Tesis - Dirección General de Servicios Telemáticos

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
ASOCIACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO DE ALTO RIESGO EN
VARONES Y SU PAREJA SEXUAL CON NEOPLASIA INTRAEPITELIAL DE
CÉRVIX UTERINO, EN EL ESTADO DE COLIMA.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA
JOSÉ GUZMÁN ESQUIVEL
Urólogo
ASESORES
Dra. en C. ALICIA MARTÍNEZ CONTRERAS
Dra. en C. LUZ MARGARITA BALTAZAR R.
ASESOR CLÍNICO
ASESOR BÁSICO
CO-ASESORES DE LA MAESTRÍA
Dr.
en C.
BENJAMÍN TRUJILLO H. M. INTERNISTA
COLABORADORES
Médico Ginecólogo ARNOLDO MUÑIZ GÓMEZ
Colima, Col. Enero del 2006
2
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo de tesis se realizó en el laboratorio de Biología Molecular del
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Colima.
El autor de la tesis declara haber obtenido y disfrutado de una beca de apoyo
ofrecida de el CONACYT, con número de Registro 187010 y el apoyo de una beca para el
desarrollo del proyecto por parte del Fondo al Fomento de la Investigación por parte de el
Instituto Mexicano de Seguro Social, con número de registro 057-2004.
En especial agradecimiento a las personas que me dieron su apoyo de manera
incondicional para la obtención de las becas y para que el desarrollo del proyecto llegara a
su fin.
Gracias a la Dra. Luz Margarita Baltazar R. y Dra. Alicia Martínez Contreras por su apoyo
y sus consejos.
Al Q.F.B Mario Ramírez Flores por su invaluable apoyo y dedicación que tiene en los
haberes del laboratorio de Biología Molecular.
Al Dr. Jorge Molina por su perseverancia y su incondicional apoyo que me ofreció desde
un inicio y sobre todo por hacerme ver siempre la posibilidad de lograr los objetivos.
DEDICADA:
A mi esposa Alejandra,
y a mis hijos José Alejandro y Hannah Priscila
Con todo mi amor y cariño.
3
ÍNDICE
Sección
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Pgs.
....................................................
6
……………...............................................................................
7
ABSTRACT ………………………………………………………………...
8
1.
INTRODUCCIÓN
...........................................................................
9
2.
ANTECEDENTES
…………………………………………………
11
2.1
Virus del papiloma humano ....................................................
11
2.2
Cérvix uterino y VPH
14
2.3
Cáncer cervico-uterino en México
2.4
VPH y varones
2.5
Efecto del VPH en la motilidad de los espermatozoides
2.6
Circuncisión y virus del VPH
2.7
VHP y vacunas
RESUMEN
....................................................
........................................
15
................................................................
16
.....
18
........................................
19
................................................................
19
3.
JUSTIFICACIÓN
...........................................................................
21
4.
HIPÓTESIS DE TRABAJO ...............................................................
22
4.1
Hipótesis alterna
...............................................................
22
4.2
Hipótesis nula
...............................................................
22
OBJETIVOS ......................................................................................
23
5.
4
6.
MATERIAL Y MÉTODOS ...............................................................
24
6.1
Clasificación del diseño de estudio .......................................
24
6.2
Criterios de selección ..............................................................
24
6.2.1 Inclusión
..........................................................................
24
6.2.2 Exclusión
..........................................................................
24
6.2.3 Eliminación
………………………………………………..
25
6.3
Operacionalización de variables
………………………...
26
6.4
Variables de confusión
………………………………...
27
6.4.1 Manejo de variables de confusión
………………………...
28
6.5
Definición conceptual
………………………………...
28
6.6
Técnica penoscopia o androscopia …………………………
28
6.7
Obtención de muestra para histología
…………………
29
6.8
Obtención de muestra para RCP
…………………………
29
6.9
Extracción del DNA de exfoliación peniana …………………
29
6.10
Cuantificación y pureza del DNA extraído …………………
30
6.11
Diagnóstico Molecular
…………………………………
31
6.11.1 Condiciones de la RCP
…………………………………
31
6.11.2 Programa de temperaturas para la RCP
6.12
33
Electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción
con nitrato de plata
6.13
…………………
…………………………………………
34
Identificación de tipo viral utilizando el método
hibridación reversa simple
…………………………………
35
6.14
Flujograma de la metodología realizada en el estudio………..
37
6.15
Tamaño de la muestra
………………………................
38
6.16
Técnica de muestreo
…………………………………
40
6.17
Análisis estadístico
………………………................
40
6.18
Consideraciones éticas
………………………................
40
5
7.
RESULTADOS
…………………………………………………
41
8.
DISCUSIÓN
…………………………………………………
44
9.
CONCLUSIONES
…………………………………………………
47
10.
EXPECTATIVAS
…………………………………………………
48
11.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
12.
ANEXOS
………………………….
49
…………………………………………………………
55
6
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Pág.
Tabla 1.
Distribución anatómica ano-genial de VPH en varones
Tabla 2.
Operacionalización de variables
Tabla 3.
Variables de confusión
Tabla 4.
Composición del volumen final de 20 μl de la muestra
amplificada por RCP
………….
17
…………………………………
26
…………………………………………
27
………………………………………….
32
Tabla 5.
Programa de temperaturas para la RCP
………………………….
33
Figura 1.
Esquema de una hibridación reversa
……………... ………….
36
Figura 2.
Flujograma de la metodología realizada en el estudio
………….
37
Tabla 6.
Resultados de los promedios obtenidos por grupo ………………….
41
Tabla 7.
Tabla de contingencia 2x2 para asociación del VPH y muestras
cervicales con lesiones pre-malignas o papanicolaou normal
Tabla 8.
….
42
Resultados obtenidos de las variables de confusión utilizando tabla de
contingencia 2x2
…………………………………………
43
7
RESUMEN
Objetivos: Determinar si el virus del papiloma humano (VPH) en varones, es un factor de
riesgo para el desarrollo de neoplasia intraepitelial de cérvix uterino en su pareja sexual y
conocer su frecuencia y tipo de VPH.
Hipótesis: El VPH en varones es un factor de riesgo para el desarrollo de neoplasia
intraepitelial de cérvix de su pareja sexual.
Material y Métodos: Se realizó un estudio de casos y controles, incluyendo a hombres
pareja sexual de mujeres con neoplasia intraepitelial cervical y con citología cervical
uterina negativa. El estudio fue aprobado por el comité de ética local y firmaron carta de
consentimiento informado. Las muestras se tomaron con cito-cepillo en pene y fueron
analizadas por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) con primers consenso
específicos de VPH.
Resultados: Nosotros analizamos 21 casos y 40 controles, ocho de ellos fueron excluidos
por DNA degradado. No hubo diferencia significativa entre ambos grupos de estudio,
obteniendo 3 casos positivos para VPH en el grupo de casos y 2 en el grupo de controles.
Las 5 muestras positivas, fueron virus de bajo grado. No hubo asociación del virus VPH en
varones y la neoplasia intraepitelial cervical de su pareja sexual.
Conclusiones: En el presente estudio no se encontró al VPH en hombre, como factor de
riesgo para el desarrollo de lesiones de cervix uterino. Los virus encontrados fueron de
bajo riesgo. Nuestro tamaño de muestra no fue suficiente para conocer la diferencia entre
ambos grupos de estudio.
8
ABSTRACT
Objective: To determine if the human papilloma virus (HPV) in man is a risk factor for the
development of cervical intraepithelial neoplasia on the female sexual partner and to know
the frequency and type of HPV.
Hypothesis: The VPH in men is a factor of risk for the development of cervical
intraepithelial neoplasia in their sexual pair.
Materials and Methods: A case-controls study was made; including men with female
sexual partner with cervical intraepithelial neoplasia and negative cervical uterine
cytological study. The study was approved by the local laws and signed letter of informed
consent. The samples were taken with cito-brush in the penis and were analyzed by chain
reaction of the polymerase (RCP) with primers VPH consensus specific.
Results: We analyzed 21 cases and 40 controls, eight of them were excluded by
degraded DNA. There was no significant difference between both training groups,
obtaining 3 positive cases for VPH in the group of cases and 2 in the control group. The
5 positive samples were virus low degree. There was not association of virus VPH in
men and their sexual partner.
Conclusion: In the present study one was not to the VPH in man, like factor of risk for
the development of neoplasia intraepithelial cervical. The virus found was of low risk.
Our size of sample was not enough to know the difference between both training
groups.
9
1.
