas se incuban a 37°C + 1°C. Para el crecimiento óptimo, se requieren atmósferas
microaeróbicas con 5-10% de oxígeno y 5-10% de dióxido de carbono (y preferiblemente 5-9% de
hidrógeno). Las condiciones microaeróbicas de crecimiento se pueden producir por diversos métodos.
En algunos laboratorios se utiliza la evacuación repetida de los gases de la jarra de incubación y su
sustitución por gases envasados. Los equipos generadores de gases están comercializados. Los
incubadores de atmósfera variable son más adecuados si se trata de gran número de cultivos.
Las condiciones de cultivo e incubación se controlan sistemáticamente utilizando cepas control de
C. fetus subesp. fetus y C. fetus subesp. venerealis. Tales controles deben incluirse en cada serie de
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aislamiento. No es necesario incluir más de un control por día a menos que se utilicen diferentes lotes
de medio, en cuyo caso debe probarse cada lote.
iii)
Lectura de los resultados
Normalmente las colonias de C. fetus aparecen después de 2-5 días en los medios recomendados.
El crecimiento puede ser lento, particularmente en presencia de otras bacterias contaminantes en las
muestras. Para evitar que el crecimiento de los contaminantes se superponga a colonias específicas,
se recomienda examinar diariamente el medio y subcultivar las colonias que se sospechan que
corresponden a C. fetus. Después de 3-5 días de incubación, las colonias miden 1-3 mm de diámetro.
Son ligeramente grisáceas-rojizas, redondas, convexas, lisas y brillantes, con un borde regular. Los
cultivos deben incubarse como mínimo 6 días.
e)
f)
Confirmación del microorganismo
i)
Morfología microscópica: Campylobacter fetus es móvil, aunque esta propiedad puede desaparecer
después de subcultivos. A menudo Campylobacter fetus presenta la forma de un bacilo curvado
fino, de 0,3-0,4 µm de ancho y 0,5-8,0 µm de largo. En estado vivo se pueden observar
simultáneamente formas cortas (en forma de coma), medias (en forma de S) y largas (helicoidales con
varias espirales). Las bacterias siempre se presentan aisladas. Los cultivos viejos pueden contener
formas cocoides.
ii)
Pruebas bioquímicas: Campylobacter fetus es oxidasa y catalasa positivo.
iii)
Campylobacter fetus no crece en condiciones aeróbicas.
Identificación de Campylobacter a nivel de especie
Estas pruebas (ver Cuadro 1) deben hacerse con cultivos puros. Idealmente deben realizarse utilizando una
suspensión estandarizada, con una turbidez que no sea superior a la No. 1 de McFarland, o equivalente.
Cuadro 1. Caracteres diferenciales del género Campylobacter
Oxidasa
Catalasa
H2S(a)
25°C
42°C
Glicina 1%
NaCl
3.5%
Cefaloiina
Ácido
nalidíxi-co
C. fetus subesp.
venerealis
+
+
–
+
V(b)
–
–
S
V
C. fetus subesp. fetus
+
+
–
+
V(b)
+
–
S
R
C. jejuni
+
+
–
–
+
+
–
R
V
C. sputorum biotipo
sputorum
+
–
+
–
+
+
V
S
V
C. sputorum biotipo
faecalis
+
+
+
–
+
+
V
S
V
C. sputorum biotipo
paraureolyticus
+
–
+
–
+
+
V
S
V
(a) = En medio de triple azúcar-hierro; (b) = Aunque C. fetus no pertenece a las especies termófilas de
Campylobacter, se ha descrito el crecimiento de esta especie a 42°C (12, 41);
(+) = reacción o crecimiento positivo; (–) = reacción negativa o ausencia de crecimiento de la cepa en medio apropiado en
condiciones especificadas; V = resultados variables; S = sensible; R = resistente.
