07/01/2008 Revisión: 0 PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE

PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE
RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
ORGAFOSFORADOS, TRIAZOLES Y
PIRETROIDES EN FRUTAS Y VERDURAS
POR GC –MS
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
1.
PRT-711. 07- 171
Fecha emisión:
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OBJETIVO
Determinar residuos de plaguicidas organofosforados, triazoles y piretroides en frutas y verduras
por método cromatografía gaseosa con detector selectivo de masas.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El método es aplicable a muestras de frutas y verduras de consumo humano recepcionadas en la
Sección Química de Alimentos y Nutrición del Subdepartamento Alimentos y Nutrición.
3.
FUNDAMENTO
Se basa en la extracción de residuos de plaguicidas en muestras sin grasas y alto contenido de
humedad con acetonitrilo. La mayoría de los residuos no iónicos son extraídos en la solución
acetonitrilo adicionando cloruro de sodio y buffer fosfato pH= 7.0, para luego realizar limpieza
con columna SAX/PSA, eluyendolos con acetona-hexano para su determinación.
4.
REFERENCIAS
4.1. Método Multiresiduo para plaguicidas por GC-MS, Método Oficial Japonés.
4.2. Multiresidue Method for the Determination of Residues of 251 Pesticides in Fruits and
Vegetable by Gas Cromatography/ Mass Spectrometry. (2000) J. AOAC int, Vol 83, 698713.
Elaborado por
Marcelo Soto
Encargado
Laboratorio
Residuos
Plaguicidas
Toxicología
Revisado por
Aprobado por
T.M. Mariana Fernandez
Emilia Raymond
de Encargada de Calidad Depto Jefa Sección Química de
y
Alimentos y Nutrición
PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE
RESIDUOS DE PLAGUICIDAS
ORGAFOSFORADOS, TRIAZOLES Y
PIRETROIDES EN FRUTAS Y VERDURAS
POR GC –MS
Sección Química de
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5.
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
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Fecha emisión:
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TERMINOLOGÍA
G.C
MSD
ppm
SIM
EI
= Cromatografía gaseosa.
= Detector selectivo de masas
= Una parte por millón, mg/Kg o mg/L.
= Single ion monitoring
= Electronic ionization
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
MATERIALES E INSUMOS
6.1.1
6.1.2
6.1.3
6.1.4
6.1.5
6.1.6
6.1.7
6.1.8
6.1.9
6.1.10
6.1.11
6.1.12
6.1.13
6.1.14
6.1.15
6.1.16
6.1.17
6.1.18
6.1.19
6.1.20
Columna cromatográfica HP-5MS 30 m x 0.32 mm x 0.50 µm.
Papel filtro Nº 5 A 150 mm.
Columna de extracción en fase sólida SAX/PSA, 500 mg + 500 mg adsorbente.
Matraz de aforo de 100 mL ± 0.02 mL (20°C), clase A.
Embudos de decantación con tapa de 125 mL.
Embudo de porcelana Buchner 125 mm.
Balón evaporación fondo redondo de 50 y 100 ml.
Probeta de 10, 50, 100 y 1000 mL (20 °C), clase A.
Micropipeta intervalo de 100-1000 µL.
Pipeta total vidrio de 0.5 mL ± 0.002 (clase A)
Pipeta total vidrio de 4 mL ± 0.015 (clase A)
Pipeta total vidrio de 10 mL ± 0.02 (clase A)
Pipetas Pasteur de 3 mL.
Vaso precipitado 100 y 250 mL
Matraz Erlenmayer 125 mL.
Tubos de vidrio con tapa de 15 mL.
Viales de 2 mL para autosampler.
Envase de vidrio ámbar de 1000 mL con tapa rosca.
Espátula
Piseta de propileno.
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6.2 REACTIVOS
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
6.2.7
6.2.8
6.2.9
6.2.10
Acetonitrilo grado residuos.
Acetona GC grado residuos.
Hexano GC grado residuos 95-98% pureza.
Agua desionizada
Sulfato de sodio anhidro grado plaguicidas.
Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4).
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4).
Cloruro de sodio p.a.
Hidróxido de sodio p.a.
Ácido clorhídrico p.a
6.3 EQUIPOS
6.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
6.3.5
6.3.6
6.3.7
6.3.8
6.3.9
6.3.10
6.3.11
Cromatógrafo Gaseoso.
Refrigerador para almacenar estándares intervalo entre 2 y 8 °C
Refrigerador para almacenar muestras entre 2 y 8 °C
Campana con extractor de gases corrosivos
Balanza analítica.
