E.BB25

Análisis enzimático y ultraestructura celular del hongo
lignocelulolítico pleurotus ostreatus
*José Luis Suárez Segundo1,2, José Luis Torres Garcia1, Sergio Huerta Ochoa3, José David
Sepúlveda Sánchez4, Gerardo Díaz Godínez1, Rubén Díaz Godínez1, Maura Tellez-Tellez1 y
Carmen Sánchez Hernández1,2.
1
Centro de Investigación en Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Tlaxcala, 2Maestría en
Ciencias Biológicas UAT, Tlaxcala, México, 3Depto de Biotecnología, UAM, México, 4 CENICA
Centro Nacional de Investigación y Capacitación ambiental,, México.
*José Luis Suárez Segundo
+Carmen Sánchez, [email protected], Tel/Fax +52 2484815482
Biorremediación
Resumen
La capacidad degradativa de Pleurotus ostreatus es debido a la fuerte actividad oxidativa y baja
especificidad de sustrato de sus enzimas ligninolíticas. Este es un hongo comestible capaces de
colonizar y degradar una gran variedad de substratos lignocelulósicos. El objetivo de este trabajo fue
determinar la actividad enzimática y la ultraestructura de las diferentes etapas de crecimiento de los
cuerpos fructiferos y de las hifas jóvenes (ZJ) y maduras (ZM) de una colonia de P. ostreatus. Los
cuerpos fructiferos maduros tienen la mayor actividad enzimática de lacasas, proteasas, glucanasas y
quitinasas. La mayor actividad de lacasas se observó en (ZJ) y (ZM), y al comienzo de la fructificación
del hongo. Esto demuestra que las lacasas juegan un papel crucial en la fase de crecimiento del micelio
y en las primeras etapas de crecimiento de este organismo. El grosor de las hifas del hongo al crecer se
debe al incremento de glucanos. El almacenamiento de glucógeno se encuentra en la (ZY) y en la base
de los cuerpos fructíferos y disminuye a medida que el hongo madura. El conocimiento sobre la
ultraestructura y la fisiología de los hongos son cruciales para entender los requisitos y mecanismos
llevados a cabo durante el crecimiento de estos organismos.
Palabras clave: Pleurotus ostreatus, Ultraestructura de las hifas, enzimas ligninoliticas
Abstract
The degradative ability of Pleurotus ostreatus is due to the strong oxidative activity and low substrate
specificity of their ligninolytic enzymes. This is an edible mushroom able to colonize and degrade a
large variety of lignocellulosic substrates. The aim of this work was to determine the enzymatic activity
and ultrastructure of different stages of growth of fruit bodies and, of the young (YH) and mature
hyphae (MH) from a colony of P. ostreatus. Mature fruit bodies had the major enzymatic activity of
laccases, proteases, glucanases and quitinases. The higher laccases activity was observed in (YH) and
(MH), and at the beginning of the fructification of the fungus. This shows that the laccases play a
crucial role in the mycelial phase of growth and in the first stages of growth of this organism.
Thickness of hyphae increases as the fungus grows, which suggests accumulation of glucans. Glycogen
storage is found in (YH) and at the base of the fruit bodies and it decreases as the fungus mature. The
knowledge on the ultrastructure and physiology of fungi are crucial to understand the requirements and
mechanisms carried out during the growth of these organisms.
Key words; Pleurotus ostreatus, hyphal ultrastructure, ligninolytic enzymes
1. Introducción
Pleurotus ostreatus es un hongo comestible, también conocido como “seta”. Este hongo tiene dos
fases de desarrollo; 1) fase vegetativa, la cual es filamentosa constituida por un conjunto de filamentos
(hifas) denominado micelio y 2) fase reproductiva; que consiste en la formación de la estructura de
soporte para el desarrollo de los cuerpos fructíferos [1]. Este hongo se caracteriza por tener un sistema
único específico de enzimas ligninolíticas, necesario para la degradación de la lignina, uno de los
principales componentes de la madera. Cabe mencionar que estos hongos ligninolíticos, por ser activos
degradadores de lignina, pueden degradar parcial o totalmente compuestos orgánicos persistentes de
estructura análoga a esta. Por ello, la gran importancia en aplicaciones industriales y en procesos de
biorremediación de contaminantes recalcitrantes como plaguicidas, tintes, explosivos, hidrocarburos
poliaromáticos etc [2,3], así como, nonifenoles, bisfenoles A y ftalatos [4]. La biodegradación de estos
compuestos por basidiomicetes se considera un proceso no específico, oxidativo, llevado a cabo por un
sistema enzimático extracelular [5]. Los estudios sobre la ultraestructura y fisiología de estos hongos
son fundamentales para conocer los requerimientos y los mecanismos llevados a cabo durante el
crecimiento de estos hongos. Por ello el objetivo de este trabajo fue evaluar las enzimas producidas y la
ultraestructura celular de P. ostreatus en la fase vegetativa y en diferentes etapas de desarrollo del
cuerpo fructífero (CF).
