UNA INFECCION VIRAL EN LA GLANDULA CERVICAL DE

BIOLOGIA
Acta Científica Venezolana, 51: 207–210, 2000
UNA INFECCION VIRAL EN LA GLANDULA CERVICAL DE
LARVAS DE Dione junio (LEPIDOPTERA: NYMPHALIDAE)
Frances Rowland Osborn y Fredi Sánchez
Instituto de Investigaciones en Biomedicina y Ciencias Aplicadas – UDO, Aptdo. 245, Cumaná, Venezuela.
FAX: 093 521629, e-mail: [email protected]
Centro de Microbiología y Biología Celular, Servicio de Microscopía Electrónica IVIC, Aptdo. Postal 21827, Caracas 1020A, Venezuela.
Recibido: 13/08/98 ; Revisado: 17/03/00 ; Aceptado: 13/05/00
RESUMEN: Las larvas de Lepidoptera son atacadas por diferentes tipos de virus, muchos de los cuales pertenecen a la familia Baculoviridae. En un estudio de la ultraestructura de la glándula cervical de Dione junio se observó que en los estadíos avanzados, las larvas
mostraron a veces síntomas indicando la presencia de dos tipos de virus. Las glándulas cervicales se prepararon para microscopía óptica
y electrónica de transmisión, utilizando el procedimiento estándar, y como tampón cacodilato de sodio (0,1M, pH 7,2). La glándula está
compuesta por dos sacos ovalados internos, que se comunican con el exterior mediante un canal extracelular. Cada saco contiene, en su
parte externa, células con núcleos grandes e irregulares y un citoplasma muy electrón denso con numerosas mitocondrias de pequeño
diámetro. En larvas infectadas los tejidos se encuentran muy dañados y se observa el virus de la poliedrosis nuclear en varios de los
núcleos. En el citoplasma se observa otro virus tipo “rickettsia”. Los virus patógenos presentes en las larvas de D. junio podrían ser estudiados como potenciales controladores biológicos en los programas de manejo de esta plaga. Palabras clave: Virus, glándula cervical,
larvas, Dione junio
A VIRAL INFECTION IN THE NECK GLAND OF LARVAE OF Dione junio (LEPIDOPTERA: NYMPHALIDAE))
ABSTRACT: Lepidopteran larvae may be attacked by different viruses, many of which belong to the Baculoviridae family. Whilst studying
the ultrastructure of the neck gland in Dione junio larvae we found that in later instars the larvae showed symptoms of attack by two types
of virus. The glands were prepared for optical and electron microscopy using sodium cacodylate buffer and standard procedures (0.1M,
pH 7.2). The neck gland is composed of two oval internal sacks which communicate with the exterior via an extracellular channel. Each
sack contains, in its external region, cells with large, irregular nuclei and a dense cytoplasm containing numerous small mitochondria. In
infected larvae, the tissues are damaged and the nuclear polyhedrosis virus can be observed in several of the nuclei. In the cytoplasm
another “rickettsia type” virus, may be observed. The pathogenic viruses present in D. junio larvae could be studied as potential biological
controls of this pest. Key Words: virus, cervical glands, larvae, Dione junio .
INTRODUCCION
Las larvas de un número grande de especies de Lepidoptera son atacadas por diferentes tipos de virus, muchos de
los cuales pertenecen a la familia Baculoviridae (Adams
1996). Se ha desarrollado el uso comercial de algunos
de estos virus, especialmente el virus de la poliedrosis nuclear en programas de control biológico de plagas de cultivos, por ejemplo, Heliothis spp. (Noctuidae) y Lymantria
dispar (Liparidae)1 . Dione junio (Heliconiinae: Nymphalidae) es una plaga de Parchita, Passiflora edulis (Passifloraceae) en el estado larval. Durante un estudio de las
defensas químicas de esta especie se observó que en los
estadios avanzados, las larvas a veces muestran síntomas
que evidencian la presencia de un virus de la poliedrosis
nuclear (Baculoviridae). Las larvas infectadas toman una
apariencia flácida, la epidermis se vuelve débil y frágil y
los tejidos internos pierden su estructura completamente
(lisis) (resultados no publicados). Como parte del estudio mencionado arriba se realizó una investigación de la
ultraestructura de la glándula cervical de D. junio . Esta glándula está ubicada ventralmente en el tórax, justamente anterior al primer par de patas y tiene una función
defensiva6 . Aquí se presenta una descripción de las glándulas sanas de D. junio, y glándulas infectadas con el vi-
rus. Se espera que estas observaciones preliminares representan un primer paso en el posible desarrollo de este
virus como un control biológico de esta plaga.
