IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES GENÉTICOS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE
HUANCAVELICA
(Creada por Ley Nro. 25265)
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES GENETICOS
MOLECULARES SNPs PARA CARACTERISTICAS DE
IMPORTANCIA ECONOMICA EN LA ALPACA
HUACAYA
LINEA DE INVESTIGACIÓN
Preservación de la biodiversidad y el ecosistema de la zona de influencia del
proyecto Camisea
INVESTIGADORES:
RESPONSABLE
:
M.Sc. Ing. WILLIAM SALAS CONTRERAS - UNH
ASESOR
:
Ph D. Blgo. JOSE ESPINOZA BABILÓN - UPCH
FECHA DE REGISTRO:
INICIO
:
.............................................................
CULMINACIÓN
:
.............................................................
HUANCAVELICA, MAYO DEL 2014
ÍNDICE
Pág.
1. PROBLEMA
1.1 Planteamiento del problema
1.2 Formulación del problema
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo general
1.3.2 Objetivos específicos
1.6 Justificación
CAPITULO I
3
3
4
4
4
4
5
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes
2.2 Bases teóricas
2.3 Hipótesis
2.4 Definición de términos
2.5 Identificación de variables
2.6 Definición operativa de variables e indicadores
7
7
8
10
11
15
15
CAPITULO III
3. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1 Tipo de investigación
3.2 Diseño de investigación
3.3 Método de investigación
3.4 Población, muestra, muestreo
3.5 Fundamento y técnica a utilizar
3.6 Procedimiento para el análisis
3.7 Toma de muestras
3.8 Análisis de laboratorio
3.9 Ámbito de estudio
16
16
16
16
16
16
18
20
21
27
CAPITULO IV
4. ASPECTO ADMINISTRATIVO
4.1 Recursos humanos
4.2 Recursos materiales
4.3 Presupuesto (cadena de gasto mensualizado)
4.4 Financiamiento
4.5 Cronogramas de actividades
28
28
29
31
37
37
BIBLIOGRAFIA
ANEXO
38
41
CAPITULO I
1. PROBLEMA
1.1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El Perú cuenta con la mayor población de alpacas (Vicugna pacos) en el mundo llegando
alrededor de 3 millones de ejemplares. En la alpaca, el principal producto económico
constituye la fibra, sin embargo, a lo largo del tiempo esta fibra ha ido disminuyendo su
calidad con lo cual el precio en el mercado ha disminuido considerablemente. El gobierno
peruano con el fin de contrarrestar esta situación ha propiciado la creación de programas
de mejora genética encaminados a elevar la productividad y calidad de la alpaca,
programas que a la fecha no han obtenido resultados satisfactorios.
Un adecuado programa de mejoramiento genético en alpacas requiere de dos
herramientas básicas para su desarrollo y aplicación: i) Selección y ii) Sistemas de
reproducción. Una selección adecuada de alpacas reproductoras depende de la
información sobre animales para la toma de decisiones, donde los registros productivos y
de filiación son fuentes de información indispensables.
Lamentablemente en el Perú, los registros de los criadores de alpacas son deficientes o
inexistentes, debido a un inadecuado manejo y baja confiabilidad en la identificación de
parentesco. Estudios previos han reportado al menos un 25% de errores de filiación
(Rodríguez y col., 2006) en registros en centros reproductores de alpacas.
Los errores de filiación en alpacas producen una merma considerable en la ganancia
genética esperada para esta especie; merma que hasta la fecha no ha sido cuantificada,
provocando el fracaso o retraso de cualquier programa de mejoramiento genético dirigido
a elevar la calidad de la fibra. Además, la ausencia de un sistema de validación de pedigrí
se convierte en una limitante para la apertura del mercado nacional e internacional de
venta de crías certificadas de alto valor genético.
El impacto generado por errores de filiación en registros productivos en ganado
doméstico, sugieren que tasas de solo el 10% producen una disminución del orden del 11
al 15% de la ganancia genética total (Banos y col., 2001), siendo además un factor
importante a considerar en la estimación del mérito genético de un animal reproductor. En
la alpaca, esta situación se agrava debido a la carencia de productos y subproductos
alternativos a la fibra con capacidad de aprovechamiento y demanda en el mercado
nacional e internacional.
Adicionalmente, la ausencia de métodos adecuados y acelerados de selección genética
disminuye el valor del ganado lo cual se manifiesta en una baja calidad de fibra. El
intervalo generacional en la alpaca alrededor de 4 años también constituye un problema
para métodos adecuados de selección, siendo la selección genética asistida por
marcadores una alternativa tecnológica a ser explotada. Los marcadores genéticos SNPs
en genes codominantes relacionados con características de importancia económica como
diámetro de fibra principal característica económica en los sistemas de producción de
alpacas.
Las consecuencias de una ausencia de alternativas tecnológicas en base a genética
molecular y su incipiente aplicación en sistemas de producción de alpacas vienen
generando que los pobladores alto andinos que subsisten con los productos generados
por la alpaca no dispongan de suficientes recursos económicos para solventar su alicaída
economía familiar. Se estima que alrededor de 200,000 familias equivalentes a un millón
de habitantes distribuidos en 14 de los 24 departamentos del Perú subsisten gracias a
este recurso pecuario.
De otro lado, cabe mencionar que en la actualidad se están realizando trabajos de
investigación científica aplicando las ventajas de la genética molecular y la disponibilidad
de una batería de microsatélites y SNPs por si sola ya permite emprender
inmediatamente una serie de estudios importantes para los programas de mejoramiento
genético. Así, tenemos que las aplicaciones a corto plazo incluyen, básicamente, la
identificación y discriminación de individuos, pruebas de filiación, estudios de
consanguinidad y variabilidad, control y verificación de empadres, aplicados en forma
efectiva los programas de mejora genética podrían ayudar a elevar la calidad genética.
1.2
FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
La genética de los rasgos económicamente importantes de la alpaca se desconoce
debido a una insuficiente caracterización de marcadores genéticos moleculares en la
alpaca. Los marcadores microsatélites y los polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs)
son marcadores de elección para el mapeo de los rasgos productivos y son una
herramienta útil para solucionar el problema.
El insuficiente número de marcadores microsatélites y SNPs identificados y validados son
un problema en la alpaca, los cuales constituyen una causa de los pobres resultados
obtenidos en los programas de mejora genética. Por lo expuesto, el problema que busca
abordar el presente proyecto constituye: La insuficiente identificación y desarrollo de
marcadores SNPs y microsatélites como herramientas de mejora genética en alpacas
Huacaya. El contar con un panel de marcadores moleculares de la alpaca también
reforzara los estudios de diversidad genética del recurso y ayudaran a los programas de
mejoramiento genético de la alpaca.
¿Existen marcadores moleculares SNPs para características de importancia
económica en la alpaca Huacaya?
1.3
1.4
OBJETIVOS
1.3.1
OBJETIVO GENERAL
Generar un panel de marcadores genéticos moleculares de la alpaca Huacaya
1.3.2
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Desarrollar libros de registros y pedigrí validados mediante ADN
Identificar marcadores genéticos de ADN tipo SNPs para el mejoramiento
genético y evaluación de la diversidad genética
JUSTIFICACIÓN
Siendo el Perú un país poseedor de una población de más 3 millones de alpacas
distribuidas principalmente en zonas alto andinas sobre los 3500 metros de altitud con
sistemas de producción constituidos principalmente por pequeños y medianos
productores (cerca del 90%) la venta de fibra de alpaca constituye un importante recurso
económico para la manutención de sus familias. (FAO, 2005)
Además el Perú es considerado como el principal productor de fibra de alpaca en el
mundo, con un 85% de la producción nacional orientada al mercado internacional .La
venta de fibra de alpaca al mercado internacional representa en promedio el 1.35% de las
exportaciones .Por otro lado cabe mencionar que actualmente, esta cifra ha disminuido
debido a la pérdida de la calidad de la fibra, lo cual ha ocasionado la disminución de su
valor comercial (FAO, 2005).
El conocimiento del estatus genético del animal es un elemento clave para una correcta
toma de decisiones en los programas de conservación y uso sostenible de cualquier
recurso genético, así como para el desarrollo de pruebas de identidad y parentesco. La
capacidad de las especies domésticas para mejorar su productividad y adaptarse a
diferentes condiciones medioambientales, requiere de tener acceso a todo su potencial
adaptativo, lo cual está estrechamente relacionado con la diversidad genética existente
(Tapia y col., 2006).
Durante los últimos años la conservación de razas y/o poblaciones ha tomado un gran
auge debido principalmente a la concientización del hombre en la necesidad de preservar
dichos recursos genéticos. La importancia de la biodiversidad y la conservación quedó
patente a partir de la cumbre de las Naciones Unidas sobre el medio ambiente y el
desarrollo celebrada en Río de Janeiro en 1992 estableciéndose entonces la necesidad
de estudiar los diferentes componentes de la diversidad genética.
El recurso genético animal constituye un patrimonio de inestimable valor, la pérdida de
diversidad genética merma nuestra capacidad de mantener y mejorar la producción y
productividad pecuaria y reduce la aptitud para hacer frente a nuevas condiciones
ambientales (FAO, 2005).
Es menester anotar que la importancia de la conservación de razas se resume en cuatro
aspectos:




De orden genético-productivo: la diversidad es necesaria para mantener la
variabilidad de las poblaciones la cual permite la adaptación a diferentes ambientes
algunas veces adversos.
De orden científico: el estudio de cada raza en particular es de interés para detectar
posibles genes únicos y valiosos en el momento actual o en el futuro de estas
poblaciones.
De orden histórico cultural: la conservación de determinadas razas y especies
representan un patrimonio genético de un país y como historia viva y paralela al
desarrollo de la población humana.
De orden ecológico-ambiental: los ecosistemas son el resultado del equilibrio entre
clima, flora y fauna y cualquier factor que afectará a alguno de estos componentes
estaría atentando contra ese equilibrio deteriorando el medio y la simbiosis ecológica
de la zona (Simons 1984).
-Antiguamente los registros genealógicos se hacían por examen aparente o
simplemente no existían.
-En la actualidad muchos de estos estudios sobre conservación de razas se basan en
los análisis genéticos a través del uso de marcadores moleculares de ADN (uno de
estos marcadores son los microsatélites o short sequence repeat tandem o SSRT).
