Biblioteca Central UABCS - Universidad Autónoma de Baja

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE BAJA CALIFORNIA SUR
__________________________________________________________________
ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
Efecto de toxinas paralizantes de Gymnodinium catenatum en el copépodo
Pseudodiaptomus euryhalinus
TESIS PROFESIONAL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
BIÓLOGO MARINO
PRESENTA
Jairo Antonio Fuentes Pascacio
Director de tesis
Dr. Felipe de Jesús Ascencio Valle
La Paz, Baja California Sur, 2010
Todo tiene su tiempo, y todo lo que se quiere debajo del cielo tiene su hora:
Tiempo de nacer y tiempo de morir;
tiempo de plantar y tiempo de arrancar lo plantado;
tiempo de matar y tiempo de sanar;
tiempo de destruir y tiempo de construir;
tiempo de llorar y tiempo de reír;
tiempo de estar de duelo y tiempo de bailar;
tiempo de esparcir piedras y tiempo de juntar piedras;
tiempo de abrazar y tiempo de dejar de abrazar;
tiempo de buscar y tiempo de perder;
tiempo de guardar y tiempo de arrojar;
tiempo de romper y tiempo de coser;
tiempo de callar y tiempo de hablar;
tiempo de amar y tiempo de aborrecer;
tiempo de guerra y tiempo de paz.
Eclesiastés 3; 1-22.
Dedicatoria
In Memoriam
Dr. José Luís Ochoa [1951-2007]
Maestro, tutor y una persona increíble que nos enseño a tener perseverancia y amor a
la ciencia.
Muchas Gracias por haberme aceptado en su equipo.
I
Dedicatoria
A mis padres:
Rubén Fuentes de la Cruz, que me enseño a vivir y luchar por mis sueños, así como mantenerme
tranquilo en situaciones difíciles con una simple llamada, te amo papá!
Miriam Guadalupe Pascacio Jiménez: gran mujer y excelente madre, no puedo pedir más amor
que el que me brindaron en mi desarrollo como persona y así como en lo académico. Gracias
mamita por darme la oportunidad de ser tu hijo o como a veces digo su experimento, te amo
mamita!!
A mis hermanos:
Alma Yazmín Fuentes Pascacio y Rubén Alejandro Fuentes Pascacio, siempre me han
demostrado todo su amor y respeto, siento haberlos dejado muy chicos para seguir mis sueños,
pero e aquí resultados, se que con el paso de su desarrollo académico me superaran y me
sentiré orgulloso de ustedes.
A mi familia Chiapaneca Pascacio Jiménez, muchas gracias por estar en toda mi vida echando
porras y ayudando a levantarme cuando intento caer.
A mi familia Oaxaqueña Fuentes de la Cruz, por todo su cariño y excelentes comidas que me
regalan cada vez que los veo.
A mi familia Veracruzana Fuentes Montalvo y amigos:
Jorge Fuentes Álvarez, gracias por ser un amigo y una de mis guías en esta vida, no tengo más
que decirle muchas gracias tío George por aceptarme en su casa y darme el amor de hijo!!
Dulce Maria Montalvo, gracias por soportar a un niño chiqueado y brindarme su amor, por
enseñarme a disfrutar las cosas buenas y que cuando se ganan a pulso saben mucho mejor los
logros, gracias tía por también tratarme como hijo!!
II
Agradecimientos
Agradezco Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste por todo el apoyo y
facilidades otorgadas para la realización de este trabajo, en especial al proyecto ―Histología
por Exposición Crónica a Saxitoxina (PSP) y Brevetoxina (NSP) en el Modelo
Experimental de Ratón-SAGARPA-2003-98‖, que me brindo el apoyo económico para el
desarrollo del experimento.
A los responsables de los siguientes Laboratorio:
Manuel Moreno (Biotoxinas Marinas), Marte Virgen (Cepario), Orlando y Norma
(Laboratorio de Salud Ambiental y Biomedicina), Dr. Juan Carlos Pérez Urbiola (Sala
Húmeda), gracias por su ayuda y colaboración al proporcionarme los copépodos y un
agradecimiento a todos los que estuvieron ayudándome en el laboratorio de Química
Analítica y Alimentaría de la Universidad de Vigo, España (Diana, Laura, Dr. Manuel
Leão, Jesús, Nati, Cori y si se me va alguno pss no se sienta tengo un problema con los
nombres, pero le agradezco a todas las personas que me brindaron su cariño y amistad en
Vigo).
Mi mas sincero agradecimiento al Dr. Tania Zenteno por aceptarme en su laboratorio y sus
consejos, al Dr. Felipe Ascencio, por su consejos y la amistad y apoyo después de la
perdida del Dr. José Luís Ochoa, así como hacernos parte de la ―Patobanda‖ (muchas
gracias a todo el equipo de trabajo que siempre estuvo al pendiente de mi). Al Dr. Carlos
Rangel por sus consejos y su amistad para el desarrollo de este trabajo. A la M. C. Erika
Torres Ochoa gracias por tu amistad y preocuparte por mi en todo el proceso universitario.
Al biologaso y nuestro jefecito de Biología Marina Marco Medina, gracias por tu amistad y
ayudarme en este proceso de papeleo para mi examen que fue un martirio para mi. A mi
asesor universitario Dr. Gerardo Gonzáles Barba, gracias por su amistad y buenos consejos
en mi vida académica en la UABCS.
A la Dra. Ana Gago en el Laboratorio de Química Analítica y Alimentaría de la
Universidad de Vigo (España), gracias por aceptarme para realizar mi estancia y confiar en
que no iba a destruir el equipo.
III
Al M. C. Ricardo Flores, gracias por tu amistad y brindarme copépodos de tu experimento
para los primeros ensayos que realice.
A la Lic. Alejandra Tapia que sin su ayuda yo hubiera sido como una aguja en un pajar en
el mundo de los copépodos, gracias por levantarte tempra y ayudarme con mi experimento,
estaré infinitamente agradecido.
Al Equipo JLO, Gorette Solís, Axel Falcon, Leyberth Fernández, Laura González, Jesús
Pérez, gracias a su apoyo y buena vibra se ha cumplido otro objetivo del Dr. Ochoa.
A mi amigo Pablo Gil Sánchez (Alias el Pabliuca, moncoco, el palito anches, pablini),
gracias hermano por estar a mi lado toda una vida y sigamos cosechando mas años de esta
amistad que muchos envidian a pesar de la distancia!! Te quiero mucho hermano.
A mis hermanos de la UABCS (el orden de los factores no altera mí cariño eé, así que no se
sientan):
Pakoles Vergara, gracias hermano por tu amistad y por las buenas platicas, por ayudarme a
pensar en lo mecánico para mi experimento ya sabes aquí no hay estrés, solo buena vibra.
Carlos López Fletes (El Fletes), gracias bro!, por soportarme esos 3 años en la misma casa
ja, por darme ánimos y estar ahí cuando se te necesitaba, ya sabes cuentas conmigo para
todo.
Georgina Ramírez (Gashina), mi amiguisima (eres niño), no tengo palabras que describan
cuantas cosas me enseñaste o la cantidad de cosas que hicimos juntos las cuales eran unas
babosadas pero muy divertidas, te quiero musho, asi que en nuestra próxima vida vamos a
juntarnos y postularnos por la beca bailando como pollito.
Víctor Vargas (el negro), gracias carnal por tu amistad incondicional, aunque estés dormido
y te pedíamos un mapa de Beirut, sabia que estabas con nosotros, nunca fallaste para ir a
dar el rol y mucho menos cuando me sentía triste en la Paz, gracias!
Claudia Miranda, parte fundamental de mi vida académica y una chica de buen corazón,
que no brinda una amistad a cualquiera y pude ganármela a pulso, muy chikiona y que no
IV
da su brazo a torcer, pero forma parte de una etapa muy feliz de mi vida estando conmigo
en las buenas y en las malas, muchas gracias.
Eduardo Villalón (Villa...amigo), gracias man por hacerme reír, por tu amistad, por todo en
la Paz, profundamente agradecido
Alfredo Vergara, el buen ta tan tan (tu me entiendes), gracias por tu amistad y por darme un
rato asilo en tu house, eres un buen compa, gracias!
Tzitziki Loeza (chichiki), uy amiga todo lo que hemos vivido y la amistad se fortalece cada
día mas, te quiero musho y donde estés siempre me acordare de ti, gracias!
Osvaldo Hernández (el hongos), mi buen fuiste la primera persona de la UABCS que
conocí en La Paz y me hizo ir a la clase de las 7 de la mañana, sabiendo que iba en la tarde
jajaja, gracias por tu amistad carnal.
Magali Gómez Valdez (maguita), contigo las palabras sobran, desde que entramos a la
carrera la conexión jalapeña se dio, sabes cuanto te quiero mushashita y también adoro tu
toque en la cocina, eres mi amiguisima, gracias por la ayuda para lograr esta meta
Denisse Perea (Renis ée), muchisimas gracias por tu amistad chiquilla, te quiero musho.
José Alberto Torres (Pepe Juguetes), compatriota gracias por tus enseñanzas y ponerme
siempre a prueba, gracias por tu amistad y la ayuda que me brindaste estando en La Paz, la
frase ―engañen al Paska‖ estará por la eternidad!!
A los que de una u otra manera me ayudaron y se preocuparon por mí en todo este proceso
mis más profundos agradecimientos, Luís (Kiwi), Diego (pony), Merít del Rocío, Sara de
las Heras (sarixis), Nats, Kalita, Lalex, Isma, A la Banda Paceña (El grillo, Wolfy, Rafa,
Chato, Cea, Poncho, si se me va alguno, sorry).
Gracias a mis nuevos amigos por presionarme y terminar el proceso de titulación: Félix
Olivares, Leonora Martínez, Sergio Castillo, Ana Cabello, Laura Camacho, Mariela Brito,
Andrea Figueroa, Samanta, Carlos Abraham.
V
Por si pensaste que me había olvidado, como puedes imaginarte eso eé Jesús?
E tenido a muchas personas que han guiado mi camino pero el Dr. Jesús Pérez Linares, se
lleva mis honores, sus cualidades como maestro, amigo, compañero, mentor, etc., etc., me
ha enseñado a tener amor a la ciencia, muchas gracias por todos tus consejos, tus regaños,
tus chistes, tus abrazos cuando estaba triste, el rinconcito que me diste pa dormí en España,
por aguantarme y hacer que fuera perseverante aunque a veces mostraba desanimo por las
cosas, por tu sinceridad y lo principal que nunca se me va olvida tu ética profesional, de
veraz de todo corazón mi querido Sen Sei, muchas gracias!
Y a todos los que no fueron mencionados por este medio, saben que son parte fundamental
de mi vida, les envió un abrazo y un gracias en general!
Siempre les brindare una sonrisa de oreja a oreja para hacerles ameno el día, aunque llueva,
truene o tiemble,
ATTE
JAFP (Alias el Paska, shamako, mocoso, come crayolas, mowly, jayo, jairini, paskaleta,
entre otros)
VI
Resumen
En la última década las Proliferaciones Microalgales Nocivas (PMN) han ido en aumento,
lo cual ha provocado que las investigaciones científicas vayan enfocadas hacia los efectos
tóxicos que pueden producir estos eventos masivos aleatorios, afectando la salud pública,
actividades acuícolas y sobre todo a una gran escala al medio ambiente. Muchos de los
estudios relacionados con PMN describen a organismos interactuando con estos eventos,
desde filtradores hasta depredadores, por lo tanto uno de los organismos más importantes es
aquel que depreda activamente a las PMN, tal como los copépodos, los cuales pueden
considerarse como vectores potenciales al estar expuestos a ficotoxinas. En este estudio, el
copépodo Pseudodiaptomus euryhalinus fue expuesto durante 3 días a diferentes
densidades celulares de Gymnodinium catenatum para observar la posible bioacumulación
y efectos tóxicos producidos por las toxinas paralizantes. No se observó diferencia
significativa (p>0.05) en el porcentaje promedio de supervivencia de los copépodos
expuestos al dinoflagelado tóxico en ninguna de las densidades celulares estudiadas (1x1062x106 cél/mL). Sin embargo, después de 7 horas los copépodos presentaron aletargamiento
prolongado en presencia de G. catenatum. Los análisis de actividad enzimática mostraron
que no hubo diferencia significativa (p<0.05) entre los copépodos expuestos a G.
catenatum y los controles, por lo que se presume que la presencia de esta microalga tóxica
no les produce daño oxidativo. Por otro lado, se pudo comprobar la presencia de toxinas
paralizantes en los tejidos de los copépodos expuestos a G. catenatum (STX, NEO, GTX14 y dcSTX). Estos resultados muestran que los copépodos son capaces de retener toxinas
paralizantes y sobreviven en presencia de G. catenatum, representando un riesgo potencial
de biomagnificación de toxinas paralizantes a través de la cadena trófica.
VII
Abstract
Harmful Algal Blooms (HAB’s) represent a worldwide problem that has been increasing in
the last decades. These natural phenomena have provoked that the scientists focus their
research to the toxic effects produced in human health, aquaculture, and environment.
Important studies regarding to HAB’s describe interactions among these microalgae and
surrounding organisms, principally those that are their predators. The copepods are
considered one of the main potential vectors of phycotoxins when they are exposed to toxic
microalgae. This work ran bioassays with copepods from the species Pseudodiaptomus
euryhalinus, fed and exposed to different cell densities of the toxic dinoflagellate
