5TM GENOMA citogenetica 00

TEMA MONOGRÁFICO
GENÉTICA BÁSICA (Y II)
Citogenética
E. Margarit, A. Soler, A. Carrió, D. Costa y F. Ballesta
Servicio de Genética. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Barcelona.
EL CARIOTIPO NORMAL
Los cromosomas son cuerpos observables al microscopio óptico
durante la división celular. Constituidos por ADN empaquetado y
proteínas, contienen el material genético presente en todas las células nucleadas del organismo. Solamente aparecen en el núcleo
celular durante la división de la célula, en el estadio llamado de
metafase, como resultado de la condensación del material que forma el núcleo celular, la cromatina. En el cromosoma metafásico
pueden distinguirse dos cromátides hermanas idénticas unidas por
el centrómero o constricción primaria (fig. 1). El centrómero está
formado por ADN muy repetitivo y divide el cromosoma en dos
brazos: el corto (p) y el largo (q). Según la posición del centrómero, los cromosomas se clasifican en metacéntricos, submetacéntricos y acrocéntricos. Los cromosomas acrocéntricos pueden presentar en el brazo corto unas estructuras de longitud polimórfica,
los satélites, que corresponden a regiones organizadoras del nucléolo (NOR). Los telómeros o extremos de los cromosomas también están formados por secuencias repetitivas y desempeñan un
papel importante en el envejecimiento celular.
El cariotipo es la disposición ordenada de todos los cromosomas
de una célula, clasificados según su tamaño. En la especie humana,
el cariotipo normal consta de 46 cromosomas, distribuidos en
22 pares de autosomas (1 a 22) y un par de cromosomas sexuales
(XX en la mujer, XY en el varón). En cada individuo, uno de los
cromosomas de cada par procede del padre y otro de la madre. En
un principio, los 46 cromosomas se ordenaron en 7 grupos (A a G),
puesto que los cromosomas de tamaño y forma similar no se podían distinguir entre sí. El estudio del cariotipo se limitaba inicialmente a detectar anomalías cromosómicas numéricas o bien alteraciones estructurales grandes, visibles al microscopio óptico. A
partir de los años setenta, el desarrollo de las técnicas de bandeo
cromosómico permitió el reconocimiento individual de cada cromosoma y el estudio detallado de su estructura, posibilitando la
detección de anomalías estructurales más sutiles. La tinción con
bandas G es la utilizada en el estudio citogenético de rutina, y
otros tipos de bandas (C, NOR, Q) se reservan para estudios más
específicos (centrómeros, satélites, heterocromatina).
La fórmula cromosómica es una nomenclatura utilizada para
describir el cariotipo de un individuo, que indica el número de
cromosomas presentes en la célula, el complemento sexual (XX o
XY) y la descripción de la anomalía en su caso. Las normas internacionales de nomenclatura cromosómica se describen en el ISCN
19951.
ALTERACIONES DEL CARIOTIPO
El cariotipo de un individuo puede estudiarse a partir de células
en división, por lo cual es necesario establecer un cultivo celular.
Por su facilidad de obtención y cultivo, la sangre periférica se utili-
Núcleo
Célula
Brazo corto (p)
Centrómetro
Cromátides
Brazo largo (q)
Telómero
Metafase
Cromosoma
Cariotipo
Figura 1 Obtención del cariotipo a partir de una célula en división. En el
panel superior (derecha) se indica la nomenclatura de las distintas regiones cromosómicas.
za generalmente para la obtención de preparaciones cromosómicas, aunque el análisis citogenético se puede realizar a partir de
cualquier tipo celular que contenga núcleo, dependiendo del tipo
de estudio que interese: células fetales del líquido amniótico, vellosidades coriales, médula ósea, tejidos, etc.