Agitador automático de embudos de decantación.
Homogeneizador de acero Blender o similar.
Rotavapor con baño termorregulado 40 ºC ± 2 ºC.
Evaporador con corriente de nitrógeno.
Manifold de extracción.
Bomba de vacío.
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7.
DESARROLLO
7.1
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
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7.1.1 Preparación de soluciones
a) Solución de acetona/hexano (3:7) (v/v) : Adicionar 300 mL de acetona en una probeta
graduada de 1 L, adicionar 700 mL de hexano, mezclar por 15 segundos, dejar reposar
por 1 minuto y trasvasijar el contenido a un envase ámbar de 1 L previamente
ambientado y sellar. Esta solución debe prepararse al momento del análisis
b) Hidróxido de Sodio 1 M: Disolver 4 g de hidróxido de sodio con agua desionizada y
enrasar a 100 mL en matraz aforado. Duración mínima 1 año y debe conservarse a
temperatura ambiente.
c) Ácido Clorhídrico 1 M: Adicionar cuidadosamente 0,8 mL de ácido clorhídrico a un
matraz de 100 mL que contiene 50 mL agua desionizada. Enrasar a 100 mL con agua
desionizada.
d) Tampón Fosfato 0.5 M pH 7.0: Disolver lentamente 52.7 g de K2HPO4 y 30.2 g de
KH2PO4 en 500 ml de agua desionizada y ajustar a pH 7.0 ± 0.1 con hidróxido de sodio
1 M o Ácido clorhídrico 1M según corresponda. Enrasar en matraz aforado de 1 L con
agua. Duración mínima 3 meses y debe conservarse a una temperatura de entre 2-8 ºC.
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7.1.2 Preparación de Estándares
a) Solución stock Atrazina (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente
25 mg del estándar de atrazina, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y
disolver con pequeño volumen de acetona a un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta
completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual
a 0 °C en viales ámbar
b) Solución stock Clorpirifos (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de clorpirifos, en una balanza analítica (precisión
0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de
25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
c) Solución stock Cyflutrin (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente
25 mg del estándar de cyflutrin, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y
disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta
completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual
a 0 °C en viales ámbar.
d) Solución stock Difenoconazole (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de difenoconazole, en una balanza analítica
(precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz
de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a
una temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
e) Solución stock Ethion (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente 25
mg del estándar de ethion, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y
disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta
completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual
a 0 °C en viales ámbar.
f) Solución stock Fenvalerato (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de fenvalerato, en una balanza analítica (precisión
0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de
25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
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g) Solución stock Isoprothiolane (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de isoprothiolane, en una balanza analítica
(precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz
de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a
una temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
h) Solución stock Methidathion (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de methidathion, en una balanza analítica
(precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz
de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a
una temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
i) Solución stock Permetrina (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de permetrina, en una balanza analítica (precisión
0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de
25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
j) Solución stock Pirimifos-Metil (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de pirimifos-Metil, en una balanza analítica
(precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz
de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a
una temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
k) Solución stock Pyrimethanil (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de pyrimethanil, en una balanza analítica (precisión
0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de
25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
l) Solución stock Simazina (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente
25 mg del estándar de simazina, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y
disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta
completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual
a 0 °C en viales ámbar.
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m) Solución stock Terbacil (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio aproximadamente
25 mg del estándar de terbacil, en una balanza analítica (precisión 0.0001 g), arrastrar y
disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de 25 mL, aforar hasta
completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una temperatura menor o igual
a 0 °C en viales ámbar.
n) Solución stock Tetraconazole (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de tetraconazole, en una balanza analítica
(precisión 0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz
de aforo de 25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a
una temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
o) Solución stock Triadimenol (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de triadimenol, en una balanza analítica (precisión
0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de
25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
p) Solución stock Triazophos (1000 ppm): pesar en una navecilla de vidrio
aproximadamente 25 mg del estándar de triazophos, en una balanza analítica (precisión
0.0001 g), arrastrar y disolver con pequeño volumen de acetona en un matraz de aforo de
25 mL, aforar hasta completar el volumen. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C en viales ámbar.
