Pais, Silvia Marina. 2010 - Biblioteca Digital de la Facultad de

Caracterización de fosfatasas de proteínas 2 A en
Solanum tuberosum L. y su participación en vías
de señalización asociadas a tuberización y estrés
Pais, Silvia Marina
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. Luis
Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la
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This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.
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Fuente / source:
Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
CARACTERIZACIÓN DE FOSFATASAS DE PROTEÍNAS 2A EN
Solanum tuberosum L. Y SU PARTICIPACIÓN EN VÍAS DE
SEÑALIZACIÓN ASOCIADAS A TUBERIZACIÓN Y ESTRÉS
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en
el área CIENCIAS BIOLÓGICAS
Lic. Silvia Marina País
Directora: Dra. María Teresa Téllez-Iñón
Directora Asistente: Dra. Daniela Andrea Capiati
Consejera de Estudios: Dra. Sara Maldonado
Lugar de trabajo: Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular,
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (INGEBI, CONICET)
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2010
Resumen
CARACTERIZACIÓN DE FOSFATASAS DE PROTEÍNAS 2A EN
Solanum tuberosum L. Y SU PARTICIPACIÓN EN VÍAS DE
SEÑALIZACIÓN ASOCIADAS A TUBERIZACIÓN Y ESTRÉS
La fosforilación reversible de proteínas tiene un rol importante en la señalización asociada al
desarrollo y al estrés en plantas. Algunos estudios sugieren que las fosfatasas de proteínas
2A (PP2A) están involucradas en estos procesos. El objetivo de este trabajo fue caracterizar
las subunidades catalíticas de PP2A (PP2Ac) en Solanum tuberosum L. y estudiar su
participación en la señalización asociada a la tuberización y el estrés. Búsquedas
bioinformáticas en bases de datos de ESTs revelaron la presencia de seis isoformas de
PP2Ac en S. tuberosum. Estas isoformas muestran patrones de expresión diferentes en
distintos órganos de la planta y sus niveles cambian durante la formación del tubérculo. Se
ha propuesto que las señales hormonales y ambientales que modulan la tuberización son
integradas en las hojas. Para estudiar el rol de las PP2As en respuesta a condiciones que
afectan la tuberización, se analizó la expresión en hojas de los genes “específicos de
tubérculo” Patatina y Pin2, en presencia o ausencia de inhibidores de estas fosfatasas. Se
encontró que una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio (condición promotora de la
tuberización) estimula la expresión de Patatina y Pin2 posiblemente mediante el aumento de
la actividad de PP2A, sin afectar los niveles de ARNm y proteínas de PP2Ac. Por otro lado,
el ácido giberélico (GA, regulador negativo de la tuberización), disminuye el nivel de ARNm
de algunas de las subunidades catalíticas, lo que se correlaciona con una menor cantidad
de proteínas PP2Ac. Esta disminución causada por el GA inhibiría las señales de
tuberización río abajo de los efectos inductores de una alta relación sacarosa/nitrógeno. Por
otro lado, para estudiar la participación de las PP2As en la señalización asociada al estrés,
se estudió la expresión de genes de respuesta a estrés en presencia o ausencia de un
inhibidor de estas fosfatasas y se determinaron los patrones de expresión de las
subunidades catalíticas en dichas condiciones. Se observó que las isoformas de PP2Ac son
diferencialmente reguladas en respuesta a estrés y que estas fosfatasas tendrían un rol
positivo en la señalización asociada a salinidad, mientras que regularían negativamente la
transducción del estrés biótico.
Palabras Clave: Solanum tuberosum L., Fosfatasas de Proteínas 2A, Tuberización,
Sacarosa, Ácido giberélico, Estrés biótico y abiótico
2
Abstract
CHARACTERIZATION OF PROTEIN PHOSPHATASES 2A IN
Solanum tuberosum L. AND THEIR INVOLVEMENT IN
TUBERIZATION AND STRESS SIGNALING
Protein phosphorylation/dephosphorylation plays critical roles in development and stress
signaling in plants, and some studies have suggested that protein phosphatases 2A (PP2A)
are involved in these processes. The aim of this work was to characterize PP2A catalytic
subunits (PP2Ac) in Solanum tuberosum L. and to study their involvement in tuberization and
stress signaling. Bioinformatic searches of EST databases revealed the presence of six
PP2Ac isoforms in S. tuberosum. PP2Ac isoforms show distinct expression patterns in
different organs and are developmentally regulated during tuber formation. The hormonal
and environmental signals that modulate potato tuberization are thought to be integrated in
the leaves. To study the roles of PP2A in the leaf responses to conditions that affect
tuberization, the expression of the “tuber-specific” genes Patatin and Pin2 was analyzed in
the presence or absence of PP2A inhibitors. It was found that a high sucrose/nitrogen ratio,
which promotes tuber formation, increases the transcript levels of Patatin and Pin2 possibly
by increasing the activity of PP2As, without affecting PP2Ac mRNA or protein levels. In
addition, gibberellic acid (GA), a negative regulator of tuberization, down-regulates the
transcription of some of the PP2Ac isoforms, decreasing their protein levels. PP2Ac downregulation by GA may inhibit tuberization signaling downstream of the inductive effects of a
high sucrose/nitrogen ratio. These results suggest that PP2As may act as molecular
switches that can be regulated by signals that affect tuberization to activate or inhibit the
response. In addition, to determine if PP2As are involved in stress signaling in potato plants,
the expression of stress-responsive genes was analyzed in the presence or absence of a
PP2A inhibitor. PP2Ac expression profiles in response to different environmental stresses
were also determined. The results obtained show that the expression of different PP2Ac
isoforms is modified in response to stress, and that these phosphatases may positively
regulate salt stress signaling while having a negative role in biotic stress signal transduction.
