DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE INFECCIONES POR CHIKV

VIGILANCIA DEL VIRUS
CHIKUNGUNYA POR
LABORATORIO EN ARGENTINA
Bioq. Victoria Luppo
Laboratorio de Arbovirus
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH)
“Dr. J.I.Maiztegui”- ANLIS, Pergamino-Argentina
CHIKUNGUNYA
 Virus del género Alphavirus y Flia Togaviridae
 Deriva de Makonde: “aquel que se encorva”
 Son esféricos, con una nucleocápside dentro
de una envoltura lipoproteica.
 Son virus con genoma de RNA de
polaridad positiva de aprox. 11.5 KB
 Genes proteínas no estructurales: replicación del
virus; genes de proteínas estructurales: implicadas
en el reconocimiento con el sistema inmune
(epítopes específicos)
Proteínas no estructurales
Proteínas estructurales
Está Relacionado Genéticamente Y
Serológicamente a O’nyong-nyong, Igbo
Ora Y En Menor Medida Mayaro Y Ross
River
• 1 Serotipo
•3 Genotipos Principales:
•Africa Occidental (selvatico)
•Africa Central/Este/Sur (ECSA)
•Asiatico-Americano
Selección, recolección y envío de muestras
Selección de muestras a procesar:
Muestras de pacientes con inicio agudo de fiebre >38.5º C, artralgia grave o artritis
no explicada por otra condición médica, que reside o haya visitado áreas con
circulación de CHIKV.
Tipo de muestra:
Suero de Fase aguda: hasta 8 días tras el inicio de síntomas
Suero de Fase convalesciente: 10-15 días tras el inicio de síntomas
LCR: casos de meningoencefalitis.
Conservación de la muestra:
-Refrigerada si se procesa dentro de las 48 hs
-Congelada si se procesa después de las 48 hs
Envío de la muestra
-Con hielo seco (en lo posible), o con geles refrigerantes para asegurar la cadena
de frío
-Siempre con la ficha clínico-epidemiológica completa (fecha de inicio de los
síntomas, Fecha toma de muestra, Historia de viajes, antecedentes de vacunación,
etc)
-Triple envase
VIREMIA Y CINETICA DE
ANTICUERPOS EN INFECCIONES POR
CHIKV
DIAS DE EVOLUCIÓN
Técnicas de laboratorio para CHIK
Aislamiento viral e identificación
por IF o RT-PCR
Detección de
genoma viral
(RT-PCR
convencional y en
Tiempo Real )
Detección de anticuerpos contra
proteínas virales: Elisa IgM/IgG,
Neutralización por reducción del
número de placas.
Inactivación
1er paso
extracción del
RNA (BSL2)
Algoritmo para detección de CHIKV, DENV y
requerimientos de Bioseguridad
Muestra de Caso sospechoso de CHIKV y
DENV
Serología en
casos
RT-PCR (-) CHIK
en BSL2
< 8 días de evolución
ELISA IgM DENV
(desde 4 dpi)
RT- PCR DENV y CHIKV
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
IgM CHIKV
Secuenciación –
Filogenia
Positivo
Aislamiento Viral
(BSL3)
Estudiar PAR SEROLÓGICO
por Neutralización r técnica
de para CHIK y otros
Alphavirus (BSL3)
Negativo
Solicita
Segunda
muestra
para repetir
serología
Estudiar por
técnica de
neutralización
para DEN y otros
Flavivirus
(BSL2, virus
quiméricos para
SLEV y WN, cepa
vacunal YFV)
Algoritmo para detección de CHIKV, DENV y
requerimientos de Bioseguridad
Caso sospechos de DENV y CHIKV
Serología
en BSL2
≥ 8 días de evolución
ELISA IgM DENV y
CHIK V
Positivo
CHIKV
Estudiar
PAR SEROLÓGICO por
técnica de
neutralización para
CHIK y otros Alphavirus
( BSL3)
*Estudio de segunda muestra para descartar posible
infección secundaria de DENV sin IgM (Clínica y
Epidemiología)
Positivo DENV
Negativo DENV y
CHIKV
Estudiar
PAR SEROLÓGICO por
técnica de neutralización
para DENV y otros
Flavivirus
Se descarta caso
de DENV* o
CHIKV
(BSL2, virus quiméricos
para SLEV y WN, cepa
vacunal YFV)
•Búsqueda de otros
Arbovirus
TÉCNICAS DIRECTAS
AISLAMIENTO VIRAL
 Gold Stándard de los métodos directos
 Muestra indicada: suero de fase aguda
(< de 8 días de evolución y perfectamente
conservada)
 Inoculación en lineas celulares suceptibles:
BHK-21, HeLa, Vero y C6/36. Efecto
citopático al 3er día.
 Confirmación por técnica de IF , RT-PCR
convencional o en real time del
sobrenadante celular.
 Aislamiento en laboratorio BSL-3 de cepas
obtenidas en el INEVH de casos importados
Aislamiento de cepas de CHIKV en el INEVH (BSL 3)
1.
2.
3.
4.