INTRODUCCIÓN
El Cáncer cervico-uterino (CaCU) es la segunda causa de cáncer en la mujer en
México y se reporta hasta 500,000 nuevos casos por año en el mundo, con 190 mil muertes
por año. Los países subdesarrollados muestran actualmente tasas más elevadas de cáncer
comparado con países desarrollados y la tendencia no ha disminuido en los últimos años.
Se ha señalado la elevada incidencia, prevalencia y mortalidad por CaCU en
México (tasa de prevalencia 44.4/100 mil) con aproximadamente una muerte cada 2 horas.
También se reconoce una alta prevalencia de esta neoplasia en mujeres que radican en el
estado de Colima, México. Es conocido a nivel mundial que en la mayoría de las enfermas,
dicho cáncer esta íntimamente
relacionado con infección por los virus del papiloma
humano oncogénicos principalmente 16 y 18, y estos se transmiten habitualmente por
relaciones sexuales. En la ciudad de México hasta el 87% de las mujeres con CaCU
muestran virus de papiloma humano (VPH) de alto riesgo. Aunque se ha estimado a nivel
mundial que el factor masculino tiene un papel importante en la transmisión y desarrollo
de la enfermedad, existen pocas investigaciones en nuestro país que refieran la frecuencia
de esta infección y más aun la relación que guarda los tipos de virus con su pareja sexual.
Por esto resulta de gran importancia investigar la frecuencia de VPH de alto riesgo en
hombres, pareja sexual de mujeres con lesiones pre-malignas cervicales y CaCU.
La infección VPH de alto riesgo u oncogénicos causa virtualmente todos las casos
de CaCU. La infección del VPH es de fácil transmisión y más frecuentemente por vía
sexual.
El hombre es un reservorio y fuente principal de transmisión de la infección, sin
embargo, su comportamiento es totalmente distinto que en la mujer, ya que en pocas
ocasiones se le ha relacionado a lesiones precancerosas o verdaderas neoplasias. Es decir,
el cáncer de pene representa el 1% de los tumores malignos en el varón, alcanzando una
incidencia de 1 a 2 x100.000 habitantes.
10
Si México es un país con una de las tasas más elevadas de muertes por CaCU y el
Estado de Colima es una de las poblaciones con una alta incidencia y mortalidad por
CaCU, entonces tendríamos que investigar si realmente la presencia del virus en el varón
es el factor de riesgo más importante en estas pacientes o por el contrario, existen otros
factores asociados que pueden influir de forma más relevante para el desarrollo de esta
enfermedad.
11
2.
ANTECEDENTES
2.1
VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO
Los virus son organismos intracelulares obligados, compuestos de ácido
ribonucleico (ARN) o por desoxirribonucleico (ADN), pero nunca ambos y una capa
protectora de proteína sola o combinada con componentes lipídicos o glúcidos. En general
el ácido nucleico es una molécula única de hélice simple o doble. No pueden reproducirse
solos (replicación), ya que necesitan de células con metabolismo activo y fuera de ellas son
macromoléculas inertes.
Los papilomavirus son un grupo de pequeños virus de ácido desoxiribonucleico
(DNA). La naturaleza viral de las verrugas en el humano fue primeramente indicado hace
aproximadamente 90 años por Ciuffo, que demostró la transmisión de verrugas comunes
usando células libres infiltradas. El papilomavirus fue descrito en 1933 por Richard Shope
y hasta los años 70 fue cuando por primera vez el genoma del papiloma humano es
clonado en bacteria (1).
Los papilomavirus son miembros de la familia de los Papovavirus que incluye el
Polyomavirus del ratón, el virus simio 40 y los virus humanos BK y JC. Este grupo de virus
tiene la característica de tener un genoma circular encerrado en una cápsula poliédrica de
20 caras (icosaedro). Está constituido a la vez por una partícula de un diámetro de 55
nanómetros y estructura de icosaedro compuesta por 72 unidades básicas (capsómeros) y
no tienen membrana lipídica. La producción de partículas virales por ruptura del virus tiene
la capacidad de comportarse como antígenos. La partícula viral es mínimamente estable al
calor y a la desecación, sin embargo, esta relativa estabilidad hace posible la infección en
determinados casos sin contacto directo entre individuos.
12
El cromosoma viral del VPH es circular, de doble hélice y con un DNA de 7,900
pares de bases y 5.2 millones de daltons de tamaño. Algunos virus de DNA son replicados
por DNA-polimerasas idénticamente como lo hace el DNA celular, por esta razón, algunos
tipos de papilomavirus son capaces de transformar la célula normal en neoplásica (2).
Todos los VPH presentan 7 genes de expresión temprana y dos genes de expresión
tardía (L) así como una región reguladora no codificada (LCR).
Los papilomavirus son ampliamente distribuidos en el mundo animal, produciendo
infecciones en muchos mamíferos, aves y tumores en muchas de estas especies, sin
embargo, la infección cruzada no se ha demostrado (3).
Con mucha frecuencia el VPH infecta a humanos y varios tipos de papilomavirus
infectan virtualmente toda la superficie epitelial incluyendo piel y mucosas (4-5). Aunque
muchos de los epitelios infectados producen lesiones papilares o máculas benignas, algunos
tipos de VPH son asociados a un incremento a riesgo de neoplasia y por tanto estas
neoplasias pueden ocurrir en todos los sitios donde hay esta infección. Así, la infección por
VPH es de fácil transmisión, presumiblemente por heridas microscópicas en la superficie
del epitelio y comúnmente durante la actividad sexual. Las infecciones en introito y vagina
también son frecuentes pero raramente terminan en cáncer. Por lo anterior, podemos decir
que la infección de VPH es generalmente considerada de transmisión sexual y muchos
estudios actuales manifiestan de manera contundente que el número de parejas sexuales es
uno de los más importantes factores de riesgo asociado a la presencia del VPH. Se ha
documentado incluso la transmisión del VPH de mujer a mujer en actividad sexual lésbica
(6).
13
Hay pocos estudios epidemiológicos en relación a la transmisión sexual por rutas no
sexuales, tales como, fómites ambientales y transmisión vertical, sin embargo, claramente
son mucho menor que vía sexual. En un estudio realizado por Pao y cols., (7) se detectó
VPH en la vulva en el 15% de las mujeres vírgenes, lo que apoya la transmisión no sexual.
Existen más de 100 Tipos de VPH con más de 40 tipos ano-genitales y de los cuales
aproximadamente 15 de ellos son de alto riesgo u oncogénicos (8). Los tipos 6 y 11 causan
los condilomas acuminados y están asociados a lesiones escamosas intra-epiteliales de
bajo grado (LSIL) (9). Otros tipos de bajo riesgo también comunes son los tipos 53, 61 y
62. Hablando específicamente de los tipos oncogénicos o de alto riesgo tenemos a los
siguientes: VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, y posiblemente
otros más(10).
Los tipos 16, 18, 45, 31 y 33 considerados como de alto riesgo prevalecen en
lesiones escamosas intra-epiteliales de alto grado (HSIL) y cáncer cervico-uterino invasor.
El virus 16, es únicamente de alto riesgo u oncogénico y se encuentra en el 50% de los
casos de CaCU (Muñoz y Bosch, 1977). El proceso de carcinogénesis puede ser evaluado
visualmente (colposcopia y técnicas relacionadas), microscópicamente (citología e
histología) y molecularmente. Esto ha conducido a entender y avanzar en el paso crítico,
que va de un cérvix normal a un cáncer (10). La infección por el VPH se estudia mejor a
nivel molecular porque muchas infecciones no son microscópicamente evidentes o visibles
por el clínico. Por otro lado, los estudios serológicos no son muy sensibles por lo que
muchas mujeres infectadas no son sero-positivas.
La prevención de CaCU recae en el escrutinio y tratamiento de las lesiones
precancerosas con nuevas tecnologías y el desarrollo de vacunas profilácticas para VPH
(11).
14
2.2
CÉRVIX UTERINO y VPH
El cáncer cervico-uterino (CaCU) es la segunda causa más común de cáncer en
mujeres, diagnosticándose aproximadamente 500,000 casos de cáncer cervical invasor cada
año en el mundo. Es responsable de 190,000 muertes anuales, de las cuales, 78% ocurren
en países subdesarrollados. Durante los últimos años, la incidencia y mortalidad en EUA y
países desarrollados ha disminuido notablemente, pero no es así en países en desarrollo
(12). Las mujeres de México incluyendo a las de América Latina tienen el triple de
incidencia y mortalidad por CaCU comparado con Estados Unidos (13). La causa principal
de cáncer es la infección crónica con el VPH especialmente los tipos 16 y 18 (14-15). La
prevalencia del VPH es de 10 al 40 % de la población general dependiendo de la población
estudiada y los métodos de detección (14-16).