Key Words: Solanum tuberosum L., Protein Phosphatases 2A, Tuberization, Sucrose,
Gibberellic acid, Biotic and abiotic stress
3
Publicaciones
PUBLICACIONES
A continuación se presentan las citas correspondientes a las publicaciones relacionadas con
este trabajo de tesis:
• País SM, González MA, Téllez-Iñón MT, Capiati DA (2009) Characterization of potato
(Solanum tuberosum) and tomato (Solanum lycopersicum) protein phosphatases type 2A
catalytic subunits and their involvement in stress responses. Planta 230 (1): 13-25. DOI
10.1007/s00425-009-0923-5.
• País SM, Téllez-Iñón MT, Capiati DA (2009) Serine/threonine protein phosphatases type
2A and their roles in stress signaling (Mini-Review). Plant Signaling & Behavior 4 (11):
1013-1015.
• País SM, Muñiz García MN, Téllez-Iñón MT, Capiati DA (2010) Protein phosphatases
type 2A mediate tuberization signaling in Solanum tuberosum L. leaves. Planta 232 (1):
37-49. DOI 10.1007/s00425-010-1150-9.
4
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera agradecer a la Dra. Mirtha Flawiá y al Dr. Héctor Torres por
haberme permitido realizar esta tesis doctoral en el INGEBI. Gracias por construir un
instituto de puertas abiertas.
Gracias a la Dra. María Teresa Téllez-Iñón y a la Dra. Daniela Andrea Capiati, mis
directoras, por haberme dado un lugar en su laboratorio, por las ideas, consejos y
enseñanzas de todos estos años, desde el inicio de mi Tesis de Licenciatura hasta el final
de mi Tesis Doctoral.
Quisiera agradecer también al CONICET por la beca doctoral que me permitió llevar a cabo
esta tesis.
Gracias al grupo del 211, Noelia, Mariana, Natalia, Federico y Esteban, por tantos años
compartidos, protocolos, ideas, experimentos y charlas. También a Ezequiel V. y Juan por
los buenos momentos pasados en el laboratorio y a Marina por el trabajo compartido.
Gracias a los colegas “plantólogos” de todos estos años en el INGEBI, muy especialmente a
Carolina, Sandra, Verónica, Pablo, Diego, María Laura, Eugenia, Ezequiel L., Mauro,
Romina, Gabriela y Briardo, por toda su ayuda, por los consejos y por el interminable
intercambio de protocolos y reactivos. Quisiera agradecer también al Dr. Fernando Bravo
Almonacid del INGEBI, a la Dra. Mercedes Rivero y al Lic. Nicolás Furman del Laboratorio
de Agrobiotecnología de la FCEyN-UBA por su invaluable ayuda con el protocolo de
transformación y con la propagación de plantas in vitro.
Gracias también a todos los amigos de los otros laboratorios, especialmente a los vecinos
del 209, a los Chagas, a Rodrigo, Laura R., Marisa y a mi gran amiga Laura B. por su ayuda,
por las charlas y los almuerzos compartidos. Y también al grupo de electrofisiología por
permitirme usar miles de veces su hornito UV para “cross-linkear” millones de membranas,
gracias a todos por su buena onda.
Quisiera agradecer también a todo el personal del INGEBI, desde la secretaría hasta la
gente de seguridad, muy especialmente a Mary, Francisco, Gladys, Leonor, Ruben, Mariano
e Irma por hacer más fáciles y más gratos todos estos años.
Por último, y no por eso menos importante, quisiera agradecer a mi familia y a los amigos de
la facultad, de los viajes y de la vida por acompañarme en este camino, darme aliento y
confiar en mí.