Gymnodinium catenatum during three days. The aim of this study was to evidence possible
effects of paralytic toxins (PSP) on the crustaceans, as well as to corroborate if they were
able to accumulate those biotoxins in their tissues. There was no significant difference
(p>0.05) in the average percentage of survival between the copepods exposed to G.
catenatum in any of the cell densities tested (1x106-2x106 cell/mL). Nevertheless, after
seven hours of exposure the organisms showed long-term lethargy. Enzymatic activity
assays (catalase and lipoperoxidase) showed no significant difference (p<0.05) between
copepods fed by G. catenatum comparing with controls. These results lead as to conclude
that presumably these organisms did not experienced oxidative harm in presence of the
toxic dinoflagellate. On the other hand, there was corroborated the presence of paralytic
toxins (STX, NEO, GTX1-4, dcSTX) in the tissues of P. euryhalinus after the exposure
with G. catenatum, confirming that these crustaceans are able to accumulate PSP toxins,
but survive without oxidative damage. These findings evidence that P. euryhalinus
VIII
represents a potential threat to the environment due to the possible biomagnification of
paralytic toxins throughout the marine food chain.
IX
ÍNDICE
Pág.
Dedicatoria
I
Agradecimientos
III
Resumen
VII
Abstract
VIII
Índice
X
Lista de Tablas
XIII
Lista de Figuras
XIV
1. Introducción
1
1.1 Generalidades
4
1.1.1
Pseudodiaptomus euryhalinus
4
1.1.2
Gymnodinium catenatum
7
2. Antecedentes
8
3. Justificación
12
4. Hipótesis
13
5. Objetivo general
13
5.1 Objetivos Particulares
6. Material y Métodos
6.1.1
Pseudodiaptomus euryhalinus
13
14
14
X
6.1.2
Cultivo de Pseudodiaptomus euryhalinus
15
6.1.3
Gymnodinium catenatum
16
6.1.4
Cultivo de GCCV-6
16
6.1.5
Determinación de la cantidad eq. STX/cél de GCCV-6
17
6.1.6
Prueba de depredación
18
6.1.7
Diseño del bioensayo agudo de P. euryhalinus vs. GCCV-6
19
6.1.8
Bioensayo de ingestión
20
6.2 Daño Oxidativo
21
6.2.1
Peroxidación de lípidos (TBARS)
21
6.2.2
Catalasa
22
6.3 Cromatografía Líquida de Alta Eficacia con detección de fluorescencia
(HPLC-FLD)
23
6.3.1
23
Extracción y análisis de toxinas paralizantes (PSP)
6.4 Análisis Estadísticos
7. Resultados
25
26
7.1 Ingestión de Gymnodinium catenatum por Pseudodiaptomus euryhalinus en
el ensayo agudo
26
7.2 Daño Oxidativo
33
XI
7.2.1
Peroxidación de lípidos
33
7.2.2
Catalasa
34
7.3 Determinación de toxinas paralizantes mediante oxidación pre-columna y
análisis por HPLC-FLD
8. Discusión
34
43
8.1 Ingestión de Gymnodinium catenatum por Pseudodiaptomus euryhalinus 43
8.2 Daño celular (estrés oxidativo)
45
8.3 Detección de toxinas paralizantes mediante HPLC-FLD
47
9. Conclusiones
49
10. Recomendaciones
50
11. Bibliografía
51
XII
Lista de Tablas
Tabla
Título
Página
Tabla I
Clasificación taxonómica de P. euryhalinus
5
Tabla II
Clasificación taxonómica de Gymnodinium catenatum
7
Tabla III
Resumen de cosechas previas de GCCV-6 para conocer promedios
17
de diferentes parámetros del cultivo.
Tabla IV
Ensayo prospectivo de P. euryhalinus vs. G. catenatum
Tabla V
Programación para el análisis de detección de toxinas paralizantes
mediante oxidación pre-columna y HPLC-FLD (Lawrence et al.,
19
25
2004)
Tabla VI
Estimación del porcentaje promedio de células de G. catenatum
28
ingeridas por P. euryhalinus en el
Tabla VII
Estimación del porcentaje promedio de células de G. catenatum
29
ingeridas por P. euryhalinus en el tratamiento B del ensayo agudo
Tabla VIII
Estimación del porcentaje promedio de células de G. catenatum
31
ingeridas por P. euryhalinus en el tratamiento C del ensayo agudo.
Tabla IX
Comparación de toxinas paralizantes ausentes (-) y presentes (*) en
42
los cromatogramas integrados por el HPLC-FLD.
XIII
Lista de Figuras
Figura
Figura 1
Título
Página
Gymnodinium catenatum (Graham, 1943)
3
Distribución del Género Pseudodiaptomus en América (Mapa tomado
4
Figura 2
de Walter, 1989).
Figura 3
Figura 4
Estructura general de Pseudodiaptomus euryhalinus
6
Micrografías de Gymnodinium catenatum con MEB. A) Estructura
8
intracelular mostrando el núcleo (n) y B) mostrando los cloroplastos
(escala= 10 m) (Imágenes tomadas de Blackburn et al., 1989).
Micrografía de Pseudodiaptomus euryhalinus (20X2) (Imagen: R.
15
Figura 5
Flores).
Micrografías de las microalgas Chaetoceros calcitrans (A) e Isochrysis
15
Figura 6
galbana (B) con las que se mantuvieron los cultivos de copépodos
Micrografía de células de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6)
Figura 7
Figura 8
Figura 9
16
Imagen: J. Fuentes-Pascacio.
Placa NUNC y ubicación de pozos en la prueba de depredación
18
Diagrama de flujo del diseño experimental del bioensayo agudo de
21
Pseudodiaptomus
euryhalinus
a
diferentes
concentraciones
de
Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6).
XIV
Tratamiento A: ensayo de exposición aguda de P. euryhalinus con una
28
Figura 10
densidad de 103 cél/mL de G. catenatum.
Tratamiento B: ensayo de exposición aguda de P. euryhalinus con una
29
Figura 11
densidad de 2x103 cél/mL de G. catenatum.
Tratamiento C ensayo de exposición aguda de P. euryhalinus con una
31
Figura 12
densidad de 2x103 cél/mL de G. catenatum + P. euryhalinus.
Consumo promedio de células ingeridas por copépodo en cada día del
32
Figura 13
ensayo agudo y cada tratamiento.
Daño oxidativo de P. euryhalinus en respuesta a los tratamientos con
33
Figura 14
diferentes densidades de microalgas.
Actividad enzimática de P. euryhalinus en respuesta a los tratamientos
34
Figura 15
con diferentes densidades de microalgas.
Cromatograma del extracto de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-
35
Figura 16
6) oxidado con H2O2 [10%].
Cromatograma del extracto de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-
36
Figura 17
6) oxidado con HIO4 [0.03 M].
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de
37
Figura 18
G. catenatum [1x106 cél] (tratamiento A).
Figura 19
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de
38
G. catenatum [2x106 cél] (tratamiento B).
XV
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de
38
Figura 20
G. catenatum [2x106 cél] + C. calcitrans [1.2x108 cél] (tratamiento C).
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos sólo a C.
39
Figura 21
calcitrans [1.2x108 cél] en el tratamiento Control (-) (-).
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de
39
Figura 22
G. catenatum [1x106 cél] (tratamiento A).
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de
40
Figura 23
G. catenatum [2x106 cél] (tratamiento B).
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de
40
Figura 24
G. catenatum [2x106 cél] + C. calcitrans [1.2x108 cél] (tratamiento C).
Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos sólo a C.
41
Figura 25
calcitrans [1.2x108 cél] en el tratamiento control (-) (-) (-).
1.
XVI
Introducción
El mar es una fuente importante de alimento para el ser humano, por lo que diversas ramas
de la ciencia como epidemiología, toxicología, biología marina, etc., centran su atención a
las biotoxinas marinas producidas por microalgas (Pérez-Linares, 2001).
Las proliferaciones microalgales nocivas (PMN) o mareas rojas, como comunmente se les
conoce, son crecimientos masivos de microalgas que generalmente producen una
coloración particular en la superficie marina en forma de parches o manchas (Ochoa et al.,
2003). Entre los organismos que son capaces de formar estos eventos se encuentran
dinoflagelados, diatomeas, cianobacterias, protozoarios y bacterias. Estos organismos por sí
solos o en densidades bajas (104 cél/L) no tienen un impacto negativo, pero al desarrollar
proliferaciones mayores pueden causar daños al ambiente, alterando la dinámica y el
equilibrio del fitoplancton, zooplancton y otros organismos superiores (Alonso et al..,
2005). Recientemente se ha puesto especial atención a las PMN debido a que muchas
especies producen metabolitos secundarios(ficotoxinas), que pueden intervenir en
intoxicaciones humanas y llegan a afectar la salud ambiental, produciendo un impacto
negativo en pesquerías, acuicultura y en el sector turístico (Yasumoto y Murata, 1993;
Anderson, 1994).
Las ficotoxinas son moléculas que contienen grupos funcionales muy diversos y
heterogéneos, teniendo como único común denominador su naturaleza no proteica (Cortes,
1998; Lehane, 2001). Debido a su heterogeneidad, las ficotoxinas se han clasificado en 5
grupos de acuerdo a los síntomas que producen en el humano: intoxicación diarreica o DSP
(por sus siglas en inglés Diarrhetic Shellfish Poisoning); intoxicación amnésica o ASP (por
1
sus siglas en inglés Amnesic Shellfish Poisoning); intoxicación neurotóxica o NSP (por sus
siglas en inglés Neurotoxic Shellfish Poisoning); intoxicación por azaspirácidos o AZP (por
sus siglas en inglés Azaspiracid Poisonig); intoxicación paralizante o PSP (por sus siglas en
inglés Paralythic Shellfish Poisoning) (Hallegraeff et al.., 1995; Lindahl, 1998; FAO,
2004).
La intoxicación en el humano se puede producir por tres vías principales: I) ingestión de
organismos filtradores contaminados con ficotoxinas (e.g. moluscos bivalvos); II)
biomagnificación (por bioacumulación) al ingerir un depredador intoxicado (e.g. peces,
crustáceos, etc.); y III) por el contacto directo con la toxina disuelta en el agua después de
la lisis celular (Pérez-Linares, 2001).
Las proliferaciones de microalgas capaces de producir toxinas pueden cambiar las
comunidades zooplanctónicas en el ambiente marino, en donde la adaptación de éstos
organismos tóxicos en los nichos ecológicos pueden ocasionar disturbios importantes al
ecosistema como la muerte de diversos animales (Cortés, 1998). Como los ocasionados por
Gymnodinium catenatum que se distribuye ampliamente en aguas tropicales y
subtropicales, incluyendo regiones del Pacífico de México. Es una microalga con un
crecimiento óptimo a temperaturas entre 12.5-25°C, halotolerancia de 23-34 PSU y una
irradiancia 50-300 pE.m-2.s- (Blackburn et al., 1989). Su reproducción incluye una
diversidad de patrones tanto en su forma haploide como diploide, y una característica
importante en esta especie es que la deficiencia de nutrientes no permite que disminuya su
supervivencia (Blackburnet et al., 1989). Miden de 31-40 m de largo y 34-42 m de
transdiámetro, tiene la capacidad de formar cadenas muy largas (Fig. 1) (Blackburnet et al.,
1989).
2
G. catenatum está en contacto directo con especies del género Pseudodiaptomus, el cual
incluye copépodos muy abundantes en el zooplancton y por su posición ecológica en el
medio entran en contacto directo con proliferaciones de microalgas (Turner y Tester, 1997).
Pseudodiaptomus euryhalinus es un crustáceo que se alimenta de fitoplancton en las costas
del Pacífico mexicano. Por lo tanto, este copépodo se ha convertido en un depredador muy
eficaz para muchos dinoflagelados, como Gymnodinium catenatum, una de las especies
más importantes por su impacto negativo en el litoral mexicano (Osorio, 1998; Cortés,
1998).
Por lo anterior, el estudio de las especies consumidoras (principalmente las secundarias) es
de gran importancia ya que las exposiciones a ficotoxinas pueden provocar la
bioacumulación de estos compuestos biomagnificándose hacia poblaciones consumidoras
de zooplancton
y afectar su crecimiento, reproducción y supervivencia, llegando a
perturbar los ciclos de una comunidad o hasta todo un ecosistema (Barman y Campbell,
2003; Traas y Leeuwen, 2007).
Figura 1. Micrografía de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6) es un
dinoflagelado capaz de formar cadenas de varias células, generalmente menos de 14, pero se han reportado
cadenas de más de 60 células (Blackburn et al., 1989). Imagen: J. Fuentes-Pascacio.
3
1.1Generalidades
1.1.1 Pseudodiaptomus euryhalinus
Pseudodiaptomus es un género de copépodos calanoideos zooplanctónicos. Se distribuye
ampliamente en mares tropicales y subtropicales del Pacífico Oriental (desde las costas de
California, EEUU hasta Ecuador). En específico, la especie P. euryhalinus se distribuye
desde la Bahía de San Francisco, CA (EEUU) hasta las costas de Baja California Sur,
México (Fig.2) (Walter, 1989). ). Esta especie fue descrita por primera vez por Johnson en
1939 y su clasificación taxonómica se presenta en la Tabla I.
Figura 2. Distribución del Genero Pseudodiaptomus en América (Mapa tomado de Walter, 1989).
4
Tabla I. Clasificación taxonómica de P. euryhalinus
Reino
Animalia
Phylum
Artrópoda
Subphylum
Crustacea
