procedimiento de obtencion de aromas terpenicos por un

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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k
ES 2 054 847
kInt. Cl. : C12P 7/02
11 N.◦ de publicación:
5
51
ESPAÑA
C12P 7/04, C12G 1/06
A23C 9/12, A23L 1/226
//(C12P 7/02, C12R 1:865)
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 88402647.7
kFecha de presentación : 20.10.88
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 313 465
kFecha de publicación de la solicitud: 26.04.89
T3
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k
54 Tı́tulo: Procedimiento de obtención de aromas terpénicos por medio de un procedimiento micro-
biológico.
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73 Titular/es: Pernod-Ricard
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72 Inventor/es: Karst, Francis y
30 Prioridad: 22.10.87 FR 8714609
142, Boulevard Haussmann
F-75008 Paris, FR
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.08.94
k
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.08.94
Aviso:
k
k
Vladescu, Barbu Dinu Vladimir
k
74 Agente: Curell Suñol, Marcelino
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
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La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de aromas terpénicos, en particular
para la aromatización de bebidas, por medio de un procedimiento microbiológico que emplea mutantes
de Saccharomyces cerevisiae.
Los terpenos, considerados esencialmente como productos de origen vegetal, son compuestos caracterı́sticos de numerosos aceites esenciales. Gracias a sus propiedades fisiológicas y sensoriales, los monoy
sesquiterpenos tienen aplicaciones múltiples en la industria alimentaria, en la perfumerı́a y en la industria
farmacéutica.
Por lo demás, ciertos monoterpenos (geraniol, nerol, linalol, citronelol, alfa-terpineol) son los responsables del carácter aromático de la uva Muscat. Las variedades de uva con sabor y aroma Muscat
pertenecen a dos clases distintas, definidas principalmente por el valor de la relación linalol/geraniol.
Para las variedades “Muscat”, la relación linalol/geraniol es superior a 1 mientras que para las variedades
“Malvoisie”, es claramente inferior a 1.
Las cepas vegetales de monoterpenos, aunque numerosas, podrı́an, por razones climáticas, estacionales, económicas y polı́ticas, resultar insuficientes frente a un mercado en el que crece constantemente
la demanda, por lo cual la producción microbiana de estos principios aromáticos presenta un interés
considerable y es uno de los objetivos de la presente invención.
Contrariamente a los hongos filamentosos, cuya aptitud para sintetizar terpenos se ha señalado frecuentemente, parece que las levaduras están provistas sólo débilmente de estas capacidades biosintéticas.
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30
El artı́culo de Z. Lebensm. Unter. Forsch. (1984), 179, 450-452, describe la formación de trazas de
farnesol por parte de S. cerevisiae.
La débil producción de terpenos por parte de las levaduras y, más particularmente por parte de S.
cerevisiae, está en aparente contradicción con la presencia en las células de sistemas enzimáticos susceptibles de catalizar la biosı́ntesis de ciertos monoterpenos.
35
En efecto, las células de S. cerevisiae sintetizan cantidades significativas (0,5 - 3 % del peso seco) de
ergosterol a partir del acetil-CoA y la polimerización del acetil-CoA, como en las plantas superiores, se
realiza a través del mevalonato, el geranilpirofosfato y el farnesilpirofosfato. La S. cerevisiae posee pues
todos los enzimas necesarios para la biosı́ntesis de los terpenos y, si bien estos últimos no son secretados,
es verosı́mil que los encimas de la vı́a del ergosterol tengan una fuerte afinidad para los pirofosfatos de
los terpenos, que son ası́ polimerizados esencialmente en ergosterol.
40
La presente invención se basa en el descubrimiento del hecho que ciertos mutantes de S. cerevisiae son
capaces de secretar terpenos, contrariamente a lo que se admitı́a hasta ahora, pudiéndose utilizar dichas
cepas, además, para la preparación directa de bebidas aromáticas, fermentadas o no.
45
Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de aromas
terpénicos, caracterizado porque se cultiva, en un medio de cultivo apropiado, un mutante de S. cerevisiae, bloqueado en la vı́a de sı́ntesis del ergosterol, que secreta terpenos aromáticos.