2. Materiales y Métodos
Se utilizó la cepa de Pleurotus ostreatus COLPOS 50 (50). La fructificación de las colonias de P.
ostreatus se realizó en cajas Petri conteniendo PDA, mismas que fueron inoculadas con un fragmento
de micelio de 4 mm (desarrollado en EMA) y se incubo por 12 días a 28°C con un ciclo de 16 h luz y 8
h obscuridad. Una vez que los hongos fructificaron se cosecharon a diferentes etapas de desarrollo (0.5,
1.0, 2.0 y 4.0 mm de longitud).
Para el estudio de las enzimas se utilizó el extracto crudo enzimático (ECE) del micelio de P. ostreatus
y de las diferentes etapas del CF, el cual se obtuvo por lisis celular (empleando un macerador de tejidos
PIREX). En un tubo Eppendorf con volumen de agua conocido, el macerado se centrifugo a 15 000
rpm por 10 min. a una temperatura de -2 °C, las paredes celulares del hongo se sedimentaron y se
consideró al sobrenadante como el ECE.
Se estudio la ultraestructura del micelio de la colonia y de las diferentes etapas de desarrollo del CF. En
la colonia se tomaron muestra de la zona joven (periferia) (ZJ) y de la zona madura (centro) (ZM). En
el CF se estudiaron secciones de las diferentes zonas de desarrollo de los diferentes hongos (0.5, 1, 2 y
4 mm). Las muestras se colocaron en tubos Eppendorf con un fijador (glutaraldehido), y se vertieron en
una resina (Epon al 100%) y se colocaron en moldes, posteriormente se realizaron cortes (40 nm) con
el micrótomo para ser analizados con el microscopio electrónico.
3. Resultados
La tabla 1 muestra la actividad enzimática en las dos zonas de crecimiento de la colonia; ZJ, ZM y de
las diferentes zonas de desarrollo de los diferentes CF estudiados. En relación a la ZJ y ZM de la
colonia las enzimas lacasas presentaron la mayor actividad, 17.6 y 16.1 U/g, respectivamente. Las
glucanasas presentaron la misma actividad enzimática en ambas zonas de crecimiento de la colonia. En
el CF la mayor actividad de lacasas se presento en el CF de 0.5 mm de longitud y la mínima en el CF
de 2 y 4 mm de longitud. En el CF de 0.5 mm de longitud se encontraron similar actividad de lacasas y
glucanasas. En este CF no se presento actividad de proteasas y endoglucanasas. El CF de 1.0 mm no
presento actividad de glucanasas y de endocelulasas, mientras que el CF de 2.0 mm no presento
actividad de proteasas y endocelulasas. El CF de 4.0 mm no presento actividad de endocelulasas. En
todos los CF´s las lacasas presentaron la mayor actividad. En ninguna etapa de desarrollo del CF se
presento actividad de endocelulasas.
Tabla 1. Actividad enzimática de ZJ y ZM de las colonias, y de las diferentes fases de desarrollo de P.
ostreatus 50 expresada en U/g.
Lacasas
ZJ
ZM
0.5 mm
1 mm
2 mm
4 mm
17.6
16.1
0.83
5.6
4.7
4.6
El
grosor
Proteasas
4.1
7.0
0
1.1
0
1.9
Glucanasas
0.4
0.45
0.83
0
0.013
0.133
Endocelulasas
0.13
0.4
0
0
0
0
Quitinasas
0.008
0.006
0054
0.039
0.031
0.132
de las
hifas
de
ambas
zonas
de
desarro
llo de la colonia y del CF , se observa que las hifas de la ZJ y ZM de la colonia presentaron un grosor
de pared similar. En la base, el grosor de la pared de los CF´s de 0.5 y 1.0 mm de longitud fue similar.
Los CF´s de 2.0 y 4.0 también presentaron similar grosor de pared. En el estípite de los CF´s el grosor
de la hifa mostro la misma tendencia, mientras que en el pileo se incremento con forme aumento el
desarrollo del CF (Tabla 2).
Tabla 2. Grosor de la hifa (μm) de la ZJ y ZM, y de las diferentes fases de desarrollo de P. ostreatus.
Zona de estudio
ZJ
ZM
0.5 mm
1 mm
2 mm
4 mm
Base
2.081
2.255
2.602
2.01
4.276
4.569
Estípite
Píleo
2.458
2,036
3.908
3.965
2.017
3.336
4.286
La Tabla 3 muestra el grosor de la pared celular de la ZJ y ZM de la colonia y de las diferentes etapas
de desarrollo de los CF´s. En la colonia la pared celular de la hifa madura fue mayor que la pared
celular de la hifa joven. En la base, estípite y pileo de todos los CF´s la pared celular fue similar.
Tabla 3. Evaluación del grosor de la pared celular de la hifa (μm) de las diferentes fases de desarrollo
de P. ostreatus.