Muestras de Suero de casos sospechosos
(< 8días de evolución)
Se aislaron en celulas Vero
Identificación viral por RT-PCR
Real Time CHIKV
Titulación por UFP
Secuenciación de un fragmento
de Genoma Viral y filogenia
viral
 Se han obtenido stocks
virales con titulos ˜ 10 7 ufp
/ml:
• cepa Asiatica
(aislamiento viral de
suero de un viajero
detectado en
Argentina)
 Celulas Vero C 76
RT-PCR en tiempo real CHIKV
 Inicialmente se usó un protocolo
diseñado por el Dr. Lanciotti 2007
(sensibilidad: 1UFP o 50 copias
genómicas)
 Diseño de sonda y primer en base a la
cepa prototipo S27
 Detecta todos los genotipos West
Africa, ECSA y Asia
 No hay reactividad para otros
Alphavirus (ONN, Ross River, Mayaro,
EEE, WEE, VEE, Semiliki Forest,
Sinbis).
RT-PCR en tiempo real CHIKV
• Recientemente se han diseñado 2 sets de primers y sonda más
específicos para el genotipo asiático circulante (Fort Collins- CDC)
(sin publicar aún)
• Se analizaron en el INEVH diluciones seriadas de una de las cepas
aisladas en el INEVH procedente de República Dominicana
Los sets 2 y 3 tienen mayor sensibilidad
que el set 1, por lo cual se recomienda
para el análisis de las cepas que circulan
actualmente en América
AAAAAAAAAAA
nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 C E2 E1
No estructural
estructural
Sets de primer y sondas
• Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
• Set 2 (Asiático-América)
3855F
3957c1,2
3996-FAM1,2
• Set 3 (Asiático-América)
856F
962c
908-FAM
RT-PCR convencional genérica para Alphavirus
 Oligonucleótidos degenerados en la región nsp4 (195pb)
 Detección de EEE, WEE, VEE, CHIK, Ross River, Sinbis, Semiliki Forest
 Para identificar el Alphavirus se requiere la secuenciación genómica
AAAAAAA
nsP1 nsP2
nsP3 nsP4
No estructural
C E3 E2 E1
estructural
Caracterización Filogenética de cepas
circulantes
CHIKV detectado en Argentina- INEVH
2014
Identificación del
Genotipo Asiático
en viajeros
procedentes del
Caribe
Análisis bayesiano, 1200 nt en la
región E ; 155 pb región nsp4.
Árboles de topología similar
Congreso Argentino de Virología
CAV,2015
TÉCNICAS SEROLÓGICAS
ELISA de Captura de Ac
IgM
 Desde el 2011 el INEVH cuenta
con la técnica de Elisa IgM de
captura puesta a punto y
evaluada externamente a través
de proficiencia del CDC
 Permite detectar infección
actual o reciente
 Presenta cruce serológico con
otros alfavirus del mismo grupo
ej: virus Mayaro, Ross River,
Onyong nyong)
 Metodología in house que
utiliza reactivo producido en
INEVH
ELISA de captura IgM CHIK (P/N)
CHIK
RR
ONN
VEE
MAY
EEE
12.3
1.5
15.3
0.89
1.9
1.2
10.6
1.2
13.9
1.1
1.9
1.3
14.5
1.7
17.3
1.1
3.1
0.89
20.4
0.92
20.7
1.5
7.1
1.8
26.6
4.9
27.4
2.2
1.7
1.5
21.2
1.5
24.7
2.2
1.2
1.6
15.3
1.5
8
1.6
1.9
2.2
31.3
1.5
24.6
1.7
2.9
1.8
22
1.6
15.9
1.8
1.4
1.4
18.8
0.59
13.1
1.2
1.5
1.1
34.3
3.7
22.6
1.6
2.8
9.1
Fuente: CDC
IgM Capture ELISA
1. Anti IgM humano (4°C toda la noche)
2. Agregar suero de paciente en la dilución adecuada
(37°C , 1 Hora)
3. Agregar Antígeno (chik y normal para la misma muestra)
( 4°C toda la noche)
4. Agregar el Ac monoclonal conjugado con peroxidasa
rábano (37°, 1 Hora)
5. Adición del Sustrato TMB. Dejar 30 min a 37°C y
solución de Stop. Leer a 450 nm
Fuente: CDC
Inoculación viral
Linea Celular
C6 / /BHK-21
36
VeroC76
Producción
de antígenos:
“Slurry” para ELISA
IgM
Incubación
x días, 34ºC
Monitoreo
por ECP y/o IFI
100 % Infección
Congelamiento -70ºC
Descongelamiento
Sonicado y centrifgado
ANTIGENO p/ ELISA IgM
Inactivación por
irradiación gamma
Puesta a punto de la PRNT para confirmación
serológica de CHIKV
 Técnica serológica de referencia
para confirmar el diagnóstico
 Aumento en 4 veces el título
entre muestra
aguda/convalesciente.
 Estudiar especificidad con panel
de Alphavirus
 Se tituló stock viral de MAY para
incorporar al panel
INCORPORACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE CHIKV EN LA RED NACIONAL DE
LABORATORIOS PARA DIAGNOSTICO DE DENGUE Y OTROS ARBOVIRUS
INEVH
Confirmación,
Control de calidad,
trasferencia de
tecnología y
capacitación
Puesta a punto de
PRNT, producción de
antígenos para ELISA,
producción de controles
positivos para PCR
Incorporación
del Evento
CHIK en SIVILA
Puesta a Punto de
Real Time en
laboratorios de la
Red
Puesta a Punto de RTPCR Genérica de Alfavirus
en laboratorios sin
equipos Real Time
¡MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCIÓN!
Bioq. Victoria Luppo
[email protected]
Dra Alejandra Morales
[email protected]
Lic Cintia Fabbri
[email protected]