-Para Huancavelica y otros criadores de alpacas la mejora genética asistida con
marcadores moleculares permitirá mejorar la fibra la que redunda en una mayor
economía del poblador andino. Además también repercute en la industria con
mayores volúmenes y homogeneidad en calidad, y la industria textil contará con
mejor materia prima para la producción de telas.
-Afortunadamente la aparición de los marcadores moleculares está ayudando a
eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del
fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa
y repetitiva.
Finalmente, es importante identificar marcadores moleculares porque con ellos se
podrá realizar mejoramiento genético logrando mejores animales lo cual a su vez
permitirá mejorar los precios en beneficio de los criadores y los usuarios del
producto final
CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1
ANTECEDENTES
Tradicionalmente se consideraba al guanaco, el ancestro de estas dos especies, mientras
que se pensaba que la vicuña nunca había sido domesticada. Recientes investigaciones,
vinculan a la alpaca con la vicuña, y datan su domesticación una antigüedad de 6000 a
7000 años, en los Andes Peruanos. En nuestro territorio, en la Puna Norte y Puna Sur
hay evidencias arqueológicas del probable comienzo de la domesticación de los
camélidos, entre 3500 a 5000 años atrás iniciado por cazadores. Los análisis genéticos,
como el ADN mitocondrial, confirmaron la similitud genética entre la llama y el guanaco y
entre la vicuña y la alpaca, revelando hibridación bidireccional. Por análisis de
microsatélite ADN se sugiere que la alpaca desciende de la vicuña y que debiera ser
reclasificada como Vicugna pacos (Wheeler, 1995)
Tapia et al (2006), estudió comparativamente el material genético de los camélidos
sudamericanos, un aspecto biológico que no había sido explorado; analizó, entre otros
temas, la organización de secuencias repetidas de ADN, que suelen encontrarse en
proporción alta en los mamíferos, y cuyo papel en la estructura, evolución y regulación de
los genes no es aún conocido. Estas secuencias pueden aparecer más de un millón de
veces y, desde un punto de vista evolutivo, podrían establecer nuevas relaciones entre
los genes estructurales y regulatorios, ya que las secuencias repetidas podrían variar
algunas de sus características a lo largo del tiempo sin perder su identidad. Ello convierte
a este tipo de ADN en valiosa herramienta para inferir relaciones evolutivas entre grupos
de organismos.
Hasta la fecha se han identificado y caracterizado 23 marcadores de microsatélites
polimórficos aislados de una genoteca genómica de camélidos sudamericanos, utilizando
una sonda de poli (TG) 24. Estos SSRT presentan una gran diversidad en cuanto al
número de alelos en los distintos taxa de los camélidos sudamericanos, así como también
en los índices de heterocigocidad para cada locus. Finalmente ya se tiene algunos
marcadores apropiados para determinar relaciones de filiación. Esto permitirá validar de
una forma objetiva los registros genealógicos de camélidos sudamericanos actualmente
existentes en el país, tema en el que una vez más han tomado la iniciativa países del
hemisferio norte donde estas especies son exóticas (wheeler, 1965).
Los rasgos productivos en alpacas incluyen características de la fibra, resistencia a las
infecciones, así como rasgos reproductivos y metabólicos. Algunos loci asociados a la
variación de la lana han sido identificados por estudios de mapeo genético en ovejas.
Estudios en oveja Merino han demostrado la existencia de variantes genéticas para
genes de queratina (KRT33) y proteínas asociadas a queratina (Tricohialina y KAPs). En
alpacas, a la fecha, se cuenta con 6,611 ESTs no anotados que constituyen un recurso a
ser explotado para la generación de marcadores genéticos mediante el tamizaje dirigido a
la identificación de microsatélites y SNPs, los cuales podrían ser evaluados en
poblaciones fenotípicamente diferenciadas en rasgos productivos como diámetro de fibra
y densidad del vellón. Esta etapa está en sus inicios ya que se necesitan decenas de
marcadores para realizar los trabajos de identificación de genes relevantes. Todos los
marcadores existentes en camélidos fueron obtenidos aleatoriamente por lo que poco
contribuyen en el mejoramiento de características deseadas.
En Uruguay, trabajando con 494 ovinos Texel se analizaron los genes CAPN1, GH, CAST
y FABP9 los cuales sirvieron para implementar la selección asistida con marcadores
moleculares para el incremento del progreso genético en esta especie (Eileen, 2011).
De otro lado utilizando SNPs en Perú se trató de identificar polimorfismos del gen tlr4 en
crías de alpacas con neumonía provocada por Pasteurella multocida no encontrándose
polimorfismos tipo SNP en esta especie (Guzman, 2011).
2.2
BASES TEÓRICAS
 MICROSATÉLITES
Los microsatélites, también llamados “secuencias simples repetidas” (SSRs),
“Secuencias cortas repetidas en tandem” (STRs), son secuencias cortas de ADN que
consisten en repeticiones de 1 a 6 pares de bases de largo (Figura 1) (Hancock, 1991;
(Freeland, 2005).
Por otro lado los microsatélites presentan elevado polimorfismo genético (presencia de
múltiples alelos Estas características han permitido ser considerados como los
marcadores de elección para estudios de genética poblacional, identificación,
parentesco y mapeo genético (Bruford y Wayne, 1996; Schlötterer y Harr, 2001;
Freeland, 2005).
Figura 1. Diagrama mostrando la ubicación de tres loci microsatélites (TA)n, (TAA)n y (GC)n en un segmento cromosomal. Se aprecia
el grado de homocigosidad para el locus 1 (TA)4, y heterocigosidad para el locus 2 (TAA)7, (TAA)8 y el locus 3 (GC)7, (GC)8. Modificado
por Freeland (2005)
 DIVERSIDAD GENÉTICA
La diversidad genética se define como la cantidad de variación genética medible que
está contenida dentro de una población o especie (Freeland, 2005). La diversidad
genética es una de las características más importantes en cualquier población, siendo
esencial para su adaptación a cambios en el medio ambiente, sobrevivencia a largo
plazo y evolución (Nei y Kumar, 2000).
Niveles bajos de diversidad genética aumentan la probabilidad de incrementar los
niveles de consanguinidad provocando efectos sobre la viabilidad de los individuos y de
las poblaciones. La estimación de la diversidad genética de una población constituye un
punto central en genética poblacional y tiene una implicancia extremadamente
importante en biología de la conservación (Freeland, 2005).
La rama de la genética que estudia la generación y el mantenimiento de la diversidad
genética y/o polimorfismo genético, así como los mecanismos de la evolución a nivel
poblacional se denomina “Genética Poblacional” (Nei y Kumar, 2000).
 PARENTESCO E IDENTIDAD
La determinación de parentesco (paternidad y maternidad) se basa en la búsqueda de
incompatibilidades genéticas entre los alelos presentes en un hijo y un alegado pariente
(Figura 2) para un grupo de loci analizados asumiendo la ausencia de mutación y un
modelo de herencia mendeliana simple (Butler, 2005).
Las técnicas para determinación de parentesco se basan en la exclusión genética, la
cual utiliza incompatibilidades genéticas entre los supuestos padres y las crías, para
rechazar una particular hipótesis de asignación de parentesco. El número mínimo de
inconsistencias genéticas entre un supuesto padre y una cría para determinar la
exclusión genética es tres (Cifuentes y col., 2006).
Existen 5 indicadores para medir la robustez de una técnica de determinación de
parentesco: la probabilidad de exclusión, el contenido de información polimórfica, el
índice de paternidad, el valor de LOD y el estadístico Delta.
Individuo al azar
Alegado padre
E,F
Madre (pariente conocido)
C,D
A,B
C,B
Cría
(a)
C,D
Crías
A,B
D,B
C,B
D,A
D,B
C,A
D
C
D
D
C
(b)
Alelo paterno
Figura 2. Representación esquemática de una prueba de parentesco y su fundamento. (a) Asignación de paternidad. (b) La
determinación de parentesco se basa en una regla de herencia mendeliana: una cría tiene dos alelos para cada marcador autosomal,
uno heredado del padre y otro de la madre. Modificado por Butler (2005).
 POLIMORFISMO GENÉTICO
Polimorfismo genético es un parámetro de la variabilidad genética poblacional que se
define como la existencia de dos o más alelos asociados a un locus en una población
con una frecuencia relativa sustancial (usualmente mayor del 1%). La generación de
polimorfismo genético en un locus se debe principalmente a mutaciones puntuales,
inserciones, deleciones, conversión génica y recombinación intraalélica (Nei, 1973), los
cuales se han estabilizado en una población y región geográfica determinada.
 POLIMORFISMO DE NUCLEOTIDOS UNICO (SNPs)
Los SNPs (single nucleotid polimorfism) son considerados solamente como un cambio
de una simple base en una secuencia de ADN. Los SNPs presentan diferentes
alternativas de secuencia (alelos) en individuos normales en una o varias poblaciones
dadas (figura 1), sin embargo para ser considerado un SNP este deben presentar
frecuencias alélicas mayores del 1%. Las variantes debido a inserciones /deleciones de
bases (indels) nopueden ser consideradas como SNPs, asi mismo, como las variantes
de nucleotidos únicos en cDNAs se denomina cSNPs y son clasificadas como SNPs
bajo el criterio que también son variantes de ADN genómico
Los SNPs se consideran marcadores principalmente, sin embargo, en humanos se ha
demostrado que la existencia de SNPs tri y tetra alelicos pero con una frecuencia muy
rara al punto de casi no existir. Los SNPs se heredan como marcadores bialelicos
codominantes en forma mendeliana simple. El grado de polimorfismo medido como
contenido de información polimórfica (PIC) no es alto como en los microsatélites
multialelicos, pero su gran abundancia en el genoma balancea esta deficiencia. Los
SNPs son el polimorfismo más abundante en cualquier tipo de organismo, constituyen
el último nivel de variación genética entre individuos. Del total de variación genética en
humanos, un 90% corresponde a SNPs. En humanos se han reportado en bases de
datos 5 millones de SNPs de los cuales 4 millones han sido validados (Sobrino y col.,
2005). Los SNPs se pueden encontrar tanto en regiones codantes y no codantes del
genoma, sin embargo existe una mayor densidad de SNPs en regiones no codantes.