La incidencia total de anomalías cromosómicas en los recién nacidos vivos es de 6/1.000 (tabla I)2. Las alteraciones del cariotipo
pueden ser debidas a una variación en el número normal de cromosomas o a cambios en su estructura. Si la alteración implica un
exceso o un defecto de material genético se denomina desequilibrada, y produce malformaciones congénitas, frecuentemente
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TABLA I Alteraciones cromosómicas más frecuentes
Alteraciones numéricas
Síndrome de Down (trisomía 21)
Síndrome de Edwards (trisomía 18)
Síndrome de Patau (trisomía 13)
Síndrome de Klinefelter
Doble Y
Triple X
Síndrome de Turner
Alteraciones estructurales
Traslocaciones equilibradas
Traslocaciones desequilibradas
Inversiones pericéntricas
Incidencia total de alteraciones
cromosómicas en recién nacidos vivos
Fórmula
cromosómica
Frecuencia
en recién nacidos
47,XY,+21
47,XX,+18
47,XY,+13
47,XXY
47,XYY
47,XXX
45,X
1/700
1/3.000
1/5.000
1/1.000 varones
1/1.000 varones
1/1.000 mujeres
1/10.000 mujeres
1/500
1/2000
1/100
6/1.000
acompañadas de retraso mental. Una alteración equilibrada no
produce, en principio, enfermedad en el individuo portador, aunque sí hay riesgo para su descendencia.
Dentro de las alteraciones numéricas, podemos distinguir entre
las aneuploidías, cuando sobra o falta uno o más cromosomas, y las
euploidías o variaciones en el número de juegos completos de
23 cromosomas. Ejemplos: 47,XY,+21 (un cromosoma 21 en exceso
o trisomía 21); 45,X (falta un cromosoma del par sexual, monosomía
X); 69,XXY (triploidía). En ocasiones, se detecta la presencia de un
fragmento o marcador cromosómico extra, de origen desconocido.
Las anomalías cromosómicas estructurales son variadas y pueden llegar a ser muy complejas, precisando en ocasiones de técnicas específicas para ser caracterizadas. Las más frecuentes son las
traslocaciones (intercambio de fragmentos entre distintos cromosomas), en especial las llamadas robertsonianas, que consisten en
la fusión céntrica de dos cromosomas acrocéntricos. En las deleciones falta un fragmento de cromosoma, mientras que en las duplicaciones se detecta un fragmento repetido. Las inversiones suponen la rotura de un fragmento que gira 180º y vuelve a unirse al
cromosoma en orientación invertida, y se denominan pericéntricas
o paracéntricas según el fragmento contenga o no el centrómero.
Un isocromosoma es un cromosoma anómalo, compuesto solamente de dos brazos cortos o de dos brazos largos. Un cromosoma
dicéntrico contiene dos centrómeros. El anillo cromosómico se
produce por rotura y pérdida de los extremos de un cromosoma,
seguido de la unión de los extremos que han quedado libres3.
Los mosaicos presentan dos o más líneas celulares con distinta
dotación cromosómica, todas ellas procedentes de un mismo zigoto. Con cierta frecuencia se puede encontrar una línea celular anómala combinada con otra de cariotipo normal. Ejemplos:
47,XY,+21/46,XY; 45,X/46,XY. En las quimeras, en cambio, las distintas líneas celulares en el individuo derivan de zigotos iniciales
diferentes.
Polimorfismos
Otras variaciones del cariotipo constituyen rasgos polimórficos no
patológicos presentes en la población normal. Los más frecuentes
son la inversión de los cromosomas 9 y 16 –inv(9), inv(16)–, así como variaciones en la longitud de la heterocromatina del cromosoma Y (Yqh+, Yqh–).
ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS EN INDIVIDUOS
INFÉRTILES
La formación de gametos haploides (n cromosomas) en un individuo diploide (2n cromosomas) implica una reducción del número
cromosómico a la mitad. Este proceso tiene lugar a través de la
meiosis, que a partir de una célula somática con 46 cromosomas da
lugar a dos gametos de 23 cromosomas, uno solo de cada par.