5
Índice
ÍNDICE
ABREVIATURAS
10
INTRODUCCIÓN
12
1. Transducción de señales en plantas
12
1.1 Señales: características y percepción
1.2 Transducción e integración de señales
1.3 Respuestas: individualidad y plasticidad fenotípica
2. Fosfatasas de proteínas
12
14
16
17
2.1 Clasificación y características generales
2.2 Fosfatasas de proteínas tipo 2A
2.2.1 Diversidad y complejidad estructural
2.2.2 Regulación
2.2.3 Fosfatasas PP2A descriptas en plantas
17
21
21
23
25
3. Modelo biológico: Solanum tuberosum L.
27
4. Tuberización
29
4.1 Factores que regulan el proceso de tuberización
4.1.1 Fotoperíodo
4.1.2 Temperatura
4.1.3 Intensidad lumínica
4.1.4 Nitrógeno
4.1.5 Sacarosa
4.1.6 Giberelinas
4.1.7 Otros reguladores de la tuberización
4.2 Integración de señales e inducción de la tuberización
4.3 Cambios anatómicos asociados a la tuberización
4.4 Cambios metabólicos y moleculares asociados a la tuberización
5. Transducción de señales en condiciones de estrés
5.1 Estrés abiótico
5.1.1 Estrés por bajas temperaturas
5.1.2 Estrés por alta salinidad
5.2 Herbivoría
5.3 Interacciones planta-patógeno
29
29
30
30
31
31
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33
33
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36
39
39
41
42
43
45
RESULTADOS PREVIOS
49
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
50
MATERIALES Y MÉTODOS
51
1. Material vegetal
51
1.1 Plantas crecidas en invernáculo
1.2 Plantas crecidas in vitro
51
52
6
Índice
2. Tratamientos experimentales
2.1 Tratamientos relacionados con tuberización
2.2 Tratamientos relacionados con estrés
52
52
52
3. Inhibidores de actividad fosfatasa de proteínas
53
4. Soluciones generales
53
4.1 Soluciones empleadas en técnicas relacionadas con bacterias
4.2 Soluciones empleadas en técnicas relacionadas con ADN y ARN
4.3 Soluciones empleadas en técnicas relacionadas con proteínas
53
54
54
5. Cepas bacterianas
55
6. Medios de cultivo de bacterias y antibióticos
55
7. Vectores
56
8. Oligonucléotidos iniciadores (Primers)
57
8.1 Primers específicos para PP2Ac
8.2 Primers para sonda conservada de PP2Ac
8.3 Primers para marcadores de estrés
8.4 Primers para control de RT-PCR
8.5 Primers para 3’RACE-PCR de StPP2Ac2b
8.6 Primers para la sobre-expresión de StPP2Ac2b
9. Técnicas de ADN recombinante
9.1 Amplificación por PCR
9.2 Separación de fragmentos de ADN en geles de agarosa
9.3 Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa
9.4 Cuantificación de ADN
9.5 Digestión con enzimas de restricción
9.6 Eliminación de fosfatos en extremos 5’
9.7 Agregado de fosfatos en extremos 5’
9.8 Reacciones de ligación
9.9 Chequeo de las construcciones recombinantes
57
57
57
58
58
58
58
58
59
59
60
60
60
61
61
62
10. Transformación y obtención de ADN plasmídico a partir de bacterias Escherichia
coli
62
10.1 Preparación de bacterias competentes
10.2 Transformación por shock térmico
10.3 Purificación de ADN plasmídico
11. Transformación y obtención de ADN plasmídico a partir de bacterias
Agrobacterium tumefaciens
11.1 Preparación de bacterias competentes
11.2 Transformación por shock térmico
11.3 Purificación de ADN plasmídico
62
63
63
64
64
65
65
12. Transformación de Solanum tuberosum mediada por Agrobacterium tumefaciens
66
12.1 Reactivos utilizados para la transformación
12.2 Transformación
12.3 Repique de explantos
12.4 Chequeo preliminar de las plantas obtenidas
13. Diseño y obtención de sondas para Southern y Northern Blot
66
67
68
68
68
7
Índice
13.1 Sondas para PP2Ac
13.2 Otras sondas
68
69
14. Marcación radiactiva de sondas para Southern y Northern Blot
71
15. Southern Blot
71
15.1 Extracción de ADN genómico
15.2 Cuantificación de ADN genómico
15.3 Digestión de ADN genómico
15.4 Electroforesis de ADN genómico
15.5 Transferencia e hibridación de ADN genómico
16. Análisis de expresión a nivel de ARNm por Northern Blot
16.1 Extracción de ARN total a partir de material vegetal
16.2 Cuantificación de ARN
16.3 Electroforesis de ARN
16.4 Transferencia e hibridación de ARN
16.5 Deshibridación de membranas
17. Análisis de expresión a nivel de ARNm por RT-PCR semi-cuantitativa
17.1 Tratamiento con ADNasa
17.2 Síntesis de ADNc por transcripción reversa
17.3 Reacción de PCR semi-cuantitativa
71
72
73
73
73
74
74
75
75
75
76
76
76
77
77
