XVIII OLIMPIADA ARGENTINA DE BIOLOGÍA EXAMEN PRÁCTICO

XVIII OLIMPIADA ARGENTINA DE BIOLOGÍA
EXAMEN PRÁCTICO Nº 2
Exomorfología y herencia de caracteres en Drosophila
melanogaster
INTRODUCCIÓN
Drosophila melanogaster es conocida como “mosca de la fruta” y está ampliamente
extendida por todo el mundo. Sus características biológicas, genéticas y citogenéticas lo
hacen un material ideal para la investigación científica. Se puede destacar:
ƒ son pequeñas (3mm en estado adulto), fáciles de manejar y cultivar en el laboratorio.
ƒ tienen un ciclo biológico corto, la duración de los estadios del mismo varía con un
gran número de factores, el más importante es la temperatura (9-10 días a 25ºC).
ƒ es fácil distinguir entre machos y hembras. Son muy fértiles; cada hembra puede
poner hasta unos 500 huevos.
ƒ su complemento cromosómico es de 2n = 8, lo que simplifica el estudio citogenético
de la especie. La simbología utilizada para Drosophila es particular dado que para los
alelos dominantes se simboliza +, por ejemplo para alas salvaje es: v+ y alas
vestigiales es: v
ƒ se han descrito más de 1000 mutantes diferentes.
Diferenciación sexual
La distinción entre machos y hembras en D. melanogaster puede hacerse a partir del
tercer estadio larvario, en la pupa y en el adulto. En el adulto las diferencias son las
siguientes:
ƒ tamaño: la hembra es ligeramente más grande que el macho.
ƒ forma: el abdomen de la hembra es más ancho que el del macho y terminado en
punta, mientras que el del macho termina redondeado.
ƒ color: la hembra posee sobre la parte dorsal del abdomen una serie de bandas de
pigmentación oscuras alternando con bandas claras, mientras que el macho tiene un
manchón negro en el extremo del abdomen por la fusión de varias bandas.
ƒ número de segmentos abdominales: la hembra posee 7 mientras que el macho sólo
tiene 5.
ƒ aparato genital: las hembras tienen el abdomen de color claro y sólo una placa
vaginal de la misma coloración que el resto; los machos tienen un arco genital de color
pardo.
ƒ peine sexual: sólo lo poseen los machos en el primer segmento tarsal de su primer
par de patas, y lo utilizan para sujetarse a las hembras durante la cópula.
vista dorsal de D. melanogaster
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Los objetivos para este trabajo práctico son:
* Caracterizar morfológicamente el fenotipo salvaje de D. melanogaster.
* Analizar patrones de herencia presentes en la mosca de la fruta.
Materiales
Cada equipo posee:
* una probeta y un tubo en su interior, que contiene una muestra de moscas de la fruta de
diferentes líneas fenotípicas.
* microscopio estereoscópico (lupa).
* calculadora.
* un trozo de algodón.
* una hoja de papel blanco.
* 2 agujas histológicas.
* Éter a cargo del responsable del laboratorio (solicitarlo cuando sea necesario).
* Vaso de plástico con alcohol para descartar las moscas una vez que las cuentan
PROCEDIMIENTO
Importante: se recomienda leer detenidamente todo el protocolo de trabajo antes de
iniciar con la manipulación del material.
Eterificación
Para la observación, clasificación y recuento de las moscas es preciso anestesiarlas
previamente con éter; esta operación se llama eterificación. Se procede de la siguiente
forma:
1- Extraer el tubo de ensayo que contiene la muestra.
2- Colocar el algodón en el fondo de la probeta.
3- Colocar unas gotas de éter sobre el algodón hasta humedecer (3-4 gotas).
4- Colocar el tubo de ensayo dentro la probeta, dejar actuar hasta observar que las
moscas no se mueven (pocos segundos).
5- Colocar las moscas anestesiadas sobre el papel blanco introducirlas bajo la lupa para
su observación, y seleccionar 10 moscas en buen estado para su observación.
Recomendación:
1- EL TIEMPO DE EXPOSICIÓN AL ÉTER NO DEBE EXCEDERSE PARA EVITAR QUE
LAS MOSCAS MUERAN Y ENTREN EN RIGOR MORTIS, DADO QUE ESTO DIFICULTA
SU MANIPULACIÓN Y SON FRÁGILES.
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Parte A: Características exomorfológicas de la mosca de la fruta
1 - Luego de observar los ejemplares de la muestra en la lupa, indicar el número de:
I. hembras con fenotipo salvaje:………………………………
II. machos con fenotipo salvaje:………………………………
III. hembras con la mutante:…………………………………
IV. machos con la mutante:…………………………………..
2- ¿Cuál/es de los siguientes caracteres afecta/n la/s mutación/es observada/s?