2.3
HIPÓTESIS
El origen común de los mamíferos se refleja en la secuencia de sus genes. Los camélidos
como cualquier mamífero tiene un genoma de alrededor de 3 mil millones de bases y
cerca de 25,000 genes. Las secuencias traducidas a proteínas (exones) constituyen
menos del 1.5 % del genoma, el resto son secuencias que interrumpen a los genes
(intrones) y secuencias entre genes.
La secuencia del genoma humano y otras especies han revelado que los individuos no
son idénticos, sino que hay variaciones prácticamente en todos los genes. Los
microsatélites son unas secuencias que se encuentran cada 10,000-40,000 pares de
bases y que son muy variables (polimórficas, y ofrecen hasta 90 % de informatividad).
Los marcadores microsatélites son ubicuos, y (cada 40,000 bases), habrá mucha
probabilidad de encontrarlos dentro de cualquier gen. Los microsatélites son altamente
polimórficos, y van a ser útiles para seguir su segregación (y del gen asociado) a través
de las generaciones, permitiendo ser utilizados en pruebas de identidad, parentesco,
consanguinidad, variabilidad genética y selección asistida.
En consecuencia la hipótesis que planteamos es la siguiente:
En la alpaca Huacaya las características de importancia económica están
determinados por marcadores moleculares SNPs
2.4
DEFINICIÓN DE TÉRMINOS
 MARCADORES MOLECULARES.- Los marcadores moleculares son biomoléculas que
se pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser
marcadores moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el ADN (genes
conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida) esta cadena de ADN son
fragmentos específicos que pueden ser identificados en todo el genoma.
Los marcadores moleculares están situados en lugares específicos del genoma y se
usan para “marcar” la posición de un gen en concreto o la herencia de una
característica particular. En un cruzamiento genético, las características de interés
seguirán generalmente unidas a los marcadores moleculares. Por lo tanto, se pueden
seleccionar individuos en los que el marcador molecular esté presente, ya que el
marcador indica la presencia de la característica deseada.
Son todas aquellas moléculas (proteínas o ADN) que se pueden identificar y
caracterizar para definir un genotipo determinado. Muchos de ellos permiten la
asociación de genotipos con fenotipos específicos.
 ALPACA.- Según algunos investigadores, la alpaca proviene de la domesticación de la
vicuña, y habita en la zona alta andina por encima de los 3,800 msnm en Perú, Bolivia,
Chile, Argentina y, en menor medida, en los Estados Unidos, Canadá, Nueva Zelanda y
Australia.
La alpaca es un animal de fina estampa, armoniosa en su caminar, de cuerpo esbelto
cubierto de fibra que en su conjunto se denomina vellón. Presenta almohadillas
plantares, característica que le otorga la condición de animal ecológico al no dañar el
pasto, ni provocar erosión.
La alpaca como especie doméstica es criada en rebaños; su producción principal es la
fibra que presenta un número variado de colores, pasando del blanco al café, hasta el
negro; también el color roano y el gris.
De otro lado, la carne fresca de alpaca es materia prima de alta calidad para la
elaboración de gran variedad de embutidos y conservas, además, se pueden preparar
gran variedad de platos. Dicha carne es reconocida como uno de los alimentos más
nutritivos, pues posee 22% de proteínas, 56 miligramos de colesterol por cada 100
gramos de carne y un contenido graso de 3% por lo que es considerado un producto
light.
 HUELLA GENETICA.- Fragmentos característicos del material genético que diferencian
a un individuo de otro. Técnica por la que se analiza el ADN de un individuo para
observar el patrón de repetición de secuencias. Este patrón es único para cada
individuo.
 MEJORAMIENTO GENETICO.- Consiste en aplicar principios biológicos económicos y
matemáticos, con el fin de encontrar estrategias óptimas para aprovechar la variación
genética existente en una especie animal en particular para maximizar su mérito. Esto
involucra tanto la variación genética como entre los individuos de una raza como la
variación entre razas y cruces.
 GENÉTICA MOLECULAR.- La genética molecular es el campo de la biología que
estudia la estructura y la función de los genes a nivel molecular. La genética molecular
emplea los métodos de la genética mendeliana, cuantitativa, poblacional y la biología
molecular.
 SECUENCIACION DE ADN.- La secuenciación de ADN es el proceso por el cual se
establece el orden preciso de bases a lo largo de una cadena de ADN. Esto se hace
comúnmente al someter los fragmentos de ADN a electroforesis en gel, lo cual lleva a la
separación del ADN en fragmentos que difieren en tamaño sólo por una base. Cada
fragmento de ADN se detecta debido a la presencia de un marcador radioactivo o
fluorescente. Los instrumentos más usados para establecer las secuencias del ADN
emplean un rayo láser para detectar el ADN marcado con fluorescencia. A partir del
patrón de los fragmentos de ADN resultantes se puede deducir la secuencia
subyacente del ADN.
 GENOMA.- Conjunto completo de los genes de un organismo. El genoma humano, por
ejemplo, contiene entre 30000 y 40000 genes.
 MAPEAR GENES.- Conocido también como mapa de ligamiento, es un mapa de
marcadores polimórficos que define las distancias por los eventos de recombinación
ocurridos en la región cromosómica que los contiene. Se refiere a los cromosomas de
una especie, que muestra la posición de sus genes conocidos o de los marcadores
correspondientes.
 FINGERPRINTING.- Conocido también como “fingerprinting del ADN” o “trazado del
perfil del ADN”, el fingerprinting en las plantas se basa en el supuesto de que cada
variedad o población individual tiene un perfil genético, revelado mediante su ADN, que
es exclusivo de esa variedad o población. Los investigadores obtienen muestras de
ADN a partir del tejido vegetal y usan varias técnicas para producir un “fingerprint” (una
huella característica y singular), que se ve como una serie de bandas de tamaño
variable, muy similar a un código de barras.
Las bandas correspondientes a una variedad pueden ser comparadas con las de otras
variedades para detectar similitudes y diferencias. Cuanto más similitudes hay, más
emparentadas están las dos variedades y se pueden determinar los progenitores de la
variedad en cuestión o de las variedades hermanas que comparten los mismos
progenitores.
 ADN.-Moléculas de las células que contienen la información genética y que son
responsables de la transferencia de ésta, de generación en generación. Cada molécula
de ADN está constituida por dos cadenas formadas por un elevado número de
compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una especie de
escalera retorcida de doble hélice.
Cada nucleótido está formado por tres unidades: una molécula de azúcar llamada
desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados
llamados bases: adenina, guanina, timina o citosina. El ADN incorpora las instrucciones
de producción de proteínas.
 GEN.- La unidad funcional y física de herencia que pasa de padres a sus
descendientes. Los genes son piezas de ADN, y la mayoría de los genes contienen la
información necesaria para la formación de una proteína específica.
 MICROSATELITES o SSR (Repetición de secuencias discretas).- En los genomas
existe un ADN ubicuo y abundante denominado "microsatélite" que consiste en mono,
di, tri y tetranucleótidos repetidos en tándem. Este ADN, que es muy polimórfico, se ha
utilizado como marcador molecular cuando la secuencia del motivo repetido se clona y
secuencia para usarla en el análisis de poblaciones. De esta manera se han estudiado
con éxito numerosos árboles, aunque en algunos se ha visto que los microsatélites son
menos variables de lo que se esperaba. Otras siglas para designar esta técnica son:
ISSR, IMA, ISA, IRA, y RAMP.
 HIBRIDACION.- En biología molecular, hibridación es el proceso de unir dos hebras
complementarias de ADN.
 TAXA.- En biología, un taxón (del griego ordenamiento) es un grupo de organismos
emparentados, que en una clasificación dada han sido agrupados, asignándole al grupo
un nombre en latín, una descripción, y un tipo, que si el taxón fuera una especie este
sería un espécimen o ejemplar concreto. Cada descripción formal de un taxón asociada
al nombre del autor o autores que la realizan, los cuales se hacen figurar detrás del
nombre. En latín el plural de taxón es taxa, y es como suele usarse en inglés, pero en
español el plural adecuado es taxones. La ciencia que define a los taxones se llama
taxonomía.
 POLIMORFISMO.- Un polimorfismo es un sitio a lo largo de la secuencia del ADN
donde distintas personas pueden tener secuencias diferentes. Puede tratarse de la
sustitución de una simple letra (digamos que donde yo tenga una g usted tiene una t. O
puede ser más complicado y donde hay una secuencia repetida, yo tenga veinte copias
y usted 18). En resumen, es un sitio en el ADN donde hay una variación común entre
individuos. Los cambios poco frecuentes en general no se llaman polimorfismos. Tienen
que presentarse en una frecuencia de al menos uno por ciento para llenar el requisito
de esta definición.
 LOCUS.- En biología, el locus es el lugar físico donde está un gen en un cromosoma.
Todos los alelos de un gen están en el mismo locus, o sea, que si en un ser vivo hay un
solo gen que, por ejemplo codifica una proteína, éste, estará en el mismo lugar en toda
su especie.
 FILIACIÓN.- la filiación es la relación ascendente entre un grupo de parientes. Por
ejemplo, entre los hijos y sus padres, o entre los abuelos y sus nietos. Se opone a la
relación de descendencia.
 REGISTROS GENEALÓGICOS.- Esta unidad tiene como objeto certificar la
información proveniente de las descendencias de animales registrados (Pedigrí), a fin
de garantizar la pureza racial de los mismos. Archiva registros genealógicos de varias
especies y razas desde mediados del siglo pasado. Estos datos son la base de las
evaluaciones genéticas, a la cual debe adicionarse medidas objetivas de productividad.
 EXONES.- Es la región de un gen que contiene la información para producir la proteína
del gen. Cada exón codifica una porción específica de la proteína completa. En
eucariotas los exones de un gen se separan por regiones largas de ADN (llamadas
intrones) que no codifican.
 INTRONES.- Es una secuencia no codificadora de ADN que separa a dos exones. El
intrón inicialmente se transcribe en la molécula de ARN mensajero pero después es
eliminado durante el proceso de maduración del ARN.
 PCR.- (reacción en cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las
técnicas esenciales para la preparación de huellas dactilares, si bien no vale para
elaborar marcadores por sí sola, la reacción básica de la PCR comienza con la
desnaturalización del ADN molde para separar las cadenas, continúa con el
alineamiento de un par de oligonucleótidos con su ADN molde, y termina con la
polimerización para sintetizar un nuevo ADN entre los dos oligonucleótidos.