18. Determinación de sitios alternativos de poliadenilación por 3’RACE-PCR
78
19. Análisis de expresión a nivel de proteínas por Western Blot
79
19.1 Extracción de proteínas
19.2 Cuantificación de proteínas
19.3 Electroforesis de proteínas
19.4 Transferencia de proteínas
19.5 Detección de proteínas PP2Ac mediante anticuerpos
79
80
80
81
81
20. Densitometría de bandas
82
21. Determinación de la actividad fosfatasa
82
21.1 Soluciones y reactivos empleados en los ensayos de actividad
21.2 Método del p-Nitrofenil-fosfato
21.3 Método de la Fosforilasa a
82
83
83
22. Determinación del contenido relativo de agua (RWC) en hojas
84
RESULTADOS
85
1. Familia de PP2Ac en Solanum tuberosum L.
85
2. Expresión de PP2Ac en distintos órganos de la planta
93
3. Participación de PP2A en vías de señalización de tuberización
3.1 Alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo
3.2 Giberelinas
4. Participación de PP2A en vías de señalización de estrés
4.1 Estrés abiótico
4.1.1 Estrés por bajas temperaturas
99
100
106
110
110
110
8
Índice
4.1.2 Estrés por alta salinidad
4.2 Daño mecánico
4.3 Elicitores fúngicos
113
119
123
5. Poliadenilación alternativa de StPP2Ac2b
129
FUTUROS EXPERIMENTOS: Sobre-expresión de StPP2Ac2b en Solanum
tuberosum L.
131
DISCUSIÓN
136
CONCLUSIONES
149
BIBLIOGRAFÍA
150
9
Abreviaturas
ABREVIATURAS
A Ampere
ABA (Abscisic acid) Ácido abscísico
ADN Ácido desoxi-ribonucleico
ADNc Ácido desoxi-ribonucleico copia
ADN-T ADN de transferencia
AGI (Arabidopsis Genome Initiative) Iniciativa para el genoma de Arabidopsis thaliana
AIA Ácido 3-Indol-Ácético
APS Persulfato de amonio
ARN Ácido ribonucleico
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
ARNr Ácido ribonucleico ribosomal
AS Acetosiringona
ATP Adenosina 5’-trifosfato
BSA (Bovine serum albumin) Seroalbúmina bovina
°C Grado Celsius
CAM (Crassulacean Acid Metabolism) Metabolismo ácido de las Crassulaceae
CaMV Virus del mosaico del coliflor
CDPK (Calcium-dependent protein kinase) Quinasa de proteínas dependiente de calcio
CIP Centro Internacional de la Papa
CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) Bromuro de N,N,N-trimetilhexadecanamonio
cv Cultivar
Da Dalton
DMSO Dimetil-sulfóxido
dNTP 2’-desoxinucleósido 5’-trifosfato (dATP: 2’-desoxiadenosina 5’-trifosfato; dCTP: 2’desoxicitidina 5’-trifosfato; dGTP:
2’-desoxiguanosina 5’-trifosfato; dTTP: 2’desoxitimidina 5’-trifosfato)
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilen-diamino-tetra-acético
EST (Expressed sequence tag) Secuencia de ADNc de un gen o parte de él
FAO (Food and Agriculture Organization) Organización para el alimento y la agricultura
g Gramo
GA (Gibberellic acid) Ácido giberélico / Giberelina
GFP (Green Fluorescent Protein) Proteína verde fluorescente
h Hora
HB7 (Homeobox-leucine zipper protein 7) Factor de transcripción tipo HD-ZIP
HEAT (Huntingtin, Elongation factor 3, A subunit of PP2A, Target of rapamycin 1) Motivo
aminoacídico característico de la subunidad A de PP2A
I1PP2A/I2PP2A Inhibidores 1 y 2 de PP2A
IC50 Concentración inhibitoria 50
J Joule
JA (Jasmonic acid) Ácido jasmónico
kb Kilobase
L Litro
LCMT (Leucine Carboxyl Methyltransferase) Metiltransferasa de la leucina carboxilo-terminal de
PP2Ac
LD (Long days) Días largos
LEA (Late embryogenesis abundant) Proteínas abundantes en la embriogénesis tardía
LRR (Leucine-Rich Repeat) Repeticiones ricas en leucina
lx Lux
MAPK (Mitogen-activated protein kinase) Quinasa de proteínas activada por mitógenos
10
Abreviaturas
m Metro
M Molar
min Minuto
MOPS Ácido 3-N-morfolino-propanosulfónico
MS Medio Murashige – Skoog
ON (Overnight) Incubación durante toda la noche
p/p Peso/Peso
p/v Peso/Volumen
PAGE (Polyacrylamide gel electrophoresis) Electroforesis en gel de poliacrilamida
pb Pares de bases
PCR (Polymerase chain reaction) Reacción en cadena de la polimerasa
PGA (Polygalacturonic acid) Ácido poligalacturónico
Pi Fosfato inorgánico
Pin1/Pin2 (Proteinase inhibitor 1/2) Inhibidores de proteasas 1 y 2
PME (Phosphatase Methylesterase) Metilestearasa de la leucina carboxilo-terminal de PP2Ac
pNP (p-Nitrophenol) p-Nitrofenol
pNPP (p-Nitrophenyl-phosphate) p-Nitrofenil-fosfato
PP (Protein Phosphatases) Fosfatasas de proteínas
PP2A (Protein Phosphatases type 2A) Fosfatasas de proteínas tipo 2A