En un individuo portador de una anomalía cromosómica, el
apareamiento entre cromosomas homólogos que tiene lugar normalmente durante la meiosis no puede producirse correctamente,
con lo cual al dividirse la célula para producir los gametos es probable que los cromosomas no se separen bien (segregación anómala). El fallo en el proceso de disyunción cromosómica conlleva
la formación de gametos desequilibrados, con exceso o con defecto
de material genético, y que son incapaces o poco capaces de producir un embrión viable4.
Aproximadamente un 10% de las parejas presentan infertilidad.
En estos casos, es aconsejable realizar el estudio cromosómico de
la pareja para descartar posibles alteraciones cromosómicas que interfieran en la reproducción. Las principales anomalías cromosómicas presentes en individuos infértiles son:
– Translocaciones equilibradas. El individuo presenta un intercambio de dos fragmentos cromosómicos, sin pérdida ni ganancia
de material genético.
– Translocaciones robertsonianas. Es un tipo especial de traslocación, frecuente en individuos infértiles, en la cual dos cromosomas acrocéntricos están unidos por el centrómero, impidiendo su
segregación a gametos distintos durante la meiosis. Los gametos
resultantes son disómicos o nulisómicos con respecto a los cromosomas implicados en la translocación, dando lugar a zigotos trisómicos o monosómicos. Es especialmente frecuente la translocación robertsoniana entre los cromosomas 13 y 14 (fig. 2D).
– Alteraciones en el número de cromosomas sexuales. Es relativamente frecuente la alteración conocida como síndrome de Klinefelter, en la cual el individuo infértil presenta dos cromosomas X
y un cromosoma Y (47,XXY) (fig. 2A). La presencia de dos cromosomas X produce atrofia testicular en estos individuos, y la espermatogénesis no tiene lugar. En el síndrome de Turner (45,X) (fig.
2B), la ausencia de uno de los cromosomas sexuales produce disgenesia ovárica. También existen individuos mosaico, con una línea celular normal y otra anómala.
– Microdeleciones en el brazo largo del cromosoma Y. Son deleciones submicroscópicas que incluyen genes implicados en la espermatogénesis masculina. Aunque en algunos casos las deleciones son visibles al microscopio óptico, la mayoría sólo pueden detectarse a través del estudio molecular5.
– Otra alteración detectada en individuos azoospérmicos, aunque menos frecuente, consiste en la translocación del gen SRY, determinante sexual masculino específico del cromosoma Y, al cromosoma X. El resultado es un individuo de sexo masculino y cariotipo 46,XX incapaz de producir gametos6.
EL CARIOTIPO EN EL DIAGNÓSTICO PRENATAL
En determinadas situaciones puede estar indicada la obtención del
cariotipo fetal durante la gestación (tabla II). Existen en la actualidad diversas técnicas para el diagnóstico prenatal citogenético.
La biopsia corial se realiza en el primer trimestre de la gestación
(preferentemente entre las semanas 10 y 13) y consiste en la extracción de una muestra de vellosidades coriales. El cariotipo puede
obtenerse en pocos días si se aprovechan las células trofoblásticas
que presentan una gran actividad mitótica espontánea (método directo) o más tarde si se cultivan las células del interior de las vellosidades (método de cultivo largo). El inconveniente principal es la
existencia de mosaicos confinados a la placenta (1-1,5%), que obli-
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Figura 2 Anomalías cromosómicas detectadas en células procedentes de sangre periférica (A, B), líquido amniótico (C), y vellosidades coriales (D). A: síndrome de Klinefelter (47,XXY); B: síndrome de Turner (45,X); C: síndrome de Down o trisomía 21 (47,XX,+21); D: traslocación robertsoniana 13;14
(45, XY, t(13;14)(q10;q10)).
gan en determinados casos a comprobar el cariotipo de las vellosidades en otros tejidos fetales, pero permiten el estudio de una patología como la disomía uniparental (véase más adelante) y el diagnóstico de una posible causa de problemas perinatales como el retraso de crecimiento intrauterino. Las muestras de vellosidades son
el material más adecuado para los estudios moleculares prenatales.