Clase
Maxillopoda
Subclase
Copepoda
Orden
Calanoidea
Género
Pseudodiaptomus
Especie
Pseudodiaptomus euryhalinus
Clasificación obtenida de http://www.itis.gov
Bajo condiciones de laboratorio, P. euryhalinus presenta una distribución diferencial en sus
respectivos estadios: los nauplios tienden a ser pelágicos, mientras que los adultos suelen
ser epibentónicos, por lo que la mayoría tratan de acercarse al fondo, así como sujetarse de
algún sustrato que esté suspendido en la columna de agua o las paredes del área de cultivo
(Osorio, 1998). P. euryhalinus presenta dimorfismo sexual con respecto a la talla de los
individuos, donde las hembras tienen en promedio 1465 m y los machos 805 m; estas
medidas se pueden diferenciar a partir del 8º día de cultivo (Johnson, 1939).
Este copépodo presenta cinco estadios naupliares de vida libre después de la eclosión y la
larva se puede reconocer desde Nauplio II por medio de sus estructuras ya desarrolladas.
Eventualmente desarrolla seis estadios copepodito con dimorfismo sexual en su talla a
partir de Copepodito IV. Sin embargo, no alcanza la madurez sexual hasta el estadio de
Copepodito VI, a partir del cual desarrollan el segmento genital por completo (Johnson,
1939 y 1948).
5
En general los copépodos calanoideos presentan un cuerpo dividido en dos partes
principales: cefalotórax y abdomen; la primera se subdivide en cabeza y tórax, las cuales se
encuentran fusionadas y unidas al abdomen por medio de un punto de flexión por detrás de
el último segmento torácico (Fig. 3). Una característica particular es la primera antena que
es más larga que la segunda y consta de 16 a 28 segmentos (Marshall y Orr, 1972; CamposHernández y Suárez-Morales, 1994).
CB
Cefalotórax
TX
AB
Figura 3. Estructura general de Pseudodiaptomus euryhalinus (CB: cabeza, TX: tórax, AB: abdomen). Imágen
obtenida de http://copepodes.obs-banyuls.fr/en/index.php
6
1.1.2 Gymnodinium catenatum
Gymnodinium catenatum es un dinoflagelado de la clase Gymnodiniales (Tabla II) y en
estado individual tiene forma elipsoidal, con un cingulum bien excavado, ecuatorial,
desplazado y descendente; el sulcus es largo y angosto, ensanchado en su parte posterior y
se prolonga en la epiteca hasta el ápice, donde termina en una bifurcación que delimita una
pequeña protuberancia que sirve de unión con el individuo que le precede. La epiteca es
truncada, redondeada o cónica. Las células miden de 31-40 m de largo y 34-42 m de
transdiámetro (Cortés, 1998). Tiene un núcleo elipsoidal y ecuatorial, y numerosos
cloroplastos de color verde oliva (Fig. 4).
Tabla II. Clasificación taxonómica de Gymnodinium catenatum
Reino
Protozoa
Phylum
Dinophyceae
Clase
Gymnodiniales
Orden
Gymnodiniaceae
Género
Gymnodinium
Especie
Gymnodinium catenatum
Clasificación obtenida de http://www.algaebase.org
Este organismo es capaz de producir toxinas paralizantes (PSP) y fue descrito por Graham
en 1943. Su distribución es mundial y en México se le ha descrito desde el Golfo de
California hasta las costas de Oaxaca y Chiapas (Cortés, 1998). Se estima que para que este
organismo pueda causar daños importantes su densidad debe alcanzar entre 1,800 y 6.6x106
cél/L. Una de las toxinas que puede producir G. catenatum es la saxitoxina, la cual se
considera entre las más peligrosas por su toxicidad (80g/100g, limite máximo permisible
7
en moluscos para consumo humano), ya que puede acumularse en tejidos comestibles de
moluscos bivalvos, crustáceos y peces que llegan a consumir directa o indirectamente a este
dinoflagelado (Lehane, 2000; Band-Schmidt et al., 2003; FAO, 2004; Pérez-Linares et al.,
2009).
B
A
Figura 4. Micrografías de Gymnodinium catenatum con MEB. A) Estructura intracelular mostrando el núcleo
(n) y B) mostrando los cloroplastos (escala= 10 m) (Imágenes tomadas de Blackburn et al., 1989).
2. Antecedentes
El efecto de toxinas las paralizantes y su acumulación en organismos marinos se ha
estudiado en muchos casos durante eventos nocivos, causando daños severos en peces,
moluscos, crustáceos, e incluso en el humano, en éste último debido generalmente al
consumo de productos contaminados (Yasumoto y Murata, 1993; Lehane, 2000; PérezLinares et al., 2008; Pérez-Linares et al., 2009).
Los vectores o centinelas por excelencia para la detección de toxinas paralizantes son los
moluscos bivalvos (Lehane, 2000, Band et al., 2003). Sin embargo, recientemente se han
descrito vectores poco convencionales también capaces de acumular toxinas paralizantes
como pulpos, camarones, cangrejos y peces (Montoya et al., 1996; Negri y Llewellyn,
1998; Halstead, 2002; Pérez-Linares et al., 2008 y 2009). La saxitoxina se aisló por primera
8
vez de extracto obtenido intraperitonealmente de la almeja Saxidomus giganteus, los cuales
fueron analizados por medio de ensayo en ratón, obteniéndose 10 mg de STX/Kg (Harada,
et al., 1983).
Durante la década de los 80, Bricelj y colaboradores (1990) estudiaron el comportamiento
del mejillón Mytilus edulis en Alaska durante una proliferación de Alexandrium fundyense.
Estos autores reportaron que las toxinas paralizantes no tenían efecto en el mejillón, el cual
continuaba filtrando y consumiendo dinoflagelados, acumulando las toxinas en sus
vísceras, excediendo los 80 g eq. de STX/100 g en menos de una hora.
El Pacífico mexicano no ha sido excepción en la presencia de saxitoxina en moluscos; por
ejemplo, en la almeja Catarina (Argopecten ventricosus) se reportó una acumulación de 63
g eq.STX/100 g del metabolito tóxico, vinculado a la proliferación microalgal producida
por Gymnodinium catenatum en Bahía Concepción (Band-Schmidt et al., 2003). En el 2004
Gárate y colaboradores realizaron una comparación de perfiles tóxicos de dos bivalvos de
la Bahía de Mazatlán y Bahía Concepción, los cuales
estuvieron en contacto con
Gymnodinium catenatum, presentando las concentraciones más altas en Bahía Concepción
(298 g eq.STX/100g), mientras que en la Bahía de Mazatlán no superaron los 39.40 g
eq.STX/100 g.
Además de bivalvos, también se ha reportado acumulación de toxinas paralizantes en otros
moluscos. En 1984 Halstead y Schantz encontraron concentraciones de 4000 µg de PSP/kg
en gasterópodos (Thais lapillus, Lunatia heros, Turbo spp., Tectus spp., Lambis lambis,
Buccinum undatum, Neptunea decemcostata y Colus stimpsoni) después de haberse
alimentado con Jania sp. la cual presenta perfiles de PSP (Lehane, 2000).
9
Existen otros vectores de toxinas paralizantes además de los moluscos. Se ha reportado que
algunas especies de crustáceos son capaces de acumular dichas toxinas. Oshima y
colaboradores en 1984 obtuvieron perfiles de PSP en 10 especies de cangrejos obteniendo
en sus resultados la presencia de neosaxitoxina y saxitoxina en sus tejidos. En los
crustáceos el hepatopáncreas se considera un órgano blanco de toxinas paralizantes, debido
a que se han reportado varios casos de acumulación, de PSP. Arnott en 1998 estudió las
vísceras langostas en Australia encontrando que los perfiles PSP (180 g eq.STX/100g)
sobrepasaban los límites permisibles y sugiriendo que la obtención de las toxinas se llevó a
cabo a través de la cadena trófica.
Pérez-Linares y colaboradores (2008 y 2009) mediante un diseño experimental con
camarones de cultivo (Litopeneus vannamei) alimentados con G. catenatum y Karenia
brevis,
demostraron que éstos crustáceos con alto valor comercial, son capaces de
acumular toxinas PSP y NSP en el hepatopáncreas y músculo después de estar expuestos 45
días a los dinoflagelados aún en densidades bajas pero en exposiciones crónicas.
Aunque existen muchos reportes sobre la acumulación de ficotoxinas en moluscos y otros
animales, los trabajos realizados con el zooplancton son muy reducidos, a pesar de la
importancia que tienen debido a que son los primeros organismos que interactúan con las
PMN y quienes comienzan la probable bioacumulación de toxinas, así como su transporte a
través de la red trófica entre organismos pelágicos y bentónicos (Turner, 2006).
Existen varias especies de copépodos que se alimentan de fitoplancton tóxico y
recientemente se han realizado estudios sobre el efecto adverso inducido por ingerirlos.
10
Uye y Takamatsu en 1990 examinaron la ingestión, mortalidad y tasa de producción de
huevos en Pseudodiaptomus marinus y Acartia omorii al retarlos con 15 especies que
producían PMN en las costas de Japón, concluyendo que no hubo ningún daño sobre estos
organismos. Sin embargo, reportaron un comportamiento alimenticio diferente,
regurgitando las células ingeridas después de unos minutos transcurridos.
Frangópulos y colaboradores en el 2000 desarrollaron un experimento alimentando al
copépodo Acartia clausi con Alexandrum minutum registrando los parámetros de tasa de
ingestión, producción de huevos, sucesos de eclosión y la salud naupliar. Los autores
reportaron una baja eclosión y desarrollo naupliar atribuido a la acumulación de toxinas
paralizantes en los tejidos y huevos ya que se detectaron altas concentraciones de GTX-1-4
(Frangópulos et al., 2000). Por otro lado, la siguiente generación de nauplios alimentados
con las microalgas no tóxicas, rechazaron la interacción con el estadio copepodito que
fueron eclosionados de copépodos alimentados con dinoflagelados tóxicos, los autores
concluyen que posiblemente la interacción con la toxina este afectó o inhibió el estado
nutricional de las nuevas eclosiones (Frangópulos et al., 2000). Kozlowsky y colaboradores
en el 2009 mencionan que específicamente las toxinas tienden a afectar el estado
nutricional de los copépodos y sugieren que el bajo nivel nutricional de las microalgas
provoque un déficit en cuanto a moléculas fundamentales para el desarrollo de los
organismos, por lo tanto desarrollaron un bioensayo con las especies de Acartia tonsa y
Temora longicornis, induciéndolos a consumir Alexandrium minutum y Alexamdrium
tamarense, incluyendo la detección de daño en los tejido por medio de ensayo enzimático
de glutatión transferasa. Sin embargo, los resultados no fueron los esperados ya que los
tratamientos con el control no produjeron evidencia significativa, por lo cual concluyen que
11
tal vez ésta enzima no juegue un rol importante en la desintoxicación de copépodos
expuestos a fitoplancton tóxico (Kozlowsky et al., 2009).
3. Justificación
En diversas partes del mundo se han publicado trabajos acerca del efecto que producen las
ficotoxinas en la dinámica de los consumidores primarios (omnívoros zooplanctónicos) y
los demás niveles tróficos (moluscos, crustáceos, peces, aves y mamíferos) (Teegarden,
1999). La forma en la que se contaminan se puede llevar a cabo por diferentes procesos
como ingestión directa, bioacumulación en tejidos en organismos depredados, la absorción
y adsorción directa al encontrarse disuelta la toxina en el agua, incluso por la defecación de
muchos organismos que logran eliminar los productos nocivos por sus procesos naturales
(Frangópulos et al., 2000; Lehtiniemi, 2002).
Debido al impacto negativo de las ficotoxinas sobre el ambiente y la salud pública a nivel
internacional y en específico aquellas que involucran toxinas paralizantes (Barman y
Campbell, 2003; Hamasaki et. al, 2003), se ha puesto especial interés a las rutas de
transferencia de las toxinas a través de la red trófica y los posibles efectos que producen en
un nivel clave en el proceso alimenticio, como es el zooplancton (Turner y Tester 1997).
En México existen pocos trabajos relacionados con la transferencia de ficotoxinas en varios
niveles tróficos y los daños causados en organismos planctónicos por toxinas paralizantes.
Aunado a lo anterior, los reportes publicados sobre problemas específicos de toxinas
paralizantes en el litoral mexicano, no cuentan con suficiente información para aclarar el
proceso y efecto de estas biotoxinas en organismos zooplanctónicos como Acartia clausi y
12
Pseudodiaptomus euryhalinus, que son especies importantes por su abundancia y
principales consumidores del fitoplancton en el Pacífico mexicano (Palomares et al. 2006).
4. Hipótesis
El copépodo calanoideo Pseudodiaptomus euryhalinus es capaz de acumular toxinas
paralizantes en sus tejidos y no presenta daño celular después de ingerir células del
dinoflagelados tóxico Gymnodinium catenatum.
5. Objetivo general
Corroborar que no existe acumulación de toxinas paralizantes y evidenciar daño celular
debido a la interacción de ficotoxinas con los tejidos de P. euryhalinus después de
alimentarlo con el dinoflagelado tóxico G. catenatum
5.1 Objetivos Particulares