PP2Ac Subunidad catalítica de PP2A
PP2AD Dímero formado por las subunidades catalítica y estructural de PP2A
PPM (Metal ion-dependent Protein Phosphatases) Fosfatasas de proteínas dependientes de
metales
PPP (Phosphoprotein Phosphatases) Fosfatasas de fosfoproteínas
PR (Pathogenesis-related) Proteína relacionada con la patogenia
PTPA (Phosphatase Two A Phosphatase Activator) Activador de PP2A
RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) Amplificación del extremo del ADNc
ROS (Reactive oxygen species) Especies reactivas del oxígeno
RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR) PCR con transcripción reversa
RWC (Relative Water Content) Contenido relativo de agua
s Segundo
SD (Short days) Días cortos
SDS Dodecilsulfato de sodio
ssp. Subespecie
T°°m Temperatura de melting
T°°a Temperatura de annealing
T°°amb Temperatura ambiente
Tap42/Tap46 (Type 2A phosphatase-associated protein of 42/46 kDa) Proteína de 42/46 kDa
asociada a PP2Ac
Tas14 (Tomato Abscisic acid and salt stress-inducible protein 14) Proteína tipo dehidrina
TC (Tentative Consensus) Contig generado a partir del ensamble de ESTs
TEMED N,N,N,N'-tetrametilnediamina
TMV Virus del mosaico del tabaco
tNOS Terminador de la transcripción del gen de la nopalina sintetasa
Tris 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
U Unidad enzimática
UTR (Untranslated region) Región no traducida del ARNm
UV Luz ultravioleta
V Volt
v/v Volumen/Volumen
WT (Wild-type) Tipo silvestre
ZR trans-Zeatín Ribósido
11
Introducción
INTRODUCCIÓN
1. Transducción de señales en plantas
La célula vegetal primordial solucionó el problema de la adquisición de energía a través de
una asociación simbiótica con un organismo con capacidad fotosintética. Dada la
característica ubicua de la luz, el movimiento no fue un requerimiento imperativo en la
evolución de las plantas. En cambio, la necesidad de incorporar agua, minerales y energía
lumínica, llevó al surgimiento de morfologías aptas para optimizar la ocupación del espacio
circundante y el aprovechamiento de los recursos disponibles en él. Una estructura
ramificada con crecimiento apical y repeticiones metaméricas cumple con estos
requerimientos además de facilitar la recuperación luego de una lesión. Por esta misma
razón, la especialización de los órganos fue mantenida en un mínimo y no se localizan
funciones críticas en sólo uno o dos tejidos (Trewavas, 2005a, 2009).
Las plantas intentan maximizar el número de descendientes en el marco de los
condicionamientos impuestos por el ambiente externo y por su propia constitución genética.
El espectro cualitativo y cuantitativo de señales recibidas cambia continuamente durante el
desarrollo, y el fenotipo de hojas, tallos y raíces se ajusta plásticamente en cada nueva
situación (Trewavas, 2005a). Aquellos individuos que puedan explotar más eficientemente
los recursos de su entorno y responder de manera adecuada a las señales del ambiente
circundante serán los que logren un mayor éxito reproductivo (Trewavas, 2005b).
1.1 Señales: características y percepción
El ambiente externo experimentado por las plantas presenta una enorme complejidad y el
rango de señales abióticas y bióticas sensadas por ellas es muy diverso. Entre estas
señales externas podemos encontrar aquellas relacionadas con la luz, la disponibilidad de
nutrientes y
agua en el suelo, el dióxido de carbono, la humedad, la temperatura, la
gravedad, el viento, la estructura del suelo, la presencia de plantas vecinas, la herbivoría y el
ataque de patógenos. Por otro lado, existe también una gran cantidad de señales internas:
moléculas reguladoras del crecimiento y desarrollo, señales mecánicas relacionadas con el
crecimiento y la pared celular, metabolitos y señales sistémicas de defensa, entre otras
(Gilroy y Trewavas, 2001; Trewavas, 2005a, 2009) (Figura 1).
12
Introducción
1
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Figura 1 | Estímulos sensados por las plantas. Un amplio rango de señales externas e internas es
monitoreado por las plantas. Estas señales son transducidas e integradas para generar respuestas
que permitan optimizar la incorporación de nutrientes y la supervivencia frente a los desafíos del
ambiente circundante. Adaptada de Gilroy y Trewavas, 2001.