q) Solución intermedia Atrazina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar de
1000 ppm de Atrazina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
r) Solución intermedia Clorpirifos (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de Clorpirifos y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
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s) Solución intermedia Cyfluthrin (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de Cyfluthrin y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
t) Solución intermedia Difeconazole (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de Difeconazole y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
u) Solución intermedia Ethion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar de
1000 ppm de Ethion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
v) Solución intermedia Fenvalerato (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de Fenvalerato y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar
hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
w) Solución intermedia Isoprothiolane (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de Isoprothiolane y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
x) Solución intermedia Methidathion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de Methidathion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
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y) Solución intermedia Permetrina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de Permetrina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
z) Solución intermedia Pirimifos- Metil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de Pirimifos- Metil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10
mL, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a
una temperatura menor o igual a 0 °C
aa) Solución intermedia Pyrimethanil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de Pyrimethanil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
bb) Solución intermedia Atrazina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar de
1000 ppm de atrazina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
cc) Solución intermedia Clorpirifos (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de clorpirifos y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
dd) Solución intermedia Cyfluthrin (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de cyfluthrin y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
ee) Solución intermedia Difeconazole (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de difeconazole y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
ff) Solución intermedia Ethion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar de
1000 ppm de ethion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
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completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
gg) Solución intermedia Fenvalerato (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de fenvalerato y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
hh) Solución intermedia Isoprothiolane (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de isoprothiolane y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
ii) Solución intermedia Methidathion (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de methidathion y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
jj) Solución intermedia Permetrina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de permetrina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
kk) Solución intermedia Pirimifos- Metil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de pirimifos- metil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
ll) Solución intermedia Pyrimethanil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de pyrimethanil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
mm)
Solución intermedia Simazina (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de simazina y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
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nn) Solución intermedia Terbacil (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar de
1000 ppm de terbacil y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
oo) Solución intermedia Tetraconazole (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del
estándar de 1000 ppm de tetraconazole y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL,
enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
pp) Solución intermedia Triadimenol (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de triadimenol y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar
hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una
temperatura menor o igual a 0 °C
qq) Solución intermedia Triazophos (100 ppm): Tomar una alícuota de 1000 µL del estándar
de 1000 ppm de triazophos y agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL, enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser congelada a una temperatura
menor o igual a 0 °C
rr) Solución multiestándar (1 ppm): Tomar una alícuota de 500 µL de cada uno de los
estándares de 100 ppm mencionados anteriormente, agregarlo sobre un matraz de aforo
de 50 mL, enrasar hasta completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser
refrigerada a una temperatura entre 2 a 8ºC.
ss) Solución multiestándar (0.5 ppm): Tomar una alícuota de 5 mL de la solución
multiestándar de 1 ppm, agregarlo sobre un matraz de aforo de 10 mL y enrasar hasta
completar el volumen con acetona. Esta solución debe ser refrigerada a una temperatura
entre 2 a 8 ºC.
NOTA: La caducidad de cada una de estas soluciones esta indicada en el libro:” Preparación
de soluciones estándares RGG-700.00-034 y mezclas de estándares RGG-700.00.35”
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7.1.3. Preparación de curva de calibración y fortificados
a) Curva de calibración (0,04-0,8 µg*ml-1): Se preparan cinco niveles para una curva de
calibración a partir de la solución multiestándar intermedia de 1,0 ppm. Se toma la
alícuota correspondiente de la solución multiestándar, se trasvasija a un vial de 1 mL y
se completa el volumen con la solución acetona, siguiendo el esquema de dilución:
Solución
multiestándar
(µg/mL)
1
1
1
1
1
Alícuota a
tomar
µL
40
80
200
400
800
acetona
960
920
800
600
200
Concentración
(µg / mL)
0,04
0,08
0,2
0,4
0,8
b) Fortificados (0,2 µg*g-1): Para obtener una concentración de los analitos en estudio en la
matriz, se procede a agregar una alícuota del multiestándar sobre esta, luego se procede a
realizar la extracción como una muestra problema.
Los fortificados se obtienen siguiendo el esquema:
Solución multiestándar
(µg / mL)
Alícuota a tomar
mL
Cantidad de matriz (g)
0,5
4
10
7.2.