2.5
IDENTIFICACIÓN DE VARIABLES
 Variable independiente:
Marcadores genéticos moleculares SNPs
 Variable dependiente:
Características de importancia económica
2.6
DEFINICIÓN OPERATIVA DE VARIABLES E INDICADORES
OBJETIVO
Generar un panel
de marcadores
genéticos
moleculares de la
alpaca Huacaya.
VARIABLES
INDEP.
Marcadores
genéticos SNPs
DEP.
Características
de importancia
económica

INDICADORES
ESCALA
 Secuencia de ADN
 Número de
repeticiones
Alelos
presentes
medidos con
repeticiones
 Mayor demanda de
la alpaca.
 Mayor peso vivo
Registros del
control
productivo
CAPITULO III
3. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN
3.1
TIPO DE INVESTIGACIÓN
Aplicada
3.2
NIVEL DE INVESTIGACION
Tecnológica.
3.3
DISEÑO DE INVESTIGACIÓN
Experimental.
3.4
MÉTODO DE INVESTIGACIÓN
Matemático estadístico
3.5
POBLACIÓN, MUESTRA, MUESTREO
Población
Muestra
Muestreo
: 700 alpacas del centro experimental de Lachocc - UNH
: 300 alpacas.
: Dirigido.
Localización del estudio: El ámbito de estudio está comprendido en el departamento,
provincia y distrito de Huancavelica, en el Centro de Investigación de Camélidos
Sudamericanos-Lachocc perteneciente a la Universidad Nacional de Huancavelica.
Duración: El tiempo que demandara el trabajo de investigación propuesto es de 20
meses sin considerar el tiempo que demore la aprobación.
3.6
FUNDAMENTO Y TÉCNICA A UTILIZAR
FUNDAMENTO
Todo ser vivo, tanto plantas como animales están constituidos y controlados por un factor
llamado “factor genético” el cual determina el comportamiento y manifestación del animal.
Este factor genético está representado por una sustancia llamada ADN la cual a su vez es
una secuencia de bases nitrogenadas distribuidas al azar y que en conjunto de dos, tres o
más bases determinan secuencias llamadas intrones exones o genes los cuales son los
responsables de la diferenciación entre animales desde el punto de vista genético.
Un marcador genético es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en
un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear en una familia. Un marcador puede ser
un gen o puede ser un fragmento de ADN sin función conocida. Los marcadores se usan
a menudo como una forma indirecta de rastrear el patrón hereditario de un gen que no ha
sido identificado todavía y cuya ubicación aproximada se desconoce. Los marcadores se
usan para el mapeo genético como el primer paso para encontrar la posición e identidad
de un gen.
La razón principal del incremento del uso de los SSRs como una herramienta molecular
es que proveen la más alta incidencia de polimorfismo o PIC (Polymorphic Information
Content) en comparación con otras técnicas como RFLPs y RAPDs. Poseen, además,
atributos muy valorables porque tienen la característica de:
a.- Ser altamente informativos: presentan herencia codominante y muchos alelos son
encontrados entre individuos estrechamente relacionados.
b.- Ser técnicamente simples: la tecnología del PCR puede fácilmente y rápidamente ser
utilizada para la automatización en el uso de estos marcadores.
c.- Ser una técnica sensible: sólo pequeñas cantidades de ADN son requeridas.
d.- Ser analíticamente simples: los datos son producidos de forma confiable y altamente
reproducibles.
e.- Ser muy abundantes: los microsatélites están uniformemente dispersos a través del
genoma, aproximadamente cada 10 Kbp.
f.- Ser ampliamente aplicables: los loci son altamente conservados entre especies
relacionadas y algunas veces entre géneros.
Técnica de Sambrook (1989)
Sambrook, reporta una técnica para extracción de ADN genómico basada en el uso de
soluciones detergentes para lisis de membranas celulares y nucleares, seguido de un proceso de
eliminación de proteínas mediante desnaturalización con fenol y un paso de eliminación de la
fase orgánica con solventes como cloroformo. Finalmente, una etapa de precipitación del ADN
genómico utilizando sales y alcoholes. Para luego responder el ADN genómico en una solución
tamponada.
Probabilidad de Exclusión (PE)
La probabilidad de exclusión (PE) constituye la capacidad de un marcador genético para excluir
a un falsamente asignado padre en términos de probabilidad (Weir, 1994). La probabilidad de
exclusión depende del número de alelos y de las frecuencias alélicas del marcador y no de las
frecuencias genotípicas observadas (Butler, 2005).
a) PE1: Probabilidad de exclusión para un candidato a pariente.
Dónde: pi es la frecuencia del alelo I y n es el número de alelos en un locus.
b) PE2: Probabilidad de exclusión para candidato a pariente dado el genotipo de un
pariente conocido del sexo opuesto.
Dónde: pi es la frecuencia del alelo I y n es el número de alelos en un locus.
c) PE3: Probabilidad de exclusión para un par de candidatos a parientes.
Dónde: pi es la frecuencia del alelo I y n es el número de alelos en un locus.
d) PEA = Probabilidad de exclusión acumulada o total.
PE (acumulado o total) = 1- (1 - P1) (1 - P2) (1 - P3)…….. (1 - Pk)
Dónde: Pk es la probabilidad de exclusión del locus K.
2.2.3. Contenido de información polimórfica (PIC)
El contenido de información polimórfica (PIC) constituye una medida de la informatividad y
polimorfismo de un locus genético, en estudios de parentesco refleja la probabilidad que una cría
lleve un alelo raro, el cual permitiría la deducción del genotipo parental para un locus dado (Botstein
y col., 1980). El valor de PIC es determinado mediante la siguiente formula:
n
n-1
PIC = 1 - ( ∑ pi 2 ) - ∑
i=1
n
∑ 2 pi 2 pj 2
i=1 j=i+1
Donde: pi es la frecuencia del alelo I, pj es la frecuencia del alelo J y n es el número de alelos en un locus (Botstein y col., 1980).
2.2.7. Identidad y Probabilidad de identidad (PID)
La determinación de identidad se basa en la búsqueda de genotipos idénticos asumiendo la
asociación de alelos dentro y entre loci al azar (Waits y col., 2001). Un estimador de identidad es la
probabilidad de identidad (PID), la cual refleja la probabilidad que dos individuos seleccionados
poseen un genotipo idéntico al analizar un mismo locus. La probabilidad de identidad es calculada
mediante la siguiente formula:
P(ID) = ∑ pi 4 + ∑ ∑ (2 pi pj)2
Dónde: pi es la frecuencia del alelo I, pj es la frecuencia del alelo J e i  j ; Butler, 2005).
Cuantificación de la Diversidad Genética
Existen estimadores de la diversidad genética basados principalmente en frecuencias alélicas o
frecuencias genotípicas. Los principales estimadores de la diversidad genética son: la diversidad
alélica (A), proporción de loci polimórficos (P), heterocigosidad esperada (H E) y heterocigosidad
observada (HO) (Freeland, 2005)
.
Diversidad Alélica
La frecuencia relativa de un alelo en particular en una población es denominada frecuencia alélica.
La frecuencia alélica es considerado un indicador fundamental en estudios evolutivos, porque un
cambio genético en una población es usualmente descrito por un cambio en la frecuencias de sus
alelos (Nei y Kumar, 2000). La frecuencia alélica en especies diploides consiste en número de alelos
de un tipo dado dividido entre dos veces el tamaño poblacional para un locus autosomal
(Templeton, 2006) y la diversidad alélica (A) constituye simplemente el numero promedio de alelos
por locus (Nei y Kumar, 2000).
Heterocigosidad
La heterocigosidad (H) constituye la proporción de individuos heterocigotos en la población. Un valor
de heterocigosidad elevado significa que existe una elevada diversidad alélica presente en la
muestra analizada (Butler, 2005). La heterocigosidad puede ser dividida en dos indicadores: la
heterocigosidad esperada (HE) y la heterocigosidad observada (HO).
La heterocigosidad esperada (HE) también llamada diversidad génica (Nei, 1973), es definida como
la probabilidad que dos alelos escogidos al azar en una población sean diferentes (Weir, 1996).
n
HE = 1 - ∑ pi 2
i=1
Donde: pi es la frecuencia del alelo I y n es el número de alelos en un locus (Nei, 1973).
La HE es usada comúnmente como una medida de diversidad genética que refleja el nivel de
heterocigosidad que podría esperarse en una población que se encuentre en equilibrio de HardyWeinberg (Freeland, 2005).
La heterocigosidad observada (HO) es definida como la proporción de individuos heterocigotos
observados para un locus en particular (Weir, 1996).
Coeficiente de Consanguinidad (F o FIS)
Consanguinidad, se define al resultado del cruzamiento entre individuos estrechamente
relacionados. La forma más intensa de consanguinidad es originada por autofecundación y es dada
en individuos hermafroditas. La consanguinidad puede ser medida mediante dos importantes
coeficientes: el coeficiente de parentesco o coancestria (FJK) y el coeficiente de consanguinidad (FI,
F o FIS) (Maynard, 1999).
El coeficiente de parentesco o coeficiente de coancestria (FJK) constituye la probabilidad que dos
genes homólogos de dos individuos J y K seleccionados al azar sean idénticos por descendencia
(Maynard, 1999). El concepto de identidad por descendencia puede definirse como la propiedad que
dos alelos dados sean copias de un solo alelo que existió en un ancestro reciente (Freeland, 2005).
El coeficiente de consanguinidad (FI, F o FIS) constituye la probabilidad que dos alelos en un locus
en un individuo sean idénticos por descendencia (Maynard, 1999; Freeland, 2005). El coeficiente de
consanguinidad describe la proporción por la cual la heterocigosidad disminuye en relación con una
población que presenta cruzamientos al azar asumiendo que ambas presentan la misma frecuencia
génica inicial (Maynard, 1999).
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA
1.- Selección fenotípica.
La selección fenotípica consiste en la elección de n grupo de animales mediante la evaluación
de un set de caracteres fenotípicos con capacidad de medición.
2.- Identificación.
a) Identificación de marcadores microsatélites in silico.