Las señales sensadas por las plantas tienen una intensidad, dirección (o localización)
y duración particular, y estas características pueden cambiar minuto a minuto (Trewavas,
2005a). A su vez, en condiciones naturales, los recursos básicos para el desarrollo de la
planta se presentan en cantidades variables a lo largo del tiempo y se distribuyen
espacialmente en forma de gradientes o mosaicos (Trewavas, 2005b).
13
Introducción
Receptores específicos son capaces de percibir estas señales. Para proveer una
información completa sobre las diferentes características de los estímulos, las plantas
utilizan familias de receptores relacionados. La integración de la información aportada en
conjunto genera entonces una percepción “tridimensional” del estímulo, en tiempo y espacio
(Trewavas, 2009). Como ejemplo, se pueden mencionar los receptores involucrados en la
captación de señales lumínicas: familias de fitocromos, criptocromos y fototropinas que
permiten discriminar diferentes longitudes de onda e intensidades, así como también las
características del fotoperíodo (Christie, 2007; Li y Yang, 2007; Bae y Choi, 2008).
La mayoría de los receptores conocidos se localizan en la membrana plasmática,
aunque también pueden encontrarse en otros lugares de la célula, como el citoplasma o la
pared celular. A su vez, las distintas familias de receptores presentan una gran diversidad
estructural y funcional. Existen receptores quinasas de serina/treonina, receptores basados
en los sistemas bacterianos de dos componentes, receptores relacionados con canales de
membrana, receptores con dominios LRR de interacción proteína-proteína y receptores
asociados a procesos de ubiquitinación (Chow y McCourt, 2006; Humphrey et al., 2007;
Spartz y Gray, 2008; Hanson y Smeekens, 2009; Ho et al., 2009).
1.2 Transducción e integración de señales
Los mecanismos de transducción de señales permiten canalizar, amplificar e integrar los
estímulos recibidos por la planta para la posterior generación de respuestas. En las células
vegetales la transducción se realiza a través de una red construida por una gran variedad de
componentes, entre ellos:
• Segundos mensajeros como calcio (McAinsh y Pittman, 2009), nucleótidos cíclicos
(Newton y Smith, 2004), especies reactivas del oxígeno (Kim et al., 2008; Quan et al.,
2008) y fosfoinositoles (Xue et al., 2009), junto con las enzimas que los generan y/o
regulan sus niveles
• Canales de calcio y proteínas que lo unen, como la calmodulina (Kim et al., 2009)
• Quinasas y fosfatasas de proteínas (Cheng et al., 2002; Luan, 2003; Mishra et al., 2006)
• Proteínas que permiten el anclaje y/o interacción de los componentes de señalización,
como las proteínas 14-3-3 (Oecking y Jaspert, 2009)
• Componentes de las vías de degradación de proteínas (Somers y Fujiwara, 2009)
• Factores de transcripción de diversas familias (Ulker y Somssich, 2004; Olsen et al.,
2005; Ramsay y Glover, 2005)
14
Introducción
El flujo de información a través de la red de transducción puede divergir, ramificarse,
converger, sinergizar e integrarse por entrecruzamiento entre diferentes vías (Trewavas,
2005b). A través de ciclos de retroalimentación positiva o negativa una red de transducción
aumenta su fortaleza. A su vez, la redundancia dada por múltiples isoformas de las
proteínas involucradas y/o por circuitos de control superpuestos asegura el proceso de
señalización. Finalmente, se debe tener en cuenta que algunos elementos de la red son
específicos de una señal mientras que otros son compartidos por distintas vías (Trewavas,
2002). La especificidad está controlada por interacciones proteína-proteína (típicamente
mediadas por proteínas de andamiaje) y por la formación de “microdominios” en los que se
agrupan los segundos mensajeros asociados a una señal y los componentes que funcionan
río abajo de dichos mensajeros (Hetherington y Waterhouse, 2002).
Una propiedad altamente difundida en los sistemas de señalización en plantas es que
las señales usualmente inducen la síntesis de las proteínas que median su transducción
(Gilroy y Trewavas, 2001). Otro tema recurrente es la prevalencia de vías reguladas
negativamente. En estos casos, el estado basal es mantenido por el funcionamiento activo
de la vía en ausencia de la señal (McCarty y Chory, 2000). Un ejemplo de esto es la vía de
transducción del etileno, cuyos receptores están activos en ausencia de la hormona.
Finalmente, existen diferentes niveles temporales en los sistemas de transducción. Los
eventos intracelulares iniciales (en segundos, minutos, horas) consisten en cambios en el
flujo iónico y modificación del grado de fosforilación de proteínas, eventos posteriores (en
horas, días) se relacionan con modulación de la expresión génica y luego (en horas, días,
meses) con modificaciones en la señalización intercelular sistémica (Trewavas, 2009). Por
último, es posible la generación de cambios a nivel de cromatina que pueden persistir por
mucho tiempo e incluso ser heredados (Verhoeven et al., 2010).