Las infecciones ano-genitales por VPH, así como las verrugas tienden a resolverse
de manera espontánea, teniendo una media aproximada de 1 año decreciendo con el tiempo
y teniendo así VPH no detectable en dos años (10). En un estudio realizado en mujeres
jóvenes sexualmente activas, tuvieron una incidencia en tres años de 43% disminuyendo la
frecuencia 20% en el primer año y al final del estudio solo un 9 % (17).
Otros factores, sin embargo, pueden estar presentes con la infección del VPH y
hacer de esta manera que se modifique la incidencia y la tasa de mortalidad del CaCU, así,
tenemos al tabaquismo, infecciones de transmisión sexual concomitante, paridad, variantes
del tipo viral e incluso los métodos utilizados como escrutinio para CaCU, pero sin lugar a
dudas aun persiste en algunos países y algunas regiones la falta de educación y una
promoción de la salud deficiente.
15
2.3
CÁNCER CERVICO-UTERINO EN MÉXICO
México tiene una de las tasas más elevadas de cáncer invasor en el mundo
(44.4/100.000) con aproximadamente una muerte cada 2 horas (18).
El registro nacional de Cáncer ubica al CaCU como la neoplasia más
frecuente, y en el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) es la neoplasia más común
en la mujer. En 1998 la tasa de mortalidad por ésta enfermedad fue de 8.2 por 100 000
mujeres derechohabientes usuarias, con oscilaciones desde 2.8 en Hidalgo hasta 16.4 en
Colima. Los estados de Quintana Roo y Colima son las entidades federativas que durante
dicho año notificaron las mayores tasas de incidencia y mortalidad (19).Para el año 2001 en
el estado de Colima se reportaron 36 defunciones por CaCU con una tasa de 18.5 por
100,000 habitantes, ocupando el 4° lugar a nivel nacional, solo por debajo de Chiapas,
Quintana Roo y Tabasco (19).
En la ciudad de México se ha encontrado una prevalencia de VPH en el 17% de
mujeres sanas y llega al 87% en las enfermas con CaCU. Por otra parte, se presenta una
prevalencia de 83% en HSIL y 33% en LSIL (19-20). Estos hallazgos concuerdan con la alta
incidencia de CaCU observada en México.
Por otra parte, así como la vagina y vulva, la piel del pene es frecuentemente
huésped del VPH, aunque el cáncer en estos casos se desarrolla de forma rara. La
circuncisión reduce la probabilidad de infección por VPH, por tanto, la circuncisión reduce
el riesgo de CaCU entre las parejas sexuales (21).
El estándar de oro para el diagnóstico de VPH es la detección de ADN de VPH. La
introducción del método de la RCP ha hecho disponible un test específico y altamente
sensitivo para la detección de VPH. Se ha utilizado la RCP para identificar ADN de VPH
en frotis cervico uterino (Papanicolaou) y en cortes de biopsias tisulares embebidos en
parafina de pacientes con SIL y CaCU con ésta tecnología todos los tipos carcinogénicos
importantes se detectan con eficacia (22). Así también, el uso de biopsia de piel de prepucio
o escroto dirigido en zonas aceto-positivos y toma de muestra con cito-cepillo en prepucio,
da resultados favorables para detectar ADN de VPH.
16
En la clínica de displasias del servicio de ginecología de nuestro hospital se habían
detectado 37 casos de SIL de alto grado y 8 CaCU en el periodo comprendido de
diciembre de 1999 a enero de 2001.
2.4
VPH Y VARONES
La existencia de reservorios de VPH potencialmente oncogénicos entre varones
muchas veces es subclínica. Existen sin embargo, una clara relación entre VPH de alto
riesgo y cáncer de pene (23-24). Se ha correlacionado, incluso, VPH con neoplasias en otros
sitios distintos a los señalados, tales como carcinoma de células trancisionales de vejiga,
uretra, laringe, ano etc. (25). Por lo anterior sin embargo, cabe señalar que algunos reportes
han concluido la falta de evidencia, del papel que pudiera tener el VPH en el desarrollo del
carcinoma de células trancisionales en la vejiga (26).
Los cambios histológicos premalignos a nivel de pene concordantes con SIL se
denomina neoplasia intra-epitelial peniana (NIP I, II o III). Parejas masculinas de mujeres
con HSIL tienen mayor probabilidad de NIP que condilomas (27). En estudios recientes se
han encontrado ADN de los tipos 16 y 18 de VPH hasta en el 33% de las parejas sexuales
de mujeres con HSIL (21).
En el estudio histopatológico de biopsia de zonas ácido acético positivas del pene –
máculas y pápulas con cambios neoplásicos, se han encontrado VPH de alto riesgo hasta
el 94% de los casos y en controles sanos se observan cambios histológicos sugestivos de
infección por VPH, pero cuando se hace tipificación para ADN VPH el resultado es
negativo, por lo que se considera que los exámenes histopatológicos de signos de infección
por VPH distintos a neoplasia son de valor limitado (28). Se ha documentado el grado de
concordancia entre citología exfoliativa y biopsia para detectar ADN del VPH, con
resultado de 65.25%. Obteniendo una sensibilidad de 81% y una especificidad de 96% para
el exudado cervical, tomando como referencia a la biopsia. Así, resultaron muestras
positivas para optima detección de VPH en el 74.7% con biopsia y 61.5% con exudado
cervical. (29). Este trabajo tiene relevancia en el sentido de que las muestras que se toman
de pene, son mediante la técnica de exfoliación.
La magnitud de la contribución del hombre al riesgo de desarrollar canceres
relacionados con el VPH en la población, depende principalmente de dos factores: el patrón
17
de conductas sexuales en la población y la prevalencia de VPH en la misma. Este concepto
no es nuevo, fue propuesto por primera vez por Skegg y cols. en 1982, antes de que el VPH
fuera identificado como agente causal del cáncer de cérvix. Estos investigadores
propusieron que en algunas poblaciones “el riesgo de cáncer de cérvix, depende menos de
la propia conducta sexual de las mujeres que de su marido u otros compañeros sexuales”.
De esta forma Skegg, propuso tres patrones de comportamiento sexual.
Patrón A: se observaría en comunidades no promiscuas, monogamia entre mujeres y
hombres.
Patrón B: sería observado en algunas comunidades latinoamericanas, en las que suelen ser
mujeres monógamas mientras que los hombres tienen muchas parejas sexuales.
Patrón C: sería observado en la sociedad más liberal, con hombres y mujeres con muchas
parejas sexuales. Finalmente éste autor, postulaba que la incidencia de cáncer de cérvix
debería ser más baja en patrón A y más alta en patrón C.
Aunque la distribución del VPH es amplia en la zona genital, se han determinado
los porcentajes encontrados por zona genital y que pueden apoyarnos en la toma de
muestras donde no hay sospecha clínica de lesiones (tabla I) (30).
Tabla 1.
Distribución anatómica ano-genital del VPH en pacientes masculinos
Sitio
Porcentaje *
Superficie interna de prepucio
70%
Surco balano prepucial y frenillo
10%
Glande y escroto
10%
Ano
10%
Uretra
5%
* El total excede al 100% debido a la distribución multicéntrica de infección por VPH
18
Habría de suponerse, que la mucosa distal de uretra pudiera estar altamente
infectada por VPH cuando la infección se encuentra presente en genitales, sin embargo,
otros estudios han concluido la baja incidencia de VPH en uretra distal(31). En un estudio
comparativo realizado en la ciudad de Cuernavaca México, se pudo demostrar que las
muestras tomadas de orina solo pudieron detectar el 14 % del gen β-globina y sin embargo,
las tomadas en prepucio y surco balano-prepucial se demostró hasta en el 95% (32). Esto
nos indica que la uretra no sería el sitio ideal para tratar de identificar DNA del VPH.
2.5
EL EFECTO DEL VPH EN LA MOTILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES
Han sido analizados en varios estudios descriptivos la motilidad espermática
relacionada a la presencia de VPH. En uno de ellos, descrito por Lai y Cols. (33) se señala
una alta significancia de astenozospermia comparada con un grupo donde no hubo
evidencia de VPH. Aunque el grupo fue pequeño y el estudio fue descriptivo, vale la pena
señalar la importancia de realizar estudios más amplios y con controles adecuados que
permitan señalar la significancia estadística si es que la hay, sobre esta alteración
espermática.