MATERIALES Y METODOS
Se colectaron larvas del quinto estadío de Dione junio en
una plantación de parchita, ubicada en Las Maravillas, Dtto. Brión, Estado Miranda. Las larvas se trasladaron al
Laboratorio de Comportamiento de la Universidad Simón
Bolívar. Se disecaron las glándulas cervicales de las larvas vivas bajo agua destilada, con la ayuda de un microscopio estereoscopio, Zeiss Stemi SV 11. Las glándulas
disecadas se sumergieron inmediatamente en pre-fijador
fresco (glutaraldehido al 2,5% y paraformaldehido 1% en
solución tampón cacodilato de sodio (CBS), pH 7,2 y 260
mOsm/l; luego los tejidos fueron postfijados en una solución de Tetróxido de Osmio (OsO4 ) al 1% en solución
tampón CBS, pH 7,2. Los tejidos, después de varios lavados en tampón CBS fueron deshidratados en una serie
creciente de etanol3;5;8 . Las muestras fueron incluidas en
una mezcla de resina, Polybed 812. Se realizaron cortes
ultrafinos, de 60-70 nm, teñidos con Acetato de Uranilo al
6% durante 5 min y Citrato de Plomo durante 3 min. Las
observaciones y tomas fotográficas se realizaron en un mi-
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Osborn y Sánchez
Figura 1. Ultraestructura de la glándula cervical en larvas
sanas. Detalle del área perimetral de un saco. Mb: membrana
basal, P: pliegue de la superficie basal de una célula. 31.000X.
Figura 3. Ultraestructura de la glándula cervical en larvas
sanas. Detalle del área próxima al canal. Ca: canal, Pc:
epicutícula, Nc: endocutícula, Mv: microvellosidades. 13.000X.
Larvas sanas
Células de los sacos
Figura 2. Ultraestructura de la glándula cervical en larvas
sanas. Detalle del área de síntesis de un saco. N: núcleo, Cr:
cromatina, Rr: retículo endoplasmático rugoso, M: mitocondria.
2.800X.
Los sacos de la glándula cervical están delimitados por
una membrana basal de 0.5m de grosor, y contenido homogéneo (Figura 1). Próxima a esta membrana la superficie basal de las células está muy plegada y aparecen prolongaciones en forma de dedos apuntando hacia la membrana (Figura 1). El citoplasma de las células es denso y
contiene mitocondrias además de retículo endoplasmático rugoso (Figura 2). Los núcleos son grandes y de forma
irregular (Figura 2). La cromatina se observa en conglomerados definidos uniformemente distribuidos, y entre los
mismos se encuentra un material heterogéneo y granular.
Células del canal central
croscopio electrónico de transmisión Philips (EM-400T).
RESULTADOS
Este canal está rodeado por células similares a las encontradas en el saco. El tejido cercano a la membrana basal
se encuentra muy plegado y próximo a la cutícula las células presentan numerosos microvellosidades (Figura 3).
Estructura de la glándula cervical de Dione junio
Larvas infectadas
La glándula cervical es una glándula eversible, compuesta
por un par de sacos ovalados internos. Cada saco contiene, en su parte externa, células dispuestas alrededor del
reservorio que contiene una sustancia amorfa (Figura 4).
Se puede observar que estas células presentan una estructura muy abierta. En la parte anterior de cada saco se
presenta un canal extracelular que descarga independientemente en un canal central ensanchado que comunica
directamente con el exterior (Figura 4). Este canal está
formado por una invaginación de la cutícula de la larva.
La ultraestructura de la glándula se observa muy alterada
(Figura 5). En varias de las células de la glándula, particularmente hacia la región externa donde se evidencia la
presencia de partículas virales de la poliedrosis nuclear,
algunas de ellas en proceso de replicación. (Figuras 5 y
6). En algunos cortes se observa que la envoltura nuclear
está desintegrada, liberando los poliedros virales (Figura
7). Además del virus de la poliedrosis nuclear se presenta otra estructura viral tipo “rickettsia”, en el citoplasma1
(Figura 5).
Infección viral en larvas de Dione junio
Figura 4. Sección transversal de la glándula cervical de D.
junio. S: saco, R: reservorio, C: cutícula, Ca: canal central. 70X,
microscopía óptica.
Figura 5. Detalle de una célula periférica infectada con los
virus. N: núcleo, Ci: citoplasma, Bv: virus de la polihedrosis
nuclear (Baculoviridae), Vr: virus tipo “rickettsia”. 9.000X,
microscopía electrónica de transmisión.
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Figura 6. Detalle del virus de la polihedrosis nuclear. Bv:
Baculoviridae. 36.000X, microscopía electrónica de transmisión.
Figura 7. Se observa la desintegración de la envoltura nuclear,
liberando los poliedros virales. N: núcleo, Bv: Baculoviridae, Po:
poliedros. 17.000X, microscopía electrónica de transmisión.