Concentración en
matriz
(µg / g)
0,2
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
7.2.1. Extracción
Desde su recepción, las muestras se mantendrán entre 2 ºC a 8 ºC , hasta la preparación para el
análisis. Los cereales recibidos se mantienen sin lavar donde se procede a homogenizar en
blender una porción representativa y suficiente para realizar una serie de trabajo. El resto de la
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muestra homogeneizada, se congelará a una temperatura menor o igual a 0 °C debidamente
identificada.
a) Pesar 20 g de la muestra previamente molida en homogenizador. En este punto debe
agregarse la alícuota de los analitos en el caso de muestras fortificadas, y esperar 30
minutos previo a la extracción.
b) Adicionar 50 mL de acetonitrilo al homogenizador que contiene la muestra.
c) Homogenizar la muestra contenida en blender por 3 minutos a 2500 rpm.
d) Vaciar el contenido al sistema de filtración (embudo Buchner, papel filtro Nº 5 A y
Kitasato). Se lava el blender con 2 porciones de 15 mL repitiendo los punto d y e.
e) Filtrar a través de un embudo de vidrio que posee papel filtro Nº 5A y depositarlo en
matraz de aforo de 100 mL, enrasar con acetonitrilo (Solución A).
f) Tomar 20 mL de solución A y depositar en embudo de decantación de 125 mL.
g) Agregar al embudo de decantación de 125 mL que posee solución A, 8.5 g de NaCl y 20
mL de Tampón fosfato (pH=7,0).
h) Agitar 10 minutos en agitador automático de embudos de decantación.
i) Dejar reposar hasta separación de fases.
j) Desechar la fase acuosa (inferior) en vaso precipitado, y recibir la fase orgánica en
matraz erlenmayer de 125 mL
k) Adicionar 5 g de sulfato de sodio anhidro a matraz erlenmeyer y agitar manualmente por
15 segundos.
l)
Pasar el filtrado a través de un embudo de vidrio que posee papel filtro Nº 5 A y
depositar en balón de evaporación fondo redondo de 100 mL
m) Concentrar el extracto orgánico en Rotavapor con baño termorregulado a 40 ºC o inferior
a 1 mL aproximadamente.
n) Secar bajo corriente de N2.
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o) Reconstituir a 2 mL con mezcla acetona/ hexano (3:7) (Solución B).
7.2.2. Purificación
a) Instalar en el manifold las columnas SAX/PSA.
b) Acondicionar las columnas con 10 mL mezcla acetona/ hexano (3:7). Detener el flujo
cuando el menisco alcance el tope del relleno, se debe impedir que las columnas se
sequen. Desechar la mezcla acetona/ hexano (3:7).
c) Pasar la Solución B a través de las columnas y eluir con 7 mL acetona / hexano (3:7).
d) Concentrar el extracto orgánico (Solución B) en rotavapor con baño termorregulado a 40
ºC o inferior a 1 mL aproximadamente.
e) Secar bajo corriente de N2.
f) Reconstituir a 1 mL con acetona (Solución Test).
g) Leer en GC-MS.
7.3.
ANÁLISIS INSTRUMENTAL
La determinación de los analitos se realiza a través de GC-MS. Para comprobar el correcto
funcionamiento del sistema cromatográfico se debe verificar la respuesta de un patrón directo del
nivel mas bajo de la curva de calibración.
Además antes de la jornada de uso del equipo, se debe asegurar que el equipo presente las
condiciones optimas de trabajo, para eso es necesario realizar una evaluación del sistema interno del
equipo (Tune Evaluation), si no se encuentra en condiciones optimas, revisar Instructivo
“Encendido, operación y apagado del cromatografo gaseosos de gases Nº inventario 23891 con
detector selectivo de masas HP 5973 MSD Nº inventario 24718” IT 701-00-019.
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7.3.1. Condiciones Cromatográficas:
DETECTOR
Columna
Temperatura Horno
Temperatura Inyector
Temperatura Detector
Modo Inyección
Gas Portador
Volumen Inyección
Modo Ionización
GC-MS
HP-5MS (0.25mm i.d x 30m x 0.25µm)
50 ºC (1 min)
20 ºC / min
125 ºC (0 min)
10 ºC / min
300 ºC (10 min)
250 ºC
280ºC (interfase)
Splitlees
Helio 5.0 o superior (flujo constante, 1ml/min)
1µL
EI
7.3.2. Espectrómetro de masas
Parámetros de la fuente de iones:
Modo:
EI
Temperatura Cuadrupolo.
(ºC):
Temperatura Fuente Ionica
(ºC)
SIM
70 eV
150
230
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7.3.3. Método de Masas
Se monitorizan transiciones específicas para cada compuesto a determinar así como tiempos de
retención (T.R) aproximados, obtenidos para cada una de ellas.
En la cuantificación se utiliza la transición señalada con negrilla en la tabla adjunta para cada
compuesto y en la confirmación las transiciones monitorizadas de los compuestos.
Transiciones para cada compuesto
Nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
7.4.