En otros estudios, sin embargo, han demostrado la presencia del VPH dentro
de los espermatozoides e incluso con expresión activa, lo que nos indica que pueden servir
como vectores y llevar la transmisión del virus a la pareja sexual o al feto a través del
huevo fecundado (34-35). Recordemos que el DNA del VPH una vez que se incorpora dentro
de la célula puede permanecer en estado físico episomal, es decir, en cadena circular sin
integrarse al genoma de la célula y por otra parte abrirse esta cadena e incorporarse al
genoma de la célula, sin embargo, en ambos estados se encuentran expresándose en forma
activa .
Estos datos apoyan algunos reportes de casos en infantes infectados por VPH
donde no hubo evidencia de abuso sexual y suponen esta manera transmisión congénita
(36).
19
Este reporte mencionado en un lactante de 17 meses de nacido con condiloma
acuminado recurrente, nos hace pensar en la presencia de esta infección por esta vía, pero
sin descartar como primera causa el abuso sexual.
2.6
CIRCUNCISIÓN Y VIRUS DEL VPH
La circuncisión reduce la probabilidad de infección por VPH probablemente debido
a la reducción de la infección en un epitelio cornificado, de esta manera, la circuncisión
disminuye significativamente el riesgo de CaCU en mujeres pareja sexual de estos
hombres (37). Por otro lado, se cree que el examinar a la pareja masculina de mujeres con
infección por VPH es de valor incierto (38).
Aproximadamente el 65 % de hombres pareja sexual de mujeres con displasia
genital y condiloma tienen signos clínicos de infección por VPH en sus genitales. Estos
cambios de la piel asociados al VPH son frecuentemente no visibles si no se magnifica la
imagen. Esto ha sugerido que pueden ser responsables de la diseminación y propagación
del virus entre sus parejas sexuales (mujeres) y como consecuencia, desarrollar condiloma,
displasia o incluso cáncer invasor (39).
2.7 VPH Y VACUNAS
La inmunidad específica para VPH después de una infección natural se encuentra
limitada, principalmente porque la infección por dicho virus es superficial y muchos genes
de estos virus se expresan en niveles bajos. El desarrollo de vacunas para las infecciones
del VPH está dirigido para inducir inmunidad humoral y celular para que se pierda la
progresión y se genere la regresión de las infecciones por VPH (40).
Las vacunas pueden ser profilácticas o terapéuticas. Las vacunas profilácticas están
diseñadas para la prevención de infección primaria y por otro lado, las vacunas terapéuticas
se diseñan con el propósito de prevenir la progresión de la infección de VPH o que
progrese una lesión de bajo grado a alto grado o incluso, se pueda erradicar un CaCU
20
residual. Este último tipo de vacunas se han enfocado principalmente en las regiones E6 y
E7 debido a su papel en la oncogénesis.
En los inicios de los 90`s algunos investigadores pudieron producir la expresión de
la núcleo-cápside de la región L1 en cultivos de células eucariotas y así desarrollar
partículas como virus del VPH (VLPs). Este tipo de partículas son idénticas a los viriones
del VPH pero sin el núcleo del DNA, de tal manera que se pueden producir anticuerpos
sin producir infección o riesgo oncogénico. Estudios en fase I y II han demostrado que son
bien tolerados y seguros (41). Recientemente se presentó el primer estudio hecho con
vacunas para la prevención de la infección VPH 16, teniendo resultados muy alentadores
pero siendo altamente específicos con el genotipo. Esto ha generado investigaciones
relacionadas a las vacunas bi-valente y tetra-valente que puedan actuar en los virus más
frecuentes y de alto riesgo (42).
Se requiere aún de muchos estudios de investigación relacionados a las vacunas
para VHP. No solamente el conocer la efectividad y los efectos colaterales de la misma en
el control de la infección, sino también, en la manera de producir en gran escala dicha
vacuna con bajos costos. Pero sobre todo el hacer conciente a la población de la
importancia de dichas vacunas y su aplicación, incluso en población sin vida sexual activa
pero con alto riesgo.
Es posible contar con dichas vacunas en 5 o 10 años para su aplicación general y así
demostrar por medio de estudios específicos la utilidad en el control de CaCU y condiloma
humano.
21
3. JUSTIFICACIÓN
La elevada frecuencia de CaCU y la alta tasa de mortalidad en mujeres que radican
en el estado de Colima, nos hace reflexionar y a la vez preocuparnos sobre la importancia
que tiene el conocer los factores de riesgo asociados a el CaCU.
¿Cual es la asociación del virus del papiloma humano de alto riesgo presente en varones
que tienen pareja sexual con lesiones pre-malignas de cérvix uterino?
Está ampliamente conocida la relación estrecha que guarda las lesiones premalignas y el CaCU con la presencia de VPH de alto riesgo u oncogénicos. También se
conoce que la vía de transmisión del VPH es mayormente la vía sexual, aunque se
reconozcan otras vías no sexuales. Sin embargo, podemos decir en términos generales que
la alta prevalencia de VPH tiene relación directa con la pareja sexual.
Muchas referencias hace alusión a la frecuencia, distribución y tipificación del
VPH en mujeres y solo algunas se han encaminado a determinar frecuencias y correlación
viral con la pareja sexual.
Conociendo que dentro del territorio nacional Colima ocupa uno de los
primeros lugares de CaCU y una de las mayores tasas de mortalidad, es por esta razón la
importancia de determinar cual es la frecuencia y de que manera se asocia el VPH en
hombres pareja sexual de mujeres con lesiones pre-malignas y CaCU.
En la última década, las investigaciones empezaron ha dirigirse en la identificación
de vacunas que pudieran brindar protección y más aun pudieran ser efectivas en la
erradicación de los VPH, sin embargo, la gran variedad y especificidad de los virus han
limitado la cobertura de la mayoría de los virus de alto riesgo y más aún las dificultades
que entraña la producción masiva de dichas vacunas.
El partir de este estudio de casos y controles, y la relevancia que pensamos puede
tener, va encaminada sobre todo a ofrecer datos confiables de la prevalencia de este virus
en hombres en una ciudad con la más alta incidencia y mortalidad por CaCU prácticamente
del mundo y poder así, analizar si es un factor de riesgo la infección de VPH en varones
cuando su pareja sexual presenta lesiones pre-malignas y CaCU. El conocimiento de esta
22
información nos dará un diagnóstico epidemiológico, y entonces sí, procurar la adquisición
y aplicación de vacunas profilácticas y terapéuticas según sea el caso.
4.
HIPÓTESIS DE TRABAJO
El virus del papiloma humano en varones es un factor de riesgo para el desarrollo de
neoplasia intraepitelial de cérvix uterino en su pareja sexual.
4.1
HIPÓTESIS ALTERNA
El virus del papiloma humano de alto riesgo en varones, se asocia en su pareja
sexual, que presenta neoplasia intraepitelial de cérvix uterino.
4.2
HIPÓTESIS NULA
El virus del papiloma humano de alto riesgo en varones no se encuentra asociado en
su pareja sexual que tiene neoplasia intraepitelial de cérvix uterino.
23
5.
OBJETIVOS
a.- GENERAL
Evaluar la asociación del VPH de alto riesgo en varones y su pareja sexual con neoplasia
intraepitelial de cérvix uterino en el estado de Colima.
b.- ESPECÍFICOS
1.-Describir la frecuencia de VPH entre hombres, pareja sexual de mujeres portadoras de
neoplasia intraepitelial de cérvix uterino.
2.-Determinar los tipos de VPH más frecuentes en hombres que son pareja sexual de
mujeres con neoplasia intraepitelial de cérvix uterino.
3.-Analizar la asociación del VPH de alto riesgo entre la pareja sexual.
24
6.
6.1
MATERIAL Y MÉTODOS
CLASIFICACIÓN DEL DISEÑO DEL ESTUDIO
CASOS Y CONTROLES
6.2
CRITERIOS DE SELECCIÓN
6.2.1
INCLUSIÓN
a.
–Hombres, pareja sexual de mujeres con neoplasia intraepitelial
de cérvix
uterino diagnosticadas histológicamente.
b.
–Hombres, pareja sexual de mujeres con estudio citológico de cérvix uterino
negativo para neoplasia.
c.
–Mujeres
portadoras de neoplasia intraepitelial
de cérvix uterino
diagnosticadas por estudio histológico.
d.
6.2.2
a.
–Mujeres con estudio citológico de cérvix uterino negativo para neoplasia.
EXCLUSIÓN:
– Hombres que presentaron otra alteración o patología en pene o genitales que
impidió o dificultó su estudio, tales como: Herpes genital, pediculosis, blenorragia,
psoriasis, HIV positivos, bajo tratamiento antiviral o inmuno-modulador, haber recibido
radioterapia y quimioterapia.
b.
