Procedimiento para determinar tiamina en alimentos. Método

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR
TIAMINA EN ALIMENTOS
Método Fluorométrico-HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
1.
PRT-711.02-047
Fecha emisión:
09/ 01/ 2008
Revisión: 0
Fecha revisión:
09/ 01/ 2008
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OBJETIVO
Determinar la concentración de tiamina por cromatografía liquida de alta resolución en
harinas, productos a base de leche, de cereales, o una mezcla de ambos, enriquecidos o no
con vitamina B1.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El método es aplicable a muestras de harinas, productos a base de leche, de cereales, o una
mezcla de ambos, enriquecidos o no con vitamina B1 recepcionadas en la Sección Química
de Alimentos y Nutrición.
3.
FUNDAMENTO
Se basa en la extracción de la tiamina por un tratamiento enzimático, hidrólisis ácida,
seguido de purificación, oxidación a tiocromo (compuesto fluorescente cuya fluorescencia
es directamente proporcional a la concentración de tiamina presente en la muestra) y
posterior identificación y cuantificación por cromatografía liquida isocrática en fase
inversa con detector de fluorescencia, ajustada a una longitud de onda de excitación de 365
nm y de emisión de 436 nm.
4.
REFERENCIAS
4.1. United State Pharmacopeia U.S.P. XIX, año 1975, pág 504, 629.
4.2. Análisis de Vitaminas, Rolf Strobecker y Heinz M, año 1967, página 80, 82.
4.3. Methods for the determination of vitamins in food, G. Brubacher Muller Mulot and
A.T. Southgate, año 1975, pág 51- 64.
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5.
TERMINOLOGÍA
Tiamina: Se encuentra la forma sintética como Tiamina clorhidrato o mononitrato y
corresponde a un grupo de vitaminas solubles en agua que forman parte del grupo de
vitaminas del complejo B.
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1. Materiales
6.1.1 Columna: C 18 o RP-18 (5 um) 125 x 4 mm
6.1.2 Dispositivo de filtración al vacío para membrana Millipore.
6.1.3 Embudos
6.1.4 Espátula
6.1.5 Matraces Erlenmeyer de color ámbar, boca ancha, de 250 mL
6.1.6 Matraces Erlenmeyer de color ámbar de 100 mL
6.1.7 Matraces aforados de color ámbar de 1000 mL
6.1.8 Matraces aforados de color ámbar de 100 mL
6.1.9 Matraces aforados de color ámbar de 10 mL
6.1.10 Membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm.
6.1.11 Membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm.
6.1.12 Navecillas
6.1.13 Papel filtro Whatman Nº 2
6.1.14 Pre Columna C 18 o RP -18 (5 um) 4-4
6.2.
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
Equipos
Balanza analítica 0,1 mg de resolución.
Baño termorregulado con agitación magnética y rangos de Tº de 40 ºC a 50 ºC.
Baño termorregulado entre 80ºC a 90ºC.
Cromatógrafo líquido de alta resolución con detector de fluorescencia bomba
cuaternaria o isocrática, autosampler o inyector manual y software adecuado.
6.3. Reactivos
6.3.1 Ácido clorhídrico fumante 37 % p.a.
6.3.2 Ácido clorhídrico 1 N. En un matraz aforado de 1000 mL que contenga
aproximadamente 500 mL de agua destilada, añadir con cuidado 82 mL de HCL al
37%, enrasar con agua destilada.
6.3.3 Hidrogenofosfato de di-Potasio trihidratado p.a. (K2HPO4· 3 H2O) p.a
6.3.4 Solución de Hidrogenofosfato de di-potasio, solución 10 mM pH 7,2. En un vaso de
1000 mL pesar exactamente 2,28 g de K2HPO4· 3 H2O.y disolver en
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aproximadamente 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con HCL
1N.Trasvasar a un matraz aforado de 1000 mL y enrasar con agua destilada.
Desgasificar bajo presión reducida y filtrar a través de. Membranas Millipore 0,22
micras x 47 mm.
6.3.5 N,N-Dimetilformamida. p.a
6.3.6 NaOH 15%
6.3.7 Papaína soluble p.a
6.3.8 Sodio Acetato trihidratado p.a.
6.3.6.1 Solución de acetato de sodio 2,5 M
Pesar 340 mg de g de acetato de sodio trihidratado y llevar a un matraz aforado de
1000 mL con agua destilada y enrasar.
6.3.7 Fase móvil: Dimetilformamida, solución al 30% en hidrogenofosfasto de di-potasio.
6.3.7.1 En un matraz aforado de 1000 mL adicionar 300 mL de N,N-dimetilformamida y
enrasar con la solución de hidrogenofosfato de di-potasio, solución 10 mM pH 7,2.