DISCUSION
guir las estructuras, probablemente debido a las alteraciones morfológicas producidas por la presencia de dos tipos
de virus, el virus de la poliedrosis nuclear y el virus tipo
“rickettsia”.
La ultraestructura de la glándula cervical contiene núcleos
grandes y de forma irregular, característicos de células defensivas en larvas de Lepidoptera4;7 . En los sacos, los
numerosos pliegues próximos a la membrana basal probablemente tienen la función de absorción. Las células
que rodean el canal central de la glándula son similares
a las células del saco. La presencia de microvellosidades
próximas a la cutícula del canal sugiere una secreción de
sustancias al canal. No se observa ninguna perforación
de la cutícula del canal, lo que sugiere que la secreción
pasa a través de éste por difusión2 .
En larvas infectadas de Dione junio no se pudo distin-
El virus de la poliedrosis nuclear ataca con frecuencia
larvas de diferentes familias dentro del orden Lepidoptera. Las larvas ingieren los poliedros, que están presentes
en el follaje. Luego, el virus se multiplica en los núcleos
de la larva y eventualmente causa la ruptura y desintegración celular. Ha sido reportado recientemente la presencia
de un Baculovirus en larvas de Spodoptera frugiperda en
un cultivo de maíz ubicado en el estado Lara, Venezuela 9 .
Estudios de laboratorio y campo confirmaron que el virus
es altamente patógeno para esta plaga, reduciendo significativamente la infestación de la misma10;11 . Los virus tipo
“rickettsia” han sido reportados en larvas de Trichoplusia
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Osborn y Sánchez
(Noctuidae)1 .
ni
Este virus retarda el desarrollo de la larva
y en los estados avanzados de la enfermedad, el citoplasma de los órganos infectados es destruido por completo1 .
Este es el primer reporte de la presencia de este virus en
larvas de Nymphalidae para Venezuela.
En conclusión, la existencia de los virus patógenos en
las larvas de D. junio aporta una información interesante
para la formulación de una nueva línea de investigación.
En este caso, demostrar la potencialidad de ser utilizados
como agentes de control biológico en los programas de
manejo de esta plaga.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece la Dra. Gloria Villegas para facilitarnos el uso
del microscopio electrónico de transmisión en el Laboratorio de Ultraestructura, Centro de Biociencias del Instituto
de Estudios Avanzados (IDEA), Caracas, Venezuela. Este
trabajo fue parcialmente financiado por CONICIT bajo el
proyecto QF-36.
REFERENCIAS
1. Adams, J.R. The use of electron microscopy in insect pathology. Phillips Electron Optics Bull . 123:11-21, 1996.
7. Snodgrass, R.E. Principles of Insect Morphology. Cornel
University Press. Ithaca and London, 1993, pp. 59.
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glands in social Hymenoptera. En: Chemistry and Biology
of Social Insects. J. Reder and H. Rembold (eds.). J. Peperny Verlag, München, 1987, pp. 81-84.
8. Stobbart, R.H.J. and Shaw, J. Salt and water balence: excretion. In: The Physiology of Insecta. Vol III. Rockstein
(ed.). Academic Press. New York, London, 1964, pp. 189235.
3. Crossley, A.C. and Waterhouse, D.F.. The ultrastructure
of the osmeterium and the nature of its secretion in Papilio
larvae (Lepidoptera). Tiss. Cell 1(3):525-554, 1969.
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certain Lepidopterous larvae. Ann. Entomol. Soc. America.
18:203-239, 1925.
5. Lu, C.C. and Chow, Y.S.. Fine structure of the larval osmeterium of Papilio demolus libanius (Lepidoptera: Papilionidae). Annals. Entomol. Soc. Am. 84(3):294-302, 1991.
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1173-1181, 1998.
9. Velázquez, J., Ferrer, F., Yanellys, R. y Farro, A. Aislamiento e identificación de un Baculovirus en larvas de Spodoptera frugiperda Smith. (Lepidoptera: Noctuidae). Trabajo presentado en el XVI Congreso Venezolano de Entomología. 1999.
10. Yanellys, R., Velázquez, J., Ferrer, F. y Farro, A. Evaluación de dos Baculovirus en larvas de Spodoptera frugiperda
Smith. (Lepidoptera: Noctuidae). Trabajo presentado en el
XVI Congreso Venezolano de Entomología. 1999.
11. Yanellys, R., Velázquez, J., Ferrer, F. y Farro, A. Evaluación de dos Baculovirus para el control de Spodoptera frugiperda Smith. (Lepidoptera: Noctuidae) bajo condiciones de
campo. Trabajo presentado en el XVI Congreso Venezolano
de Entomología. 1999.