Establecer cultivos de Pseudodiaptomus euryhalinus bajo condiciones de
laboratorio.

Cultivar y mantener la cepa GCCV-6 de Gymnodinium catenatum bajo
condiciones de laboratorio para la obtención de biomasa.

Diseñar un bioensayo para corroborar la depredación de P. euryhalinus sobre G.
catenatum.
13

Registrar la densidad celular promedio de G. catenatum ingerida por cada
copépodo.

Obtener la toxicidad de GCC-6 por bioensayo en ratón (g eq. STX/cél).

Obtener la densidad celular mínima de GCCV-6 que necesita consumir cada
copépodo para la detección de toxinas PSP de acuerdo al Límite de Detección
del método de Lawrence et al., 2004.

Diseñar un bioensayo agudo de exposición/alimentación de P. euryhalinus con
GCCV-6 para conocer sus efectos.

Analizar extractos de P. euryhalinus para determinar si existe daño celular por
la ingestión de G. catenatum, midiendo la actividad enzimática de catalasa y
lipoperoxidación.

Analizar los extractos de P. euryhalinus mediante HPLC-FLD para confirmar la
presencia/ausencia de toxinas paralizantes después del bioensayo con G.
catenatum.
6. Material y Métodos
6.1 Pseudodiaptomus euryhalinus
Los copépodos (Fig. 5) fueron donados por el Dr. J. C. Pérez-Urbiola (Sala Húmeda de
Bioensayos, CIBNOR) y fueron colectados en enero de 2006 de los estanques
supralitorales del CIBNOR, con la técnica de arrastre utilizando una malla de plancton
de 150 m.
14
Figura 5. Micrografía de Pseudodiaptomus euryhalinus (20X2) (Imagen: R. Flores).
6.1.2 Cultivo de Pseud|odiaptomus euryhalinus
Los organismos muestreados se mantuvieron durante 15 días en 2 tanques cilíndricos (88
L) de fibra de vidrio y con fondo plano. Para mantenerlos en condiciones óptimas, se
hicieron recambios diarios de agua mediante sifoneo para eliminar desechos. Se empleó
agua de mar (35±2psu), filtrada (5 m) y con aireación constante en cada tanque (Flores,
2008)
La alimentación de los copépodos fue proporcionada por el laboratorio de Microalgas del
CIBNOR, suministrando a cada tanque una mezcla de las microalgas Chaetoceros
calcitrans e Isochrysis galbana a una densidad aproximada de 3.4x108 cél/L (Fig. 6). Los
copépodos fueron alimentados cada 24 horas con la mezcla de microalgas, las raciones con
las que se alimentaban a los crustáceos iban en aumento con forme iban cambiando de
estadio y a la biomasa orgánica en cada tanque (Flores, 2008).
A
B
Figura 6. A Micrografías de las microalgas Chaetoceros calcitrans (A)(imagen: M. Hoppenrath) e
Isochrysis galbana (B) (Imagen: F. Jouenne), con las que se mantuvieron los cultivos de copépodos.
Después de 15 días de cultivo los organismos fueron divididos en dos tanques aforados a
500 L, manteniendo las condiciones anteriormente mencionadas.
15
6.1.3 Gymnodinium catenatum
La cepa GCCV-6 (Fig. 7) fue adquirida comercialmente de la CODIMAR, CIBNOR, la
cual fue aislada de la parte central del Golfo de California, se extrajo de una proliferación
microalgal nociva presente en Bahía Concepción, afectando a una gran cantidad de
invertebrados marinos.
(http://www.cibnor.gob.mx/eplant1.php?pagID=colecciones/codimar/codimar).
Figura 7. Micrografía de células de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6) Imagen: J. Fuentes-Pascacio.
6.1.4 Cultivo de GCCV-6
La cepa GCCV-6 se cultivó en el cepario del CIBNOR, utilizando medio f/2+Se (Guillard y
Ryther, 1962; Guillard, 1975). Para prepararlo se empleó agua de mar filtrada (0.45m) con
33 PSU y esterilizada en autoclave (121°C, 15lb, 20’). Los cultivos se mantuvieron en
cámaras con lámparas de luz blanca (150 mol m-2 sec-1), con ciclos de luz y oscuridad
(12:12 h) y a una temperatura de 26 ± 1 °C.
La densidad celular se determinó sustrayendo 1mL del cultivo previamente homogenizado,
agregando una gota de Lugol (5% I2 + 10% KI) y cuantificando con la ayuda de una cámara
Sedwick-Rafter y un microscopio compuesto.
16
Los cultivos se dividieron en lotes destinados para la alimentación de los copépodos para
los bioensayos y para la extracción de toxinas (obtención del perfil de toxinas de GCCV-6).
Todos los lotes fueron escalados al alcanzar su fase logarítmica (~20 días posteriores a su
inoculación según Band-Schmidt et al., 2005) para disponer de células vivas y suficiente
biomasa durante los experimentos.
Para cosechar los cultivos primero se homogenizaron varios lotes, midiendo su volúmen
total, se tomaron 3 alícuotas (1 mL c/u) para conocer la densidad celular y el resto se
centrifugó (6,200xg, 15’, 4°C). El sobrenadante se desechó y la biomasa sedimentada se
utilizó para extracción de toxinas paralizantes (PSP) utilizando el método recomendado por
la AOAC.
6.1.5 Determinación de toxicidad por célula de GCCV-6
Estudios previos con GCCV-6 han demostrado que produce en promedio 6.06 g eq
STX/mL y 58.8 pg eq STX/cél. También se ha reportado que dentro del perfil de toxinas
incluye STX, dcSTX, GTX2, 3, NEO y GTX1, 4 (Pérez-Linares, 2008; Pérez-Linares et al.,
2008 y 2009).
Para estimar la concentración de toxina paralizante por célula fue necesario realizar los
cálculos en los lotes previamente cultivados. En la Tabla III se resumen los resultados.
Tabla III. Resumen de volúmenes de extractos y densidad celular promedio de cosechas
previas de GCCV-6.
Volumen de
cultivo (L)
Volumen de extracto
(mL) en HCl [0.1 N]
Densidad celular
promedio (cél/mL)
5
390
6750
5
410
9940
7
500
5980
17
6.1.6 Prueba de depredación
El primer ensayo prospectivo se realizó en una placa NUNC de 24 pozos (Fig. 8),
agregando en 12 pozos agua de mar filtrada (0.45m) y una densidad celular de 103 cél. de
GCCV-6 en cada uno. Posteriormente se colocaron 20 copépodos en cada pozo. Su
comportamiento se observó bajo un microscopio estereoscópico para corroborar la
depredación del copépodo sobre el dinoflagelado.
.
Figura 8. Placa NUNC y ubicación de pozos en la prueba de depredación
El segundo ensayo prospectivo se realizó con cinco recipientes (por triplicado) conteniendo
agua de mar con las mismas condiciones que las anteriores, copépodos y diferentes
densidades celulares de G. catenatum y Chaetoceros calcitrans. La Tabla IV resume los
parámetros empleados en del ensayo. Este bioensayo tuvo como objetivo estudiar el
comportamiento alimenticio de los copépodos al estar expuestos a G. catenatum, a una
mezcla de G. catenatum y C. calcitrans y estimar la mortandad de G. catenatum y P.
18
euryhalinus juntos y separados. La Tabla IV muestra el resumen de las características
desarrolladas en el ensayo.
Tabla IV. Ensayo prospectivo de P. euryhalinus vs. G. catenatum
No. de Lote
P. euryhalinus
G. catenatum
C. calcitrans
1
90
1x104 cél
-
2
90
5x104 cél
-
3
90
1x104 cél
6.7x106 cél
4
90
-
6.7x106 cél
5
0
5x104 cél
-
6.1.7 Diseño del bioensayos agudo de P. euryhalinus vs. GCCV-6
Para el bioensayos agudo se utilizaron adultos de P. euryhalinus con un promedio de 1x104
organismos por lote. Los copépodos se agruparon en 18 matraces de 2 L (utilizando la ½ de
su capacidad) a una densidad de 10 copépodos/mL. Los organismos se mantuvieron en
ayuno por 5 h.
Los lotes experimentales se mantuvieron con un sistema de aireación mediante dos bombas
y a una temperatura de 26 ±1°C (clima artificial automatizado), en agua de mar filtrada y
con 35 UPS.
Al inicio del ensayo los copépodos se alimentaron con diferentes densidades celulares de
GCCV-6: 1x103 cél /mL, 2x103 cél/mL y una combinación de GCCV-6 (2x103 cél/mL) y
1.2x108 células de Chaetoceros calcitrans. Lo anterior se realizó con el objeto de producir
una exposición directa, simulando una proliferación microalgal, la cual se considera desde
densidades >1800 cél/L (Lehane, 2000; Band-Schmidt et al., 2003). Además se
19
consideraron lotes control con la misma densidad celular de copépodos, bajo las mismas
condiciones, pero alimentándolos con de C. calcitrans (1.2 x108 cél) sin la presencia de
GCCV-6. El lote control de GCCV-6 se estableció en las mismas condiciones que los
anteriores pero sin depredadores, para conocer el porcentaje de mortalidad de las células
bajo estas condiciones y poder estimar la cantidad real consumida por los copépodos.
Todos los lotes se realizaron por triplicado y con una sola dosis diaria de dinoflagelados
durante tres días. A lo largo del experimento se registró el comportamiento y los daños
aparentes en los copépodos.
Una vez finalizado el bioensayo, los organismos se sacrificaron y se mantuvieron a -20°C
hasta su procesamiento para los análisis químicos. La figura 9 representa el diagrama de
flujo del ensayo agudo
6.1.8 Bioensayo de ingestión
Para poder estimar la cantidad de células de GCC-6 y C. calcitrans ingeridas por los
copépodos, durante el bioensayo se realizaron conteos celulares periódicos. Se tomó 1 mL
de agua la columna de cada uno de los matraces 5 horas después de agregar las dosis de G.
catenatum, posteriormente se tomaron muestras cada hora por 5 h y todas se fijaron con
lugol [10%]. Los controles fueron procesados de la misma forma para estimar el porcentaje
de mortalidad de las microalgas por separado.
20
Figura 9. Diagrama de flujo del diseño experimental del bioensayo agudo de Pseudodiaptomus euryhalinus a
diferentes densidades celulares de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6).
6.2 Daño Oxidativo
6.2.1 Peroxidación de lípidos (TBARS)
Para conocer el grado de daño celular que presentaron los organismos al estar expuestos a
las microalgas tóxicas se empleó la prueba de peroxidación de lípidos, la cual se estimó
cuantificando el contenido de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico presente en el
tejido de los copépodos (Okhawa et al., 1979; Persky et al. 2000). Se homogenizaron
100mg de tejido en 2 mL de solución salina fría (450 mM NaCl, 10 mM KCl, 1 mM
PMSF) y se centrifugaron (2000xg, 10’, 4°C). Se tomaron 250L del sobrenadante y se
colocaron en tubos de 1.5 mL para posteriormente incubarse por 15’ en un baño de agua
21
con agitación constante a 37°C. Transcurrido el tiempo de incubación las muestras se
colocan en un baño de agua fría (4°C) y se les adicionaron 250 L de ácido tricloroacético
(TCA) al 12.5% en HCl y 500 L de ácido tiobarbitúrico (TBA) al 1%. Los tubos fueron
puestos nuevamente a incubar en un baño de agua durante 10’ y centrifugados nuevamente
bajo las condiciones antes mencionadas. El sobrenadante fue traspasado a celdas de cuarzo
(1 mL) para poder cuantificar en un espectrofotómetro a una = 532nm. Los resultados se
calcularon a partir de una curva estándar de malondialdehido bis-(dietilacetal) y se
expresaron en nanomoles de TBARS/g de tejido húmedo.
6.2.2 Catalasa
Además de la prueba de peroxidación de lípidos, se realizaron ensayos para medir la
actividad enzimática de la catalasa y estimar la pérdida de H2O2 en los tejidos de los
organismos y estimar el estrés oxidativo manifestado por los organismos expuestos a G.
catenatum. Para esto se mezcló la solución de trabajo (PBS 100mM, H2O2 10mM) y 10 L
de muestra (homogenizado de copépodos) en una celda de cuarzo (1 mL) y se cuantificó la
absorbancia con un espectrofotómetro a una = 240 nm. La actividad enzimática se expresó
en unidades de catalasa por mg de proteína. Una unidad de catalasa se define como la
cantidad de enzima necesaria para reducir 1 mol de H2O2 por minuto (Aebi, 1984).
22
6.3 Cromatografía Líquida de Alta Eficacia con detección de fluorescencia (HPLCFLD)
6.3.1 Extracción y análisis de toxinas paralizantes (PSP)
El análisis de toxinas paralizantes (PSP) se llevó a cabo utilizando el método oficial
propuesto por la AOAC (AOAC, 1997; Lawrence et al., 2004). Brevemente, se causó lisis
celular de los tejidos de copépodos mediante congelamiento y descongelamiento y por
medio de un homogenizador o polytrón. Se tomaron 1.5g de muestra, se agregó 1 mL de
HCl [0.1N] para obtener un mejor homogenizado y comenzar la extracción de toxinas
paralizantes. Posteriormente las muestras se calentaron hasta ebullición y de mantuvieron
por 5 min retirando inmediatamente después. Al enfriarse las muestras se aforaron
nuevamente a 1 mL con HCl [0.1N] para recuperar el volumen inicial y se filtraron con un
filtro Whatman© No. 1 y dos veces con membranas de nitrocelulosa (0.45m) hasta obtener
un extracto claro y desechar remanentes de células. Todo este proceso se realizó en una
campana de flujo laminar, con ayuda de una bomba de vacío y una unidad de filtración de
250 mL. Como medida de seguridad todos los materiales utilizados y los desechos
obtenidos del cultivo/cosecha de GCCV-6 y extracción de PSP fueron tratados con NaOH
[0.2 N] por 15 min para matar células vivas y destruir trazas de toxinas antes de vertirse al
drenaje (Wannemacher, 1989; Jeong et al., 2002).
Para detectar los componentes tóxicos de los extractos por medio de HPLC-FLD, fue
necesario oxidarlos en purinas antes de inyectarse, como señala el protocolo propuesto por
Lawrence et al. (2004). Todas las muestras antes de oxidarlas se purificaron con cartuchos
de extracción en fase sólida (SPE-C18 SUPELCO®, VisiprepTM), utilizando una cámara de
23
vacío (Supelco, Visiprep) para eliminar posibles compuestos con fluorescencia natural.
Posteriormente las muestras se oxidaron con H2O2 [10%] provocando una oxidación
alcalina en las toxinas paralizantes y originando compuestos fluorescentes (detección de
toxinas H-hidroxiladas). Para el caso de toxinas N-hidroxiladas (GTX 1,4, Neo, B2, C3, 4)
la reacción se realizó utilizando ácido periódico [HIO4] en medio alcalino.
Para corroborar las toxinas paralizantes presentes en el extracto de GCCV-6y en los tejidos
de los copépodos se utilizaron estándares certificados (National Reserch Council, Halifax,
Canadá) que fueron proporcionados por el Laboratorio de Química Analítica y Alimentaria
de la Universidad de Vigo, donde se llevaron a cabo los análisis cromatográficos. El equipo
utilizado y las características del protocolo fueron las siguientes: Sistema HPLC-FLD con
bomba cuaternaria (Agilent modelo 1200 Series), equipado con el programa Chemstation
para el análisis e integración de datos. El detector de florescencia se programó a una λ=330
nm de excitación y una λ=390 nm de emisión. Para la separación de los analitos se empleó
una columna C18 (5 m, 4.6x250 mm, Phenomenex Luna) y una elución en gradiente con
un flujo de 1.5 mL/min de las siguientes fases móviles A: formiato de amonio [0.1] en agua
MilliQ y B: formiato de amonio [0.1M] en 4% de acetonitrilo acuoso, ambas con un pH
6.0. En la Tabla V se resume el programa utilizado para el análisis de PSP mediante HPLCFLD.
24
Tabla V. Programación para el análisis de detección de toxinas paralizantes mediante
oxidación pre-columna y HPLC-FLD (Lawrence et al., 2004)
Minutos
Fase A
Fase B
0-6
100-95%
0-5%