6.3.8 Takadiastasa p.a
6.3.9 Tiamina clorhidrato o mononitrato estándar, secado a 105º C y almacenado en
desecador con deshidratante adecuado.
6.3.10 Ferricianuro de potasio
6.3.10.1Solución de ferrocianuro de potasio al 1%. Tomar 1 g de ferrocianuro de potasio y
llevar a 100 mL con agua destilada o desionizada.
6.3.11 Solución oxidante.
Tomar 4 mL de la solución de ferrocianuro de potasio al 1% en un matraz de 100 mL
y enrasar con solución de NaOH al 15%.
6.4. Solución Estándar de Tiamina:
6.4.1 Solución stock de 1 mg/mL
Pesar exactamente 50 mg de clorhidrato de tiamina o mononitrato de tiamina en un matraz
de 50 mL color ámbar, disolver en agua destilada adicionando 5 mL de HCL 1N y enrasar
con agua destilada. Guardar en frasco oscuro a una temperatura menor de 10 ºC (preparar
la solución cada 6 meses o cuando se requiera)
6.4.2 Solución intermedia de 100 ug/mL.
Diluir 5 mL de la solución stock a 50 mL con agua destilada. Guardar en frasco oscuro a
una temperatura menor de 10 ºC.
6.4.3 Solución de 10 ug/mL.
Diluir 5 mL de la solución intermedia de 100 ug/mL en un matraz de 50 mL y enrasar con
agua destilada.
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6.4.4 Solución de 1 ug/mL.
Diluir 5 mL de la solución en un matraz de 50 mL y enrasar con agua destilada.
6.4.5 Curva de trabajo de 0.2, 0.5, 1.0, 2,0 ug/ 10 mL
En matraces separados de 10 mL de color ámbar tomar alícuotas de 0,2 - 0,5 - 1.0 – 2 mL
respectivamente de la solución de 1 ug/mL (6.4.4) y proceder a la oxidación agregando 2
mL de ferricianuro alcalino y agitar por 2 minutos, enseguida adicionar 0,45 mL de ácido
ortofosfórico, enfriar inmediatamente y enrazar con agua destilada. La solución está lista
para traspasar a vial ámbar e inyectar en HPLC.
7.
DESARROLLO
El ingreso de la muestra para su análisis debe cumplir con el Instructivo de Aceptación o
Rechazo de muestras IT 711-02-065.
Profesional del laboratorio es el encargado de realizar el análisis HPLC, realiza los
cálculos e informa resultados.
Técnico del laboratorio efectúa el resto del procedimiento
7.1. Preparación de la muestra
La vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio el tiocromo que es el producto de la
oxidación si es fotosensible, por lo cual se debe utilizar material ámbar o color marrón
durante la etapa de oxidación.
7.1.1 Homogeneizar la muestra mezclando o moliendo cuando se requiera, pesar + 5 g
para harinas en un matraz erlenmeyer con tapa de 250 mL.
7.1.2 Adicionar 0,5 g de Taka-Diastasa 0,25 g de papaína y 15 mL de agua destilada a +
45-50 ºC. Mézclese bien a fin de obtener una suspensión homogénea.
7.1.3 Tapar el matraz y colocarlo durante 30 min en un baño termorregulador a + 45-50
ºC. Enseguida añadir 30 ml de agua destilada entre + 45-50 ºC.
7.1.4 Hidrólisis
7.1.4.1 Añadir 5 mL de HCL 1 N al matraz anterior, mezclar bien. Calentar por 30 min a
baño maría hirviente agitando ocasionalmente para evitar grumos.
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7.1.4.2 Enfriar y añadir 5 mL de acetato de sodio 2,5 M, mezclar bien y transferir
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml color ámbar y enrazar con agua
destilada.
7.1.4.3 Filtrar a través de papel filtro Whatman Nº 2 y membranas Millipore de 0,22 micras
de 13 mm. La solución está lista para la oxidación.
7.2. Oxidación
7.2.1 En un matraz aforado de 10 mL color ámbar, adicionar una alícuota de 1 mL de
filtrado anterior que contiene la tiamina.
7.2.2 Añadir 3 mL de solución de ferrocianuro de potasio alcalino, agitar por 2 min en
forma constante.
7.2.3 Añadir 0,45 mL de ácido fosfórico concentrado, mezclar, enfriar y enrasar con agua
destilada.
