Resumen de investigación: “Pathway for Parkinson disease”

Resumen de
investigación:
“Pathway for
Parkinson disease”
(3) Hoang, Q. Q. (2014) Pathway for Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111,
2402-2403.
Esther Blanco Romero
GENÉTICA MOLECULAR | GRADO EN BIOLOGÍA CURSO
2014/2015
(3) Hoang, Q. Q. (2014) Pathway for Parkinson disease. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 111, 2402-2403.
1. Introducción
La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo de etiología
desconocida. Los síntomas más comunes incluyen temblores de las extremidades,
rigidez muscular, arrastre de los pies al caminar, postura encorvada, bradiquinesia,
hipotensión ortostática, alteraciones del sueño, disfunción autónoma, alteraciones
olfativas, depresión y demencia (1, 3).
Es causada por una pérdida progresiva de las neuronas pigmentadas de la sustancia
nigra compacta y la aparición en el resto de neuronas de cuerpos de Lewy, que son
agregados ricos en proteína anormales. La degeneración de las neuronas de la sustancia
nigra es una parte de un proceso más amplio de degeneración que comienza en la
médula oblonga y que se propaga al mesencéfalo y el córtex cerebral. La pérdida de
neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra compacta conlleva deficiencia en
dopamina, responsable de los síntomas motores y no motores (1, 2 y 3).
Esta enfermedad, como otras enfermedades de origen genético, tiene un carácter
heredable pero también pueden darse casos esporádicos. Aunque son conocidos muchos
de los síntomas que produce la enfermedad y la causa, no se conoce cómo se produce
esa pérdida progresiva de neuronas. Por ello es importante el estudio desde los genes a
las proteínas, con el fin de elucidar el mecanismo por el que esta enfermedad se
desarrolla. Uno de los genes que tiene una relación con la enfermedad de Parkinson
hereditario es LRRK2 (quinasa con repeticiones ricas en leucina 2), que codifica para
una proteína multidominio que incluye entre los catalíticos un dominio quinasa, un
dominio C-terminal (COR) y un dominio con actividad GTPasa (ROC) acoplados; que
es fosforilada en la célula e interviene en las rutas de endocitosis de vesículas (3 y 4).
Figura 1: Proteína multidominio LRRK2.
El objetivo de este estudio es identificar las proteínas que interaccionan con LRRK2
para elucidar el papel de esta quinasa en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson, ya
que mutaciones en esta proteína son una de las causas más comunes de la enfermedad,
posiblemente por sobreactivación de su actividad quinasa (4).
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2. Datos experimentales (4):
2.1 Estudios de interacción proteica y formación de complejos:
a) Arrays proteína-proteína:
En esta técnica una proteína se inmoviliza por la existencia de un agente de captura que
pueden ser anticuerpos o proteínas recombinantes, en este caso se emplea la fusión de la
proteína de interés a un tag (secuencia de aminoácidos o péptidos para la que existen
anticuerpos específicos). La proteína de interés queda inmovilizada sobre la superficie
del array y puede ser incubada con la muestra compleja de proteínas para estudiar la
posible interacción con la proteína inmovilizada.

LRRK2 interacciona con 3 miembros de la familia de cochaperonas BAG,
incluida BAG5:
Mediante arrays proteína-proteína en los que el gen de LRRK2 ha sido mutado (los
dominios catalíticos siguen intactos) se fusiona con el tag GST y posteriormente la
proteína se inmoviliza en el array. Este array se somete a una muestra compleja y como
resultado se recuperan 3 miembros de la familia BAG, entre ellos BAG5, proteína que
se expresa en neuronas y promueve la muerte de neuronas dopaminérgicas.
Para evitar falsos positivos se establece un control negativo solo con GST, así puede
conocerse si las proteínas que se recuperan en GST-LRRK2 truncada se debe a una
interacción con GST o sí realmente es interacción con la proteína LRRK2.