La amniocentesis se realiza generalmente en el segundo trimestre de gestación (preferentemente a las 15-16 semanas) y consiste
en la obtención, por punción transabdominal, de una muestra de
líquido amniótico; las células presentes en el líquido deben ser cultivadas hasta obtener el crecimiento necesario para la realización
del cariotipo. El inconveniente principal es el tiempo de cultivo requerido, que puede oscilar entre 10 días y 3 semanas, dependiendo de la viabilidad de los tipos celulares contenidos en cada muestra. El líquido sobrenadante puede ser utilizado para estudios bioquímicos como el análisis de la alfafetoproteína y la
acetilcolinesterasa para el diagnóstico prenatal de defectos abiertos
del tubo neural.
La cordocentesis se puede realizar a partir de las 20 semanas de
gestación y consiste en la obtención de una muestra de sangre fetal
por punción del cordón umbilical. El cariotipo se obtiene a partir
de un cultivo semejante a los de sangre periférica7.
El cariotipo fetal también puede obtenerse mediante otras técnicas muy especializadas, como la biopsia de tejidos fetales o la punción
para obtener líquidos biológicos fetales como orina o exudados8.
En la gran mayoría de los casos el cariotipo prenatal obtenido es
normal. Las anomalías cromosómicas más frecuentes son el síndrome de Down, las trisomías 18 y 13 y las aneuploidías sexuales, y
están relacionadas con la indicación del procedimiento (edad ma-
TABLA II Indicaciones para diagnóstico prenatal citogenético
Edad materna superior a 37 años
Cribado bioquímico en suero materno positivo
Marcadores ecográficos de aneuploidía
Anomalías de la morfología fetal
Aneuploidía en gestación previa
Progenitor portador de anomalía cromosómica
terna avanzada, cribado positivo, anomalías de la morfología fetal).
Cuando la indicación del estudio es la presencia en un progenitor
de una alteración cromosómica estructural equilibrada, el feto
puede presentar el cariotipo normal, la misma alteración equilibrada o con desequilibrio (aumento o pérdida de material genético),
en cuyo caso comportará alteraciones fenotípicas.
La disomía uniparental consiste en la presencia de dos cromosomas homólogos procedentes sólo de un progenitor y la ausencia
del cromosoma correspondiente del otro progenitor9. Para algunos
cromosomas humanos, como el 7, 11, 14 y 15, es necesaria la contribución paterna y materna para el correcto funcionamiento de alguno de sus genes; la disomía uniparental de estos cromosomas es
una causa establecida de enfermedad como los síndromes de
Beckwith-Wiedermann, Prader-Willi y Angelman. Se ha demostrado que con cierta frecuencia un zigoto inicialmente trisómico
puede mantener la trisomía en el tejido placentario pero perder el
tercer cromosoma en la línea celular que conduce al feto, con lo
cual un diagnóstico prenatal en biopsia corial puede presentar una
trisomía y el feto presentar un cariotipo normal, pero con riesgo de
presentar una disomía uniparental para el cromosoma inicialmente
trisómico10,11.