i)
Prueba de crecimiento en presencia de glicina
La prueba se hace sobre cada cepa que parezca ser C. fetus (cepas sospechosas) preparando una
suspensión en tampón a pH 7,2. Ésta se inocula en un medio con glicina (15 ml de medio con sangre
+ exactamente 1,65 ml de una solución acuosa de glicina al 10%), y en medio base con sangre. La
incubación se realiza bajo las condiciones atmosféricas especificadas. En paralelo se prueban dos
cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Como todas las cepas son "fastidiosas",
pequeños cambios en el medio pueden ser importantes y la falta de crecimiento en glicina debe
considerarse como una prueba preliminar de que se trata de C. fetus subes. venerealis. La
reproducibilidad de la prueba es baja y se han descrito cepas intermedias (34).
ii)
Prueba de crecimiento en presencia de cloruro sódico
Se inocula una suspensión en tampón pH 7,2 de la cepa sospechosa a un medio con sangre que
contenga 3,5% de NaCl (15 ml de medio con sangre + 2,04 ml de una solución de cloruro sódico 5 M),
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y a un medio base con sangre. La incubación se realiza bajo las condiciones atmosféricas
especificadas. En paralelo se prueban dos cepas control.
iii)
Prueba de producción de sulfhídrico
La prueba de sulfhídrico (H2S) se hace en medio sólido de triple azúcar-hierro (medio TSI) que
contiene peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro
sódico (5 g/litro), citrato férrico (0,5 g/litro), tiosulfato sódico (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro),
sacarosa (10 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo fenol (0,0024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada
(hasta 1.000 ml). Este medio se esteriliza en el autoclave a 115°C durante 15 minutos después de
distribuir en tubos. Se puede preparar según se necesita o bien se prepara y se mantiene guardado en
condiciones normales de almacenamiento durante aproximadamente 3 semanas.
Antes de uso, licuar el medio en un baño de agua hirviendo e inclinar los tubos para obtener una
pendiente con una profundidad de 3 cm. Este medio puede guardarse bajo condiciones normales
durante 8-10 días antes de uso.
iv)
Prueba de sensibilidad a cefalotina y a ácido nalidíxico
La sensibilidad a cefalotina (CN) y ácido nalidíxico (NA) se prueba por la técnica del disco (31). Se
preparan en el laboratorio discos conteniendo cada uno CN (30 µg) o NA (30 µg) empapando discos
de papel de filtro en soluciones de CN (3 mg/ml) y NA (3 mg/ml). Los discos se secan y se guardan
hasta uso.
Para la prueba, se suspenden cultivos de 72 horas de las cepas problema en PBS pH 7,2, a una
concentración de 109 bacterias/ml. Porciones de 100 µl de esta suspensión se colocan como una capa
uniforme sobre el medio base de sangre. Las placas de cultivo se secan antes de depositar el cultivo
sobre la superficie. A continuación, se colocan encima los discos de sensibilidad, los cultivos se
incuban a 37°C en atmósfera apropiada y se examinan después de 48 y 96 horas. Una zona de
inhibición alrededor de un disco de al menos 3 mm indica que la cepa problema es sensible a ese
antibiótico. Todas las cepas de C. fetus subesp. fetus y la mayoría de las de C. fetus subesp.
venerealis son resistentes a NA (27). Todas las cepas de C. fetus son sensibles a CN (27).
g)
Inmunofluorescencia
Esta prueba puede aplicarse para identificar el microorganismo por la técnica directa o para confirmar la
identificación de una cepa aislada. No diferencia entre diferentes especies (30).
i)
Preparación de sueros inmunes
Se crecen cepas de Campylobacter, preferiblemente cepas estándar de colecciones de cultivo
reconocidas (C. fetus subesp. venerealis o C. fetus subesp. fetus), durante 3 días a 37°C, por
separado, en medio de agar sangre y en condiciones microaeróbicas. Los microorganismos se
recogen en PBS pH 7,2, y se lavan dos veces por centrifugación. Se inoculan intramuscularmente
conejos de 3 meses con 2 ml de una suspensión de 1011 microorganismos/ml de una subespecie de
C. fetus en PBS y adyuvante incompleto de Freund. El inóculo se administra en cuatro sitios, con 0,5
ml en cada sitio. Los animales se sangran antes de la inoculación y después a intervalos semanales.