I. color de ojo.
II. forma del ojo.
III. forma del ala.
IV. longitud de cerdas.
V. forma de antena.
VI. forma de las cerdas.
VII. forma de pata.
VIII. color de cuerpo.
Respuesta:……………………………………………………………………… I
Procedimiento
* De los ejemplares separados elegir un ejemplar macho y uno hembra con fenotipos
salvajes para el punto 3 de la parte A y para la parte B, respectivamente.
* Descartar el resto de las moscas en el recipiente destinado a tal fin.
Importante: El ejemplar elegido debe ser colocado bajo la lupa a ventral. Una vez hecho
esto llamar al docente encargado del laboratorio, el cual tomará una foto de este material.
3- Completar los siguientes esquemas dibujando donde corresponda la o las
característica/s morfológica/s que permitió/eron reconocer una mosca macho.
Silueta a ventral de D. melanogaster
3
4- Tomar el ejemplar hembra seleccionado para su observación en el microscopio
estereoscópico. (Se recomienda, cambiar la posición del insecto para observarlo desde
diferentes ángulos).
Completar la siguiente tabla con los códigos de respuesta dados más abajo.
Región corporal
Cabeza
Tórax
Abodomen
Característica
Aparato bucal
Ocelos
Tipo de Alas
Nº de alas
Tipo de Patas
Segmentos abdominales
Código de respuesta
04
A
I
V
α
H
Códigos de respuestas
* Aparato bucal
01. picador-chupador
02. masticador
03. lamedor
04. chupador
* Ocelos
A. tres ocelos dispuestos en forma triangular
B. dos ocelos alineados
C. No presenta ocelos
* Alas
Tipos
I. membranosas
II. recubiertas por escamas microscópicas coloreadas
III. con la mitad basal dura y la mitad apical membranosa (hemiélitros).
IV. anteriores enteramente duras o apergaminadas
Número
V. un solo par situado en mesatórax
VI. dos pares de alas situados en meso y metatórax respectivamente
* Tipo de Patas
α. Patas caminadoras
β. Patas adaptadas para salto
* Segmentos abdominales
G. entre 7 y 8 segmentos abdominales
H. menos de 7 segmentos abdominales
5- De acuerdo a la información registrada en los ítems anteriores, asignar el nombre
correcto del Orden al que pertenece el organismo bajo estudio:
Respuesta:…………………………………………………………………….. Diptera
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Parte B: Ejercicios de aplicación
“Análisis estadístico del modo de herencia de la mutante determinada en la Parte A
del examen”
* Un estudiante debe analizar una muestra que contiene moscas de la fruta
correspondientes a una progenie F2 obtenida a partir de un cruzamiento entre líneas
puras de una cepa salvaje y de la mutante examinada en la parte A.
En esta muestra se registran los siguientes valores:
machos mutantes: 37
machos salvajes: 36
hembras salvajes: 77
hembras mutantes: 0
1- La proporción de fenotípica observada en la progenie total se aproxima a:
Proporción Hembras mutantes
a)
b)
c)
d)
1/4
-
machos
mutantes
1/4
2/4
hembras
salvajes
2/4
2/4
3/4
1/4
machos
salvajes
1/4
1/4
1/4
1/4
2- En función de los datos anteriores puede deducirse que el genotipo de los organismos
parentales y F1 fue:
Proporción Hembra
Parental
a)
Xw+Xw+
b)
Xw+Xw
c)
Xw+Xw+
d)
Xw+Xw
Macho Parental
Hembra F1
Macho F1
Xw+Y
Xw+Y
XwY
XwY
Xw+Xw+
Xw+Xw+ / Xw+ Xw
Xw+Xw
Xw+Xw / XwXw
Xw+Y
XwY / Xw+Y
Xw+ Y
XwY / Xw+Y
3- Sobre la base de todo lo analizado se puede plantear la siguiente hipótesis:
"La/s mutación/es observada/s en la progenie corresponde a una herencia:
a) ligada al sexo dominante.
b) autosómica dominante.
c) ligada al sexo recesiva".
d) autosómica dominante
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Una manera de comprobar la bondad de ajuste entre las frecuencias fenotípicas
observadas en la F2 y las frecuencias fenotípicas esperadas de acuerdo a la hipótesis,
es aplicar el test de Chi cuadrado (X2). Al final del examen se presenta un anexo con
información sobre cómo realizar el test del X2.
4- Completar la tabla con los datos. (Utilizar 3 decimales)
Fenotipo
Machos
Salvajes
Machos
Mutantes
Hembras
Salvajes
Hembras
Mutantes
individuos
observados
(Oi)
individuos
esperados
(Ei)
(Oi - Ei )2
Oi - Ei
(Oi - Ei )2
Ei
36
1/4 x 150: 37.5
-1.5
2.25
0.06
37
1/4 x 150: 37.5
0.5
0.25
0.006
77
2/4 x 150: 75
2
4
0.053
0
0
0
0
0
5- El valor del estadístico calculado es:…… 0.119 (RANGO 0,11- 0,12)..........................
6- El número de grados de libertad es:………………… 2…………………………….…….