6-10
95-30%
5-70%
10-14
30-100%
70-0%
14-18
100%
0%
6.4 Análisis Estadísticos
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar. Con los datos se realizaron
los estadísticos descriptivos y las pruebas de normalidad correspondientes (KolmogorovSmirnov & Lilliefors) y de homocedasticidad (Cochran, Hartley, Batlett). Para detectar
diferencias significativas entre las horas de muestreo por cada día de cada tratamiento,
utilizando una ANOVA de una vía; también se realizo una ANOVA de una vía para
mostrar diferencias significativas entre tratamientos A, B y C vs control (- -) en las pruebas
de ensayo enzimático y daño oxidativo. Para todos los casos se consideró el 95% como
nivel de confianza y α<0.05 como tendencia no significativa. Todos los análisis estadísticos
se llevaron a cabo usando el paquete Statistica© 7.0 (StatSoft, Inc. 1984-2004).
25
7
Resultados
7.1 Ingestión de G. catenatum por P. euryhalinus: ensayo agudo
Se observó diferencia significativa (p<0.05) en la ingesta promedio de dinoflagelados por
Pseudodiaptomus euryhalinus, consumiendo entre el 40% y el 50% del total de
Gymnodinium catenatum después de transcurridas 5 horas (ver Tablas VI, VII y VIII),
después de exponerlos a densidades de 1X106 células (tratamiento A: Figuras 10, 11 y 12),
2X106 células (tratamiento B: Figuras 13, 14 y 15) y 2X106 células mezcladas con
Chaetoceros calcitrans (tratamiento C: Figuras 16, 17 y 18). Este comportamiento siguió el
mismo patrón en los tres días del experimento. Después de la tercer hora de haber realizado
el primer conteo en los tratamientos A, B y C (6 y 7 horas después de haberle agregado G.
catenatum), se presenta una disminución drástica entre <8% a 0% de pastoreo por parte de
P. euryhalinus durante los tres días de experimento. Lo anterior coincidió con el nivel de
flotabilidad del copépodo, pues la mayoría comenzaron a mostrar signos de aletargamiento,
sedimentándose en el fondo del matraz. Este comportamiento fue contrastante con las
primeras horas después de agregar los dinoflagelados, ya que todos los crustáceos se
observaron en la parte superior de la columna de agua desplegando gran actividad
depredatoria.
Después de haber transcurrido 4 horas, la tasa de ingestión se incrementó, observándose
entre <70% a 3% de células promedio ingeridas por los copépodos. Asimismo, el
comportamiento de los organismos también se modificó, presentándo intensa actividad en
la columna de agua. Finalmente, posterior a las 5 horas, el consumo de células en los tres
tratamiento fue diferente entre ellos (desde <18% hasta un 0% de células promedio
26
consumidas), registrándose nuevamente una disminución en la dinámica de P. euryhalinus
dentro de los acuarios.
a)
b)
27
c)
Figura 10. Tratamiento A: ensayo de exposición aguda de P. euryhalinus con una densidad de 103 cél/mL de
G. catenatum. a) Primer día del ensayo; b) Segundo día de exposición; c) Tercer día de exposición. Se
observa que el segundo día los copépodos tuvieron la mayor actividad de pastoreo sobre los dinoflagelados.
Tabla VI. Estimación del porcentaje promedio de células de G. catenatum ingeridas por P. euryhalinus en el
tratamiento A del ensayo agudo.
Horas de muestreo 
1er. Día
2do. Día
3er. Día
1
2 3 4
442 5 3 24
710 7 20 14
369 24 8 4
5
19
0
83
Datos en rojo: diferencia significativa (p<0.05) entre las 5 horas de muestreo
Segundo Tratamiento
a)
28
b)
c)
Figura 11. Tratamiento B: ensayo de exposición aguda de P. euryhalinus con una densidad de 2x103 cél/mL
de G. catenatum. a) Primer día del ensayo; b) Segundo día de exposición; c) Tercer día de exposición. Se
observa la misma ingestión despues de la primera hora de agregar a los dinoflagelados, pero el segundo dia
hubo mucho mayor consumo que el primer y tercer día.
Tabla VII. Estimación del porcentaje promedio de células de G. catenatum ingeridas por P. euryhalinus en el
tratamiento B del ensayo agudo.
Horas de muestreo 
1
2
3
4
5
717 127
1er. Día
3 38 45
1638
2do. Dia
9 13 29 27
1127
3er. Día
38 33 23 35
Datos en rojo: diferencia significativa (p<0.05) entre las 5 horas de muestreo
29
Tercer tratamiento
a)
b)
30
c)
Figura 12. Tratamiento C ensayo de exposición aguda de P. euryhalinus con una densidad de 2x103 cél/mL de
G. catenatum + P. euryhalinus. a) Primer día del ensayo; b) Segundo día de exposición; c) Tercer día de
exposición. Se observa la misma ingestión despues de la primera hora de agregar a los dinoflagelados, pero el
segundo dia hubo mucho mayor consumo que el primer y tercer día.
Tabla VIII. Estimación del porcentaje promedio de células de G. catenatum ingeridas por P. euryhalinus en el
tratamiento C del ensayo agudo.
Horas de muestreo 
1
2
3
4
5
787
1er. Día
0
3
15 61
1512
2do. Dia
0
25 29
5
1394 15 35
3er. Día
9
67
Datos en rojo: diferencia significativa (p<0.05) entre las 5 horas de muestreo
Se comparó el porcentaje promedio de células de microalgas que ingirieron los copépodos
entre los tratamientos y durante cada día del ensayo agudo (Fig. 13). Se observó que no
hubo diferencia significativa (p>0.05) en el consumo de dinoflagelados entre los tres días
dentro de cada tratamiento. Sin embargo, al comparar los resultados entre los diferentes
lotes se observó en diferencia significativa (p<0.05) en los tratamientos B y C con respecto
al tratamiento A, donde su tasa de alimentación es mayor.
31
Figura 13. Consumo promedio de células ingeridas por copépdodo en cada día del ensayo agudo y cada
tratamiento.. A = 1x103 cél /mL de G. catenatum, B =2x103 cél /mL de G. catenatum, C = 2x103 cél /mL de
G. catenatum + Chaetoceros calcitrans. Encontrando diferencia significativa (p<0.05) entre B y C, con
respecto a A, pero comparando los 3 días dentro de cada tratamiento no hubo tal diferencia.
32
7.2 Daño Oxidativo
7.2.1 Peroxidación de lípidos
Después de analizar los datos obtenidos en el ensayo de la peroxidación de lípidos con la
prueba ANOVA (de dos vías y 95% de confianza) se observó que no hay diferencia
significativa (p<0.05) entre los grupos control y los expuestos a G. catenatum. Estos
resultados son consistentes con los obtenidos en el ensayo de la actividad de la catalasa,
sugiriendo que no hay daño o alteración los procesos enzimáticos en los tejidos de P.
euryhalinus expuestos a los dinoflagelados tóxicos. En la Figura 14 se puede observar que
el grupo que contenía al copépodo alimentado sólo con Chaetoceros calcitrans (tratamiento
D) no se observó la producción de metabolitos secundarios tóxicos, y por consiguiente no
hubo diferencia en su actividad TBARS con respecto a los expuestos a G. catenatum.
TBARS (nmol/g de tejido humedo)
Ensay o tisular para identif car la peroxidación de lípidos
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
a
b
c
d
Mean
Mean±SD
Outliers
Extremes
Tratamiento
Figura 14. Daño oxidativo de P. euryhalinus en respuesta a los tratamientos con diferentes densidades de
microalgas. Los valores se presentan como promedio ± desviación estándar. A = 1x10 3 cél /mL de G.
catenatum, B =2x103 cél /mL de G. catenatum, C = 2x103 cél /mL de G. catenatum + Chaetoceros calcitrans,
D = C. calcitrans
33
7.2.2 Catalasa
Los resultados obtenidos en el ensayo de la actividad enzimática de la catalasa en tejidos de
copépodos expuestos a dinoflagelados tóxicos se analizaron con la prueba ANOVA (de dos
vías y 95% de confianza), observándose que no hubo diferencias significativas
comparándolos con los controles, ni entre los tratamientos. Lo anterior nos lleva a la
conclusión de que los copépodos no presentan alteraciones en la actividad de la catalasa al
estar expuestos al dinoflagelado tóxico Gymnodinium catenatum y por consiguiente se
puede inferir que no existe estrés oxidativo bajo estas condiciones.
Analisis tisular para la catalasa
260
240
220
200
180
160
140
120
CAT (U/mg de proteína)
100
80
60
a
b
c
d
Mean
Mean±SD
Outliers
Extremes
Tratamientos
Figura 15. Actividad enzimática de P. euryhalinus en respuesta a los tratamientos con diferentes densidades
de microalgas. Los valores se presentan como promedio ± desviación estándar. A = 1x103 cél /mL de G.
catenatum, B =2x103 cél /mL de G. catenatum, C = 2x103 cél /mL de G. catenatum + Chaetoceros calcitrans,
D = C. calcitrans
7.3 Determinación de toxinas paralizantes mediante oxidación pre-columna y
análisis por HPLC-FLD
Se pudo observar que las muestras (extractos de GCCV-6 y tejidos de copépodos)
contenían compuestos con fluorescencia natural al inyectarlas antes de purificarlas con los
cartuchos SPE-C18 y previos a la oxidación. Esto es importante porque varios de éstos
34
compuestos presentan los mismos tiempos de retención que algunas de las toxinas
paralizantes, traslapando las señales. Lo anterior puede llevar a una sobreestimación de los
resultados. Por esta razón, el paso de ―clean-up‖ fue decisivo para la obtención de
resultados fiables.
Al oxidar el extracto de GCCV-6 con H2O2 se pudo determinar que la cepa produce dcSTX,
GTX2, 3 y STX (Fig. 16); y con la oxidación con ácido periódico (HIO4) se identificaron
las toxinas NEO y GTX 1,4 (Fig. 17). Estos resultados son consistentes con trabajos
realizados previamente con esta cepa y utilizando el mismo método (Pérez-Linares, 2008;
Pérez Linares et al., 2008 y 2009). Para corroborar el perfil de toxinas que produce GCCV6 se utilizaron mezclas de patrones certificados (NRC, Halifax, Canadá) proporcionados
por el Laboratorio de Química Analítica y Alimentaria de la Universidad de Vigo (España).
FLD1 A, Ex=330, Em=390(PSP_MX2\09031300.D)
LU
FLD1 A, Ex=330, Em=390(PSP_MX2\09031301.D)
dcSTX
9.726
GTX 2, 3
11.457
STX
14.325
30
9.760
25
20
B1
11.415 13.142
15
*
10
10.415
5
0
0
2
4
6
8
10
12
14.2
30
14
16
min
Figura 16. Cromatograma del extracto de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6) oxidado con H2O2
[10%]. Se observa la presencia de dcSTX, GTX 2-3 y STX [flechas] producidas por el dinoflagelado (línea
azul), corroborándolo con la mezcla de estándares: dcSTX, GTX 2-3, B1, STX (línea roja). * Producto de
oxidación secundaria de dcSTX (Cada cromatograma en escala diferente debido a que la señal del extracto de
GCCV-6 era mayor y ocultaba la señal de los estándares).
35
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09030907.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09030910.D)
*
LU
12.054
18
16
14
12
10
8
11.877
NEO
6
GTX 1,4
11.042
11.190
6.814
4
6.596
10.606
5.833
8.392
2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 17. Cromatograma del extracto de Gymnodinium catenatum (cepa GCCV-6) oxidado con HIO4 [0.03
M]. Se observa la presencia de GTX 1,4 y NEO [flechas] producidas por el dinoflagelado (línea azul),
corroborándolo con la mezcla de estándares: GTX 1,4 y NEO (línea roja). * Producto de oxidación secundaria
de GTX 1, 4. (Cada cromatograma en escala diferente debido a que la señal del extracto de GCCV-6 era
mayor y ocultaba la señal de los estándares).
Se compararon extracciones de la misma cepa (GCCV-6) realizadas en 2006 (PérezLinares, 2008) para verificar si existía algún cambio en el perfil de toxinas producido por el
dinoflagelado cultivado bajo condiciones de laboratorio en los últimos tres años. Se
comprobó que el perfil seguía siendo el mismo, detectándose dcSTX, GTX 2, 3, STX con
la oxidación con H2O2 [10%] y NEO y GTX 1,4 con la oxidación con HIO4 [0.03 M].
Con respecto a la detección de toxinas paralizantes en tejidos de copépodos expuestos a
células de G. catenatum se observó que los crustáceos fueron capaces de retener toxinas
PSP. La dcSTX se detectó en los tejidos de los organismos de los tres tratamientos
estudiados, pero la GTX 2, 3 y la STX solo se pudieron detectar en 2 tratamientos. Los
copépodos del tratamiento A retuvieron todas las toxinas que produce GCCV-6 (Fig. 18 y
36
22). En las muestras de copépodos del tratamiento B sólo se detectaron la dcSTX, la GTX
2,3 y la NEO (Figs. 19 y 23). Los organismos del tratamiento C retuvieron dcSTX, STX y
NEO (Figs. 20 y 24). En los controles (- -) no se detectaron toxinas paralizantes (Figs. 21 y
25).
En la tabla IX se muestra un resumen de las toxinas presentes y ausentes durante el
experimento, todos los tratamientos (A, B, C) se comparan con la cepa de GCCV-6 (control
-) y con Pseudodiaptomus euryhalinus alimentado con una microalga no toxica (Control - ). Se distingue que la única toxina que se detectó en los tejidos de copépodos de los tres
tratamientos fue dcSTX.
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031002.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031000.D)
dcSTX
LU
9.917
2.2
2
1.8
1.6
GTX
2,3
11.561
1.4
9.951
STX
*10.586
14.350
B1
11.570
13.213
1.2
14.447
10.597
1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 18. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de G. catenatum [106 cél]
(tratamiento A).
Se pueden observar las toxinas dcSTX, GTX 2-3 y STX [flechas] retenidas por los
copépodos (línea azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: dcSTX, GTX 2-3, B1,
STX. (*Producto de oxidación secundaria de dcSTX). Oxidación con H 2O2 [10%]. Ambos cromatogramas a
la misma escala.
37
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031007.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031006.D)
dcSTX
LU
9.847
2
1.8
1.6
GTX 2,3
1.4
11.496
9.851
STX
14.316
*
10.526
B1
1.2
13.170
11.483
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 19. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de G. catenatum [2x106 cél]
(tratamiento B). Se pueden observar las toxinas dcSTX y GTX 2-3 [flechas] retenidas por los copépodos
(línea azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: dcSTX, GTX 2-3, B1, STX.
(*Producto de oxidación secundaria de dcSTX). Oxidación con H 2O2 [10%]. Ambos cromatogramas a la
misma escala.
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031012.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031011.D)
dcSTX
LU
9.630
2
1.8
1.6
*
10.346
1.4
GTX 2,3
9.626
11.301
STX
14.026
B1
1.2
12.943
0
2
4
6
8
10
12
14.018
14
16
min
Figura 20. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de G. catenatum [2x106 cél]
+ C. calcitrans [1.2x108 cél] (tratamiento C). Se pueden observar las toxinas dcSTX y STX [flechas] retenidas
por los copépodos (línea azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: dcSTX, GTX
2-3, B1, STX. (*Producto de oxidación secundaria de dcSTX). Oxidación con H 2O2 [10%]. Ambos
cromatogramas a la misma escala.
38
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031016.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031011.D)
*
LU
10.346
1.4
dcSTX
1.35
9.626
GTX 2,3
11.301
1.3
STX
14.026
1.25
1.2
B1
12.943
1.15
1.1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 21. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos sólo a C. calcitrans [1.2x108 cél] en el