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TABLA III Neoplasias hematológicas, alteraciones cromosómicas asociadas, genes implicados y valor pronóstico de las anomalías cromosómicas
Neoplasia hematológica
Anomalías
cromosómicas (%)
MIELOIDE
Síndromes mielodisplásicos (SMD)
20-60%
Síndromes mieloproliferativos crónicos (SMPC)
Leucemia mieloide crónica (LMC)
Leucemia mieloide aguda (LMA)
M2
M3
M4
M5
LINFOIDE
Leucemia linfoblástica aguda (LLA)
L1-L2 (B prematura)
60-80%
60-90%
L1-L2 (LLA común)
L1-L2 (pre-B)
L3 (B)
L1-L2 (T prematura)
(T común)
(T)
Síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC)
Línea B
Leucemia linfocítica crónica (B-LLC)
Otras
Línea T
Leucemia linfocítica crónica (T-LLC)
40-100%
Otras
LINFOMAS
Linfoma no hodgkiniano (B-LNH)
Linfoma de Burkitt
Linfoma folicular
Linfoma de células del manto
Linfoma difuso de células grandes
Linfoma anaplásico de células grandes
Linfoma de Hodgkin
ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ASOCIADAS
A NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
Las neoplasias hematológicas presentan en su mayoría anomalías
cromosómicas clonales, específicas en algunos casos, de un tipo
concreto de neoplasia. La mejora de las técnicas citogenéticas, que
ha permitido la obtención de cromosomas bandeados de buena calidad, ha incrementado en los últimos años los estudios citogenéticos en neoplasias y, lo que es más importante, ha permitido la caracterización de anomalías cromosómicas concretas. Los registros
de citogenética de los diferentes tipos de tumores son regularmente
publicados en el Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer,
que en su quinta edición12 describía las anomalías cromosómicas de
más de 22.000 neoplasias. Las neoplasias hematológicas engloban
el 73% de todas las anomalías cromosómicas descritas.
Los estudios citogenéticos son necesarios para establecer el diagnóstico y pronóstico de las hemopatías malignas, así como para realizar el seguimiento del paciente y valorar la eficacia del tratamiento13.
Las anomalías cromosómicas permiten en algunos casos localizar y
caracterizar los posibles genes implicados en la patogenia de la enfermedad y desarrollar terapias específicas. Existen principalmente
dos clases de genes implicados en el cáncer: los oncogenes y los genes supresores de tumores, ambos reconocidos como principales
Anomalías cromosómicas
Genes
Pronóstico
del(5q),–Y,del(20q),
+8,+11,del(11q),i(17q),
7,del(7),inv/t(3q),complejos
1q,del(5q),7,+8,+9,t(9;22)(q34;q11)
del(13q),i(17q),del(20q)
t(9;22)(q34;q11)
ABL;BCR
Bueno
Intermedio
Malo
t(8;21)(q22:q22)
t(15;17)(q22;q11)
inv(16)(p13q22)
t(9;11)(p21;q23)
ETO; AML 1
PML;RARA
MYH11;CBFB
AF9;MLL
Bueno
Bueno
Bueno
Intermedio
t(4;11)(q12;q23)
t(9;22)(q34;q11)Ph+
hiperploidia, casi haploide, del(6)
(q14q27),del(12p)
t(1;19)(q23;p13)
t(1;11)(p32;q23)
t(8;14)(q24;q32)
t(2;8)(p12;q24)
t(8;22)(q24;q11)
t(9;22)(q34;q11)Ph+
del(9)(p21)
t(10;14)(q24;q11)
t(11;14)(p13;q11)
t(8;14)(q24;q11)
AF4;MLL
ABL; BCR
Malo
Malo
PBX1;E2A
AF1P;MLL
MYC;IGH
IGK;MYC
MYC; IGL
ABL;BCR
Malo
Intermedio
Malo
HOX11;TCRD
RBTN2;TCRD
MYC;TCRA/TCRD
Malo
Malo
reorganizaciones 14q32 (14q+)
+12,14q+,del/t(13q),del(6q)
14q+,del(6q), reorganizaciones I
reorganizaciones 14q11
inv(14)(q11q32),
t(14,14)(q11;q32)
del/t(14)(q11)
del(6q),del/t(7q3436),del/t(2p)
IGH
t(2;8) (p12;q24)
t(8;14)(q24;q32)
t(8;22)(q24;q11)
t(14;18)(q32;q21)
t(11;14)(q13;q32)
t(3;14)(q27;q32)
t(2;5)(p23;q35)
reorganización: 1pq,3q,del(6q),
7q,12p,13q,14q32
IGK;MYC
MYC;IGH
MYC;IGL
IGH;BCL-2
BCL-1;IGH
BCL-6;IGH
ALK;NPM
Malo
TCR
IGH;TCR
Bueno
“dianas patogénicas” de las anomalías citogenéticas asociadas al cáncer. Se han descrito diferentes mecanismos para activar oncogenes e
inactivar los genes supresores de tumores. Diferentes tipos de anomalías cromosómicas producen diferentes efectos génicos; así, una
deleción parcial o total de un cromosoma puede producir la pérdida
de genes supresores de tumores produciendo un efecto cancerígeno. La ganancia de material genético debido a duplicaciones o triplicaciones añadiría uno o más alelos de oncogenes activos que serían
patogénicamente importantes en algunas neoplasias. Por último,
anomalías cromosómicas, como traslocaciones, inserciones e inversiones, producirían una relocalización del material genético, pudiéndose destruir un gen, crearse un gen nuevo de fusión o bien interferir el control de regulación de genes determinados14.
