Informe Final

Informe Final
Febrero 2005 - Enero 2006
Clave del Proyecto: 20050381
Centro Interdisiplinario de Ciencias Marinas
ESCUELA
Condiciones para el uso del alimento vivo como una vía de
administración oral de la hormona 17 alfa metiltestosterona en la
producción de monosexos de la cabrilla arenera.
PROYECTO
Ningún programa asociado
PROGRAMA
Resumen.- En especies con ontogenia indirecta, como la cabrilla arenera
Paralabrax maculatofasciatus es conveniente el uso del alimento vivo como
primer alimento, una vez que sus reservas endógenas han sido agotadas.
Debido a esto, para poder influir en su diferenciación sexual se ha planteado el
uso de alimento vivo como una forma inicial de administración de estrógenos
para lograr la producción de monosexos. Primeramente se debe identificar el
momento previo en que ocurra la diferenciación sexual, para esto se realizaron
cortes transversales en larvas de cabrilla de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 días después
de la eclosión (DDE) y por análisis histológico se determino que las células
germinales pueden ser detectadas a
partir del día 25 y 30 DDE, cuando
alcanzan tallas alrededor de 18 mm de longitud notocordal. De esto se
concluyo que la hormona debe ser administrada el día 15 DDE, al momento de
iniciar la alimentación con nauplios de Artemia, Para asegurar que la hormona
sea incorporada a la Artemia, se probó previamente la factibilidad de esto,
colocando en frascos de 1 L, dos concentraciones de la hormona 17 alfa
metiltestosterona (15 y 30 mg/Kg de alimento en un litro de agua de mar). Se
tomaron muestras a 1, 3, 6 y 9 horas (según el protocolo de alimentación de las
larvas) y se guardaron a -80ºC, posteriormente fueron liofilizadas y enviadas a
la Universidad de Oregon para su análisis por radio inmunoensayo (RIA, por las
siglas en inglés). Se encontró para las dos concentraciones que a partir de una
hora la hormona ya esta presente en los nauplios de Artemia y permanece
durante las 9 horas de enriquecimiento con el esteroide.
Introducción.- La cabrilla arenera es un pez que ha sido estudiado por más de
una década, estos estudios van encaminados para lograr la biotecnología que
permita su cultivo comercial. Entre los avances que se tienen ha sido
establecer un protocolo de alimentación durante la cría larvaria. De este modo
tenemos que durante los primeros 18 días de alimentación, se ha utilizado con
éxito al rotífero Brachionus plicatillis, teniendo una coalimentación del día 15 al
18 con la Artemia sp., la cual es proporcionada en estadio naupliar y se
complementa con juveniles hasta el día 30. El conocimiento de esta especie
nos ha permitido saber que se reproducen precozmente, lo cual no es
conveniente para su engorda debido al gasto energético que conlleva esto. Una
alternativa que podría resolver este problema es la producción de monosexos,
la cual es una estrategia que se ha utilizado para reducir aspectos no deseados
en sistemas de producción de peces, aspectos tales como la reproducción,
heterogeneidad de tallas y agresividad intrínseca del cortejo (Beardmore et al.
2001). Para lograr producir monosexos es necesario influir en la diferenciación
sexual de los peces. Esto es posible de realizar por diversos métodos.
Para que esta manipulación tenga éxito, se debe identificar el periodo crítico en
que ocurre la determinación del sexo e iniciar el tratamiento hormonal, con la
administración oral de la 17 alfa metil testosterona (17 MT) y poder dirigir el
fenotipo del sexo hacia donde sea conveniente (Blázquez et al. 2001). Al
determinar la etapa en que puedan identificarse las células germinales
mediante análisis histológico, se proporcionara la información necesaria para
manejar el proceso de inversión sexual y coadyuvara a determinar la talla-edad
en la que se diferencia el tejido gonádico. En la cabrilla arenera el cultivo de
monosexos prevé producir machos debido a su condición protogínica. El
periodo crítico para la reversión sexual, es altamente variable según la especie.
Por lo general, se aplican durante los periodos iniciales de vida, en
consideración del tipo de desarrollo ontogenético que se presenta en dichas
especies. En la tilapia Oreochromis niloticus, la cual también madura
precozmente, se inicia el tratamiento con 17 MT desde la primera alimentación,
siendo esta los nauplios de Artemia (Vera Cruz y Mair, 1994). Por tanto, son
estos los que se utilizan como la vía de administración de la hormona mediante
un proceso de bioencapsulación (Stewart et al. 2001). En el presente estudio,
se quiere determinar el tiempo en que ocurre la diferenciación sexual y la
viabilidad de que los nauplios de Artemia sean enriquecidos con la hormona 17
alfa metiltestosterona y así administrar la hormona a las larvas de la cabrilla
arenera antes de que ocurra la diferenciación sexual.
