1 - BIOTECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
CAHUASQUÍ LUNA JIMENA
18/ABRIL/2011
CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA
Métodos turbidimétricos (ópticos).
Consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un
cultivo bacteriano. La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la
masa del cultivo.
La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas de una
suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.
Estudios teóricos y experimentales han mostrado en soluciones diluidas, la absorbancia
es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula
o por UFC cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes.
a) Espectrofotómetro:
Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida
a través de la suspensión). Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para
relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema.
La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula
y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes
de onda (λ) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para
>107céls/ml.
Para estimar el número de microorganismos totales o el número de microorganismos
viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada
tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad
Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.
Absorbancia en función del Peso Seco
Absorbancia = K x Peso Seco
K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del
microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W 0).
La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones
diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya
que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer.
El inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de
pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.
Absorbancia en función del Peso Seco
Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales
En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos
diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo
número de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.
(1)
La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para suspensiones
diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya
que valores mayores producen desviaciones de la Ley de Beer.
El inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de
pipeteo y menor sensibilidad por bajo nivel de absorción
b) Nefelómetro:
Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto
respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada
directamente por la preparación. Este método consiste en varios tubos de vidrio con
BaCl2 al 1% + cantidades crecientes de H2SO4 al 1%; donde se origina un precipitado de
BaSO4, origen de la turbidez, la cual se relaciona con un número de células/ mL. Posee
mayor sensibilidad que el espectrofotómetro se usa generalmente el tubo 6 de
(ESCALA MC FARLAND; SULFATO DE BARIO. TUBOS 1 A 10) (2)
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Millones
de Escala
de
bacterias/ mL
MacFarland
300
4.0
600
3.7
900
3.5
1.200
3.4
1.500
3.3
1.800
3.2
2.100
3.15
2.400
3.10
2.700
3.04
3.000
3.00
 Ventajas
Los métodos de dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos
 Desventajas
Pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco
(contenido macromolecular). (3)
Bibliografía
1. MEDIDAS DE CRECIMIENTO. [En línea]
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioRecuento.htm.
2. ESCALA MACFARLAND. [En línea]
http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales%20teoricos/crecimiento.p
df.
3. RECUENTO DE MICROORGANISMOS. [En línea]
http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_microbiol
ogia_de_los_al.htm.