50
Se ha podido mostrar, en efecto, gracias a los trabajos en los que se basa la presente invención, el
hecho de que la biosı́ntesis del ergosterol bloqueada por mutaciones en ciertas etapas para ciertas cepas
(denominadas a continuación mutantes auxótrofos para el ergosterol) se traducen en acumulaciones de
intermediarios terpénicos. Las mutaciones que afectan la vı́a de los esteroles en la levadura S. cerevisiae
más susceptibles de traducirse en acumulaciones de pirofosfatos de terpenos corresponden a los bloqueos
en las etapas catalizadas por la escualenosintetasa y la farnesil-difosfato sintasa (EC 2.5.1.10).
55
Pueden seleccionarse cepas de este tipo por mutación de cepas de Saccharomyces y selección en un
medio que contenga un esterol, en particular el ergosterol, y la nistatina.
60
Sin embargo, a causa de la auxotrofia para el ergosterol, algunas de estas cepas, por ejemplo la cepa
134 que se describirá más completamente en los ejemplos, presentan en ciertos casos un crecimiento relativamente débil debido a los contenidos en general poco elevados de esterol de los jugos de frutas. A
fin de paliar las fluctuaciones cualitativas y cuantitativas frecuentemente importantes que se observan
cuando se hace fermentar este tipo de cepas, se han podido obtener, en particular por subclonaje, cepas
que presentan, además de las mutaciones descritas anteriormente, una mutación supresora que se traduce
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en un crecimiento en ausencia de ergosterol.
La supresión parcial de la auxotrofia para el ergosterol conduce a la restauración del fenotipo salvaje.
5
Por análisis de tétrada, se ha podido establecer que:
- la mutación segrega independientemente de la auxotrofia para el ergosterol,
- la mutación puede ser recuperada de las esporas recombinantes protótrofas para el ergosterol,
10
- la mutación es recesiva.
A pesar de su relativa independencia del ergosterol exógeno, estos clones producen siempre cantidades
importantes de monoterpenos.
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Este tipo de cepas puede ser seleccionado por subclonaje a partir de las cepas anteriores en un medio
desprovisto de ergosterol, por ejemplo.
Es importante observar que estas cepas que sintetizan de forma limitada el ergosterol, pueden crecer
en ausencia de ergosterol pero que esta mutación no afecta el bloqueo en la vı́a de los esteroles y en los
descendentes erg+ no se manifiesta fenotı́picamente.
A fin de garantizar la estabilidad genética de los mutantes erg-, se conservan en estado heterocigoto
bajo forma de diploides erg/erg+. Antes del empleo, se recuperan las esporas erg- después de esporulación y disección de ascas.
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30
35
Durante la realización de este procedimiento, se ha constatado que algunas cepas erg- procedentes,
después de esporulación, de los diploides erg-/erg+, no excretaban terpenos en el medio. Esto ha conducido a la constatación de una mutación recesiva suplementaria que, asociada con el bloqueo en la vı́a de
los esteroles, permite la excreción de los terpenos.
Ası́, los mutantes más interesantes según la invención deben llevar, preferentemente, además de las
mutaciones precedentes, una mutación designada ter que está implicada ya sea en la permeabilización de
la membrana ya sea en la desfosforilación del geranil-pirofosfato.
En los haploides recombinantes erg+, la mutación ter no se manifiesta fenotı́picamente. Sin embargo,
las esporas erg- procedentes de los diploides erg+ ter/erg- ter producen siempre terpenos.
La conservación de los mutantes productores de terpenos debe realizarse en el estado heterocigoto con
una cepa que lleve la mutación ter como antecesor erg+.
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45
Entre los mutantes preferidos según la invención, es necesario citar los mutantes que llevan las mutaciones siguientes:
- - erg-, bloqueo en las etapas de la vı́a de los esteroles catalizadas por la farnesil-pirofosfato sintetasa
y la escualeno sintetasa,
- un supresor recesivo no ligado a la mutación erg- que confiere una relativa independencia al ergosterol exógeno sin afectar el bloqueo en la vı́a de los esteroles,
50
- ter, mutación recesiva que permite la producción de terpenos, sin la cual el geranil-pirofosfato
acumulado gracias al bloqueo erg- no es excretado en el medio bajo forma de geraniol.