Cuando los títulos del suero son elevados por pruebas de inmunofluorescencia o de aglutinación, se
inyectan intravenosamente 0,1-1,0 ml con 1010 microorganismos viables/ml. Los conejos se sangran 7
días después y se juntan los sueros heterólogos. En un estudio reciente, se ha descrito un conjugado
preparado de IgY de pollo como alternativa a los anticuerpos de conejo (8). Se han descrito
anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para la detección inmunodiagnóstica de C. fetus (6).
ii)
Preparación de conjugados
La fracción de IgG se separa por precipitación con sulfato sódico. El suero se ajusta a pH 8,0 con PBS
0,1 M y se añaden 18 g de sulfato sódico anhidro por cada 100 ml. El precipitado se recoge por
centrifugación y se redisuelve en agua destilada a su volumen original. Se re-precipita añadiendo 12 g
de sulfato sódico/100 ml. Se recoge el precipitado, se disuelve en agua destilada a la mitad de su
volumen, y se dializa frente a PBS, pH 7,2, a 4°C hasta que esté libre de sulfato. Se determina el
contenido en proteína y se ajusta la concentración con PBS a 1,0-1,5 g de proteína por 100 ml (por
ejemplo, seroalbúmina bovina). Esta solución se ajusta a pH 9,0 con carbonato sódico 1M. Se añade
el isómero 1 de isotiocianato de fluoresceína (FITC) en un volumen mínimo de carbonato sódico 0,1 M
a una concentración final de 15 mg FITC/1,0 g de proteína. Esto se agita durante 18 horas a 4°C. La
mezcla se ajusta a pH 7,0 con ácido clorhídrico 0,1 M y se dializa frente a PBS a 4°C con frecuentes
cambios. Los restos de FITC libre se eliminan por filtración en gel de Sephadex G25, y el producto
final se guarda a -20°C o a temperatura inferior en pequeñas alícuotas.
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La dilución de trabajo del conjugado se determina probando varias diluciones en PBS con frotis de un
cultivo de C. fetus, y seleccionando el doble de la concentración más baja que produce fluorescencia
brillante con estos microorganismos de ensayo. Por microscopía de alta resolución, los
microorganismos fluorescentes tienen una morfología típica y frecuentemente se concentran en los
bordes del frotis.
iii)
Prueba de inmunofluorescencia
Las muestras se fijan a portaobjetos de vidrio, se tiñen con el antisuero conjugado con FITC, y se
examinan para presencia de microorganismos fluorescentes. La tinción se realiza en una cámara
húmeda a 37°C durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan luego hasta eliminación del conjugado
libre, se someten a dos lavados con PBS (10 minutos cada lavado), y se montan con glicerol
tamponado (80% [v/v] de glicerol: 20% de tampón fosfato 0,1 M, pH 8,0).
Los cubreobjetos se sellan para evitar el secado y los portaobjetos se examinan en un microscopio de
luz ultravioleta.
h)
Identificación molecular de Campylobacter fetus
Se han descrito en la literatura métodos basados en PCR para la identificación específica de C. fetus (21) y
de cada una de las subespecies (21, 44).
2.
Pruebas serológicas de detección de anticuerpos
Las pruebas para anticuerpos incluyen la prueba de aglutinación del mucus vaginal y el enzimoinmunoensayo
(ELISA).
a)
Prueba de aglutinación del mucus vaginal
Esta prueba es útil en manadas, pero no para identificar animales individuales infectados por C. fetus. Solo
se identifica alrededor del 50% de los animales infectados. La prueba se realiza mejor con mucus vaginal
tomado 37-70 días después de la infección, pero la presencia de anticuerpos puede retrasarse hasta 3-4
meses. Algunas vacas permanecen positivas durante varios años mientras que otras se vuelven negativas
en 2 meses. Aproximadamente el 50% de las vacas positivas son negativas a los 6 meses (15).
Las muestras tomadas por lavados vaginales se consideran diluidas 1/5 con el lavado salino. Cuando las
muestras se obtienen con tampones, el mucus vaginal se extrae con 7 ml de solución salina fisiológica y
se deja durante la noche a 4°C. Se presiona el tampón para obtener el líquido y se utiliza como líquido
problema en la prueba de aglutinación del mucus vaginal.