– Hombres que siendo pareja sexual de mujeres incluidas en el estudio no
quisieron participar en el estudio.
25
6.2.3
ELIMINACIÓN:
a.
–Cuando la muestra resulte insuficiente para la extracción del DNA.
b.
–Cuando la muestra resulte con errores técnicos durante su procesamiento.
c.
– Hombres que habiendo manifestado su anuencia a participar en el estudio,
desearon retirarse del mismo, bajo cualquier circunstancia.
Casos:
Mujeres con neoplasia intraepitelial de cérvix uterino
Controles:
Mujeres con estudio citológico de cérvix uterino negativo
Ambos casos y controles se obtuvieron de una misma población de referencia.
Factor de riesgo principal:
VPH en hombres
Medición de exposición: presencia o ausencia
26
6.3
Tabla 2.
Variables
Neoplasia intra-
Operacionalización de variables
Interrelació Nivel de dUnidad
Dependiente
epitelial de
dDefinición conceptual Definición
medición
medición
Cualitativa
Presente(+)
Alteración de la diferencia
Diagnóstico histopato-
Nominal
Ausente (-)
ción del epitelio escamoso,
lógico de lesión pre-
afecta solo tercio inferior,
maligna de bajo y alto
medio y superior del espesor
grado.
cérvix uterino.
operativa
del epitelio.
Independiente
VPH
Cualitativa
Presente(+)
Presencia de banda de 188
Presencia o ausencia
Nominal
Ausente (-)
pb por electroforesis en gel
ADN de VPH por
poliacrilamida al 6%.
medio de RCP.
27
6.4
Tabla 3.
Variable
Edad de inicio de
Variables de confusión
Interrelación Nivel de
Independiente
actividad sexual
Número de parejas
Independiente
sexuales en últimos
Definición
Definición
medición
conceptual
operativa
Cualitativa
Edad expresada
-Hasta 18 años y –Más
Dicotómica
en años cumplidos
de 18 años
Cualitativa
Encuentros sexuales
Nº- de parejas sexuales
Politómica
con distintas parejas no relacionad -Una
5 años
con pareja
-de dos a tres
actual
-más de tres
Cualitativa
Expresado como
Gonorrea
transmisión
Nominal
presencia de otras
Tricomoniasis, Herpes genital,
sexual concomitantes
Dicotómico
enfermedades de
Clamidia tracomátis y otras.
Enfermedades
Independiente
transmisión sexual
Tabaquismo
Paridad
Independiente
Independiente
Cualitativo
Hábito de fumar
-Fumador o
Dicotómica
Cigarro diariamente
-No fumador
Cualitativa
Número de embarazos
Dicotómica
-De uno a 3 embarazos y
-más de tres embarazos
28
6.4.1
MANEJO DE VARIABLES DE CONFUSIÓN
Se utilizó Chi cuadrada para cada variable de confusión, haciendo dicotómicas a las
siguientes variables: Paridad, inicio de vida sexual activa, enfermedades de transmisión
sexual, tabaquismo y para número de parejas sexuales se estratificó en tres categorías, a. /
una pareja sexual. b. / de dos a tres parejas sexuales y c. / de 4 a más.
6.5
DEFINICION CONCEPTUAL
La neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) constituye una alteración de la
diferenciación del epitelio escamoso del cérvix o cuello uterino, que afecta los diferentes
niveles de espesor de esta estructura y se caracteriza histo-patológicamente por pérdida de
maduración, aneuploidia nuclear y figuras mitóticas anormales. Estas lesiones se
consideran precursoras de las neoplasias invasoras del cuello uterino (43).
La neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) SIL, se clasifica en:

Neoplasia intra-epitelial cervical 1(NIC1) LSI, si está afectado
el tercio inferior del espesor del epitelio.

Neoplasia intra-epitelial cervical 2 (NIC2) HSIL, si están
afectados tercio inferior y medio del espesor del epitelio

Neoplasia intra-epitelial cervical 3 (NIC3) HSIL, si están
afectados los tres tercios del epitelio (carcinoma in-situ).
6.6
TÉCNICA PENOSCOPIA O ANDROSCOPIA
El área genital (pene, escroto, pubis) y la uretra distal hasta 2 centímetros, se
observaron clínicamente y con visualización bajo aumento por colposcopia con lente de
aumento 5x 10 antes y después de la aplicación del ácido acético al 5% en gasa. Dicha gasa
29
humedecida se aplicó sobre la zona genital y se dejó por 5 minutos, se tomaron muestras y
se anotaron los hallazgos clínicos.
6.7
OBTENCIÓN DE MUESTRA PARA HISTOLOGÍA
El diagnóstico histológico se confirmó con biopsia dirigida. La biopsia consiste en
un pequeño fragmento de tejido procesado y embebido en parafina, al que se realizan
múltiples cortes para su tinción y observación bajo microscopia. Estas muestras analizadas
fueron revisadas y descritas por un solo patólogo.
6.8
OBTENCIÓN DE MUESTRAS PARA RCP
A los participantes hombres, se les tomó citología peniana y de fosa
navicular para el diagnóstico molecular de infección por VPH. La muestra se tomó
raspando la superficie del surco balano-prepucial y con movimientos de rotación en fosa
navicular con cito cepillo, rotulándose debidamente con datos completos del paciente.
El citocepillo se deposito en un micro tubo de 2 ml con 1 ml de solución
amortiguadora TBE. Los tubos se refrigeraron a –20° C hasta el momento en que se realizó
la extracción del ADN en el laboratorio de genética
del Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas (CUIB).
6.9
EXTRACCIÓN DEL ADN DE EXFOLIACIÓN PENIANA
OBTENIDO POR CITO-CEPILLO
1.- Se centrifugaron los micro tubos que contenían a los cito cepillos, por 20 seg. A 10,000
rpm.
2.- Con movimientos circulares se retiró el citocepillo.
3.- Se centrifugó de nuevo a 10000 rpm por 25 minutos y se quitó el sobre-nadante con
cuidado de no tirar el botón.
4.- Se agregaron a las muestras 100 μl de solución de digestión que contenía 200 μl de
Proteinasa K.
5.- Se dejo en baño Maria a 37 ºC de uno a tres días.
30
6.-Se inactivo la Proteinasa K a 98ºC durante 8 minutos.
7.- Se agregó un volumen de fenol-cloroformo-alcohol- isoamílico (25:24:1). Se mezclo
bien, y después de separar las dos fases por centrifugación a 10 000 rpm. por 10 minutos a
4ºC. se tomó la fase acuosa superior y se pasó a otro tubo, con cuidado de no tomar la
interfase.
8.- Se agregó volumen igual de cloroformo-alcohol –isoamílico (24:1). Se centrifugó a 10
000 rpm. por 10 minutos a 4ºC. Se tomó la fase acuosa cuidando de no tomar la interfase,
trasfiriéndolo a otro tubo.
9.- Se agregó dos volúmenes de alcohol absoluto frío y una décima de volumen de acetato
de sodio 3M a un pH 5.2 permitiendo que el ADN precipitara a -20ºC al menos una hora.
10.- Se centrifugó a 7 000 rpm. por 10 minutos y se eliminó el exceso de alcohol, sin tirar
el botón.
11.- Posteriormente se agregó 50 μl de alcohol al 70% y se centrifugó a 7 000 rpm. por 10
minutos.
12.- Posteriormente se secó el botón con el tubo destapado por al menos 2 hrs.
13.- Finalmente se disuelve el botón con 100 μl de solución amortiguadora TE 1X estéril,
dejando en baño María a 37ºC por 24 hrs.
6.10
CUANTIFICACIÓN Y PUREZA DEL ADN EXTRAIDO
Para la determinación y pureza del ADN extraído se realizó mediante dos métodos:
Cualitativo y Cuantitativo.
a.- Cuantitativo: Por espectrofotometría se determinó cantidad y pureza de ADN
considerando calidad óptima del ADN la relación ADN /proteínas mayor de 1.8.
b.- Cualitativo: consistió en determinar integridad y pureza del ADN por electroforesis en
gel de agarosa al 1% con solución amortiguadora TBE 1X.
Una vez determinada la calidad y cantidad de ADN se realizó la dilución de trabajo a una
concentración de 100ng/µ para RCP.
31
6.11
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
6.11.1
Condiciones de la RCP
Se utilizaron los siguientes iniciadores universales que se unen a la región E1 de los
VPH: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 56 y 58.
