Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502504
GUIA No 1.1- Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes.
I. EL PROBLEMA.
Demostrar que en la composición de material Biológico se encuentran carbohidratos, lípidos,
proteínas y sales minerales y comparar los diferentes órganos y/o tejidos desde el punto de vista
de sus componentes principales.
II. FUNDAMENTO TEORICO.
Los compuestos biológicos están hechos a partir de los mismos elementos que se encuentran en
otras moléculas pero predominan algunos elementos; los más comunes son el carbono, hidrógeno,
nitrógeno, oxígeno, fósforo, y azufre. El agua es un componente importante de la célula y es la que
eleva el porcentaje de composición del oxígeno.
Las reacciones químicas que se efectúan en la célula, forman y rompen enlaces de acuerdo a
mecanismos comunes a toda la química, pero estas reacciones son catalizadas por o que se llevan
a cabo a velocidades muy rápidas. En estás reacciones intervienen una serie de biomoléculas y
biopolímeros que son indispensables para la célula; entre ellos tenemos las proteínas, que son
biopolímeros grandes (formados por aminoácidos) que entre sus múltiples funciones están las de
tipo estructural y la función catalítica (enzimas). Los carbohidratos son un grupo de biomóleculas
abundantes, en ellos tenemos los azúcares sencillos (glucosa), sus polímeros (almidón) y algunos
derivados (ácido galacturónico). En cuanto a los lípidos, son los componentes importantes de las
membranas biológicas, los más sencillos son los ácidos grasos, luego están algunas moléculas
más grandes como los fosfolípidos y algunas moléculas más complejas como el HDL. Los ácidos
nucleicos, ADN y ARN, son biopolímeros conformados por los nucleótidos, los cuales a su vez
están formados por un azúcar (ribosa), una base nitrogenda (como la citosina) y al menos un grupo
fosfato.
III. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN.
Elabore el preinforme con la siguientes indicaciones:
- Revise el fundamento químico (las reacciones) de cada una de las pruebas de identificación.
- Explique brevemente el funcionamiento de cada uno de los órganos y/o tejidos a analizar.
- Realice la ficha técnica de los reactivos a utilizar en la práctica
- Realice la ficha técnica de los reactivos que se van a utilizar.
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IV. MATERIALES Y REACTIVOS.
Materiales por grupo:
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Un mortero con mano
Una cápsula de porcelana
Cinco vasos de precipitados de 100ml
Un vaso de precipitados de 500ml
Un vaso de precipitados de 250ml
Diez tubos de ensayo
Una gradilla para tubos de ensayo
Un pipeteador o propipeta
Un vidrio de reloj
Una espátula
Una placa de calentamiento
Un termómetro
Dos tubos para centrífuga
Materiales y reactivos generales. (el volumen de los reactivos está calculado para 10 grupos)
-
Ácido tricloroacético al 10% (300ml)
Etanol-Eter-Cloroformo 2:2:1 (300ml)
Etanol al 95% (500ml)
NaCl al 10% (300ml)
Reactivo de Lugol
Reactivo de Molisch
Reactivo de Benedict
Reactivo de Millón
Solución de ninhidrina al 0,2%
HCl 2N
Coloroformo
Anhídrido acético
Ácido sulfúrico concentrado
NaOH al 15% (200ml)
Arena lavada
Hielo
Diez pipetas graduadas de 5ml
Corazones de pollo
Hígados de pollo
Carne de pollo
Cerebro de res
Agua destilada
Balanza analítica
Centrífugas
Diez goteros plásticos
Cuatro vasos de precipitados de 250ml
Tres cajas de Petri.
V. PROCEDIMIENTO.
1. Cada grupo realizará el fraccionamiento químico sobre un tejido determinado de acuerdo al
diagrama No 1.
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2. Con las muestras obtenidas en el punto anterior se realizarán una serie de pruebas de
caracterización.
Carbohidratos: Para la muestra de glicógeno y mono-polisacáridos.
Divida cada una de las muestras en cuatro porciones en tubos de ensayo y realice las siguientes
pruebas:
1. Agregue 3 gotas de Lugol y observe.
2. Adicione 1ml de HCl 2N y colocar al baño maría por 25 min, dejar enfriar y agregar
nuevamente 3 gotas de Lugol. Observar.