LRRK2 interacciona con la proteína 14-3-3, STUB1/CHIP, RAB7L1 y GAK
por el dominio de unión proteína-proteína:
En el array anterior, en el que LRRK2 tenía los dominios catalíticos, no se recuperó 143-3. Se realizó otro experimento, esta vez con LRRK2 intacta unida e inmovilizada por
su unión al tag Flag y en este caso sí se recupera 14-3-3, lo que sugiere que 14-3-3 se
une a LRRK2 pero necesita el dominio de unión proteína-proteína. Además se
recuperan STUB1/CHIP, RAB7L1 y GAK.
También es necesario usar un control negativo para comprobar si la unión es específica
de LRRK2 o se debe al tag, por ello el control negativo consta de Flag-GFP.
b) Coinmunoprecipitación:
Con el fin de observar las interacciones específicas de las proteínas BAG5, GAK y
RAB7L1, que podrían estar interaccionando con LRRK2 se realizaron ensayos de
coinmunoprecipitación, técnica que muestra la interacción de una proteína unida a un
tag con proteínas endógenas de la célula, al hacer que la proteína unida al tag precipite y
la mezcla quede enriquecida en esa proteína se puede después hacer un western blot de
la muestra y estudiar la presencia de otras proteínas por anticuerpos específicos. Si
hubiese más proteínas presentes significaría que estaban unidas a la proteína que hemos
hecho inmunoprecipitar.
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
LRRK2 interacciona con BAG5, GAK y RAB7L1:
El experimento de array ya sugería una interacción entre LRRK2 y BAG5, pero con el
fin de profundizar más en el mecanismo de interacción molecular se realizaron ensayos
de coinmunoprecipitación, uniendo la proteína BAG5 al tag Flag. Se observó que
BAG5 coinmunoprecipita con LRRK2 endógeno y, de igual modo, que LRRK2
coinmunoprecipita con BAG5 endógeno.
Lo mismo ocurre con GAK unida a GFP y con RAB7L1 unida a Flag.
Es decir, LRRK2 puede interaccionar de manera independiente con BAG5, GAK y
RAB7L1 endógena en el cerebro de ratón.
Sin embargo, las distintas proteínas tienen diferentes requerimientos de secuencia para
la unión con LRRK2. Por ejemplo, al disociar con un inhibidor de quinasa de LRRK2,
las proteínas 14-3-3 y BAG5 permanecen unidas.
BAG5:

Hsc70/Hsp70 estabiliza el complejo formado por BAG5-LRRK2:
Se observó que al mutar en BAG5 por el cambio de residuos de aspartato y arginina a
alanina (mutante DARA), la proteína BAG5 se une menos a LRRK2 y esto se debe a
que Hsc70 ya no puede unirse a BAG5.

LRRK2 se une por su dominio COR a BAG5:
Al repetir los experimentos de coinmunoprecipitación pero con LRRK2 mutada en
distintos dominios se observó que solo es necesario el dominio COR para recuperar
BAG5 en el ensayo.
GAK:

La unión entre GAK y LRRK2 también está mediada por Hsc70/Hsp70:
El complejo GAK-LRRK2 coinmunoprecipita con BAG5 pero no cuando esté tiene las
mutaciones comentadas anteriormente (mutante DARA), lo que sugiere que la unión de
Hsc70 también media la interacción entre GAK y LRRK2 y que la proteína BAG5
endógena puede coinmunoprecipitar con GAK en el cerebro de ratón.