Se utilizaron como iniciadores los siguientes Oligonucleótidos.
La secuencia CPIIG: 5´ ATG ´ TTA ´ ATT ´ GAC ´ CCT ´ CCA ´ AAA ´ TT 3´
La secuencia CPI: 5 ´ TTA ´ TCA ´ TAT ´ GCC ´ CAT ´ TGT ´ ACC ´ AT 3´
Fragmento amplificado de 188 pb.
La RCP se efectuó en un termociclador modelo ROBOCYCLER gradient-40, con tapa
caliente, marca STRATAGENE.
La composición final de las muestras que se sometieron a la amplificación a través de este
termociclador se representa en la tabla 2.
32
Tabla 4.
Composición del volumen final de 20 μl
de la muestra
amplificada por RCP.
REACTIVO
Solución amortiguadora
CONCENTRACIÓN
CONCENTRACIÓN
INICIAL
FINAL
10X
1X
de reacción
MgCl2
50Mm
1.5 Mm.
Iniciador cp II
10pmol/μl
1 pmol/μl
Iniciador cp I
10pmol/μl
1 pmol/μl
Datp
10Mm
0.2 Mm
-Dctp
10Mm
0.2 Mm
-Dgtp
10Mm
0.2 Mm
DtP
10Mm
0.2 Mm
Taq polimerasa
5U/ μl
0.5 U totales
ADN blanco
100 ng/ μl
Agua bidestilada
0.01 μg/ μl
Aforar a 20 ul
33
6.11.2.
En la tabla 3 se describen los ciclos y las temperaturas empleadas en el
termociclador para la amplificación de las muestras.
Tabla 5.
Programa de temperaturas para la reacción de RCP.
Paso 1
Desnaturalización inicial
94ºC por 5 minutos
Paso 2
Desnaturalización
94ºC por 30 segundos
Paso 3
Alineamiento
51ºC por 30 segundos
Paso 4
Extensión
72ºC por 1 minuto
Paso 5
Ir al paso 2, 32 veces Total 33
veces
Paso 6
Extensión final
10 minutos a 72ºC
Paso 7
Conservación
4ºC, tiempo indefinido
Paso 8
Fin del programa
Para cada RCP se realizaron controles de calidad en el diagnóstico de VPH, con un control
negativo (agua bidestilada) y uno positivo a la presencia del VPH, para la cual se utilizó
ADN extraído de la línea celular SIHA.
34
6.12
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Y TINCIÓN
CON NITRATO DE PLATA
El producto amplificado de 188 pb producto de RCP, se visualizó por electroforesis
en gel de poliacrilamida al 6% en TBE 1X.
Se pre-corrió el gel a 120 voltios por 10 minutos en la cámara de electroforesis
vertical y luego en cada pozo del gel se aplicó 10μl de la solución del amplificado con 3μl
de jugo azul. En cada uno de los pozos centrales, se aplicó 4μl de una escalera de
fragmentos de ADN de 50 pb como marcador de peso molecular. El gel
se corrió
inicialmente a 120 voltios por 10 minutos y luego 160 voltios por 1 hora 20 minutos,
después se retiró el gel de la cámara vertical y se tiñó con nitrato de plata.
Para la tinción con nitrato de plata: Se colocó el gel en solución fijadora durante 10
minutos
-15 ml alcohol 95%
-0.75 ml ácido acético glacial
-150 ml agua destilada
Después se colocó el gel en solución de nitrato de plata durante 10 minutos
-0.3 g nitrato de plata
-150 ml agua destilada
Se enjuago 1 vez por lo menos de 15 segundos en agua destilada y finalmente se
adicionó 150 ml de solución reveladora y esperando (5 min.) a que se revelen las
bandas.
-4.5 g NaOH
-0.75 ml formaldehído 37%
-150 ml agua destilada
35
6.13
IDENTIFICACIÓN DE TIPO VIRAL UTILIZANDO EL MÉTODO
HIBRIDACIÓN REVERSA SIMPLE
Las muestras positivas para el ADN de VPH se utilizaron para la identificación del
tipo(s) VPH, utilizando el método descrito por Gravitt (44). En esta metodología, la
detección y tipificación de VPHs se realiza mediante la RCP utilizando los sistemas de
iniciadores y sondas My09/My11 y GP5/GP6 que facilitan la identificación de 27 tipos (18
asociados a cáncer y 9 no asociados). En todas las reacciones se incluye un par de
iniciadores para el gen de la globina-B, el cual sirve como control interno para demostrar la
presencia de DNA genómico amplificable. Brevemente, este procedimiento consiste en lo
siguiente: el ADN es sometido a la amplificación utilizando iniciadores marcados con
biotina. Posteriormente el producto amplificado, se transfiere a membranas de Nylon
mediante la técnica de hibridación reversa. Esta técnica consiste en desnaturalizar el
producto amplificado y después se realiza una incubación con las membranas que
contienen oligonucleótidos para la tipificación de los 27 tipos de VPHs. Haciendo lavados
de alta astringencia se logra que el producto amplificado se fije específicamente a la
membrana, después se adiciona el conjugado y el sustrato de la enzima lo que producirá el
color para posteriormente realizar la tipificación (fig.1). Como cada oligonucleotido
específico para cada VPH esta ubicado en un lugar determinado dentro de la tirilla o
membrana de Nylon, la posición en donde se desarrolle color determinara el tipo de VPH
encontrado en la muestra.
36
Cromógeno
(NBI/ BCIP)
Precipitado
púrpura
3’
Fosfatasa alcalina
Estreptavidina
Biotina
DNA amplificado
5’
Sonda de DNA
TTT
TT
TT
Tirilla de nylon
Figura 1. Esquema de una hibridación reversa. La sonda de ADN es retenida al papel
de nylon por medio de una cola de poli-T. Después de que el producto amplificado ha
sido marcado con biotina (contenida en los iniciadores), este se incuba con la sonda y se
realizan lavados de alta astringencia para permitir la unión de la sonda con el producto
amplificado y se agrega el conjugado de estreptovidina-fosfatasa para luego añadir el
sustrato de la enzima, lo que va a producir color.
37
6.14
Fig. 2.
Flujograma de la metodología realizada en el estudio.
PROCESO DE LAS MUESTRAS
EXTRACCIÓN DE ADN: CITO-CEPILLO
Determinación pureza y calidad de ADN
Pureza: electroforesis-gel agarosa al 1%
Concentración: espectrofotometría
Condiciones aceptables
(repurificar)
Condiciones
no
aceptables
AMPLIFICACIÓN DE LAS REGIONES E1 DEL VPH POR RCP.
(Observación del producto por electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%)
Positivo (VPH)
Negativo (VPH)
Método de discriminación por medio de hibridación reversa simple
Identificación de los tipos de VPH
38
6.15
TAMAÑO DE LA MUESTRA
El tamaño de muestra se obtuvo de la fórmula propuesta en el paquete Epiinfo 2000
V.6 para tamaño de muestra en estudio de casos y control según el autor Joseph L. Fleiss en
su libro”Statistical Methods for Rates and Proportions” Second edittion. del editor John
Wiley & Sons, 1981, 44-45.
Fórmula
m=
m´
4
[1 + √ 1 + 2(r + 1)
m´r
(P2 – P1)
IC = 95%
Poder de la prueba = 80%
Teniendo una prevalencia de 59% de enfermos (Hombres pareja sexual de mujeres con
lesiones pre-maligna y CaCU).
Tendiendo una prevalencia de 10% de sanos (Hombres pareja sexuales de mujeres sin
lesiones o sanas)
Para tratar de explicar la prevalencia tomada como referencia en la elaboración del
tamaño de muestra, tenemos lo siguiente:
Prevalencia de VPH en hombres pareja sexual de mujeres sanas sin lesiones cervicales.
Boch y Castellsague (España) Artículo publicado en la revista J. Natl Cáncer Inst. 1996;
88.1060. Prevalencia de 3.5 %.
Grussendor – Conen y cols. (Alemania) Lancet.1986; 2: 1092 muestra una prevalencia de
8-11 %.
39
Prevalencia de VPH en varones pareja sexual de mujeres
con lesiones premalignas:
artículo de Bleeker y cols. Journal American of Dermatology. 2002; 47(3): 351-357.
Prevalencia de 59%.
Tamaño de la muestra:
18 casos
18 controles
36
10 % de pérdidas =
Sub – total población de hombres
40
40
6.16
TÉCNICA DE MUESTREO
Consecutivos (Casos Incidentes)
6.17
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para estadística descriptiva, se utilizaron promedios y porcentajes (en valores cuantitativos)
Para estadística inferencial, se utilizaron las pruebas Chi2 con corrección de Yates (Val.