Las cepas ası́ obtenidas secretan terpenos aromáticos en cantidades apreciables pero la sociedad solicitante ha podido demostrar la posibilidad de aumentar aún esta secreción.
55
En efecto, los estudios realizados han demostrado que el funcionamiento de las alcohol-deshidrogenasas
(ADH) desviado en el sentido de un aumento del fondo de acetil-CoA permite aumentar la actividad de
la vı́a de los esteroles por una mayor disponibilidad del acetil-CoA.
En particular, son interesantes las mutaciones siguientes:
60
- los mutantes ADH I− , es decir los mutantes desprovistos de isoenzima fermentario, que son incapaces
de formar etanol a partir del acetaldehı́do y que presentan por lo tanto una producción aumentada
del acetil-CoA;
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- los mutantes ADH IIc, es decir los mutantes constitutivos para el isoenzima oxidativo, que oxidan
el etanol en acetaldehı́do incluso en presencia de fuertes cantidades de azúcar (condición tı́pica para
los jugos y mostos de frutas) mientras que la cepa salvaje sólo oxida etanol en ausencia de azúcar.
5
10
La combinación de estas diferentes mutaciones permite obtener, en particular, mutantes que producen
terpenos en cantidad importante, especialmente terpenos de interés aromático, tales como el farnesol y
el geraniol.
Ası́, los mutantes particularmente interesantes son los mutantes auxótrofos para el ergosterol y que
son ADH IIc o sea los mutantes ADH I- y ADH IIc.
El procedimiento según la presente invención puede ser realizado de forma diversa.
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25
Ante todo, es posible utilizar el cultivo de este tipo de mutante para la preparación de aromas tales
como aromas de Muscat natural que serán purificados a partir del cultivo y que podrán ser utilizados
para la aromatización de substratos alimentarios, en particular de bebidas.
En la mayor parte de los casos, sin embargo, los aromas terpénicos se prepararán directamente in situ
por cultivo de substratos alimentarios, en particular de lı́quidos alimentarios o de productos alimentarios
fluidificables, tales como purés de frutas, por ejemplo. En este caso, estos substratos serán fermetados
directamente por las cepas mutantes de S. cerevisiae que asegurarán por lo tanto la aromatización de los
substratos.
En el caso de que el mutante utilizado sea un mutante ADH I− , es decir un mutante que no disponga
de alcohol-deshidrogenasa fermentaria, los productos de fermentación obtenidos serán productos no alcoholizados o con un grado de alcohol muy bajo.
30
Desde luego, en ciertos casos puede ser interesante hacer fermentar, por medio de este tipo de cepa, los
medios ya alcoholizados para conferirles ciertos aromas; en este caso se podrán efectuar fermentaciones
sucesivas, por medio de una levadura que produzca alcohol y luego por medio de los mutantes según la
presente invención o bien efectuar, cuando ello sea posible y compatible con el crecimiento de las levaduras, una cofermentación de las dos levaduras. Estas levaduras pueden utilizarse igualmente para realizar
la adquisición de espuma, por ejemplo en los vinos espumosos.
35
Desde luego, en numerosos casos, la preparación de bebidas alcohólicas y aromatizadas podrá realizarse
utilizando un mutante según la invención pero que disponga de una alcohol-deshidrogenasa fermentaria
(ADH I+ ).
40
Siendo algunas de las cepas según la presente invención auxótrofas para el ergosterol, será necesario,
cuando el medio de cultivo sea un medio puramente sintético, prever la adición de ergosterol a fin de
garantizar el crecimiento de las levaduras. En el caso de substratos de origen vegetal tal adición no es,
en general, necesaria teniendo en cuenta la existencia de estos compuestos en estado de trazas en los
diferentes extractos vegetales.
45
50
55
Los ensayos efectuados con ayuda de los mutantes según la presente invención han demostrado que era
ası́ posible obtener, por ejemplo, jugos de frutas no alcoholizados que presentan el aroma caracterı́stico de
los Muscats o bien productos alcoholizados de tipo vino o espumosos que presentan aromas caracterı́sticos
de Muscat o de Malvoisie.