En la prueba de aglutinación del mucus vaginal, el antígeno es un cultivo de 48 horas de C. fetus subes.
venerealis en agar con 7% de sangre fresca (de menos de 2 semanas) de oveja, que contenga
preferentemente 0,1% de cicloheximida. Este cultivo se sub-cultiva en 20-30 placas con agar sangre, o bien
se pipetea una suspensión de la bacteria en PBS estéril en frascos Roux con agar sangre y se extiende
sobre la superficie del medio por agitación suave. Los cultivos se incuban en microaerobiosis durante 2-3
días a 37°C con 85% de nitrógeno, 10% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno. Las células se recogen y
se suspenden en suspensión salina con 0,5% de formol. Si se utilizan frascos Roux, se emplean 10 ml de
solución salina con formol y bolas de vidrio para extraer las células. La suspensión se filtra por una gasa
para eliminar restos grandes, se lava tres veces por centrifugación a 6.000 g durante 20 minutos y el lavado
final se resuspende en 0,25% de formol salino y se guarda durante 1 semana. Para titular el antígeno, se
prepara una serie de diluciones en formol salino. Cada dilución se titula con diluciones dobles de un
antisuero bovino adecuado contra C. fetus. Cada tubo debe contener 0,5 ml de suero y 0,5 ml de antígeno.
El contenido se mezcla bien antes de incubar a 37°C durante 18 horas. El título del antígeno se determina
por la dilución más alta que origina al menos un 50% de aglutinación con la muestra de suero positivo.
Las muestras de mucus vaginal se homogenizan con cuatro volúmenes de PBS (o 5% de fenol salino)
utilizando bolas de vidrio. Si se ha practicado un lavado vaginal, las muestras son adecuadas. Una vez
homogenado, se transfieren 2 ml a un tubo de ensayo colocado en un baño de agua a 57°C. Se colocan en
el mismo baño 10 ml aproximadamente de agar Oxoid No.1 fundido (20 g/litro). Cuando el contenido de los
dos tubos se ha equilibrado a 57°C, se pipetean 2 ml del agar en el homogenado. La mezcla se agita
vigorosamente y se vierte rápidamente en un recipiente con tapón de rosca con una boca de 45 mm de
anchura. Cuando la mezcla se ha solidificado, se depositan 2 ml de fenol salino al 5% sobre el agar antes
de cerrar el tapón. El recipiente se incuba después durante 18 horas a 37°C para extraer el anticuerpo.
El líquido claro se aspira de la superficie del agar y se emplea como muestra de la prueba en un ensayo de
aglutinación en tres tubos. El primer tubo se deja vacío, y en los otros se pipetean 0,5 ml de 0,5% de fenol
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
483
Capítulo 2.3.2. − Campilobacterioriosis genital bovina
salino. Luego se ponen 0,5 ml de la muestra problema en el primer y segundo tubo. Se mezcla el contenido
del segundo tubo y se transfiere 0,5 ml al tercer tubo. Se mezcla el contenido del tercer tubo y se eliminan
0,5 ml. A continuación, se añade a cada tubo 0,5 ml de una dilución estandarizada del antígeno y se
mezcla bien. Después de incubar a 37°C durante 18 horas, las pruebas se observan con luz oblicua sobre
un fondo negro. Cada dilución se valora como sigue:
Agua clara
75% claridad
50% claridad
25% claridad
No claridad
=
=
=
=
=
++++
+++
++
+
-
Se debería realizar al mismo tiempo una titulación de un control positivo utilizando el mismo método que
para determinar el título de un antígeno frente a un antisuero positivo conocido. El antígeno se utiliza a la
misma dilución estandarizada frente a diluciones del suero positivo. Los resultados se pueden validar si se
obtiene el título esperado utilizando las muestras de control positivo.