Base
0.396
0.506
0.51
0.436
0.532
0.423
Estípite
nd
nd
0.375
0.421
0.46
0.47
ZJ
ZM
0.5 mm
1 mm
2 mm
4 mm
ND; No determinado
nd; etapa de desarrollo no presente en la colonia
Píleo
nd
nd
ND
0.451
0.425
0.486
Las figuras 1, 2 y 3 muestran micrografías de las diferentes zonas de crecimiento de P. ostreatus, se
observa que las hifas de la ZJ del cuerpo fructífero presentaron mayor contenido de material
citoplasmico, seguidas de la base del hongo de 1.0 y 4.0 mm de longitud. Se observa que las hifas de la
base de 4 mm presentan una mayor longitud que las hifas del hongo de 1.0 mm de longitud.
Fig. 1. Hifas de la zona joven del hongo P. ostreatus 50, empleando microscopia electrónica a 100 µm.
Fig. 2. Hifas de la base del hongo P. ostreatus 50 de 1 mm de longitud, empleando microscopia
electrónica a 100 µm.
Fig. 3. Hifas de la base del hongo P. ostreatus 50 de 4 mm de longitud, empleando microscopia
electrónica a 100 µm.
4. Discusión
Las lacasas presentan mayor actividad en las dos zonas de desarrollo de la colonia, esto puede ser
debido a que la fase vegetativa es la responsable de invadir el sustrato. Se ha reportado que este tipo de
hongos poseen un sistema enzimático muy eficiente en la degradación de compuestos
ligninocelulósicos y esto es debido a la presencia de diversas enzimas entre ellas las lacasas. La etapa
inicial de desarrollo del hongo es la fase vegetativa que es la responsable de colonizar estos residuos
[6]. De igual forma todos los CF´s presentaron la mayor actividad de lacasas en la base, esto indica que
estas enzimas también son responsables en el desarrollo del hongo. En general, el CF de 4.0 mm de
longitud presento la mayor actividad de todas las enzimas, esto sugiere que una mayor cantidad de
enzimas son necesarias durante el desarrollo de los hongos. El grosor de las hifas es similar en la ZJ,
ZM en la base y estípite del hongo de 0.5 mm de longitud y en todas las zonas de desarrollo del hongo
de 1.0 mm de longitud. El mayor grosor se presento en los hongos de 2 y 4 mm de longitud, esto
sugiere que conforme el hongo se desarrolla la cantidad de diversos componentes celulares como los
glucanos son acumulados en la pared, lo cual se ha sugerido en previas investigaciones [7]. Se observa
que el contenido de glicógeno es mayor en la base y en las primeras etapas de desarrollo de estos
organismos, además las células son de menor dimensión. La longitud de las hifas se incrementa según
se va desarrollando el organismo.
5. Conclusiones
Las enzimas lacasas participan de manera importante en el desarrollo de la fase micelial y durante las
primeras etapas de crecimiento de los hongos.
El grosor de la hifa se incrementa a medida que se desarrolla, lo que sugiere una concentración
principalmente de glucanos en su pared.
El glicógeno es un factor muy importante en el desarrollo de estos organismos
Agradecimientos
Al CONACYT por las becas otorgadas a José Luis Suárez-Segundo. Al Dr. Jorge Sepulveda Sánchez
por su importante apoyo en la realización de los estudios sobre microscopia electrónica, lo que ha sido
muy importante para el desarrollo de esta investigación.
Referencias
[1] Téllez-Téllez, M.; Díaz-Godínez, G. y Sánchez, C. (2003). Physiology of a colony of
Pleurotuspulmonarius grown on media overlaid with a Cellophane membrane. Appl Microbiol
Biotechnol 63:212-216.
[2] Reddy, C.A. (1995).The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants.Curr Opin
Biotechnol 6:320-328.
[3] Asgher, M.; Bhatti, H.; Ashraf, M.; Legge, R. (2008). Recent developments in biodegradation of
industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system. Biodegradation 19:771-783.
[4] Hwang, S.S. y Song, HG (2008). Biodegradation of endocrine-disrupting phthalate by
Pleurotusostreatus.J Microbiol Biotechnol 18:767-772.
[5] García, T.A.M. y Torres, S.R.G. (2003). Producción de enzimas ligninolíticas por basidiomicetes
mediante la técnica de fermentación en sustrato solido. Revista Colombiana de Biotecnología 5:56-64.
[6] Sánchez C. (2009). Lignocellulosic residues: biodegradation and bioconversion by fungi.
Biotechnol Adv 27(2) 85-194.
[7] Sánchez C.; Téllez-Téllez M.; Díaz-Godínez, G. y Moore, D. (2004). Simple staining detects
ultrastructural and biochemical differentiation of vegetative hyphae and fruit body initials in colonies
of Pleurotus pulmonarius. Lett Appl Microbiol 38 (6): 483-487.