Los mutantes ADH I− o ADH IIc son, por su parte, particularmente interesantes en la producción de
los esteroles, en particular del ergosterol, y de manera general de todos los productos que impliquen un
aumento de la presencia de acetil-CoA.
Los siguientes ejemplos, ilustrados por medio de las figuras, permitirán poner en evidencia otras caracterı́sticas y ventajas de la presente invención.
Ejemplo 1
Obtención de un mutante ADH I−
60
El mutante FL 100 ADH I− se selecciona a partir de la cepa salvaje haploide FL 100 (ATCC 28383)
por medio de la resistencia al alcohol alı́lico en presencia de glucosa. Este mutante, protótrofo para el
ergosterol, no acumula intermediarios terpénicos, siendo funcionales todas las etapas de la vı́a de los
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esteroles.
5
En contrapartida, las mayores disponibilidades de acetil-CoA debidas a la mutación ADH I− se
traducen en un aumento significativo de la cantidad de ergosterol sintetizado (tabla 1). Este tipo de
mutantes representa cepas hiperproductoras de ergosterol.
TABLA 1
Ergosterol
(% del peso seco)
10
FL 100
FL 100 ADH I−
15
0,75 + 0,06
1,06 + 0,05
Ejemplo 2
20
25
Obtención de un mutante auxotrofo para el ergosterol
Se efectúa una mutagénesis con la ayuda de rayos ultravioletas de la cepa salvaje FL 100.
Se seleccionan luego las cepas resistentes a la nistatina en presencia de ergosterol. Entre los mutantes
resistentes se selecciona uno de ellos que se denomina “mutante erg 9”.
La auxotrofia de este mutante es confirmada en un medio completo (extracto de levadura 1 %, bactopeptona 1 %, glucosa 2 %) con o sin ergosterol (80 µg/ml).
30
35
La medida de la actividad escualeno-sintetasa se efectúa en la fracción microsomal por medio del
método de Agnew y Popjak (Agnew W.S., Popjak G. (1978) J. Bio. Chem. 253, 4566-4573) que demuestra el hecho de que este mutante erg 9 está desprovisto de actividad escualeno-sintetasa.
El mutante erg 9 se caracteriza igualmente por la ausencia del ADH I (débil producción de etanol) y
por la constitutividad para el ADH II. Su fenotipo se resume en la tabla 2.
TABLA 2
Crecimiento
40
45
FL 100
erg 9
50
Escualeno sintetasa
ADH I
ADH II
Etanol
YPG + erg
YPG
(Actividad especı́fica)
(Act. esp.)
(Act. esp.)
(g/l)
+++
+++
0,24
16,2
12,3
36,2
++
-
0
0
10,8(∗)
3,7
(∗) en presencia de 90 g/l de glucosa
Ejemplo 3
55
60
Obtención de un mutante auxotrofo para el ergosterol
Este mutante se ha obtenido a partir de un mutante termosensible auxótrofo para la glicina (a 32 ts)
después de mutagénesis UV en un medio con nistatina. Este mutante acumula dimetil-alil-pirofosfato in
vitro y no produce farnesil-pirofosfato en presencia de isopentenil-pirofato (marcado con carbono 14) y
de geranil-pirofosfato, lo que indica la ausencia de la actividad farnesil-difosfato sintasa.
Por lo demás, el mutante 134 presenta el fenómeno caracterı́stico de las cepas erg 9; el alelismo fenotı́pico indica la presencia de un alelo de erg 9; se trata pues de un mutante doble farnesil-difosfato
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sintasa.
Como el mutante erg 9, el mutante 134 es ADH I− y ADH II constitutivo. Los resultados que se refieren a la secreción del geraniol in vivo muestran que la mutación farnesil-difosfato sintasa es bradı́trofa.
5
Ejemplo 4
Los dos mutantes erg 9 y 134 se disponen en cultivo agitado (24 horas) o estacionario (4 dı́as) en
medio completo (extracto de levadura 1 %, bactopeptona 1 %, glucosa 2 %, ergosterol 0,008 %) a 28 ◦ C.
Estos dos mutantes secretan efectivamente farnesol y geraniol como se resume en la tabla 3.