tratamiento Control (-) (-). No se detectaron toxinas paralizantes ni compuestos con fluorescencia natural
(línea azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: dcSTX, GTX 2-3, B1, STX.
(*Producto de oxidación secundaria de dcSTX). Oxidación con H2O2 [10%]. Ambos cromatogramas a la
misma escala.
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09030913.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09030912.D)
LU
2
1.8
1.6
1.4
NEO
11.346
*12.246
GTX 1,4
1.2
7.049
1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 22. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de G. catenatum [1x106 cél]
(tratamiento A). Se pueden observar las toxinas GTX1, 4 y NEO [flechas] retenidas por los copépodos (línea
azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: GTX 1,4 y NEO. (*Producto de
oxidación secundaria de GTX1, 4). Oxidación con HIO4 [0.03 M]. Ambos cromatogramas a la misma escala.
39
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031102.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031103.D)
*
LU
11.308
1.26
1.24
NEO
1.22
10.319
1.2
1.18
10.290
1.16
GTX 1,4
5.789
1.14
1.12
1.1
1.08
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 23. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de G. catenatum [2x106 cél]
(tratamiento B). Se puede observar la toxina NEO [flecha] retenidas por los copépodos (línea azul). La línea
roja representa las señales de la mezcla de estándares: GTX 1,4 y NEO. (*Producto de oxidación secundaria
de GTX1, 4). Oxidación con HIO4 [0.03 M]. Ambos cromatogramas a la misma escala.
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031107.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031108.D)
*
LU
1.28
11.195
1.26
1.24
NEO
10.229
1.22
1.2
1.18
10.125
GTX 1,4
5.724
1.16
1.14
1.12
1.1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 24. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos a cultivos de G. catenatum [2x106 cél]
+ C. calcitrans [1.2x108 cél] (tratamiento C). Se puede observar la toxina NEO [flecha] retenidas por los
copépodos (línea azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: GTX 1,4 y NEO.
(*Producto de oxidación secundaria de GTX1, 4). Oxidación con HIO 4 [0.03 M]. Ambos cromatogramas a la
misma escala.
40
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031112.D)
FLD1 A, Ex=330, Em=390 (PSP_MX2\09031113.D)
*
LU
1.28
11.239
1.26
1.24
NEO
10.250
1.22
1.2
GTX 1,4
1.18
5.666
1.16
1.14
1.12
0
2
4
6
8
10
12
14
16
min
Figura 25. Cromatogramas de extractos de P. euryhalinus expuestos sólo a C. calcitrans [1.2x108 cél] en el
tratamiento control (-) (-) (-). No se detectaron toxinas paralizantes ni compuestos con fluorescencia natural
(línea azul). La línea roja representa las señales de la mezcla de estándares: dcSTX, GTX 2-3, B1, STX.
(*Producto de oxidación secundaria de GTX1, 4). Oxidación con HIO 4 [0.03 M]. Ambos cromatogramas a la
misma escala.
41
Tabla IX. Comparación de toxinas paralizantes ausentes (-) y presentes (*) en los
cromatogramas integrados por el HPLC-FLD.
Tratamientos\
dcSTX
GTX2,3
B1
STX
GTX1,4
NEO
*
*
-
*
*
*
*
*
-
*
*
*
*
*
-
-
-
*
*
-
-
*
-
*
-
-
-
-
-
-
Toxinas
Cepa GCCV-6
A: Gymnodinium
catenatum 1X103
cél/litro
B: Gymnodinium
catenatum 2X103
cél/litro
C: Gymnodinium
catenatum 2X103
cél/litro +
Chaetoceros
calcitrans
Control(-)
Pseudodiaptomus
euryhalinus
42
8. Discusión
8.1 Ingestión de Gymnodinium catenatum por Pseudodiaptomus euryhalinus
Muchas investigaciones relacionadas con la interacción de toxinas producidas por
proliferaciones micoalgales nocivas sugieren que la presión por medio de la ingestión que
ejerce el zooplancton puede moderar los ―blooms‖ (Turner y Anderson, 1983; Watras et al.,
1985; Uye, 1986). Sin embargo, otros investigadores reportan que al presentarse una PMN
existe un decremento en la alimentación de crustáceos causado por la producción de
metabolitos secundarios de las microalgas responsables de las mareas rojas, disminuyendo
la presión depredatoria y siendo un factor muy importante para el crecimiento exponencial
de las microalgas (Fiedler, 1982; Huntley, 1982; Uye and Takamatsu, 1990).
En este estudio se llevaron a cabo bioensayos en laboratorio tratando de simular las
densidades celulares promedio en una marea roja monoespecífica de Gymnodinium
catenatum. Al poner en contacto a los copépodos (P. euryhalinus) con el dinoflagelado, su
comportamiento fue depredatorio inmediatamente, debido a que los organismos se
encontraban en ayuno (Figs. 10, 11 y 12). Esta tasa alta de consumo se presentó debido a
los reflejos naturales para alimentarse que tienen los calanoideos, paralelo a que la cantidad
de luz presente fue un factor importante para la depredación, ya que en la oscuridad se
reduce esta actividad. Este fenómeno ha sido reportado anteriormente para Acartia tonsa
donde los crustáceos fueron alimentados con cultivos de Thalassiosira Weissflogii y
posteriormente se midió por medio de la pigmentos de clorofila la cantidad consumida en
intervalos de 1 hora durante las 24 horas, reportando gran actividad de alimentación
después de agregarle los cultivos de T. weissflogii, durante la primeras horas del día,
43
mientras que en la noche se mantuvo uniforme el consumo pero en menor cantidad que en
presencia de luz (Durbin et al., 1990). En este trabajo, después de 6 horas de iniciado el
ensayo se observó una disminución en la tasa de ingestión (Figs. 10, 11 y 12). Teegarden y
Cembella (1996) reportaron que Acartia tonsa disminuye su tasa de ingestión entre 7 y 9
horas después de estar expuesto a varias especies del dinoglagelado del género
Alexandrium. Sugieren que las toxinas paralizantes que produce Alexandrium spp. Lo
incapacita en su actividad depredadora durante un período. Esto se pudo observar también
en el experimento con P. euryhalinus, ya que después de ingerir células de G. catenatum se
registró una disminución de su ingestión, pero después de algunas horas los copépodos
recuperaron sus capacidades de depredación.
Estos resultados sugieren que el comportamiento de P. euryhalinus no difiere de otros
copépodos calanoideos reportados en otros trabajos. A pesar de que la ingestión de células
del dinoflagelado tóxico fue inducida en gran medida por el ayuno, existen otros factores
que influyeron para que P. euryhalinus se alimentara con una especie de microalga tóxica.
Este organismo es altamente selectivo cuando la comida es abundante y variada, pero
cuando el alimento es escaso su instinto por sobrevivir y alimentarse lo conduce a no
discriminar entre el alimento disponible (Price, 1983; Price y Paffenhöfer, 1986; Osorio,
1998).
Por otro lado, se observó una disminución en el consumo de células de G. catenatum
después de 24 h del experimento. Esto pudo haberse llevado a cabo por el aletargamiento
que experimentaron los organismos, pero también pudo contribuír la capacidad químicasensorial que tiene el zooplancton gracias a los apéndices bucales (setas) especializados con
los que cuentan (Huntley et al., 1986; Sykes y Huntley, 1987; Teegarden y Cembella,
44
1996). Boyd en 1976 propuso que la filtración y selectividad del zooplancton se realiza con
la segunda maxila, generando un proceso de reconocimiento y discriminación del alimento
apto/no apto entre setas y enditas. Teegarden en 1999 observó que el mecanismo de ingerir
dinoflagelados tóxicos productores de PSP, por lo que los organismos llegan a presentar
consecuencias iniciales como peristalsis reversible (regurgitación), pérdida de capacidad
motora, parálisis progresiva, así como disminución de reproducción (Haney et al. 1995;
Huntley et al. 1986; Sykes y Huntley, 1987). Esto último es consistente con el
comportamiento que observó P. euryhalinus al ingerir G. catenatum. Uye y Takamatsu
(1990) y Sykes (1991) demuestran que los copépodos aprenden a reconocer sus alimentos
por medio de ―ensayo y error‖ (ingestión y consecuencia) para eventualmente distinguir el
alimento peligroso del que no lo es. Debido a esta capacidad que tienen muchos organismos
del zooplancton, el consumo de G. catenatum muy probablemente fue disminuyendo a
medida que los organismos presentaban efectos nocivos, llegando a manifestar un
comportamiento alimenticio evasivo en las últimas horas de cada día del experimento. Lo
anterior se evidenció cuando se alteró la flotabilidad de los copépodos y presentaron
movimientos natatorios irregulares. Este comportamiento anómalo ha sido utilizado
previamente como indicador de intoxicación en organismos marinos (Calow, 1993; PérezLinares et al., 2008 y 2009).
8.2 Daño celular (estrés oxidativo)
Debido a las anomalías experimentadas por los copépodos en su comportamiento, así como
la retención de toxinas paralizantes en sus tejidos (Figs. 20-22 y 24-26, Tabla IX) después
haberlos expuesto a los dinoflagelados tóxicos, se esperaba una cambio en las líneas
defensivas mediante la actividad de enzimas metabólicas: por un lado la peroxidación de
45
lípidos en las membranas de las células excitables, al manifestarse un problema estructural;
y por otro lado un decremento en la actividad de catalasa y de la producción de H2O2,
debido a que el zooplancton presentaba aletargamiento al consumir dinoflagelados con
toxinas, provocando un impedimento para el consumo de oxígeno. Sin embargo, no hubo
diferencias significativas en la actividad enzimática de tejidos de copépodos expuestos a G.
catenatum comparado con los controles (Figs. 14 y 15). Kozlowsky-Suzuki y colaboradores
(2009) mencionan que los procesos de oxido-reducción son mecanismos que controlan la
acumulación de toxinas en muchos organismos marinos. Ellos estudiaron la formación de
conjugados con microcistinas, que representó el primer paso para la desintoxicación por
consumo de cianobacterias tóxicas en copépodos. Sin embargo, en estudios con toxinas
PSP en copépodos expuestos a Alexandrium minitum, no encontraron relación de la
Glutation S-Transferasa (GST) con esta vía de detoxificación, la cual se ha reportado
previamente en procesos de oxidación, haciendo más solubles los compuestos tóxicos en la
célula y excretándolos de manera más rápida.
Kankaanpää y colaboradores en el 2007 observaron que no había cambios en las
actividades oxidativas de la GST en el bivalvo Mytilus edulis al estar expuestos a extractos
de cianobacterias tóxicas, sugiriendo que ésta enzima no está implicada en la
destoxificación. La explicación de la ausencia de diferencia significativa en la actividad
enzimática entre los copépodos expuestos a G. catenatum y los controles puede estar
relacionada a que la actividad de la lipoperoxidasa y de la catalasa no están vinculadas
directamente en la detoxificación y estrés oxidativo causados por ficotoxinas en estos
organismos, a pesar de haber acumulado toxinas paralizantes en sus tejidos (Figs. 18-20 y
22-24 ).
46
8.3 Detección de toxinas paralizantes mediante HPLC-FLD
Los resultados obtenidos en el análisis por HPLC-FLD de extractos de copépodos
expuestos a G. catenatum corroboraron que éstos organismos son capaces de retener
toxinas paralizantes bajo exposiciones agudas. La Tabla IX muestra que se detectaron todas
las toxinas PSP que produce GCCV-6 (Figs. 16 y 17).
Estos resultados son consistentes con los trabajos realizados por Dutz (1998) y Frangópulos
y colaboradores (2000), quienes estudiaron a los copépodos Acartia clausi y Acartia Tonsa,
respectivamente, y reportaron la bioacumulación de toxinas GTX (1-4) producidas por
Alexandrium minutum al que fueron expuestos.
En este trabajo se comprobó la presencia de toxinas paralizantes acumuladas en tejidos de
copépodos, pero también se pudo observar que en cada tratamiento la relación de toxinas
detectadas fue diferente (Tabla IX). La STX no se detectó en el tratamiento B, la GTX1, 4
en el tratamiento B y C, y la GTX2, 3 en el tratamiento C (Tabla IX). Esto indica que
probablemente hubo una biotransformación metabólica/enzimática de éstas toxinas o una
depuración de ellas por los copépodos, o bien que se encontraban presentes pero en
cantidades por debajo del límite de detección del equipo utilizado.
Existen varios trabajos que han probado que los copépodos son capaces de alimentarse de
dinoflagelados tóxicos y posteriormente transformar o eliminar las toxinas. Turiff y
colaboradores (1995) observaron que después de alimentar a Calanus finmarchicus con
Alexandrium excavatum, las toxinas N-sulfocarbamoyl acumuladas fueron disminuyendo
de sus tejidos en un plazo de 48 horas. Palomares y colaboradores (2006) también
observaron el mismo comportamiento después de alimentar a Acartia clausi con
47
Gymnodinium catenatum, ya que el perfil de toxinas reportado para el dinoflagelado (cepa
GCCV-14) contenía dcSTX, dcGTX2, dcGTX3, C1 and C2 y las toxinas paralizantes
detectadas en los copépodos fueron NEO, dcSTX, dcGTX2, dcGTX3, B1, B2 y C2.
Guisande y colaboradores en el 2002 sugieren que las toxinas se modifican dentro del
copépodo Acartia clausi mediante la epimerización de las Gonyautoxinas. Probablemente
este mismo proceso de transformación se lleve a cabo en P. euryhalinus, ya que se observa
la presencia de GTX 2-3 y GTX 1-4 en el tratamiento A, pero en los tratamientos B y C no
se detectaron. Otra manera de desintoxicación, además de la transformación de toxinas por
el metabolismo del organismo, es mediante las heces. Estos procesos, junto con la
transferencia de toxinas hacia los huevos pueden representar >3% de las toxinas
acumuladas por día (Guisande et al., 2002; Frangópulos et al., 2000). Desafortunadamente
fue imposible colectar y analizar desechos y huevos de P. euryhalinus en estos
experimentos para comprobar esta hipótesis.
La retención de toxinas paralizantes de GCCV-6 ya ha sido reportada previamente en
crustáceos. Pérez-Linares y colaboradores (2008) observaron la acumulación de toxinas
PSP en órganos blanco de camarones (L. vanammei), detectando dcSTX, NEO, GTX2,3 y
GTX1,4 en hepatopáncreas y músculo, las mismas que se pudieron detectar en el
tratamiento A de P. euryhalinus. Cabe mencionar que en los camarones si se
experimentaron mortalidades y que la densidad celular a la que se expusieron los es mayor
(1x104) que la utilizada en copépodos (1x103), lo que sugiere que éstos últimos tienen
mayor resistencia a su exposición y son más susceptibles de acumular toxinas PSP. Este
resultado es importante desde el punto de vista ecológico, ya que el zooplancton es el
48
primer consumidor al que se enfrentan las células de una marea roja y representan un vector
potencial de biomagnificación de éstos compuestos dañinos a través de la cadena trófica.
9. Conclusiones