Un resultado positivo es aquel en el que se produce el 50% de aglutinación en el tercer tubo (dilución 1/80),
o después si se usan más de tres tubos. La reacción es dudosa si hay menos evidencia de aglutinación. Se
considera que la prueba del mucus es útil para el diagnóstico de la campilobacteriosis genital, pero debe
resaltarse que la interpretación de los resultados ha de hacerse a nivel poblacional. Para utilizar mejor la
prueba es necesario seleccionar con cuidado los animales, ya que incluso en poblaciones con una extensa
infección es probable que algunos animales escapen a la infección. Hay un período variable de adaptación
entre la infección y el desarrollo de una prueba de aglutinación positiva, y en la fase del estro las aglutininas
tienden a desaparecer del mucus parcialmente o por completo, aunque pueden presentarse a altas
concentraciones en otras fases del ciclo. En cualquier caso, los títulos de aglutinación tienden a
desaparecer con el tiempo.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se dispone de un ELISA para detectar anticuerpos secretorios IgA específicos de antígeno en el mucus
vaginal después de el aborto debido a C. fetus subesp. venerealis (17, 19). Estos anticuerpos son
duraderos, y su concentración permanece constante en el mucus vaginal durante varios meses (22).
El muestreo inicial puede realizarse después del primer período involucional (normalmente 1 semana
después del aborto) cuando el mucus se hace más claro.
Se ha descrito recientemente un ELISA para detectar la respuesta sérica humoral de IgG después de la
vacunación (33).
•
Preparación de antígeno y antigenización
Se crece Campylobacter fetus subesp. venerealis en agar con 7-10% de sangre en condiciones
microaeróbicas a 37°C durante 3 días. Las placas se analizan para pureza y se transfieren colonias a 0,5%
de formol salino durante 1 hora, se centrifuga a 17.000 g, se lava dos veces con PBS, pH 7,5, y se
resuspende a continuación en tampón carbonato 0,05 M, pH 9,6. La absorbancia final se ajusta a 0,21 a
610 nm. Se dejan durante la noche a 4°C placas de poliestireno para microtitulación de fondo plano
antigenizadas con 10 µl de antígeno, que se guardan luego a -20°C. Antes de uso, las placas se lavan dos
veces con agua destilada y después se elimina la humedad de ellas con cuidado.
484
•
Procedimiento de la prueba
i)
Se añade a cada pocillo el mucus vaginal diluido (100µl) y la placa se incuba durante 2 horas a 37°C.
ii)
Se lavan las placas como antes y se añaden 100 µl de IgA anti-bovina de conejo.
iii)
Después de una incubación de 2 horas a 37°C, se lavan las placas y se añaden a cada pocillo 100 µl
de IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rábano.
iv)
Después de otras 2 horas de incubación a 37°C, se lavan las placas y se añaden 100 µl de substrato
(ácido 5 amino-salicílico [0,8 mg/µl], pH 6,0, activado inmediatamente por la adición de 2% de peróxido
de hidrógeno [H2O2]).
v)
Las placas se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detiene la reacción añadiendo
50 µl de hidróxido sódico (NaOH) 3 M. La absorbancia se mide en un lector ELISA a 450 nm.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.3.2. − Campilobacterioriosis genital bovina
vi)
Interpretación de los resultados: cada muestra se prueba en duplicado, y en cada placa se incluye
controles positivos y negativos. Las medidas de absorbancia de las muestras problema se corrigen
para las medidas de absorbancia de los controles positivos y negativos según la fórmula siguiente:
Absorbancia muestra- Absorbancia control negativo
Resultado = ________________________________________________
Absorbancia control positivo - Absorbancia control negativo
× 100
La prueba se considera positiva si el resultado es superior a 40. Los animales vacunados no
reaccionan al ELISA con IgA ya que su mucus vaginal solo contiene anticuerpos de isotipo IgG.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Las vacunas con Campylobacter fetus subesp. fetus confieren inmunidad contra C. fetus subesp. venerealis
porque ambas cepas comparten antígenos comunes (5). Se reconocen dos grupos de antígenos de C. fetus: los
antígenos flagelares "H" que son termolábiles y los antígenos somáticos "O" que son termoestables. Además,
está presente un antígeno capsular "K" (23). La vacuna debe incorporar estos antígenos. Se trata de vacunas en
emulsión de aceite con una o más cepas que se han inactivado con formaldehído. También se han descrito otras
preparaciones de vacunas (11).