10
TABLA 3
Farnesol
(µg/100 ml)
15
Estacionario
Agitado
Estacionario
Agitado
n.d.
24
17
n.d.
138
40
n.d.
n.d.
-
n.d.
n.d.
22
FL 100
erg 9
134
20
25
Geraniol
(µg/100 ml)
n.d. = no detectable
A tı́tulo comparativo, la cepa salvaje FL 100 no produce ni farnesol ni geraniol, ni en cultivo agitado
ni en cultivo estacionario.
30
Ejemplo 5
Aromatización de jugos de frutas con mutantes erg 9 Y 134
35
40
Unos concentrados de frutas (uva blanca, uva roja, frambuesa, melocotón, pera, plátano) diluidos a
razón de 120 g/l de azúcar se siembran con 107 cpm y se incuban bajo agitación (150 revoluciones/minuto)
a 30 ◦ C.
El análisis sensorial se efectúa al cabo de 4 dı́as en los jugos liberados de células. Los análisis olfactivos
indican sistemáticamente una nota terpénica en el caso de los mutantes erg 9 y 134 a diferencia de los
productos obtenidos con la ayuda de la cepa FL 100 salvaje.
Los resultados observados se recogen en la tabla 4.
TABLA 4
45
FL 100
50
Uva blanca
Uva roja
Melocotón
Pera
Plátano
Frambuesa
55
60
vinoso
vinoso
“levadura”
“levadura”
“levadura”
“levadura”, disolvente
Erg 9
134
tipo muscat
perfume floral
perfume floral
afrutado, floral
nota muscat, “farnesol”
nota muy “farnesol”
tipo muscat
perfume floral
afrutado
afrutado, floral
nota muscat
nota vı́nica
Ejemplo 6
A partir de la cepa 134 y por subclonaje, se obtiene una nueva cepa capaz de crecer en un medio con
ausencia de ergosterol exógeno y que presenta las caracterı́sticas siguientes:
6
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- crecimiento relativamente bueno sin ergosterol (nivel intermedio entre 134 y la cepa salvaje FL 100),
- biosı́ntesis de ergosterol (10 % de la cepa salvaje),
5
- bloqueo de la etapa catalizada por la farnesil-pirofosfato sintetasa, con acumulación de geranilpirofosfato,
- excreción en el medio de cultivo de monoterpenos, más particularmente geraniol y linalol.
10
Esta cepa es de un rendimiento mucho mayor desde el punto de vista industrial y permite obtener
producciones estables, tanto en cantidad como en calidad.
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REIVINDICACIONES
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1. Procedimiento de obtención de aromas terpénicos, caracterizado porque se cultiva, en un medio
de cultivo apropiado, un mutante de S. cerevisiae bloqueado en la vı́a de sı́ntesis del ergosterol, el cual
secreta terpenos aromáticos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo apropiado
presenta un lı́quido alimentario o un producto alimentario fluidificable.
10
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el mutante tiene
una actividad muy débil escualenosintetasa y/o farnesil-difosfato sintasa.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el mutante de S.
cerevisiae presenta una mutaciónsupresor que se traduce en un crecimiento en ausencia de ergosterol.
15
20
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el mutante es un
mutante ter.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la conservación de los mutantes
utilizados en el procedimiento se efectúa en estado heterocigoto con una cepa que lleva la mutación ter
como antecesor erg+.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el mutante es constitutivo para la alcohol-deshidrogenasa oxidativa.
25
30
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el mutante está
desprovisto de alcohol-deshidrogenasa fermentaria.
I+ .
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el mutante es ADH
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los aromas
terpénicos son extraı́dos del medio después de cultivo.
35
40
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el lı́quido alimentario se elige entre los jugos de frutas, la leche o los derivados de la leche y los mostos de cereales.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, 10 y 11, caracterizado porque se preparan bebidas o productos aromatizados sin alcohol o con un débil grado alcohólico por fermentación de
los productos de base con un mutante de S. cerevisiae ADH I− bloqueado en la vı́a de biosı́ntesis del
ergosterol.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el mutante es ADH IIc.
45
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el mutante de S. cerevisiae se
utiliza como levadura de toma de espuma en la elaboración de vinos espumosos.
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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