En la tabla III se especifica el porcentaje de anomalías cromosómicas encontrados en cada tipo de hemopatía maligna, las anomalías cromosómicas más frecuentes, los genes implicados y el valor pronóstico de la alteración citogenética15.
CITOGENÉTICA MOLECULAR
Actualmente, se utiliza esta terminología para englobar aquellas
técnicas que combinan la biología molecular y la citogenética. Se
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conocidas, como la t(9;22) o la inv(16), por su rapidez diagnóstica. El análisis puede realizarse tanto en metafase como en interfase (fig. 3). Las sondas de pintado (librerías de ADN que tiñen
de manera más o menos uniforme un determinado cromosoma)
se aplican para la identificación de desequilibrios cromosómicos
de novo, cromosomas marcadores, reordenamientos crípticos16 y
reordenamientos complejos. Este tipo de sondas sólo puede ser
analizada en metafase.
La hibridación genómica comparada (CGH) permite la detección de pérdidas (deleciones) y/o ganancias (amplificaciones) de
regiones cromosómicas, a partir de una muestra de ADN. Se basa
en la hibridación competitiva entre el ADN problema y el
ADN control, marcados diferencialmente, sobre una metafase
control. La CGH es de gran utilidad en el estudio del cáncer, de
anomalías cromosómicas desequilibradas en productos abortivos y
en la identificación de cromosomas marcadores. Su gran ventaja
radica en que el estudio puede realizarse a partir de una pequeña
muestra de ADN y, a diferencia de la técnica de FISH, no precisa
una sospecha previa de determinada alteración cromosómica. Por
tanto, es una técnica idónea para aquellas muestras que presentan
dificultades para la obtención de cromosomas. No obstante, presenta ciertas limitaciones respecto a la citogenética convencional,
como la imposibilidad de detectar alteraciones cromosómicas estructurales o cambios presentes sólo en menos el 20% de las células. Precisa un sistema de análisis de imagen con un software específico. Bibliografía
Figura 3 Marcaje de los cromosomas mediante sondas fluorescentes.
Parte superior: síndrome de Williams (microdeleción de la región
crítica en el cromosoma 7). Parte inferior: reordenamiento 9;22
(bcr/abl).
basan en la unión específica de dos secuencias de ácidos nucleicos
complementarias, la sonda marcada y la secuencia de ADN diana a
la que va dirigida, en preparaciones cromosómicas.
La hibridación in situ fluorescente (FISH) utiliza sondas con
un marcado fluorescente que se aplican a una preparación cromosómica problema. Para aplicar esta técnica se precisa de una
sospecha de alteración cromosómica que nos permita realizar la
elección de la sonda, y sólo se descartan aquellas alteraciones para las que se ha aplicado la sonda. Las sondas centroméricas (secuencias de ADN satélite de los centrómeros cromosómicos)
permiten la detección de aneuploidías en interfase, por lo cual
son idóneas en muestras sin cultivar o con bajo índice mitótico, y
la identificación de cromosomas marcadores. Las sondas de secuencia única (específicas del locus) evidencian microdeleciones
cromosómicas que escapan a la citogenética convencional. Es la
técnica de elección para el diagnóstico de síndromes microdelecionales (Williams, Di George) y de traslocaciones o inversiones
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