GAK se une por el dominio PTEN a LRRK2 y BAG5:
Al realizar mutantes en los distintos dominios y hacer ensayos de
coinmunoprecipitación se observa que GAK solo necesita del dominio PTEN para su
interacción con LRRK2 y también con BAG5.
 Las interacciones entre LRRK2, BAG5 y GAK se mantienen aunque alguna de las
proteínas esté ausente.
RAB7L1:

RAB7L1 se une a LRRK2 por el dominio N-terminal HEAT:
Al realizar distintas mutaciones en los dominios de LRRK2 y hacer ensayos de
coinmunoprecitación se observa que la unión entre RAB7L1 y LRRK2 solo se ve
afectada al mutar el dominio N terminal.
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
RAB7L1 es una GTPasa que se une a LRRK2 independientemente de si
está unida a GTP o GDP:
Al realizar mutaciones en RAB7L1 que lo hagan deficiente en su unión a GTP o que
tenga la disociación de GTP/GDP aumentada se observa que sigue habiendo
coinmunoprecipitación de LRRK2. Sin embargo, la actividad de RAB7L1 sí se ve
afectada al observar que disminuye la localización del Golgi en estos mutantes.

RAB7L1 endógeno puede coinmunoprecipitar con LRRK2, GAK, Hsp 70 y
BAG5 endógenos:
En ensayos de inmunoprecipitación específica de RAB7L1 se observa que precipitan
con ella también LRRK2, GAK, Hsp 70 y BAG5, lo que sugiere que las proteínas están
unidas formando un complejo.
Figura 2: A (esquema de las posibles proteínas interactoras). B-E
coinmunoprecipitaciones: B (BAG 5), C (Rab7L1), D (GAK), usando distintos controles
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negativos. E (inmunoprecipitación de BAG5 con GAK endógeno). F y G (cocomplejo entre
LRRK2, GAK, BAG5 y Rab7L1).
2.2 Función del complejo LRRK2, GAK, Hsp 70, BAG5 y RAB7L1
mediante medidas del acortamiento de neuritas:
Para comprobar si la formación de este complejo implica que las proteínas tienen
efectos similares se realiza un ensayo de acortamiento de neuritas, que es muy grande
en mutantes de LRRK2.
Se preparan controles y por otra parte se transfectan las distintas proteínas unidas a un
tag en las neuronas. Las neuronas se fijan y se emplean distintos anticuerpos primarios
(anti-Flag, anti-GFP o anti-Myc) según la proteína que queramos reconoce junto con
anti-MAP2, una proteína implicada en la estabilización de microtúbulos y anti-bIII
tubulina que forma parte de los microtúbulos. Para obtener fluorescencia posteriormente
se emplean anticuerpos secundarios unidos a un fluorocromo.
Por microscopia se observa la localización de cada una de las proteínas detectadas por
anticuerpos y la longitud relativa de las neuritas. Por análisis estadístico puede
observarse si hay diferencias significativas en la longitud.
Figura 3: Fenotipos de acortamiento de neuritas y expresión de las proteínas de unión a
LRRK2. A y B (Tranfección de BAG5 en neuronas), C (transfección de BAG5), D
(transfección de GAK), E (transfección de Rab7L1), F (cuantificación del alargamiento de
neuritas con transfección de Rab7L1 intacta o mutada).
Como resultado se obtuvo que BAG5 causa acortamiento de neuritas, pero en el
mutante DARA de BAG5 disminuye el acortamiento. GAK y RAB7L1, al igual que
hace BAG5, aumentan el acortamiento de neuritas. Los efectos de RAB7L1 disminuyen
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en mutantes deficientes en LRRK2 lo que indica que los efectos de RAB7L1 requieren
la presencia de LRRK2.
2.3 Estudios de localización celular:
Otro de los experimentos llevados a cabo en el estudio refiere a la localización celular
de cada proteína. LRRK2 ya había sido previamente observada en microsomas, y BAG5
y GAK en la misma fracción subcelular.
En este experimento se expresa cada proteína unida a un tag y se transfecta en neuronas.
Al incubar con anticuerpos primarios que reconozcan los distintos tags y anticuerpos
secundarios con fluorescencia se puede observar en microscopía de fluorescencia qué
lugar ocupan dentro de las neuronas.
En células Hek293 de mamífero transfectadas con LRRK2 unida a un tag (Flag), que