Métodos y materiales.
1. Identificación de células germinales y diferenciación del sexo de la
cabrilla arenera.
Se tomaron 10 muestras cada 5 días de larvas de la cabrilla arenera para hacer
un seguimiento del desarrollo y presencia de las células germinales. A las
muestras de larvas recolectadas se les tomaron mediciones, con ayuda del
analizador de imágenes ImagePro Plus 4.5, y con un microscopio
estereoscópico marca Olympus y cámara analógica. Previo a la biometría, se
anestesiaron con MS-222 (metil sulfonato de tricaína en solución de 0.15 mg/L)
para facilitar su procesamiento. Por ultimo, se fijaron con formalina comercial al
10% neutralizado con fosfatos (pH 7.1).
Se realizaron cortes histológicos transversales de larvas y juveniles de cabrilla
arenera y así se determino su grado de diferenciación sexual con base a la
descripción de las células germinales primordiales (Ocampo-Cervantes, 2002).
Las muestras se procesaron con técnicas de inclusión en parafina: se tomó una
porción en la parte media central, se lavó cuidadosamente con agua corriente
para eliminar el exceso del fijador y posteriormente se procedio a la
deshidratación con alcohol etílico en concentraciones crecientes (80º, 96º y
100º) y una solución 1:1 de alcohol absoluto-americlear. Después se
procesaron en parafina a 56º C (pF), para su inclusión definitiva con parafina a
60º C (pF). Los cortes se tiñeron con la técnica tricromica de Mallory y T. Van
Gieson para de este modo poder detectar la presencia de células germinales.
2. Producción de alimento vivo con el esteroide 17 α-metiltestosterona.
Para poder plantear los experimentos de masculinización, primeramente se
realizaron algunas pruebas para asegurarnos que las concentraciones que se
quieren probar son las correctas. Esto debido a que no se tiene información
sobre la fijación de la 17 MT en el alimento vivo, particularmente la Artemia, en
etapas posteriores al nauplio. En atención a esto, es necesario tener la
seguridad que las concentraciones que se quieren probar van a estar de
manera adecuada para lograr el efecto deseado.
Para realizar estas pruebas, se hicieron ensayos con la hormona para probar la
fijación de esta en la Artemia en diferentes estadios de vida y así verificar la
viabilidad de que la hormona pueda ser fijada y de este modo ser administrada
vía oral a las larvas de la cabrilla arenera.
Estas pruebas consistieron de lo siguiente:
Se preparó la solución madre y se calcularon los ml para obtener las
concentraciones a utilizar: se pesan 500 mg de 17 MT y se colocan en una
probeta con 75 ml de alcohol etílico al 70 %. De este modo se tiene la solución
sctock (madre). Así, tenemos una concentración de 6.67 mg/ml:
500 mg/75 ml = 6.67 mg/ml
Tomando en cuenta que en cada mililitro hay 6.67 mg de hormona, se
calcularon las concentraciones para 1 L de medio de cultivo.
Descapsulación y eclosión de la Artemia
Para los ensayos de bioencapsulación, se pesaron 60 g de quistes de Artemia
y se hidrataron por 1-2 horas, posteriormente se pusieron a descapsular con
hipoclorito de sodio por 1-2 minutos o hasta virar de color café a naranja. Se
enjuago con agua corriente hasta que desaparecio el olor a cloro.
Posteriormente se incubaron por 24 horas a 28 ºC, en agua de mar filtrada y
con aeración vigorosa desde el fondo para evitar que se precipitaran. Para esto
se uso un incubador marca Aquatic eco-system con capacidad de 20 litros.
Se recolectaron los nauplios recién eclosionados y se colocaron en un tanque
con capacidad de 300 L, a una temperatura de 28ºC.
Diariamente se realizaron conteos para saber la densidad y con base en esto
se determinó la cantidad de litros necesarios que se deben de filtrar por
muestra.
Incorporación del esteroide 17 MT en la Artemia
Tomando en cuenta que en cada mililitro hay 6.67 mg de hormona, se
calcularon las siguientes concentraciones para 1 L de medio de cultivo:
6.67 mg ---------------- 1 mL
•
15 mg
---------------- x mL = 2.24 ml
6.67 mg ---------------- 1 mL
•
30 mg
---------------- x mL = 4.49 ml
Se colocaron en un frasco de plástico graduado, un volumen de 1 L de agua de
mar filtrada, se le agrego la cantidad de mililitros de 17 MT para cada
concentración y posteriormente se le agrego la cantidad filtrada necesaria de
nauplios o juveniles de Artemia.