La identificación in silico consiste en la identificación y elección de marcadores
microsatélites en base a información reportada sin la necesidad de efectuar una técnica de
laboratorio. La identificación in silico consiste en un método de tamizado y constituye el
primer paso en cualquier estudio de identificación y caracterización de un set de marcadores
genéticos.
b) Caracterización de marcadores microsatélites fluorescentes mediante electroforesis
en capilar.
La caracterización de microsatélites fluorescentes consiste en el marcado con un
fluorocromo que permite la detección de la fluorescencia emitida al ser excitado por un rayo
láser y capturada la fluorescencia por un sensor automático. La electroforesis en capilar se
basa en el uso de un capilar y una matriz o polímero líquido que permite la separación del
ADN en base a su tamaño.
Previamente se solicitara la adquisición del secuenciamiento del primer a trabajar en un
laboratorio de Estados Unidos, lo cual posteriormente se procesara en el secuenciador
automático propiedad del Instituto Peruano de Energía Nuclear (IPEN).
3.- Análisis de identidad
El análisis de identidad se basa en el índice de paternidad y los valores de LOD que son
razones de probabilidad de ocurrencia entre una hipótesis de asignación de filiación versus una
hipótesis de no filiación.
4.- Análisis de consanguinidad
Se basa en estadística F o estadística de Wright que determina niveles de relación entre los
individuos mediante la capacidad de compartir ciertos alelos.
5.- Análisis de variabilidad genética.
Se basa en estadística F o estadística de Wright, en los niveles de heterocigosidad (Numero de
heterocigotos en un población).
6.- Análisis de asociación genética entre SNPs y características fenotípicas de la fibra
Se basa en la determinación de relaciones estadísticas entre las variables genéticas (alelos de
los diferentes marcadores genéticos) y las variables fenotípicas a estudiar.
3.7
PROCEDIMIENTOS PARA EL ANALISIS
COMPONENTE 1
DESARROLLO E IMPLEMENTACION DE LIBROS DE REGISTRO Y DE PEDIGRI
VALIDADOS MEDIANTE ADN
Actividad 1. Generación de libros de registro fenotípico en alpacas reproductoras de alta
calidad.
Evaluación fenotípica y selección de alpacas reproductoras de alta calidad.
Se evaluaran fenotípicamente todas las alpacas Huacaya adultas entre 2 y 6 años de edad y
las crías de alpaca, de ambos sexos (machos y hembras) sin discriminar el color ni la edad
proveniente del Centro de Investigación de la Universidad Nacional de Huancavelica para los
principales descriptores raciales y de producción (Tabla 1). Los datos fenotípicos colectados
serán anotados en una ficha de evaluación para luego ser almacenados electrónicamente en
una base de datos (archivo Excel-Microsoft). Trescientas alpacas serán seleccionadas
mediante el cumplimiento del estándar racial, en estricto orden de mérito fenotípico. Las
alpacas seleccionadas serán identificadas mediante microchips insertados debajo de la piel a
nivel del cartílago auricular.
Descriptores e Indicadores Fenotípicos:
Sexo
Se determinara el sexo de los animales por medio de inspección visual al momento de la
evaluación.
Color
Se determinara el color del vellón mediante inspección visual y comparación con un catálogo de
colores de vellón que servirá como patrón de color.
Peso vivo
Se determinara el peso vivo de los animales mediante una balanza digital para ganado.
Tamaño
Se determinara el tamaño de las alpacas mediante el uso de una cinta métrica. La medición de
la alzada a la cruz tomara como puntos de referencia: la punta de la pezuña y la parte superior
de la cruz (unión de los dos miembros anteriores) y la longitud horizontal tomando como puntos
de referencia el punto medio del pecho y la base de la cola. Como medidas anexas se tomaran
la longitud del cuello y el volumen torácico.
Peso de Vellón
El peso de vellón se determinara mediante una balanza común tipo reloj. Esta medición se
realizara por duplicado.
Densidad de Vellón
Se determinaran la densidad del vellón mediante conteo del número de folículos primarios y
secundarios por centímetro cuadrado a través de microscopia de una biopsia de piel de
aproximadamente 2 centímetros cuadrados.
Rizos
Se determinara el número de rizos mediante inspección visual y medición con una regla
graduada en centímetros.
Finura
Se determinara el valor de finura de fibra mediante colección de una muestra de 100 gramos de
vellón del costillar medio. El promedio, desvió estándar, coeficiente de variación y % de pelos
mayores de 30 micras será determinado utilizando el equipo de análisis de fibra OFDA 2000.
Generación de informe sobre características fenotípicas en alpacas reproductoras de
alta calidad
Las fichas fenotípicas serán introducidas en formato electrónico Microsoft Excel y serán
analizadas en los programas estadísticos de SAS Y SPSS para la determinación de media,
desviación estándar y coeficiente de variación para las alpacas procedentes del Centro de
Investigación, para la emisión de una línea de base fenotípica. Además se realizara un análisis
de correlación y regresión entre los principales indicadores fenotípicos como peso vivo, peso de
vellón, uniformidad, densidad, finura de la fibra, entre otros.
Actividad 2. Generación de libros de pedigrí
Las 300 alpacas seleccionadas serán introducidas en un registro de reproductores como medio
de identificación y control genealógico.
Se realizaran cruzamientos entre las alpacas seleccionadas mediante empadre controlado y
será detallado en un registro de empadre como medio de verificación en la elaboración de un
libro de pedigrí de alpacas de alta calidad. Las relaciones de filiación serán validadas mediante
una prueba de ADN utilizando marcadores microsatélites previamente reportados (Agapito y
col., 2008).
COMPONENTE 2
IDENTIFICACIÓN Y DESARROLLO DE MARCADORES GENÉTICOS SNPs PARA EL
MEJORAMIENTO GENÉTICO DE ALPACA
Actividad 1
Elaboración de un banco de ADN de alpacas reproductoras
Se establecerá un banco de ADN de los reproductores almacenados a -20°C que sirva como
referencia para futuros estudios de genética y genómica de la alpaca
Colección de muestras de sangre
Se colectarán 3ml de sangre mediante punción en la vena yugular utilizando tubos vacutainer
con anticoagulante (EDTA) aproximadamente a 700 alpacas Huacaya (Vicugna pacos)
seleccionadas fenotípicamente previamente e identificadas con microchips.
Extracción de ADN
ADN genómico será extraído a partir de 200 microlitros de sangre con anticoagulante mediante
el método de extracciones sucesivas con solventes orgánicos (Fenol-Cloroformo) (Sambrook
et. al., 1989). El ADN extraído se colocará en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml de capacidad
y se almacenará en una congeladora a -20°C. Se procederá a su cuantificación mediante
comparación con diluciones seriadas de un marcador de peso molecular λ ADN Hind III®
(FERMENTAS) en un gel de agarosa al 1.0%
Determinación de la calidad y concentración del ADN genómico
La calidad del ADN genómico extraído será determinada mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1% -TBE 0.5X (Tris-Borato-EDTA). El ADN genómico será cuantificado mediante
espectrofotometría utilizando un equipo Nanodrop. Finalmente, el ADN genómico obtenido será
diluido con una solución TE (Tris-EDTA) hasta una concentración final de 5 ng/µL.
Actividad 2
Identificación y caracterización de marcadores SNPs en alpacas reproductoras de alta
calidad
Se identificara y validara un panel de 20 marcadores SNPs de alpaca y se explorara su
aplicación en las actividades de mejoramiento genético para lo cual se utilizaran 2 bibliotecas
de cDNA de piel de alpaca: i) una reportada y anotada en la base de datos del Genebank y ii)
otra generada recientemente en la Unidad de Biotecnología Molecular (UBM) de la Universidad
Peruana Cayetano Heredia. Un listado inicial de ESTs para los 3 genes candidatos será
elaborado en base a las secuencias disponibles en Genebank y las obtenidas mediante la
biblioteca de cDNA de la UBM. Se identificaran SNPs manualmente mediante la observación y
análisis de los cromatogramas obtenidos por secuenciamiento directo de dos bibliotecas de
cDNA de piel de alpaca.
Secuencias de los genes de keratinas y proteínas asociadas a keratinas disponibles en
Genebank y en la biblioteca de cDNA de piel de alpaca seran alineadas utilizando CLUSTAL W
program para obtener una secuencia consenso a partir de la cual se diseñaran cebadores
específicos para amplificar fragmentos únicos entre 300 y 500 bp utilizando el programa Primer
Designer 3 software (Scientific Educational Software, Durham, USA). La especialidad de los
cebadores (presencia de un solo producto de amplificación) será evaluada mediante
amplificación por PCR a partir de DNA genómico utilizando condiciones y ciclos termales
estandar. Fragmentos de 300 a 500 pares de bases de los 4 genes candidatos serán
amplificados mediante PCR utilizando los cebadores diseñados previamente utilizando Quiagen
Multiplex PCR Kit (QUIAGEN) en un termociclador modelo 9700 GeneAmp® (Applied
Biosystem). Los productos de PCR seran secuenciados usando ABI PRISM Big Dye
Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction Kit y un secuenciador automático ABI PRISM
3130 Genetic analyser®. La edición de las secuencias se realizara mediante el Clustal W y
Mega v 4.0. Un alineamiento múltiple de las secuencias generadas se realizara con el
programa Mega v4.0, para identificar la presencia de SNPs en los pooles de ADN genómico
para cada uno de los 4 genes secuenciados.
Actividad 3
Elaboración de pedigríes e identificación de familias de referencia
Información disponible en libros de registro, libros de nacimientos, libros de empadre, libros de
compra, venta de alpacas del centro de reproductores serán analizados para la construcción de
libros de pedigrí. Se cotejará el pedigrí mediante la validación del parentesco de los animales
inscritos, mediante genotipificación con un panel de 10 marcadores microsatélites y análisis con
el programa Cervus v3.0 (Kalinowski et al., 2007). Adicionalmente se cotejara el pedigree con
los genotipos obtenidos a partir del análisis de 12 marcadores SNPs previamente determinados.
La determinación de las genealogías se realizara mediante el programa PyPedal. Se
determinara el nivel de heterocigocidad de la población mediante la medición del coeficiente de
consanguinidad individual (F), coeficiente de relación promedio (AR) mediante el programa
FSTAT v4.02 (Weir & Cockerham, 1984) y Pypedal.