La adición al producto biológico de una segunda cepa de C. fetus subesp. venerealis es una práctica común. Es
importante la presencia de cuatro o cinco inmunógenos proteicos sensibles al calor que son compartidos por
muchas cepas de C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. Debe confirmarse la presencia de tales
inmunógenos (4).
En poblaciones infectadas, todos los animales para reproducción, incluyendo los toros, vacas y terneras, se
vacunan después del diagnóstico de campilobacteriosis genital bovina. Al tiempo de la segunda vacunación, se
recomienda un tratamiento adicional con antibióticos para toros infectados, ya que la vacuna no siempre es
eficaz para acabar con infecciones establecidas.
Los toros y novillas del año siguiente se vacunan, y los toros del tercer año en adelante se vacunan anualmente.
En poblaciones no infectadas solo se vacunan los toros, una vez al año.
1.
Control de inóculos
a)
Características del inóculo
El inóculo consiste en un lote grande y homogéneo de un cultivo de C. fetus subesp. fetus o de C. fetus
subesp. venerealis que se ha caracterizado cuidadosamente e identificado en cuanto a pureza, conservado
en pequeñas alícuotas.
b)
Método de cultivo
El crecimiento inicial del inóculo tiene lugar en medio sólido. Éste consiste en un medio basal al que se
añade 0,16% de Bacto agar. El medio basal se compone de 2,8% de caldo de Brucella, 0,5% de extracto de
levadura, 1,2% de succinato sódico, y 0.001% de cloruro cálcico. El cultivo inicial se mantiene 3 días a 37°C
en una atmósfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2. El cultivo se pasa a tubos adicionales con medio
semisólido y se incuba durante 48 horas. El material resultante se utiliza para producción de vacuna.
c)
Validación como vacuna
El inóculo debe estar libre de organismos contaminantes. La pureza del inóculo debe comprobarse por un
método de cultivo apropiado.
No resulta práctico probar la eficacia en condiciones de laboratorio. Se determina en el campo por
observaciones epidemiológicas.
La vacuna debe mantenerse a 4°C.
2.
Método de producción
El material de siembra se cultiva en medio líquido formado por medio basal al que se añade 0,025% de
tioglicolato sódico. Estos cultivos se incuban durante 24 horas a 37°C con agitación a 80 rpm. Se recogen los
líquidos y se añade formaldehído a una concentración final de 0,2%.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.3.2. − Campilobacterioriosis genital bovina
La vacuna se mezcla con un adyuvante de emulsión de aceite para alargar el período de inmunidad.
3.
Control del proceso
Se debe comprobar la identidad del microorganismo por cultivo e identificación, así como la ausencia de
microorganismos contaminantes.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación del material biológico se pueden encontrar en el
capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
El proceso de inactivación debe ser completo. Esto se comprueba inoculando el equivalente de una dosis
en el mismo medio y bajo las mismas condiciones que las utilizadas en el proceso de producción. Este
cultivo se incuba 72 horas en las mismas condiciones, después de las cuales no debe haber evidencia de
crecimiento bacteriano. El producto final debe estar libre de contaminantes bacterianos y fúngicos viables,
utilizando métodos adecuados de cultivo.
Se inoculan dos cobayas con 2 ml del producto, intramuscular o subcutáneamente. No debe haber una
reacción adversa atribuible a la vacuna durante un período de observación de 7 días después de la
inoculación.
c)
Potencia
La potencia de la vacuna puede medirse por seroconversión en conejos. Se miden sus títulos séricos
mediante inmunofluorescencia o por la prueba de aglutinación en tubo. Se vacunan subcutáneamente, con
la mitad de la dosis utilizada en el ganado bovino, cinco conejos que sean serológicamente negativos a una
dilución 1/100 del suero, en dos ocasiones separadas por 14 días. Como mínimo, el suero de cuatro de los
cinco ratones, recogido 14 días después de la segunda vacunación, debe mostrar un incremento en el título
de al menos cuatro veces.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver Sección C.4.b.
b)
Potencia
Ver Sección C.4.c.
•
Agradecimiento
Partes de este capítulo derivan del capítulo sobre campilobacteriosis genital bovina de ediciones previas de este
Material o están basados en él.
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