La depredación de P. euryhalinus sobre G. catenatum ocurre en mayor medida
durante la primera hora en todos los tratamientos.

En el segundo ensayo prospectivo se determinó que a una densidad de 1x104 y
5x104, no se registró mortandad en los copépodos, pero mostraron un
comportamiento aletargado.

El consumo promedio de células de G. catenatum calculado fue de 210
cél/copépodo durante los 3 días de experiemento. Relacionándolo con la
concentración de STX/célula (58.8 pg eq STX/cél; Pérez-Linares et al., 2008) se
pudo estimar que teóricamente era suficiente para poder determinarlas por
HPLC-FLD de acuerdo al límite de detección del método (LODSTX=0.022 g eq
STX/g; Lawrence et al., 2004).

Los copépodos después de 7 horas de haberles agregado el dinoflagelado tóxico
(GCCV-6), presentaron aletargamiento, depositándose en el fondo del matraz
debido a la acumulación de toxinas paralizantes.

De acuerdo a los análisis de la actividad enzimática de la Catalasa y por
Peroxidación de lípidos, no existe daño celular en tejidos de P. euryhalinus por
la ingestión de G. catenatum
49

Se comprobó que si hay acumulación de toxinas paralizantes en tejidos de P.
euryhalinus al ingerir al dinoflagelado tóxico Gymnodinium catenatum.

Estos resultados demuestran que P. euryhalinus es capaz de acumular toxinas
paralizantes y sobrevivir sin sufrir daños, representando una amenaza potencial
para el ambiente, ya que pueden actuar como vectores de ficotoxinas y
biomagnificar estos compuestos peligrosos a través de la cadena trófica.
10. Recomendaciones
Los resultados obtenidos en estos bioensayos proporcionan evidencias suficientes para
tomar decisiones importantes sobre el estudio y manejo de contingencias relacionadas con
PMN, como las que se sugieren a continuación:

Implementar métodos sensibles y fiables en el sector de salud mexicano para la
identificación y cuantificación de ficotoxinas (como HPLC-FLD, LC/MS, etc.), así
como el uso de estándares certificados para su corroboración.

Realizar estudios exhaustivos con la diversidad de zooplancton que coexiste con
miacroalgas tóxicas y determinar parámetros y rutas de desintoxicación para evitar
posibles transferencias a través de la cadena trófica que puedan llegar a productos
de consumo humano.