Actividad 4
Base de datos de genotipos de ADN alpacas reproductoras
Se elaborara un catálogo de ADN genómico y genotipos de 12 marcadores microsatélites de
alpacas, tanto en formato electrónico (Microsoft – Excel) y en forma física (Impresiones).
COMPONENTE 3
APLICACIÓN DE MARCADORES MICROSATELITES Y SNPs EN LA GENERACION DE
HERRAMIENTAS PARA MEJORA GENETICA EN UN PLANTEL DE REPRODUCTORES
Actividad 1
Identificación de los niveles de consanguinidad y variabilidad genética en el plantel
reproductor
Amplificación y análisis de ADN microsatélite
Doce loci microsatélites descritos para alpacas y llamas (Lang et al.1996, Penedo et al., 1998;
Penedo et al., 1999) serán amplificados en dos reacciones de PCR múltiple utilizando Qiagen
Multiplex PCR Kit (QIAGEN) en un termociclador modelo 9700 GeneAmp® (Applied Biosystem).
Los productos de PCR serán separados mediante un Analizador Genético ABI 3130 ADN
sequencers® (Applied Biosystems). El tamaño de los productos amplificados se determinaran
con el programa Genemapper® v.4.0 (Applied Biosystems).
Análisis de variabilidad genética y consanguinidad en alpacas
Se determinara la variabilidad genética para la población de alpacas del Centro de Investigación
mediante el análisis de las frecuencias alélicas, número de alelos por locus, heterocigosidad
observada y esperada (Nei, 1973) e índice de Garza-Williamson (Garza y Williamson, 2001),
contenido de información polimórfica (PIC), probabilidad de exclusión (Jamieson & Taylor, 1997)
para cada locus utilizando el programa Arlequín v3.1 (Excoffier, Laval y Schneider, 2005). Se
determinara las relaciones de filiación entre los animales utilizando una prueba de
determinación de parentesco (Agapito et al., 2008) utilizando el programa Cervus 3.0
(Kalinowski et al., 2007). Los niveles de consanguinidad serán determinados mediante el
coeficiente de consanguinidad (FIS) e índice de fijación (FST) para cada población y para la
totalidad de individuos analizados utilizando el programa Genepop v4.0 (Raymond y Rousset,
1995) y Arlequín v3.1 (Excoffier, Laval y Schneider, 2005).
Actividad 2
Análisis de asociación genética entre 3 genes vinculados a la producción de fibra de
alpaca y características de fibra
Se utilizaran 50 alpacas emparentadas (medios hermanos) para un ensayo de asociación con
medios hermanos. Los haplotipos para los 3 genes analizados serán determinados mediante el
programa DNA baser y Arlequin v3.1 para las 20 alpacas analizadas. Un análisis de asociación
para cada uno de los alelos y haplotipos de los genes THH, KRTAP1-1 y KRT33 con las
principales características de fibra (diámetro, lustre, confort, densidad) será realizado mediante
un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el programa SPSS v13.0
COMPONENTE 4
FORTALECIMIENTO DE LAS CAPACIDADES DE INVESTIGACION EN GENOMICA DE
ALPACAS
Actividad 1
Desarrollo e implementación de cursos de capacitación en genética molecular y
genómica
Se implementara un curso teórico sobre Genética y Genómica Molecular con una duración total
de 20 horas dirigidas a estudiantes y profesionales.
Se implementara un curso práctico sobre Técnicas y Aplicaciones en Genética Molecular con
una duración total de 20 horas dirigidas a estudiantes y profesionales.
Actividad 2
Difusión de resultados
Se publicara un artículo científico en una revista nacional y/o internacional, además se realizara
una presentación de los resultados en una conferencia científica nacional.
3.7 DE LA TOMA DE MUESTRA
La muestra utilizada para el análisis genético será sangre de alpaca, las cuales se tomarán de
la vena ubicada en la parte interna de la pierna, para lo cual estos animales serán derribados
luego del cual se procederá a tomar la muestra de sangre en una cantidad aproximada de 4 ml
con una aguja de dos puntas las cuales se depositarán en un tubo al vacío con anticoagulante
incluido (vacutainer) previamente se anotarán el número de arete de la alpaca para su
identificación posterior. La muestra previamente homogenizada con el anticoagulante será
transportada en hielo hasta el laboratorio de Biotecnología de la Universidad Nacional de
Huancavelica.
3.8. DEL ANALISIS EN LABORATORIO (GENETICO)
EXTRACCION DE ADN:
ELIMINACIÓN DE GLÓBULOS ROJOS (HEMOLISIS)
La extracción de los glóbulos rojos se hará en el laboratorio de Biotecnología de la Universidad
Nacional de Huancavelica:
PROTOCOLO PARA ELIMINAR GLÓBULOS ROJOS HEMOLISIS
1.- Colocar la muestra de sangre en un tubo falcón de 15 ml
2.- Completar hasta 15 ml con la solución de hemólisis
3.- Homogenizar con movimiento suave
4.- Llevar al refrigerador a 4ºC por dos horas para lisar los glóbulos rojos (en la parte inferior
del refrigerador)
5.- Centrifugar a 3000 rpm por 15 a 30 minutos aproximadamente
6.- Se observa el pellet
7.- Sacar toda la sangre de encima
8.- Nuevamente enrazar con la solución de hemólisis
9.- Centrifugar nuevamente a 3000 rpm por espacio de 15 a 30 minutos
10.- Sacar nuevamente el sobrenadante
LISIS DE GLÓBULOS BLANCOS
Luego de eliminar los glóbulos rojos es necesario eliminar los glóbulos blancos, significa que la
purificación es por partes para quedarse finalmente con el ADN limpio, para lo cual se usara el
siguiente protocolo:
PROTOCOLO PARA LISAR GLÓBULOS BLANCOS
1.- Colocar en cada tubo con el contenido de la muestra sin glóbulo rojo 2.5 ml de la solución
de lisis
2.- Agregar a cada tubo 250 ml de SDS (al 10%)
3.- Homogenizar suavemente
4.- Aplicar la proteinaza 20 ml (de una proteinaza que está a una concentración de 20
miligramos /ml)
5.- Luego incubar a 53 °C por 18 a 22 horas
6.- Aplicar 675 L de Cl Na (6 molar ) en cada tubo
7.- Homogenizar hasta que salga espuma
8.- Centrifugar a 3,000 rpm por tiempo de 30 minutos
9.- El sobrenadante (ADN ) transferir a otro tubo falcon
10.- Echar 2 ml de isopropanol
11.- Poner a un ependorff de 1.5 ml el ADN que está en forma de moco
12.- Centrifugar a máxima velocidad por 2 minutos
13.14.15.16.17.18.19.-
Se desecha el líquido sobrenadante
Luego echar 0.5 ml de alcohol al 70%
Centrifugar 2 minutos a máxima velocidad
Nuevamente echar 0.5 ml de alcohol al 70%
Centrifugar nuevamente 2 minutos a máxima velocidad
El sedimento es ADN limpio
Dejar abierto el tubo pero cubierto con papel absorbente para que evapore el alcohol por
24 horas
20.- Echar buffer T-E (TRIS –EDTA) en cantidad conveniente (0.25 ml)
COMPOSICIÓN DE LA SOLUCION DE LISIS (para 16 tubos)
Tris HCl (2molar)
ClNa (6 molar)
EDTA (0.25 molar)
Agua destilada
En cada tubo:
SDS (al 10%)
Proteinaza (20mlgr/ml)
200 L
320 L
320 L
40 ml
250 L
20 L
LECTURA DE CALIDAD DE ADN
La lectura de la calidad de ADN se hará en el espectrofotómetro a 260 y 280 nanómetros lo cual
revela la calidad de ADN.
3.9
ÁMBITO DE ESTUDIO
El ámbito de estudio está comprendido en el departamento y provincia de Huancavelica, en el
Centro de Investigación de Camélidos Sudamericanos-Lachocc perteneciente a la Universidad
Nacional de Huancavelica.
CAPITULO IV
4. ASPECTO ADMINISTRATIVO
4.1
RECURSOS HUMANOS
La ejecución del presente proyecto cuenta con el siguiente personal que describimos a
continuación:
INVESTIGADORES
 Ing. M. Sc. WILLIAM SALAS CONTRERAS
Docente Principal de la Universidad Nacional de Huancavelica
Especialidad: Genética Animal.
 Ph. D. JOSE ESPINOZA BABILÓN
Docente Principal de la Universidad Peruana Cayetano Heredia
Especialidad: Genética Molecular
Instituto al que pertenece: Instituto de Genética y Biología Molecular
Institución a la que pertenece: Facultad de Ciencias y Filosofía
COLABORADORES
4.2

Alumnos de la Escuela Académico Profesional de Zootecnia de la Universidad
Nacional de Huancavelica.

Personal técnico del Centro Experimental Lachocc-Huancavelica.
RECURSOS MATERIALES
DE LA LOCALIZACION DEL ESTUDIO
El trabajo se llevará cabo en el Centro de Investigación de Camélidos Sudamericanos de
Lachocc (CIDCS) de la Universidad Nacional de Huancavelica, la cual abarca una
extensión de 6,200 hectáreas de praderas, incluidas 40 hectáreas de bofedales y se
encuentra ubicada en la Sierra Centro del Perú, departamento y provincia de
Huancavelica a una altitud de 4300 metros sobre el nivel del mar. Las características
agroecológicas de Lachocc corresponden a puna seca que incluye rocas, bofedales y
riachuelos en la que prevalece una temperatura promedio anual de 6 ºC (3.8 ºC en julio y
8.2 ºC en noviembre), una precipitación pluvial de 688.3 mm/año (con meses húmedos de
diciembre a marzo y meses secos de mayo a octubre) y una predominancia de Festuca
dolicophylla, Stipa spp, y el Calamagrostis spp; pasturas características de puna seca
(Huancavelica).
DE LOS ANIMALES
Los animales que se utilizaran serán 300 alpacas de color blanco de la variedad Huacaya
tomados del total existente.