Menos de 5) o exacta de Fisher y t. de Student.
Odd-ratio para determinar riesgos o asociación entre causa y efecto.
En todas las pruebas se utilizará un IC de 95% y se consideró significancia estadística si
p = <0.05.
6.18
CONSIDERACIONES ÉTICAS
El estudio se realizó de acuerdo a las normas de ley general de Salud de la
República Mexicana, declaración de Helsinki (1964) enmendada en el 2000 (45).
Los resultados fueron manejados en forma confidencial, tanto para la mujer como
para su pareja sexual. Los resultados estuvieron disponibles solo de manera personal si el
paciente lo pidió.
El riesgo que tienen los pacientes incluidos en el estudio es mínimo, clasificado como
categoría II de la Ley General de Salud, titulo segundo capitulo I, Art.17.
41
7.
RESULTADOS
Al concluir los resultados, se obtuvieron 61 muestras, de las cuales se
excluyeron de forma definitiva 8 muestras por no tener suficiente DNA en calidad y
cantidad, analizando al término del estudio 53 muestras, 21 casos y 32 controles.
Para la comparación de ambos grupos, de acuerdo a su edad se utilizó t-Student, teniendo
como resultado los siguientes datos expresados en la tabla 4.
Tabla 6.
Resultados de los promedios obtenidos por grupo.
Media (edad)
Desviación estándar
Varianza
Casos
34.4
9.57
91.7
Controles
30.6
9.02
81.4
Prueba F. Para comparar varianza: estadístico F = 1.12
Por lo tanto, suponiendo varianzas iguales:
t-Student: Estadístico t = 1.47
p=
0.14
con p = 0.37
42
Se utilizó Chi2 para buscar asociación entre factor de riesgo, (VPH en varones), con
neoplasia intraepitelial de cérvix uterino en su pareja sexual, por lo que se empleó tabla de
2x2.
Tabla 7. Tabla de contingencia 2 x 2 para asociación del virus del papiloma humano
en el hombre y muestras cervicales con neoplasia intraepitelial cervical o
papanicolaou normal en la mujer.
CASOS
CONTROL
TOTAL
VPH
+
3
2
5
VPH
-
18
30
48
21
32
53
TOTAL
Odds ratio 2.5 IC 0.38 – 16.41
p= 0.37 (Exacta de Fischer)
Proporción de casos 14% Proporción de controles 6 %
Los resultados obtenidos en la tipificación del virus, mediante el método de reversohibridación simple fueron en el grupo de casos los tipos virales, MM4, 42 y 57 y para el
grupo de controles fueron el 66 y 53.
43
A continuación se describen los resultados obtenidos de las variables de confusión y
que por los resultados obtenidos, no fue necesario emplear alguna fórmula estadística
inferencial (tabla 8).
Tabla 8. Resultados obtenidos de las variables de confusión, utilizando la tabla de
contingencia 2 x 2 y 2 x 3.
Variable
Odds ratio
IC
Valor p*
2.8
0.68 - 11.4
0.16
1.3
0.35 – 5.17
0.73
Enfermedades de
Transmisión
Sexual
Inicio de Vida
Sexual Activa
Nivel 1 0.53
0.28 – 1.00
Número de parejas
Nivel 2 1.00
0.20 - 4.95
sexuales
Nivel 3 3.00
0.31 – 28.8
0.25
2 gl.
Paridad
1.21
0.38 – 3.85
0.77
Tabaquismo
0.45
0.08-2.5
0.45
*Chi 2, prueba utilizada para variables cualitativas
44
8.
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el presente trabajo nos indican claramente que no
existe asociación estadísticamente significativa, entre ser portador de VPH en varones y
tener una pareja sexual con y sin lesiones precursoras de cáncer cervico-uterino en el
estado de Colima, a pesar de contar con una de las tasas más elevadas de cáncer cervicouterino a nivel nacional. Los tipos virales encontrados en las muestras positivas tanto en el
grupo de casos como en controles, son de bajo grado. Esto tiene relación sobre todo porque
los casos incluidos en la muestra estuvieron mayormente relacionados con parejas que
presentaron lesiones cervicales de bajo grado.
Las variables de confusión analizadas, como gestas, tabaquismo, inicio de vida
sexual activa, enfermedades de transmisión sexual y número de parejas sexuales no son
estadísticamente significativas para el desarrollo de neoplasia intraepitelial de cérvix
uterino en nuestra población.
La proporción de casos positivos en grupo de controles (6%) es similar con lo
reportado en la literatura (46, 47), sin embargo, la proporción de positivos en el grupo de
casos (14%), está muy por debajo de lo reportado en algunas referencias que señalan hasta
un 59 % de casos positivos cuando son pareja de mujeres con lesiones pre-malignas (48).
Sin embargo en un estudio reciente multicéntrico, reportado por Castellsagué y cols. (49),
encontraron un porcentaje de VPH de 16% de todas las muestras tomadas de pene, de un
total de 1139 pacientes, 19.6% de hombres incircuncisos y 5.5 de hombres circuncidados.
Esto nos indica claramente que existe un amplio rango de detección de VPH en pene, y que
va estar influido por una gran variedad de factores que van, desde la prevalencia de VPH
de la población de referencia, la presencia o no de circuncisión en el varón, así como el
comportamiento sexual de la pareja.
También es importante considerar que la capa mucosa del prepucio no esta
queratinizada y por esta razón es más susceptible de infección viral que un epitelio
queratinizado. Esta consideración es importante para explicar la prevalencia de VPH en
varones circuncidados y no circuncidados, lo que también explica la diferente frecuencia
encontrada en la pareja sexual (50).
45
En un estudio reciente donde no se contemplo estatus de la pareja sexual, sino
solamente particularidades epidemiológicas de los hombres incluidos en el estudio, se
obtuvo una prevalencia del 28.2% de casos positivos para el VPH en muestras tomadas del
surco balano-prepucial y glande (51).
En la actualidad la Sociedad Americana de Cáncer y el Colegio Americano de
Ginecólogos y Obstetras recomiendan la realización del Papanicolaou y detección de DNA
de VPH como estudios de escrutinio para CaCU en mujeres mayores de 30 años (52).
Este hecho puede mejorar la detección oportuna de lesiones premalignas y CaCU
sin embargo, en nuestro medio el costo y los medios por la realización de RCP para el VPH
no son accesibles aún para toda la población, ni para instituciones gubernamentales de
salud.
Debido a nuestros resultados donde porcentaje de VPH en el grupo de casos fue del
14% y del grupo de controles fue del 6%, nuestro tamaño de muestra solo alcanza un
potencia del 58% y para detectar la diferencia de ambos grupos con los resultados
presentes, nosotros calculamos que se requiere de un tamaño de muestra de 163 pacientes
por grupo para encontrar diferencia. En nuestro estudio no se tuvo un tamaño de muestra
suficiente para confirmar la asociación del VPH en varones y su pareja sexual.
Las muestras obtenidas por cito-cepillo fueron adecuadas para la obtención de
material de DNA de la zona seleccionada para la identificación del VPH. Aunque la
concentración fue variable, siempre estuvo por arriba de los 50 ng. El correcto manejo de la
muestra nos permitió tener 53 muestras con DNA de calidad el cual fue confirmado con la
realización de electroforesis para primers constitutivos, que siempre amplifican cuando se
encuentra presente ADN epitelial.
Existen pocos reportes epidemiológicos dirigidos en varones relacionados al virus
del papiloma humano. Aunque la mayor relevancia clínica de la presencia del VPH es en
mujeres, es importante contar con estudios de prevalencia y frecuencia viral en varones de
población Mexicana.
Conociendo claramente cuales son los factores de riesgo para el desarrollo de
lesiones pre-malignas de cérvix y CaCU, es importante identificar si alguno de ellos esta
incidiendo en nuestra población o si existiere alguna otra causa no identificada que este
contribuyendo a la progresión de las lesiones.
46
En un estudio reciente de tipo descriptivo, se busco los factores asociados a cáncer
cervical entre mujeres dentro de un sistema de salud en Oakland, teniendo como resultados
que la mayoría de los casos de cáncer (56%), fueron mujeres que no se realizaron
papanicolaou durante un periodo de hasta 36 meses; el 32% por fallas en el papanicolaou
para la detección del CaCU y finalmente un 13% falla en el seguimiento (53).
Conociendo estos informes se podrán
realizar medidas epidemiológicas para
reducir la probable causa de dichas lesiones y más aún emprender estrategias para el
diagnóstico precoz y un tratamiento oportuno.