Durante una contingencia relacionada con PMN, se recomienda un período de veda
determinado por estudios de bioacumulación de ficotoxinas en el zooplancton (e.g.
copépodos). Lo anterior es debido a que representan la dieta de organismos
superiores como los peces, moluscos cefalópodos y crustáceos decápodos que
50
pueden biomagnificar las concentraciones de ficotoxinas pudiendo afectar la salud
pública con intoxicaciones serias; y a la economía (pesquerías y acuicultura) por las
leyes de inocuidad alimentaria.
11. Bibliografía
1. AOAC. 1997. Official Method 959.08. Paralytic shellfish poisoning toxins in
shellfish. Pp 22-23. In: Chapter 35: Fish and other marine products, Sec. 35.1.37.
AOAC International. Gaithersburg, MD, EUA.
2. Alonso-Rodríguez, R., J. L. Ochoa-Ochoa y M., Urbe-Alcocer, 2005. Grazing of
heterotrophic
dinoflagellate
Noctiluca
scintillans
(Mcartney)
Kofoid
on
Gymnodinium catenatum Graham. Revista Latinoamericana de Microbiología.
47(1-2):5-10.
3. Aebi, H., 1984. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105, 121– 126.
4. Arnott, G. H. 1998. Toxic marine microalgae: a worldwide problem with major
implications for seafood safety. Advancing Food Safety. 1:24–34.
5. Band-Schmidt, C. J., J. Bustillos-Guzmán, I. Gárate-Lizárraga , C.H. LechugaDevéze, K. Reinhardt, B. Luckas.2003. Paralytic shellfish toxin profile in strains of
the dinoflagellate Gymnodinium catenatum Graham and the scallop Argopecten
ventricosus G.B. Sowerby II from Bahía Concepción, Gulf of California, Mexico.
México.
6. Band-Schmidt, C. J., Bustillos-Guzmán, J., Gárate-Lizárraga, I., Lechuga-Devéze,
C.H., Reinhardt, K., Luckas, B. 2005. Profiles of paralytic shellfish toxin in strains
of the dinoflagellate Gymnodinium catenatum and the scallop Argopecten
ventricosus from Bahía Concepción, Gulf of California, Mexico. Harmful Algae. 4:
21–31.
7. Barman, M. y R. Campbell. 2007. The Effect of Saxitoxin Ingestion on the
Reproductive Health of Calanus finmarchicus after Exposure to Alexandrium spp
C.J. van Leeuwen and T.G. Vermeire (eds.), Risk Assessment of Chemicals: An
Introduction, 281–356.
51
8. Blackburn, S. I., G. M. Hallagraeff y C. J. Bolch. 1989. Vegetative reproduction
and sexual life cycle of the toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum from
Tasmania, Australia. J. Phycol. 25: 577-590.
9. Boyd, C. M. 1976. Selection of particle sizes in filtering-feeding copepods: A plea
for reason. Limmol. Oceanogr. 21: 175-180.
10. Bricelj, V.M., Lee, JH, Cembella, AD, Anderson, D. M.1990. Uptake of
Alexandrium fundyense by Mytilus edulis and Mercenaria mercenaria under
controlled conditions. In: Toxic marine phytoplankton, pp. 269–75
11. Campos-Hernández, A. y E. Suárez-Morales.1994. Copépodos del Golfo de México
y Mar Caribe. Biología y Sistemática. CiQro. Inst. de Ocean. y CONACYT;
México, D.F. 360 pp.
12. Calow, P. 1993. Handbook of ecotoxicology. Blackwell. London. 478-416 pp
13. Cortes, R. 1998. Las Mareas Rojas. AGT. México. 161 pp.
14. Durbin, A. G., Durbin, E. G. y Wlodarczyk, E. 1990. Diel feeding behavior in the
marine copepod Acartia tonsa in relation to food availability. Mar. Ecol. Prog. Ser.
68: 23–45.
15. Dutz, J. 1998. Repression of fecundity in the neritic copepod Acartia clausi exposed
to the toxic dinoflagellate Alexandrium lusitanicum: relationship between feeding
and egg production. Mar Ecol Prog Ser. 175:97–107
16. FAO. 2004. Marine Biotoxins. Food and Agriculture Organization of the United
Nations. Roma, Italia, 281 pp.
17. Fiedler, P. C. 1982. Zooplankton avoidance and reduced grazing responses to
Gymnodinium splendens (Dinophyceae). Limnol. Oceanogr. 27: 961 -965.
18. Flores, R. 2008. Variación en el Contenido de Ácidos Grasos del Copépodo
Calanoide Pseudodiaptomus euryhalinus (Johnson, 1939), Alimentados con las
microalgas Chaetoceros calcitrans e isochrysis galbana. Tesis de Maestría.
CIBNOR. 52 pp.
19. Frangópulos M., C. Guisande, I. Maneiro, I. Riveiro, J. Franco.2000. Short-term and
long-term effects of the toxic dinoflagellate Alexandrium minutum on the copepod
Acartia clausi. Mar. Ecol. Prog. Ser. 203: 161-169.
52
20. Garate-Lizarraga, I., J.J. Bustillos-Guzman, R. Alonso-Rodrıguez, B. Luckas. 2004.
Comparative paralytic shellfish toxin profiles in two marine bivalves during
outbreaks of Gymnodinium catenatum (Dinophyceae) in the Gulf of California.
Mar. Poll. Bull. 48: 378-402.
21. Guisande, C., Frangópulos, M., Carotenuto, Y., Maneiro, I., Riveiro, I., Vergara,
A.R., 2002. Fate of paralytic shellfish poisoning toxins ingested by the copepod
Acartia clausi. Mar. Ecol. Prog. Ser. 240, 105–115.
22. Hallegraeff, G.M. 1995. 1. Harmful algal blooms: a global overview. In Hallegraeff,
G.M. et al. eds. Manual on Harmful Marine Microalgae, pp. 1-22. IOC Manuals and
Guides No. 33.UNESCO.
23. Halstead, B. W., Schantz, E. J. 1984. Paralytic shellfish poisoning. WHO Offset
Publication No. 79:1–60. World Health Organization, Geneva, Switzerland.
24. Hamasaki, K., Takahashi, T., Uye, S., 2003. Accumulation of paralytic shellfish
poisoning toxins in planktonic copepods during a bloom of the toxic dinoflagellate
Alexandrium tamarense in Hiroshima Bay, western Japan. Mar. Biol. 143: 981–988.
25. Haney, J.F., Sasner J. J., Ikawa M. 1995. Effects of products released by
Aphanizomenon flos-aquae and punfied saxitoxina on the movements of Daphnia
carinata feeding appendages. Limnol Oceanogr. 40:263-272
26. Harada, T, Oshima, Y, Yasumoto, T.1983.Agric. Biol. Chem. 47, 191-193
27. Huntley, M. E. 1982. Yellow water in La Jolla Bay, California, July 1980. 2.
Suppression of zooplankton grazing. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 63: 81-91.
28. Huntley M, Sykes P, Rohan S, Marin V. 1986. Chemically mediated rejection of
dinoflagellate prey by the copepods Calanus pacificus and Paracalanus parvus:
mechanism, occurrence and significance. Mar Ecol Prog Ser 28:105-120
29. Jeong, HJ, H.R. Kim, K.I. Kim, K.Y. Kim, K.H. Park, S.T. Kim, Y.D. Yoo, J.Y.
Song, J.S. Kim, K.A. Seong, W.H. Yih y S.J. Pae. 2002. NaOCl produced by
electrolysis of natural seawater as a potential method to control marine red-tide
dinoflagellates. Phycologia, 41(6): 643-656.
30. Johnson, M. W. I939.Pseudodiaptomus (Pseudodiaptallous) euryhalinus a new
subgenus and species of copepoda, with preliminary notes on its ecology. Trans.
Am. Microsc. Soc. 58(3): 349-355.
53
31. Johnson, M. W. 1948. The postembryonic development of the copepod
Psudodiaptomus ewyhditms Johnson, and its phylogenetic significance. Trans. Am.
Microsc. Soc. 68(4): 3 19-330
32. Kankaanpää, H., Leiniö, S., Olin, M., Sjo¨ vall, O., Meriluoto, J., Lehtonen, K.K.,
2007. Accumulation and depuration of cyanobacterial toxin nodularin and
biomarker responses in the mussel Mytilus edulis. Chemosphere 68, 1210–1217.
33. Kozlowsky-Suzuki, B. M., Koski, E. Hallberg, R. Walle, P. Carlsson. 2009.
Glutathione transferase activity and oocyte development in copepods exposed.to
toxic phytoplankton. Harmful Algae 8 (2009) 395–406.
34. Lehane, L. 2000. Paralytic Shellfish Poisoning: A review. National Office of Animal
and Plant Health, Agriculture, Fisheries and Forestry — Australia, Canberra.
35. Lehtiniemi M., Engström-Öst J., Karjalainen M., Kozlowski-Suzuki B., Viitasalo
M. 2002. Fate of cyanobacterial toxins in the pelagic food web: transfer to
copepods or to faecal pellets?, Mar. Ecol. Prog. Ser. 241: 13-21.
36. Lindahl, O. 1998. Occurrence and Monitoring of harmful algae in the marine
environment. In Miraglia, M., Van Egmond, H., Brera, C. & J. Gilbert, eds. 1998.
Mycotoxins and phycotoxins developments in chemistry, toxicology and food safety.
Proceedings of the IX Internationa IUPAC Symposium on Mycotoxins and
Phycotoxins, pp. 409-423. Fort Collins, Colorado, Alaken Press.
37. Lawrence, J.F., B. Niedzwiadek y C. Ménard. 2004. Quantitative determination of
paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish using prechromatographic oxidation
and liquid chromatography with fluorescence detection: interlaboratory study.
Journal of AOAC International, 87(1): 83-100.
38. Marshall, S. M. y A. P. Orr. 1972. The hiology of a marine copepod. SpringerVerlag. Darmstadt, Germany. 195 pp.
39. Montoya, N. G., Akselman, R., Franco, J. M., Carreto, J. I. 1996. Paralytic shellfish
toxins and mackerel (Scomber japonicus) mortality in the Argentine Sea. In:
Reguera B, Blanco J, Fernández ML Wyatt T (eds) Harmful algae. Xunta de Galicia
and IOC of UNESCO.417–420 pp.
54
40. Negri, A. y Llewellyn, L. 1998. Comparative analyses by HPLC and the sodium
channel saxiphilin 3H saxitoxin receptor assay for shellfish toxins in crustaceans
and molluscs from tropical North West Australia. Toxicon.36: 283-298.
41. Ochoa, J. L., Nuñez V. E. y Saad, J., 2003. Diferentes términos utilizados para
describir las ―mareas rojas‖. Revista de biología tropical, 3-4:621-628.
42. Oshima, Y, Kotaki, Y, Harada, T, Yasumoto, T. 1984. Paralytic shellfish toxins in
tropical waters, pp. 161–70. In: Seafood toxins, EP Ragelis (ed.). ACS Symposium
Series 262, American Chemical Society, Washington, DC.
43. Osorio, M. 1998. Efecto de la Temperatura y La Salinidad en Parametros
Poblacionales
de
Pseudodiaptomus
ezuyhalinus
Johnson
(CRUSTACEA:
COPEPODA: CALANOIDEA) En Condiciones Controladas. Tesis de Maestría.
CICIMAR-IPN. La Paz, B.C.S., México. 68 pp.
44. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K., 1979. Assay for lipid peroxides in animal tissues
by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 95, 331–358.
45. Palomares-García, R., Bustillos-Guzmán, J.J., Band-Schmidt, C.J., López-Cortés,
D.J., Luckas, B. 2006. Effect of the toxic dinoflagellate Gymnodinium catenatum on
the grazing, egg production, and hatching success of the copepod Acartia clausi.
Ciencias Marinas. 32 (1B): 111– 119.
46. Pérez-Linares, J. 2001. Histopatología de Postlarvas de camarón blanco
Litopenaueus vannamei Expuesta a la cianobacteria Schizothrix calcicola. UABCS.
Tesis de Licenciatura. México.
47. Pérez-Linares, J. 2008. Retención de Toxinas y Daños en Tejidos de Camarón
Patiblanco Litopenaeus vannamei Producidos por la Exposición a Gymnodinium
catenatum (PSP) y Karenia brevis (NSP). CIBNOR. Tesis de Doctorado. México.
151 pp.
48. Pérez-Linares, J., J.L. Ochoa y A. Gago-Martínez. 2008. Effect of PSP toxins in
white leg shrimp Litopenaeus vannamei (Boone, 1931). J. Food Science: Food
Chemistry and Toxicology, 73: 233-237.
49. Pérez-Linares, J., J.L. Ochoa y A. Gago-Martínez. 2009. Retention and tissue
damage of PSP and NSP toxins in shrimp: Is cultured shrimp a potential vector of
toxins to human population? Toxicon, 53: 185-195.
55
50. Persky, A.M., Green, P.S., Stubley, L., Howell, C.O., Zaulyanov, L., Brazaeua,
G.A., Simpkins, J.W., 2000. Protective effect of estrogens against oxidative damage
to heart and skeletal muscle in vivo and in vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 223,
59–66.
51. Price, P.W. 1983. Hypothesis on organization and evolution in herbivorous insect
communities. In Variable plants and herbivores in natural and managed systems.
R.F. Denno and M.S. McClure.559-598 pp.
52. Price, H.J. y G.A. Paffenhöfer. 1986. Capture of small cells by the copepod
Eucalanus elongatus. Limnol. Oceanogr. 31-1: 189-194.
53. Sykes, P. F. y Huntley, M. E. 1987. Acute physiological reactions of Calanus
pacificus to selected dinoflagellates: direct observations. Mar. Biol.94: 19–24.
54. Sykes, P. F. 1991. Physiological ecology and chemical ecology of copepoddinoflagellate interactions. PhD dissertation, University of California. San Diego
55. Teegarden, G. J.1999. Copepod grazing selection and particle discrimination on the
basis of PSP toxin content. Mar. Ecol. Prog. Ser 191:163–176
56. Teegarden, G. J. y Cembella, A. D. 1996. Grazing of toxic dinoflagellates,
Alexandrium spp., by adult copepods of coastal Maine: implications for the fate of
paralytic shellfish toxins in marine food webs. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 196: 145–
176.
57. Traas, T. P. y C. J. Van Leeuwen. 2007. Ecotoxicological Effects. Springer. 686 pp.
58. Turriff N, Runge, J. A., Cembella, A. D. 1995. Toxin accumulation and feeding
behaviour of the planktonic copepod Calanus finmarchicus exposed to the red-tide
dinoflagellate Alexandrium excavatum. Mar Biol. 123:55–64
59. Turner, J. T. y D. M. Anderson. 1983. Zooplankton grazing during dinoflagellate
blooms in a Cape Cod embayment, with observations of predation upon tintinnids
by copepods. Mar. Ecol. 4: 359-374.
60. Turner, J.T., Tester, P.A., 1997. Toxic marine phytoplankton, zooplankton grazers,
and pelagic food webs.
61. Turner, J. T. 2006. Harmful Algae Interactions with Marine Planktonic Grazers
62. Uye, S. 1986. Impact of copepod grazing on the red-tide flagellate Chattonella
antiqua. Mar. Biol. 92: 35-43.
56
63. Uye, S. y K. Takamatsu. 1990. Feeding interactions between planktonic copepods
and red-tide flagellates from Japanese coastal waters. Mar. Ecol. Prog. Ser. 59:97107 pp.
64. Wannemacher, R. W. 1989. Procedures for Inactivation and Safety Containment of
Toxins. In: Proceeding of the Symposium on Agents of Biological Origin, U.S.
Army Research, Development and Engineering Center. Aberdeen Proving Ground,
Maryland, EUA, 15-122 pp.
65. Walter, T. C. 1989. Review of the new world species of Pseudodiaptomus
(COPEPODA: CALANOIDA) with a key to the species. Bull. Mar. Sci. 45 (3):
590-628.
66. Watras, C. J., Garcon, V. C., Olson, R. J., Chisholm, S. W. y D. M. Anderson. 1985.
The effect of zooplankton grazing on estuarine blooms of the toxic dinoflagellate
Gonyaulux tamarensis. J. Plankton Res. 7: 891-908.
67. Yasumoto, T., Murata, M., 1993. Marine Toxins. Chem Rev 93: 1897-1909.
57