DE LOS MATERIALES:
DE CAMPO
1.- Máquina fotográfica
2.- Lapiceros
3.- Cuaderno de campo
4.- Aguja de dos puntas para muestrear sangre
5.- Tubos vaccutainer, con anticoagulante k3 EDTA
6.- Alcohol
7.- Lápiz
DE LABORATORIO
REACTIVOS
1.- Alcohol isoamílico
2.- Cloroformo
3.- Cloruro de sodio
4.- Etanol 70% y 90%
5.- Isopropanol
6.- RNAasa (10mg/mL)
7.- SDS (dodecil sulfato de sódio)
8.- EDTA
9.- Tubos falcon de 15 ml
10.- Tubos eppendorf de 1.5L y de reacción de 0.2 L
EQUIPOS
1.- Baño maría
2.- Balanza analítica
3.- Bandejas para tinción
4.- Cámara de electroforesis horizontal
5.- Cámara de electroforesis vertical
6.- Cámara extractora
7.- Centrífuga refrigerada de 1300 rpm
8.- Congeladora
9.- Destilador de agua
10.- Espectrofotómetro
11.- Fuente de poder de 140 V
12.- Fuente de poder
13.- Horno microondas
14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.-
Microcentrifuga de tubos ependorff 1000 rpm
Micropipetores
Potenciometro
Purificador de agua ultrapura
Shaker
Termociclador
Transiluminador de luz ultravioleta UV
Transiluminador de luz visible
Vortex
Poliacrilamida
Vidrios para la poliacrilamida
OTROS MATERIALES
1.- Erlenmeyer 125, 250 y 500 ml
2.- Guantes de goma
3.- Papel aluminio
4.- Papel toalla
5.- Pipetas pasteur
6.- Placas PCR
7.- Probetas de 50, 100 500 y 1000 ml
8.- Puntas para micropipetas: 0.5, 10, 100, 1000 L
9.- Tubos de centrífuga de 15 ml
10.- Tubos ependorff de 1.5 ml y de reacción de 0.2 ml
4.3
FINANCIAMIENTO
El presente proyecto será financiado por la Universidad Nacional de Huancavelica, con el
Fondo del Gas de Camisea (FOCAM)
4.4
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES (MENSUAL)
Actividad (meses)
C1.DESARROLLO
E
IMPLEMENTACIÓN DE
LIBROS DE REGISTRO
Y
PEDIGRÍ
VALIDADOS
MEDIANTE ADN
C1.A1.Generación de
libros
de
registro
fenotípico en alpacas
reproductoras de alta
calidad
C1.A2.Generación de
libros de pedigrí
C2.IDENTIFICACIÓN Y
DESARROLLO
DE
MARCADORES
GENÉTICOS
SNPs
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
13
14
15
16
17
18
19
20
PARA
EL
MEJORAMIENTO
GENÉTICO
DE
ALPACA
C2.A1.Elaboración de un
banco de ADN de
alpacas reproductoras
C2.A2. Identificación y
caracterización
de
marcadores
microsatélites
en
alpacas reproductoras
de alta calidad
C2.A3.Elaboración de
pedigríes e identificación
de familias de referencia
C2.A4.Base de datos de
genotipos de ADN
alpacas reproductoras
C3. APLICACIÓN DE
MARCADORES SNPs
PARA LA
GENERACIÓN DE
HERRAMIENTAS PARA
MEJORA GENÉTICA
EN UN PLANTEL DE
REPRODUCTORES
C3.A1.Identificación de
los niveles de
consanguinidad y
variabilidad genética en
el plantel reproductor
C3.A2.Identificación de
valores de heredabilidad
de caracteres
cuantitativos para uso en
selección
C4.FORTALECIMIENTO
DE LAS
CAPACIDADES DE
INVESTIGACIÓN EN
GENÓMICA DE
ALPACAS
C4.A.1.Desarrollo e
implementación de
cursos de capacitación
en genética molecular y
genómica
C4.A2.Capacitación de
profesionales
C4.A3. Difusión de
resultados e informe
final
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
4.5 PRESUPUESTO
PRESUPUESTO DEL PROYECTO DE INVESTIGACION "IDENTIFICACIÓN DE MARCADORES GENETICOS MOLECULARES SNPs EN LA ALPACA HUACAYA QUE INFLUYEN EN
CARACTERISTICAS DE IMPORTANCIA ECONOMICA"
DESCRIPCION DEL BIEN
CANT
UNID
COSTO
UNIT.
PRECIO
TOTAL
1
unidad
155000
155000
155000
1
unidad
200000
200000
200000
1
unidad
200000
200000
200000
Unidad
8500
8500
8500
1
2
EQUIPAMIENTO
2.6.32.12
2.6.32.9 99
2.6.32.9 99
Equipo automatizado
para extracción de ADN
Sistema multicapilar para
electroforesis (sistema
quiaxel)
Dispensador
automatizado para
reacciones de PCR en
tiempo real (quiagility)
Computadora core i7 3.1
de 3 teras de disco duro
1
termociclador de
gradiente
1
unidad
30670
30670
30670
2.6.32.9 99
Congeladora de -20 °C
1
unidad
2000
2000
2000
2.6.32.12
Escritorio tipo gerente
1
unidad
600
600
600
2.6.32.12
Escritorio tipo secretaria
1
unidad
400
400
400
Impresora HP LaserJet
Pro M425dn, función,
imprime/copia/scanea
1
Equipo
2000
2000
2000
1
Unidad
2500
2500
2500
2.6.32.9 99
2.6.32.31
2.6.32.9 99
2.6.32.12
Lectora de microchip
IDE FX pet.
Mueble para
computadora
1
unidad
300
300
300
2.6.32.9 99
Refrigeradora
1
unidad
2000
2000
2000
2.6.32.12
Sillón giratorio tipo
secretaria
1
unidad
400
400
400
Vortex
1
unidad
4000
4000
4000
2.6.32.9 99
608370
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
INSUMOS
2.3.1.8.2.1
Tubos de 1.5 ml(caja x
1000 tubos)
1
bolsa
100
100
100
2.3.1.8.2.1
tips sin filtro de 0.5 a 10
µL (bolsa x 1000)
1
bolsa
100
100
100
2.3.1.8.2.1
Tips sin filtro de 200µL
(bolsa x 1000)
1
bolsa
100
100
100
2.3.1.8.2.1
Tips sin filtro de 1000
µL(bolsa x 1000)
1
bolsa
100
100
100
tips con filtro de 0.5 a 10
µL(caja x 960 tips)
1
caja
380
380
380
2.3.1.8.2.1
tips con filtro de 200
µL(caja x 960 tips)
1
caja
380
380
380
2.3.1.8.2.1
tips con filtro de 1000
µL(caja x 1000 tips)
1
caja
380
380
380
gradilla para tubos de 0.2
ml PCR
2
unidad
70
140
140
3
unidad
15
45
45
5
unidad
15
75
75
1
unidad
1200
1200
1200
1
unidad
1200
1200
1200
1
unidad
1200
1200
1200
1
unidad
1200
1200
1200
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.1.8.2.1
2.3.199.12
2.3.199.12
2.3.199.12
2.3.199.12
gradilla para tubos de 1.5
ml PCR
gradilla para tubos
eppendorf
Micropipeta de rango
variable de 0.5 a 10 µl
Micropipeta de rango
variable de 10 a 100 µl
Micropipeta de rango
variable de 20 a 200 µl
Micropipeta de rango
variable de 100 a 1000 µl
taq polimerasa hot start
(250 U)
1
unidad
1000
1000
1000
agua de grado molecular
de 500 ml
1
unidad
800
800
800
kit de extracción de DNA
sangre, tejido animal (kit
x 50)
1
unidad
1100
1100
2200
Hot Start Taq Plus
master mix (250 Det)
1
unidad
2400
2400
2400
2.3.199.12
2.3.199.12
2.3.199.12
2.3.199.12
kit para PCR en tiempo
real con Sybrgreen (400
det)
1
unidad
2500
2500
2500
0.2 mL Thin Wall PCR
tubes domed cap (1000
tubes)
1
Frasco
150
150
150
1
Frasco
100
100
1000
1.5 mL Boil Proof
microtubes(500) Axygen
2µL Universal fit filter
tips, racked&presterilized (10Rack x 96
tips)
1
Frasco
600
600
600
2.3.199.12
3130POP-7TM
1
Frasco
1000
1000
1000
2.3.199.12
Agarosa 100 gramos
1
Frasco
200
200
200
2.3.199.12
Agujas 21 1/2 para tubo
vacutainer (caja x 100)
2
Caja
60
120
120
2.3.16.199
Arete metálico
Cajas Criobox
1
ciento
300
300
300
1
Caja
50
50
50
2.3.199.12
dNTP set, PCR grade
4x100µL
1
Frasco
400
400
400
2.3.199.12
EDTA Disodium Salt
(500 gr)
1
Frasco
500
500
500
2.3.199.12
Etanol 2.5 litros
1
Frasco
180
180
180
2.3.16.199
frasco transparente tapa
rosca (1000 ml)
2
unidad
30
60
60
2.3.16.199
Gradilla y soporte para
tubos PCR
2
unidad
70
140
140
2.3.16.199
Gradillas para tubos
ependorff
2
unidad
15
30
30
2.3.16.199
Holders para colección
3
Caja
20
60
60
2.3.199.12
Loading buffer gel 6X
Microchip
1
Frasco
200
200
400
2
Caja
600
1200
1200
Papel toalla
Proteinasa K de 20
mg/ml
30
Rollo
5
150
150
200
400
400
2.3.16.199
2.3.199.12
2.3.16.199
2.3.199.12
frasco
2
Puntas para micropipetas
de 0.5 µL con filtro x 10
cajas
1
bolsa
130
130
130
SDS
50
Gramo
6
300
300
Tubo Vacutainer de 10
mL (caja x 100)con
anticoagulante K3 EDTA
3
Caja
100
300
300
2.3.16.199
Tubos PCR (1000 tubos)
1
bolsa
220
220
220
2.3.16.199
Tubos ependorff (1000
tubos de 1.5ml)
1
bolsa
200
200
200
2.3.16.1 99
Aretador para ganado
1
Unidad
150
150
150
2.3.16.199
2.3.199.12
2.3.16.199
21540
2.3.2.1.22
2.3.2.1.21
2.3.2.1.12
2.3.2.1.11
PASANTIA
Viáticos para viajes
diversos al interior del
país
Pasajes para viajes
diversos al interior del
país
100
Día
200
20000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
70
Pasaje
50
3500
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
350
Viáticos al exterior del
país
1
viaje
20000
20000
10000
10000
Pasajes al exterior
1
Viaje
4000
4000
2000
2000
47500
2.3.12
VESTUARIO
2.3.1.2.11
Guardapolvo blanco
2.3.13
COMBUSTIBLE
2.3.1.3.11
Gasolina (84 octanos)
680
Galon
16
10880
10880
2.3.1.3.11
Petróleo (diesel B5)
677
Galon
16
10832
10832
10
Unidad
60
600
600
600
21712
MATERIALES DE
ESCRITORIO
2.3.15.12
Engrapador tipo tijera
1
unidad
50
50
50
2.3.15.12
Papel bond A4 de 80
gramos
30
Millar
40
1200
1200
2.3.15.12
Tóner para impresora
laser
2
Unidad
300
600
600
1850
2.3.27.1.2
CAPACITACION
Servicio de asesoría para
la ejecución del proyecto
de investigación ;
capacitación a
productores y
profesionales.