3. A otra fracción adicione 1ml de agua destilada, 2 gotas de reactivo de Molisch y mezcle
cuidadosamente. Con los tubos inclinados agregue 1ml de ácido sulfúrico concentrado
el cual forma una capa de ácido debajo de la fase acuosa. Observe la coloración del
anillo formado en la interfase.
4. Coloque al baño maría por 2 min y luego adicione 2ml de reactivo de Benedict,
observe y continúe calentando por 15min; vuelva a observar.
Lípidos: Divida la muestra de extracción de lípidos en dos tubos de ensayo y realice las siguientes
pruebas:
1. Adicione 3ml de cloroformo y mezcle, luego adicione 1ml de anhídrido acético
cuidadosamente por la paredes del tubo y agite, luego agregue 3gotas de ácido
sulfúrico también por la paredes y observe la coloración de la interfase al minuto y a los
15 minutos.
2. Agregue 3ml de NaOH al 15% y una perla para ebullición, y coloque al baño maría
durante 20min, adicione 3ml de agua destilada y agite fuertemente. Observe.
Proteínas: Divida la muestra de proteínas en dos tubos de ensayo y realice las siguientes pruebas:
1.
2.
Adicione 1 ml de agua destilada y suspenda la muestra, agregue 1ml del reactivo de
millón y caliente por unos minutos al baño maría. Observe.
Agregue 1 ml de la solución de ninhidrina al 0,2% y caliente al baño maría por 10min.
Observe.
VI. TABLA DE DATOS.
El alumno debe diseñar la tabla de datos y estar en el cuaderno de laboratorio antes de iniciar la
práctica.
VII. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRÁCTICA.
-
Deducir si hay presencia de carbohidratos, aminoácidos y lípidos en el órgano y/o tejido.
Compare sus resultados con los de los demás grupos y diga las diferencias o similitudes
en cuanto a composición de los diferentes órganos y/o tejidos analizados.
Revise de nuevo los objetivos y evalúe si se cumplieron total o parcialmente, y redacte
unas conclusiones en donde exprese en forma clara lo aprendido en esta práctica.
VIII. BIBLIOGRAFÍA.
-
Conferencias para el Laboratorio de Bioquímica para Biología y Farmacia. Universidad
Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Química. Santafé de
Bogotá, 1998.
Bioquímica práctica, David Plummer, 1981.
Bioquímica experimental, Luis R. Hernández, 1979.
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TEJIDO
Cortar en trozos pequeños y pesar unos 5g,
pasar a un mortero y adicionar ATA en relación
de 1,5ml/g de tejido. Adicionar aprox 0,5 g de
arena lavada, macerar y centrifugar por 10 min.
RESIDUO
SOBRENADANTE
Lípidos, Proteínas, ácidos necleicos,
arena
Carbohidratos mono y
polisacaridos.
Adicione al residuo en nuna cápsula de
porcelana la mezcla de Etanol- EterCloroformo 2:2:1 en 1,5ml/g de tejido,
luego centrifuge a 2500 rpm por 5 minutos.
En un vaso de precipitados adicione etanol al
95% en una relación 2:1 con respecto al
volumen del sobrenadante y enfriar en un
baño de hielo por 5min. Centrifugar por 10 min
preferiblemente en frío.
SOBRENADANTE
Mono y polisacáridos,
evaporar al baño maría y
guardar
SOBRENADANTE
RESIDUO
Lípidos: evaporar al
baño maría y guardar
Ácidos nucleicos, proteína y
arena
RESIDUO
Glicógeno. Sacar
y guardar.
Extraer en una vaso de precipitados de
100ml con NaCl al 10% (1ml/g tejido
original) y a 90ºC en una baño maría por
40 min. Centrifugar a 8000 rpm por 10min
RESIDUO
Proteína desnaturalizada y
arena, sacar y guardar
SOBRENADANTE
Ácidos nucleicos. Adicionar etanol al 95% y en frío en
relación 2:1 y dejar reposar por 10min. Centrifugar a
8000 rpm por 10 min
RESIDUO
Ácidos nucleicos. Sacar y
guardar
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