Toma de muestras
A partir de que se mezclo la hormona con la Artemia, se espero una hora y se
tomaron las muestras cada 3 horas. Para esto, de cada frasco de litro se
tomaron 250 mL y se tamizaron para quitar la mayor cantidad de agua posible,
se enjuago con agua destilada y con formiato de amonio y se secaron con
papel secante por la parte inferior del tamiz, finalmente se puso la muestra en
frasco ependorf previamente etiquetados y se guardaron en congelador a 80ºC. Las muestras se liofilizaron en el CIBNOR para su posterior envió a
Oregon para ser analizadas por RIA y así determinar su concentración real.
Todos los datos se registraron en una bitácora y cada día la información se
vertió a una hoja de cálculo Excel.
Resultados
1. Identificación de células germinales y diferenciación del sexo de la
cabrilla arenera.
Se realizaron cortes transversales de larvas de 5, 10, 15, 20, 25, y 30 DDE.
Los cortes fueron teñidos usando la técnica tricrómica de Mallory y T. Van
Gieson. Los estudios histológicos en las larvas identificaron presencia de
epitelio germinativo en larvas de 25 y 30 DDE, cuando han alcanzado una
longitud de 18 mm en adelante. Las gonias se localizaron en posición
dorsoventral en la cavidad abdominal (Fig. 1).
Evidencia de que a los 30 días
(19 mm) presentan gonias
(T. Tricrómica de Mallory)
Evidencia de que a los 25 días
(18 mm) presentan gonias
(T. Van Gieson)
10 X
40 X
Gonias
Figura 1. Fue posible detectar la presencia de células germinales (gonias) en larvas de 25 y 30
DDE.
Con base en estos resultados se plantea iniciar la administración de la 17 MT a
partir de la alimentación con nauplios de Artemia, la cual se inicia a partir del
dia 15 DDE.
Protocolo de alimentación de larvas de cabrilla arenera (Alvarez-González, 1999)
¿Inicio de
tratamiento
hormonal?
Presencia
de gonias
2. Producción de alimento vivo enriquecido con el esteroide 17 αmetiltestosterona.
Se realizaron un experimento para probar la bioencapsulación de la Artemia en
diferentes estadios de vida, las pruebas se hicieron en nauplios y juveniles de
Artemia al dia 0, 5 y 10 DDE. Las muestras se encuentran liofilizaron y se
almacenaron a -80 ºC previo a su análisis por radio inmunoensayo (RIA). Estas
se enviaron para este análisis al Departamento de Pesquerías y Vida Silvestre
de Oregon State University. Corvallis, OR. USA.
Conclusiones: Debido a la presencia de gonias desde el día 25 DDE (en
larvas de 18 mm), se concluye que el tratamiento hormonal inicie a partir del
día 15 DDE. Por lo anterior, concluimos que la administración oral de la
hormona deberá iniciarse a partir de nauplios de Artemia como alimento de
dichas larvas. Tomando en cuenta la consideración anterior, se descarta la
posibilidad de iniciar el tratamiento hormonal utilizando rotíferos como
bioencapsuladores de este andrógeno.
Impacto.- La biotecnología para el cultivo de la cabrilla arenera requiere de
varios aspectos los cuales se han estado abordando. Uno de estos, mejorar su
crecimiento con la producción de monosexos es el que se esta abordando en
parte con este proyecto. Para poder iniciar esta producción es importante
conocer primeramente el momento de inicio del tratamiento, para lo cual haber
identificado la talla-edad en al cual se denota la presencia de epitelio
germinativo nos da esta información y así plantear el inicio de los tratamientos.
Además, corroborar que la hormona se fija en los nauplios de Artemia, también
es un dato importante para tener la certeza de que el andrógeno va a ser
administrado vía oral a la larvas de la cabrilla arenera.
REFERENCIAS
Alvarez-González, C. A., 1999. Optimización del proceso de producción de
semilla de la cabrilla arenera Paralabrax maculatofasciatus (Percoidei:
Serranidae) en sistemas de circulación cerrada. Tesis de Maestría.
CICIMAR-IPN. México. 108 pp.
Beardmore, J. A., G. C. Mair y R. I. Lewis. 2001. Monosex male production in
finfish as exemplified by tilapia: applications, problems and prospects.
Aquaculture, 197: 283-301.
Blázquez M., F. Piferrer, S. Zanuy, M. Carrillo y E. M. Donaldson. 1995.
Development of sex control techniques for European sea bass
(Dicentrarchus labrax L.) aquaculture: effects of dietary 17 αmethyltestosterone prior to sex differentiation. Aquaculture, 135: 329342.
Vera Cruz E.M. y G.C. Mair. 1994. Conditions for effective androgen sex
reversal in Oreochromis niloticus (L.). Aquaculture, 122: 237-248.