Entrenamiento en
técnicas de biología y
genética molecular
avanzado en las
instalaciones de la
unidad de Biotecnología
Molecular UPCH
1
Consultor
30000
30000
15000
2.3.27.1.2
Servicio de consultoría y
entrenamiento en
técnicas de biología y
genética molecular
avanzado en las
instalaciones de la
unidad de Biotecnología
Molecular UPCH
1
Especialista
20000
20000
10000
10000
2.3.27.32
Capacitación a
productores y
profesionales, alumnos y
tesistas
1
Especialista
10000
10000
2500
2500
2.3.27.32
Capacitación en uso de
software exclusivo para
genómica y biología
molecular
2
Mes
3000
6000
3000
3000
3500
3500
15000
2500
66000
ASISTENTES DE
INVESTIGACION
2.3.27.2 99
Asistente de
investigación experto en
preparación de muestras
3
Mes
3500
10500
3500
2500
2.3.27.2 99
Asistente experto en
procesamiento de
material genético (ADN)
3
Mes
3500
10500
2.3.27.2 99
Asistente de laboratorio
experto en manejo de
software de ADN
3
Mes
3500
10500
2.3.27.2 99
Asistente de laboratorio
para compilación de
información genética
3
Mes
3500
10500
2.3.27.2 99
Contador publico
colegiado
2
Mes
3300
6600
2.3.27.2 99
Asistente de investig. de
campo para genética y
selec.(Bach. ing. Zoot.)
3
Mes
3200
9600
3
Mes
2350
7050
2350
2350
2350
2.3.27.2 99
Técnico de campo (Bach.
Zootecnista o afín )
Asistente Administrativo
20
Mes
1400
28000
1400
1400
2.3.27.2 99
Experto en calificación
fenotípica de alpacas
1
evento
8000
8000
8000
2.3.27.2 99
Experto en calificación
de caracteres
reproductivos de alpacas
1
evento
8000
8000
Apoyo secretarial
14
Mes
1000
14000
2.3.27.2 99
servicio de limpieza
4
Mes
1000
4000
2.3.27.2 99
Apoyo secretarial
8
Mes
1000
2.3.27.2 99
8000
3500
3500
3500
3500
3300
3500
3500
3500
3500
3500
1400
1400
1400
3300
3200
3200
3200
1400
1400
1400
1400
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1400
1400
1400
1000
1000
1400
1400
8000
1000
1000
1000
1000
135250
PUBLICACIÓN,
COMUNICACIÓN Y
DIFUSIÓN
2.3.27.2 99
Publicación de trabajo en
revista científica
Ponencia de
presentación de
resultados
2.3.22.44
Impresión de manuales
didácticos
50
Doc.
20
1000
2.3.22.41
Gigantografia
1
Unidad
618
618
2.3.22.41
4000
1
Doc
4000
4000
1
Ponen.
5000
5000
5000
1000
618
2.3.27.2 99
Ponentes para el curso
de genómica en
Huancavelica
2
Espec
5000
10000
5000
5000
20618
CONSULTORIA
2.3.27.21
Evaluación de proy.
Monitoreo y eval. final del
proyecto
3
Jurado
3500
10500
10500
10500
OTROS SERVICIOS
2.3.25.12
Alquiler de movilidad
180
Dia
200
36000
36000
IMPREVISTOS
20000
APOYO A LA DUI
GRAN TOTAL
999940
3600
3600
3600
3600
3600
3600
3600
3600
3600
3600
BIBLIOGRAFIA
1. Agapito, J., Rodríguez, J., Herrera-Velit, P., Timoteo, O., Rojas, P., Boettcher, P., Garcia,
F., Espinoza, J. (2008) Parentage testing in alpacas (Vicugna pacos) by using semi-automated
fluorescent multiplex PCRs with 10 microsatellite markers. Animal genetics, 39:201-203.
2. Banos, G., Wiggans, G. R., Powell. R. L. (2001) Impact of paternity errors in cow identification
on genetic evaluations and international comparisons. J. Dairy Sci., 84:2523–2529.
3. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. (1980) Construction of a genetic linkage map
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32:314–31.
4. Butler, J.M. (2005) Forensic DNA typing. Biology, technology and genetics of STR markers.
2da. Ed. Elseiver Academic Press. USA: 455-539.
5. Cifuentes, L., Martinez, E., Acuña, M., Jonquera, H. (2006) Probability of Exclusion in
Paternity Testing: Time to Reassess. J. Forensic Sci., 51(2):349-350.
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Uruguay
7. Excoffier, L., Laval, G., Schneider, S. (2005) Arlequin ver. 3.0: An integrated software package
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8. FAO - Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. (2005)
Situación actual de los camélidos sudamericanos en Perú. Proyecto de cooperación técnica en
apoyo a la crianza y aprovechamiento de los camélidos sudamericanos en la región andina
(TCP/RLA/2914):1-62.
9. Freeland, J.R. (2005) Molecular Ecology. John Wiley y Sons Inc. USA: 110-111.
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ANEXOS
ANEXO 01: MARCO LÓGICO
MEDIOS DE VERIFICACION
SUPUESTOS
FIN
Elevar la producción y calidad de características de importancia económica en
alpacas Huacaya
Incremento de las características de importancia económica
Adecuado y eficiente programa de mejoramiento
genético asistido por marcadores genéticos.
PROPÓSITO
Identificar y desarrollar marcadores SNPs como herramientas de mejora
genética en alpacas huacaya.
Marcadores genéticos SNPs reportados.
Existencia de marcadores genéticos SNPs
polimorficos en el genoma de la alpaca.
COMPONENTES
-
-
Desarrollo e implementación de libros de registro y de pedigrí
validados mediante ADN
Identificación y desarrollo de marcadores genéticos SNPs para el
mejoramiento genético de alpaca.


Informe del estatus fenotípico y productivo de las alpacas
del Centro Experimental de Lachocc -Huancavelica.
Libro de pedigrí
Cronograma de empadre de alpacas reproductoras




Banco de ADN genómico.
Banco de genotipos.
Informe de la caracterización genética
Libro de pedigrí con ADN

 Los investigadores se encuentran
comprometidos con el proyecto.
 La universidad cumple con el normal
funcionamiento administrativo
 Universidad ejecuta el normalmente el
reglamento.
 Universidad cumple con ejecutar el
presupuesto del proyecto en las fechas
indicadas.
-
Aplicación de marcadores SNPs en la generación de herramientas
para mejora genética en un plantel de reproductores.
-
Fortalecimiento de las capacidades de investigación en genómica
de alpacas.
ACCIONES
1. Generar un libro de registro fenotípico en alpacas reproductoras.



Nivel de consanguinidad
Niveles de heterosis
Heredabilidad
 El plantel de reproductores de alpaca
huacaya de la Universidad Nacional de
Huancavelica no se comercializan.

Número de cursos y seminarios a los productores de
alpacas e interesados.
Número de profesionales capacitados.
Publicación en revistas indexadas.
 La Universidad Nacional de Huancavelica
cumple con ejecutar el presupuesto del
proyecto en las fechas indicadas.


Evaluación fenotípica
 Los investigadores se encuentran
comprometidos con el proyecto.
2. Generar libros de pedigrí en alpacas reproductoras.
Libros de inscripción de alpacas de alta productividad
3. Generar bancos de ADN genómico de alpacas de alta productividad.
Catálogo de ADN
4. Adecuar técnicas para identificación y desarrollo de marcadores SNPs en
alpacas.
Protocolos de genotipificación y análisis de SNPs.
5. Identificar familias de referencia y pedigrís validados en alpacas
reproductoras.
6. Generar bancos de genotipos de alpacas de alta productividad.
Identificación de pedigríes
7. Generar información sobre los niveles de consanguinidad y variabilidad
genética en alpacas reproductoras
Informes sobre consanguinidad y variabilidad genética
8. Generar información sobre parámetros de selección de características
cuantitativas en alpacas.
Informes sobre parámetros de selección
9. Mejorar la capacitación en genética y genómica molecular.
Cursos de capacitación
10.
Profesionales capacitados
Promover la formación de profesionales e investigadores jóvenes.
11.
Promover la difusión del conocimiento en el área de genética y genómica
de alpacas.
Catálogo de genotipos
Artículo científico
 La universidad cumple con el normal
funcionamiento administrativo
 Universidad ejecuta él normalmente la
reglamentación del proyecto
 Universidad cumple con ejecutar el
presupuesto del proyecto en las fechas
indicadas
ANEXO 02: MATRIZ DE CONSISTENCIA
PROBLEMA
OBJETIVO
HIPOTESIS
VARIABLES
¿Existen marcadores
moleculares SNPs
para características
de importancia
económica en la
alpaca Huacaya?
Generar un
panel de
marcadores
genéticos
moleculares
SNPs de la
alpaca
En la alpaca Huacaya las
características de
importancia económica
están determinados por
marcadores moleculares
SNPs
Independiente
-Marcadores
moleculares
SNPs
INDICADORES
METODOS Y TECNICAS
 Secuencia de ADN. METODO:
-Experimental
 Número de
repeticiones.
TECNICA:
-Análisis por microssatélite
SNPs
-Hibridación de ADN
Dependiente
 Características de -Secuenciación
importancia
Características
económica
de importancia
económica