Analito
Simazina
Atrazina
Pyrimethanyl
Terbacil
Pirimifos – Metil
Chlorpyrifos
Tetraconazole
Triadimenol 1
Triadimenol 2
Methidathion
Isoprothiolane
Ethion
Triazophos
Permethrin 1
Permethrin 2
Cyfluthrin 1
Cyfluthrin 2
Cyfluthrin 3
Cyfluthrin 4
Fenvalerate 1
Fenvalerate 2
Difenoconazole 1
Difenoconazole 2
T.R (min)
12,19
12,28
12,81
13,01
14,31
14,71
14,91
15,82
15,97
16.05
16,64
17,62
17,92
21,21
21,33
21,75
21,84
21,91
21,96
23,31
23,58
23,96
24,08
201
215
199
163
305
314
338
168
168
302
290
231
285
183
183
226
226
226
226
419
419
325
325
TRATAMIENTO DE RESULTADOS
Iones monitoriados (m/z)
186
173
173
200
183
198
117
161
276
290
286
258
171
336
128
112
128
112
85
145
231
204
153
125
257
161
163
127
163
127
206
163
206
163
206
163
206
163
225
167
225
167
267
323
267
323
197
118
125
125
265
265
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7.4.1. Cuantificación
Se realiza una curva de calibrado correspondiente a 0,04, 0,08, 0,2, 0,4 y 0,8
ppm según se describe en el punto 7.1.3. La ecuación de la curva es:
y=ax+b
Donde:
X= Concentración (ppm) del analito según corresponda
Y= área del pico del analito según corresponda, para la transición mas abundante o ion
cuantificador.
Una vez obtenido el valor de interpolación, se procede a determinar la concentración de la
muestra definida por la siguiente ecuación:
Residuos Pesticidas en Cereales µg/g =
[C x V x (100 / 20)] x 10
Donde:
C= Concentración muestra obtenida en equipo (µg/mL).
V= Volumen de muestra (mL).
W= Masa muestra (g).
7.4.2. Confirmación
10
W
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Siguiendo los criterios de confirmación definidos en Regulación (EC) 657/2002, la identidad del
compuesto se considera confirmada cuando:
Se observen picos correspondientes a las transiciones características de los analitos a determinar
y con una relación señal/ruido igual o superior a 3 .
La razón resultante de dividir el área del pico correspondiente a la transición menos abundante
(ion cualificador) y el área del pico correspondiente a la transición mas abundante (ion
cuantificador) debe ser igual al obtenido para las muestras adicionadas.
Los ratios para cada uno de los analitos son fijados durante el proceso de validación sobre las
muestras fortificadas.
7.4.3
Expresión de los Resultados
Para compuestos con LMR. La expresión de resultados es la siguiente:
a) Cuando la concentración obtenida sea inferior al Límite de Cuantificación:
“Inferior al Límite de Cuantificación”
(Límite de Decisión (CCα):...... ppb, Límite de Cuantificación: .......ppb,)
b) Cuando la concentración obtenida este comprendida entre el Límite de Cuantificación
y el valor superior del rango validado, ambos incluidos, y la identidad ha sido
confirmada:
“Valor numérico en ppb”.
(Límite de Decisión (CCα):...... ppb, Límite de Cuantificación: .......ppb
Incertidumbre:.....%)
c) Cuando la concentración obtenida esté por encima del valor superior del rango
validado y la identidad ha sido confirmada:
“Superior a ...... ppb (valor más alto del rango validado)”.
(Límite de Decisión (CCα):...... ppb, Límite de Cuantificación: .......ppb)
Los valores de CCα y CCβ son obtenidos del análisis de resultados de proceso de validación.
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7.4.4. Estimación Incertidumbre
La incertidumbre del resultado es 2 veces el coeficiente de variación correspondiente a la
reproducibilidad (CV) obtenido en la validación según el nivel de concentración ( con un factor
de cobertura k=2). Cuando la concentración obtenida se encuentre entre dos niveles, siempre se
aplicará el CV menos favorable.
I = 2xCV
NOTA: Los valores de la Incertidumbre figuran en el Informe de Validación del Método.
7.4.3. Control de Calidad
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. Los controles de calidad
quedan agrupados en tres niveles de control:
a) Nivel I:
Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y
patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b) Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas por el
analista.
c) Nivel III. Este nivel se refiere a los controles a efectuar durante el desarrollo de toda serie de
trabajo, por ello será descrito con más detalle e incluye:
-
Control de blanco (una muestra blanco por cada diez muestras por matriz, según
corresponda)
Control muestras adicionadas (una muestra por cada diez muestras por matriz)
Control de respuesta instrumental con un patrón mas bajo de la curva de calibración.