Teniendo en cuenta que muchas de las señales mencionadas en la sección anterior
llegan a la planta en forma simultánea, la integración de dichos estímulos es esencial para
la decisión entre señales conflictivas y la determinación de prioridades en la generación de
respuestas (Trewavas, 2009). Cada variable puede modificar la respuesta a otras variables
y, a su vez, su integración estará condicionada por el estado interno de la planta.
A nivel intracelular dicha integración se da por el entrecruzamiento ya mencionado
entre diferentes vías de transducción. Además, la integración a nivel intercelular es
indispensable ya que las plantas están formadas por una red de millones de células
organizadas en tejidos y meristemas que se influyen unos a otros, sin un control
centralizado. La señalización intercelular se basa en componentes físicos (por ejemplo,
señales mecánicas y eléctricas) y químicos (hormonas vegetales, proteínas, péptidos,
15
Introducción
ácidos nucleicos, oligonucleótidos, oligosacáridos, azúcares, aminoácidos y minerales).
Estos son transportados a través de las estructuras simplásticas y apoplásticas que
sustentan la señalización sistémica permitiendo que la planta se comporte como un
organismo integrado (Trewavas, 2005b; Brenner et al., 2006).
1.3 Respuestas: individualidad y plasticidad fenotípica
Las respuestas de las plantas frente a los estímulos recibidos son moduladas por el grado
de desarrollo, las condiciones ambientales previas y “relojes” internos que especifican el
momento del año y del día (Trewavas, 2000).
Una característica de estas respuestas es la individualidad. Este término se utiliza
para describir situaciones en las que células, tejidos o plantas morfológicamente similares
generan respuestas diferentes frente a un dado estímulo. Dependiendo del tipo celular y de
la vía de señalización, el número de moléculas involucradas en la percepción y transducción
será variable. Esto hace que cada célula tenga su propio umbral de sensibilidad y genere
respuestas con características propias en cuanto a intensidad y duración (Gilroy y Trewavas,
2001). En general, cuanto mayor sea la intensidad del estímulo recibido por la planta, mayor
será el número de células en las que se desencadenará una respuesta.
A su vez, las respuestas generadas se basan en la capacidad de un genotipo para
originar múltiples fenotipos. Esta propiedad de denomina plasticidad fenotípica y es
característica del desarrollo de las plantas (Gilroy y Trewavas, 2001). Existen adaptaciones
fenotípicas específicas a nivel de anatomía, morfología, desarrollo, fisiología y reproducción
(Sultan, 2000). La plasticidad permite ajustar el fenotipo para optimizar la obtención de
recursos y responder a los desafíos del ambiente circundante (Trewavas, 2009).
Finalmente, las respuestas pueden darse en diversos niveles, desde cambios sutiles
en el metabolismo hasta la generación o senescencia de diferentes órganos de la planta
(Figura 1). En general, en células “maduras”, las respuestas ocurren a nivel fisiológico y
bioquímico mientras que en células en crecimiento, las respuestas se dan a nivel del
desarrollo y la morfología (Trewavas, 2000).
16
Introducción
2. Fosfatasas de proteínas
Las modificaciones post-traduccionales de proteínas son un mecanismo esencial para la
regulación de la mayoría de los procesos celulares. En particular, la fosforilación reversible
es una forma predominante de señalización y regulación en todos los organismos vivos (Shi,
2009a). Las quinasas y fosfatasas de proteínas son las encargadas del agregado y
eliminación de grupos fosfato sobre diversos residuos aminoacídicos y representan del 2 al
4% de los genes en un genoma eucariota típico (Moorhead et al., 2009).
Las proteínas pueden ser fosforiladas en nueve aminoácidos (tirosina, serina, treonina,
cisteína, arginina, lisina, aspartato, glutamato e histidina); siendo la fosforilación en serina,
treonina y tirosina la modificación predominante en células eucariotas (Moorhead et al.,
2009). Se estima que un tercio de las proteínas en una célula eucariota son fosforiladas
(Virshup y Shenolikar, 2009). Esta modificación covalente puede alterar tanto la
conformación como la función del sustrato, generando proteínas con diferente actividad
según la posición y número de aminoácidos fosforilados (Gilroy y Trewavas, 2001). Además
de alterar la actividad, la fosforilación puede influir en la localización celular, interacción y
estabilidad de las proteínas (Moorhead et al., 2009).
2.1 Clasificación y características generales
Las fosfatasas de proteínas (PP) eucariotas pueden dividirse en dos grandes grupos según
su especificidad de sustrato: fosfatasas de serina/treonina y fosfatasas de tirosina (Tabla 1).