No contamos en nuestro medio con estudios de correlación de métodos diagnósticos
y pruebas inter o intraobservador, por lo que en expectativa esperamos se realicen y así
podamos tener una idea clara de lo que esta sucediendo en nuestra población.
47
9.
CONCLUSIONES
1. En el presente estudio no se encontró asociación estadísticamente significativa del
virus del papiloma humano en varones, pareja sexual de mujeres con lesiones premalignas de cérvix uterino.
2. La proporción del VPH de muestras tomadas de pene en el grupo de los casos, fue
del 14% y para el grupo de controles fue del 6%.
3. Los tipos virales encontrados fueron los tipos; MM4, 42, 53, 57 y 66, todos de bajo
grado en ambos grupos.
48
10.
EXPECTATIVAS
1. Conocer estudios de prevalencia poblacional de VPH en varones en cualquier región de
nuestro país donde se pueda extrapolar a nuestra población.
2. En mujeres que presentan lesiones cervicales de alto grado y CaCU, falta identificar los
tipos virales existentes y su correlación con su pareja sexual.
3. Se identificaron VPH en muestras tomadas en ambos grupos de estudios y su tipo viral
de forma adecuada, sin embargo falta explorar la sensibilidad y especificidad de
muestras tomadas por cito-cepillo y compararla con la biopsia de lesiones de pene.
4. Falta realizar estudios descriptivos para conocer si la falta de seguimiento en
realización del papanicolaou y falla en la técnica del papanicolaou, son factores de
riesgo para el desarrollo de lesiones premalignas y CaCU y conocer así su riesgo.
49
11.
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|
55
12.
ANEXOS
I.
Hoja de recolección de datos en varones
II.
Hoja de recolección de datos en mujeres
III.
Carta de consentimiento informado
56
HOJA DE RECOLECCIÓN DE DATOS
(HOMBRES)
FECHA____/____/______
Nombre: (iniciales) ____
Nº Expediente: _____________________
Dirección: ______________________________________________________________________
Edad: _____ años
Sexo: M____ F_____
Ocupación:
_________________________________
Edo.Civil: C_____ D______ UL_______ Vdo._________________________________________
Tabaquismo: Si_______ No __________ cuantos cigarrillos al día.__________ por cuanto
tiempo_________________________________________________________________________
Inicio de vida sexual activa: _________/________/______________________________________
Número de parejas sexuales: _________
En los últimos 5 años______________________
Tiempo con la última pareja sexual, si es que se tuvieron más de una______ años.
Infecciones
de
transmisión
sexual
Si________
No________
Cual
o
cuales
_______________________________________________________________________________
Otras
enfermedades
concomitantes____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Detección previa de VPH Si________ No_________ Método de Diagnóstico Utilizado Citología _______
Histopatológica ____________ o Métodos moleculares___________________________
Hallazgos por androscópia:
a.Sin
prueba
del
ácido
acético__________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
b.-Con
prueba
del
ácido
ácetico__________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Resultado citológico en su pareja sexual, si se conoce____________________________________
Resultado histopatológico en su pareja sexual, si se conoce________________________________
a.- NIC 1 o LSIL_____________
Nº- Biopsia___________________
b.- NIC 2 o HSIL ____________
Nº- Biopsia__________________
c.- NIC 3 o HSIL _____________
Nº- Biopsia___________________
d.- CaCU __________________
Nº.-Biopsia __________________
Toma de muestra adecuada para RCP: Sí________ No___________
Complicaciones del estudio practicado________________________________________________
Resultados:
Positivo para virus VPH: __________
Negativo para virus VPH: ____________________
Tipos virales encontrados: _________________________________________________________
Responsable: Dr. José Guzmán Esquivel.
Zaragoza Nº 377, centro, Colima, Col.
Tel: 31-2-21-21,
57
ANEXO
II
HOJA DE RECOLECCIÓN DE DATOS
(MUJERES)
FECHA____/____/______
Nombre: (iniciales) ____
Nº Expediente: _____________________
Dirección: ______________________________________________________________________
Edad: _____ años
Sexo: M____ F_____
Ocupación:
_________________________________
Edo.Civil: C_____ D______ UL_______ Vdo._________________________________________
Tabaquismo: Si_______ No __________ cuantos cigarrillos al día.__________ por cuanto
tiempo_________________________________________________________________________
Inicio de vida sexual activa: _________/________/______________________________________
Número de parejas sexuales: _________
En los últimos 5 años______________________
Tiempo con la última pareja sexual, si es que se tuvieron más de una______ años.
Infecciones
de
transmisión
sexual
Si________
No________
Cual
o
cuales
_______________________________________________________________________________
Otras
enfermedades
concomitantes____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Detección previa de VPH Si________ No_________ Método de Diagnóstico Utilizado Citología _______
Histopatológica ____________ o Métodos moleculares___________________________
Hallazgos por colposcopia:
a.Sin
prueba
del
ácido
acético__________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
b.-Con
prueba
del
ácido
ácetico__________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Resultado citológico_______________________________________________________________
____________________________________________ Nº. de Papanicolaou__________________
Resultado histopatológico.__________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
a.- NIC 1 o LSIL_____________
Nº- Biopsia___________________
b.- NIC 2 o HSIL ____________
Nº- Biopsia__________________
c.- NIC 3 o HSIL _____________
Nº- Biopsia___________________
d.- CaCU __________________
Nº.-Biopsia __________________
Toma de muestra adecuada para RCP: Sí________ No___________
Complicaciones del estudio practicado________________________________________________
Resultados:
Positivo para virus VPH: __________
Negativo para virus VPH: ____________________
Tipos virales encontrados: _________________________________________________________
Responsable: Dr. José Guzmán Esquivel.
Zaragoza Nº 377, centro, Colima, Col.
Tel: 31-2-21-21,
58
ANEXO
III
FORMATO DE LA CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
SECRETARIA DE SALUD
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO
PROYECTO:
Asociación del virus del papiloma humano de alto riesgo en varones y su pareja sexual
con neoplasia intraepitelial de cérvix uterino en el Estado de Colima.
Investigador: Dr. José Guzmán Esquivel.
Fecha: ___/_____/______
Nº- de registro______________
Por
medio
de
la
presente
yo____________________________________________________________________ de _______ años
de edad, acepto participar en este proyecto de investigación, el cual tiene como objeto
conocer la asociación del virus del papiloma humano y su relación con lesiones premalignas en mujeres y en su pareja sexual.
Esto, para aportar información valiosa en el campo de la investigación regional y por
consecuencia, para realizar medidas preventivas y terapéuticas oportunas.
Se me ha explicado de manera sencilla y detallada que mi participación consistirá en:
Aceptar los siguientes procedimientos.
En caso de ser Hombre:
A.- realizar exploración andrológica por medio de lentes y a la simple inspección.
B.- Aplicación de ácido acético al 3-5% por medio de una gasa humedecida, dejándola
durante 5 minutos y en pene y escroto.
59
C.- Toma de muestra de uretra terminal y surco balano prepucial, por medio de un
pequeño cepillo plástico, para la realización de las pruebas necesarias para dicho
estudio.
D.- Todos los procedimientos realizados y sus resultados, se manejaran de maneja
confidencial y se me podrá dar información de los resultados en caso de que los requiera.
En caso de ser Mujer:
E.- En caso de ser la mujer, pareja sexual con lesiones pre-malignas, solo será recabar
información en un formato o historia clínica preestablecida.
Declaro que se me ha informado que:
* Mi participación es voluntaria y que mi negación a participar, no representa ningún
problema para la atención médica, en cualquiera de las instituciones de salud de la
localidad.
* Que el riesgo (peligro), que pudiera tener, no es mayor al que enfrentaría cualquier
individuo que se somete a este tipo de pruebas diagnósticas y que son parte de la
atención médica habitual. Finalmente, las probables consecuencias generalmente son
molestias locales y si se presentaran, se contará con la atención necesaria en la unidad
médica donde se tomarán las muestras.
* Que mi participación en el proyecto es solamente de investigación diagnóstica sin fines
terapéuticos. Por
lo tanto, se canalizará para su atención adecuada en caso de
presentar una enfermedad que amerite tratamiento específico
Nombre y firma de la persona otorgante del consentimiento
Nombre y firma del testigo
Nombre y firma del testigo
Nombre y firma de la persona responsable:
Responsable:
Dr. José Guzmán Esquivel.
Domicilio: Zaragoza Nº 377 centro, Colima, Col.
Teléfono: 31-22121