7- Con un nivel de significación de α = 0.05 el valor del X2 tabulado es:……5.99………….
8- Por lo tanto, se puede concluir que:
a) se rechaza la hipótesis nula.
b) se acepta la hipótesis nula.
c) no es posible determinar si la hipótesis nula es verdadera.
“Análisis de los datos a partir de la técnica de Western blot”
Se presentan los resultados de una experiencia cuyo objetivo fue analizar la proteína
White.
Procedimiento: Se tomaron muestras de las cabezas de moscas de la línea salvaje y de
tres líneas mutantes White, se las colocó en diferentes morteros, se rompió el material, se
agrego una solución buffer y se centrifugó a 14,000 rpm por 3 min, y luego se transfirió el
sobrenadante a un tubo limpio. Se sembró 5 µl de cada muestra en un gel SDS de
poliacrilamida, el siguiente orden, marcador de peso molecular, ojos rojos (WT), ojos
blancos (M1, M2 y M3). A continuación las proteínas fueron transferidas a un filtro de
nylon y se usó como sonda un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína
codificada por el gen white. Se obtuvo el siguiente resultado.
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WT
M1
M2
M3
Referencias: WT: Salvaje; M1, M2 y M3 diferentes mutantes White. La sonda utilizada es
anti-white.
9- ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre posibles mutaciones en los genes
responsables de los pigmentos del ojo originan los resultados mostrados en el gel, para
las líneas M1, M2 y M3? Completar sobre la línea de puntos a qué mutante corresponde
cada una de las siguientes explicaciones
a) (……M1………..) El sitio de iniciación del mRNA del gen white está delecionado y el
gen no se expresa.
b) (……M3………..) Ocurrió una mutación (un codón stop) en la región codificante de la
proteína White, resultando en una falla en la traducción de la región carboxilo terminal, y
la secuencia del péptidos correspondiente tiene un peso molecular de 55 kDa.
c) (……M2………..) A pesar de que la proteína White es sintetizada, los genes
involucrados en la síntesis de los pigmentos ommochrome son defectuosos.
10- ¿Qué otro posible defecto (A, B y C) en los genes de los pigmentos puede causar los
fenotipos M1, M2 y M3? Completar sobre la línea de puntos a qué mutante corresponde
cada una de las siguientes explicaciones.
a) (……M3………..)
La secuencia codificante del gen white es fusionada con la
secuencia codificante de otro gen por translocación cromosómica, resultando en una
nueva secuencia que codifica una proteína de fusión que mantiene el sitio de
reconocimiento del anticuerpo, muestra un peso molecular un 30 % más bajo.
b) (……M2………..) Una única sustitución ha ocurrido en la región codificante del gen
white cambiando un aminoácido en la región codificante y otro en la región no codificante.
Sin embargo la reactividad inmunológica de la proteína para el anticuerpo no se ha
perdido.
c) (……M1………..) Existe una gran deleción en la región cromosómica que involucra al
gen white completo.
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ANEXO: TEST ESTADÍSTICO X2
Las proporciones mendelianas monohíbridas (3:1) y dihíbridas (9:3:3:1) son predicciones
teóricas basadas en las leyes de Mendel. Tanto la segregación de los alelos de un gen, como la
transmisión independiente, están influenciadas por al azar y por consiguiente están sujetas a
fluctuaciones aleatorias.
En genética es muy importante poder evaluar si las proporciones fenotípicas observadas
(Oi) se ajustan o no a las frecuencias fenotípicas teóricas esperadas (Ei). Cuando asumimos que
los datos se adecuarán a una proporción dada por ejemplo 9:3:3:1, establecemos lo que se llama
HIPOTESIS NULA (Ho). Se llama así debido a que se asume que no hay diferencias reales entre
Oi y Ei, y en el caso de existir alguna pequeña diferencia sería atribuida al azar. Una de las
pruebas estadísticas más simples para valorar la Ho, es el análisis de X2. Esta prueba tiene en
cuenta las desviaciones observadas de cada componente de una proporción esperada, así como
el tamaño de la muestra y las reduce a un único valor llamado estadístico o X2 calculado.
2
X =∑
(Oi - Ei)2
Ei
Este valor de X2 se utiliza luego para estimar si la desviación observada se debe o no al azar. La
distribución de X2 es una función de la densidad de probabilidades. El estadístico puede tomar
valores entre 0 → ∝
La tabla de doble entrada que se te presenta a continuación representa los valores de X2
tabulados en función de los Grados de Libertad (GL) y de un valor de probabilidad α
G.L\ α
1
0,9
0,7
0,5
0,3
0,1
0,05
0,01
0.02
0.15
0.46
1.17
2.71
3.84
9.21
2
0.21
0.71
1.39
2.41
4.60
5.99
9.21
3
0.58
1.42
2.37
3.66
6.25
7.82
11.34
4
1.06
2.20
3.36
4.88
7.88
9.49
13.28
8