7.2.4 La solución esta lista para Cromatografiar.
7.3 Determinación cromatográfica de Tiamina
7.3.1 Curva de calibración de las soluciones estándares
7.3.1.1 Inyectar en triplicado 20 uL de cada uno las soluciones estándares entre 0.2 y 2,0
ug/mL.
7.3.1.2 Tiempo de corrida: 7 minutos.
7.3.1.3 Realizar la curva de calibración utilizando el método de cálculo con estándar
externo integrado en el equipo.
7.4
Condiciones Cromatográficas de Tiamina
Columna
: C18 o RP-18 (5um) 125 x 4,6mm y Pre Columna RP -18 (5 um) 4-4
Fase móvil
: 6.3.7
Inyección
: 20 uL
Flujo o caudal
: 0,8 mL / min.
Detector
: Espectrofluorímetro, Excitación: 365 nm y Emisión 436 nm
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Cuantificación de Tiamina en muestras
Ingresar al HPLC en método Tiamina que contiene la curva de calibración obtenida de
concentración (C) en ug/mL e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del área vs
concentración. Valor C (ug/mL)
7.5.1
7.5.2
Inyectar en duplicado 20 uL de la solución eluida del extracto de la muestra de
harina de trigo.
Tiempo de corrida: 7 minutos.
7.3. Cálculo e informe de resultados
cxv
mg /Kg = --------------
a
Donde: c = concentración en ug/ml obtenidos por la interpolación en la curva de
calibración de la muestra.
v = volumen de la muestra final
a = masa de la muestra en gramos
Limite de detección: 0,01 ug/mL
Limite de cuantificación: 0,02 ug/mL
Informar mg/Kg de Tiamina con un decimal.
Control de Calidad
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos
realizados con el método analítico recogido en este procedimiento.
a) Nivel I:
Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia
certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad.
b) Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye:
- Control de blanco al inicio de la corrida cromatográfica
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Control de estándar de concentración conocida
Inyección del estándar como control por cada diez muestras inyectadas
REGISTROS
Identificación
del registro
Almacenamiento Protección
Recuperación Tiempo
retención y
disposición
Libro de Registro de En estante del Acceso
Restringido
Papel
5 años
análisis Vitaminas Laboratorio
Técnico y Profesional
RG-711.00-037
Nutrientes,
de
Laboratorio
Aditivos
y Nutrientes, Aditivos y
Contaminantes. Contaminantes
Archivador
de En
estante Acceso
Restringido
Papel
5 años
cromatogramas
Laboratorio
Técnico y Profesional
vitaminas
Nutrientes,
Laboratorio Nutrientes,
Aditivos
y Aditivos
y
Contaminantes
Contaminantes
Laboratorio
Nutriente
RG-711.00-045
En
estante Acceso
Restringido
Papel
5 años
Registro de Control Laboratorio
Técnico y Profesional
de Temperatura baño Nutrientes,
Laboratorio Nutrientes,
termorregulado
Aditivos
y Aditivos
y
Contaminantes
Contaminantes
RG-711.00-003
En
estante Acceso
Restringido
Papel
5 años
Registro
de Laboratorio
Técnico y Profesional
calibración
de Nutrientes,
Laboratorio Nutrientes,
peachimetro
Aditivos
y Aditivos
y
Contaminantes
Contaminantes
Base
datos En computador Acceso a Técnico y
Papel
5 años
computacional
del Laboratorio Profesional Laboratorio
Programa Ministerial de
Nutrientes, de Nutrientes, Aditivos
Harinas
Aditivos
y y Contaminantes
Contaminantes
RG.
711.00.001 En Estante del Acceso a Técnico y
Papel
5 años
Registro control de Laboratorio
de Profesional Laboratorio
T° Refrigerador
Nutrientes,
de Nutrientes, Aditivos
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Identificación
del registro
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Almacenamiento Protección
Aditivos
y y Contaminantes
Contaminantes
Registro preparación En estante del Acceso a Técnico y
de soluciones de Laboratorio
de Profesional Laboratorio
estándares
puros Nutrientes,
de Nutrientes, Aditivos
RGG-700.00-034
Aditivos
y y Contaminantes
Contaminantes
Registro preparación En estante del Acceso a Técnico y
de
mezclas
de Laboratorio
de Profesional Laboratorio
soluciones
Nutrientes,
de Nutrientes, Aditivos
estándares
RGG- Aditivos
y y Contaminantes
700.00-035
Contaminantes y
Jefatura
de
sección
9.
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Recuperación Tiempo
retención y
disposición
Papel
5 años
Papel
5 años
TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº
9. ANEXOS
No Aplica
Pág.
Modificada
Motivo del cambio
Fecha Aprobación