son muy fáciles de manipular, se comprueba la presencia o no de las proteínas
endógenas en distintas compartimentos subcelulares por la técnica de Western Blot.
También se cotransfectó en neuronas LRRK2 unida al tag Flag junto con las proteínas
de estudio unidas a Myc una a una, para ver si existe colocalización. Para su
visualización se empleó el mismo protocolo detallado anteriormente.
Como resultado se obtuvo que LRRK2 tiene una localización tanto citosólica como
vesicular, BAG5 citosólica y nuclear, mientras que GAK y RAB7L1 son vesiculares.
Figura 4: El complejo proteico formado con LRRK2 colocaliza en los compartimentos
vesiculares de las neuronas. A (Tranfección en Hek293 para análisis de localización
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endógena), B (localización de proteínas en neuronas), C (colocalización de LRRK2 con
GAK o Rab7L1 en neuronas.
LRRK2 colocaliza con GAK en las vesículas. RAB7L1 promueve la localización
celular de LRRK2; en mutantes de RAB7L1 deficientes en unión a GTP no son capaces
de situar LRRK2 en vesículas.
Es decir, el complejo se forma en las vesículas y es necesario que RAB7L1 esté unido a
GTP.
Para ver el lugar concreto dentro del aparato de Golgi donde se localizan se emplean los
anticuerpos específicos de la red trans-Golfi (TGN46) o de cis-Golgi (GM130).
RAB7L1 y GAK se expresan en la red trans Golgi. El experimento muestra cómo al
cotransfectar RAB7L1 y LRRK2 la localización pasa a ser perinuclear, también se
observa como la presencia de estas dos proteínas y la nueva localización para pasar a
formar el complejo llevan al desmontaje de la red trans-Golgi.
Figura 5: Formación del complejo y desmontaje del Golgi. A (transfección de LRRK2 y
Rab7L1 y marcaje de la red trans-Golgi y cis-Golgi), B (cuantificación de células con
relocalización de LRRK2 y análisis estadístico), C (LRRK2 en células cotransfectadas con
LRRK2 y Rab7L1 no se localiza en retrómero).
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3. Conclusiones (3 y 4):
Tras estudiar la interacción de proteínas, formación de complejo, función y localización
de las proteínas LRRK2, BAG5, GAK y Rab7L1 se concluye que todas ellas forman un
complejo, para lo cual es necesario la presencia de Hsp70. Inicialmente no todas las
proteínas se encuentran en la misma localización celular pero Rab7L1 dirige a LRRK2
hacia la formación del complejo.
La formación de este complejo lleva al desmontaje de la red trans-Golgi por el sistema
de autofagia lisosomal, por lo que intervienen en el tráfico de vesículas derivadas del
aparato de Golgi. Mutaciones en cualquiera de las proteínas y fundamentalmente en
LRRK2 pueden causar una sobreactivación en su actividad conduciendo al desarrollo de
la enfermedad de Parkinson.
Es decir, mutaciones en los genes que codifican para ciertas proteínas pueden suponer
un factor de riesgo para el desarrollo de Parkinson.
Son necesarios más estudios para estudiar otras posibles proteínas que interaccionen
bien formando el complejo o bien modificándolo, así como estudios de las funciones
concretas de cada proteína por separado.
Figura 6: Modelo de actuación del complejo formado por LRRK2, GAK, BAG5 y
Rab7L1.
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4. Bibliografía:
(1) Klockgether, T. (2004) Parkinson’s disease: Clinical aspects. Cell Tissue
Res 318 (1):115–120.
(2) Lang, A.E., Lozano, A.M. (1998) Parkinson’s disease. N Engl J
Med 339(15):1044–1053.
(3) Hoang, Q. Q. (2014) Pathway for Parkinson disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
111, 2402-2403.
(4) Beilina, A, et al. (2014) Unbiased screen for interactors of leucine-rich repeat
kinase 2 supports a common pathway for sporadic and familial Parkinson
disease. Proc Natl Acad Sci USA111:2626–2631.
La referencia 4 ha sido la empleada para la elaboración de los apartados de datos
experimentales y conclusiones.
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