Las fosfatasas de serina/treonina incluyen tres familias (Shi, 2009a):
• Familia PPP (fosfatasas de fosfoproteínas), conformada por las fosfatasas PP1, PP2A,
PP2B (calcineurina), PP4, PP5, PP6, PP7 y fosfatasas con repeticiones tipo kelch (PPKL)
• Familia PPM (fosfatasas de proteínas dependientes de metales), integrada por las
fosfatasas PP2C y las fosfatasas de la piruvato deshidrogenasa (PDP)
• Familia de fosfatasas con catálisis basada en aspartato, representada por las fosfatasas
del dominio carboxilo-terminal de la ARN polimerasa II (FCP/SCP)
A su vez, las fosfatasas de tirosina se dividen en tres clases (Moorhead et al., 2009):
• Clase I, conformada por las fosfatasas de tirosina clásicas y por las fosfatasas de
especificidad dual que desfosforilan tirosinas, serinas y treoninas
• Clase II, integrada por las fosfatasas de tirosina de bajo peso molecular (LMPTP)
• Clase III, representada por las fosfatasas Cdc25 (reguladoras del ciclo de división celular)
17
Introducción
Tabla 1 | Clasificación de las fosfatasas de proteínas. Se indica, para cada grupo de fosfatasas, si
presentan una o más subunidades (estructura monomérica o multimérica, respectivamente) y si han
sido descriptas en plantas.
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La mayoría de las fosfatasas de la familia PPP poseen una estructura multimérica,
donde la combinación de pocas subunidades catalíticas conservadas con un gran número
de subunidades regulatorias determina la especificidad de sustrato, el nivel de actividad y la
localización subcelular. El resto de las fosfatasas de serina/treonina (con excepción de las
PDPs), así como también las de tirosina, contienen dominios catalíticos y regulatorios dentro
de la misma cadena peptídica (Vassylyev y Symersky, 2007; Tabernero et al., 2008; Virshup
y Shenolikar, 2009; Shi, 2009a).
18
Introducción
Con respecto al mecanismo catalítico, las fosfatasas de las familias PPP y PPM
utilizan iones metálicos coordinados en su dominio catalítico para activar una molécula de
agua y así desencadenar la reacción de desfosforilación. Por otro lado, las fosfatasas
FCP/SCP poseen un mecanismo basado en dos residuos de ácido aspártico presentes en
su sitio activo, mientras que las fosfatasas de tirosina catalizan la desfosforilación a través
de un residuo de cisteína de un motivo altamente conservado en su dominio catalítico
(Tabernero et al., 2008; Shi, 2009a).
Como se observa en la Tabla 1, la mayoría de estas enzimas han sido descriptas en
plantas. Cabe destacar que en estos organismos las fosfatasas de tirosina son
marcadamente minoritarias con respecto a las de serina/treonina. Las familias PPP y PPM
son preponderantes y muestran una gran expansión, particularmente evidenciada por las
fosfatasas PP2C (Luan, 2003; Moorhead et al., 2009). Sin embargo, a pesar de algunas
evidencias sobre actividades tipo PP2B (Yang et al., 2009), no se ha identificado en plantas
ningún gen que codifique para una calcineurina típica, homóloga a las de animales.
Las fosfatasas de las familias PPP y PPM presentan diferencias en cuanto a
especificidad de sustrato, sensibilidad a inhibidores y requerimientos de cationes (Wang et
al., 2008). La arquitectura de los dominios catalíticos de ambas familias es similar, a pesar
de no estar relacionadas a nivel de secuencia.
Las fosfatasas de serina/treonina fueron inicialmente clasificadas en Tipo 1 (PP1) y
Tipo 2 (PP2A, PP2B, PP2C) en función de parámetros bioquímicos: las Tipo 1 desfosforilan
preferentemente la subunidad β de la glucógeno fosforilasa quinasa y son inhibidas por las
proteínas termoestables I-1 e I-2 (inhibidor-1 e inhibidor-2) mientras que las Tipo 2
desfosforilan preferentemente la subunidad α de la glucógeno fosforilasa quinasa y son
insensibles a I-1 e I-2 (Wang et al., 2008). A su vez, las fosfatasas Tipo 2 pueden
diferenciarse por sus requerimientos de cationes divalentes, ya que las PP2B son
dependientes de calcio y las PP2C, de magnesio/manganeso (Shi, 2009a). Por último, existe
una serie de toxinas de origen natural (ácido okadaico, microcistina, caliculina A y
cantaridina, entre otras) que inhiben diferencialmente a fosfatasas de la familia PPP sin
afectar a las fosfatasas PPM (Moorhead et al., 2009). Estos compuestos han sido
ampliamente utilizados para estudiar las funciones celulares de estas enzimas en células
vegetales y animales (Luan, 2003).
Finalmente, además de las fosfatasas PP1, PP2A y PP2B, la familia PPP incluye una
serie de fosfatasas menos abundantes que han cobrado importancia en los últimos años:
PP4, PP5, PP6, PP7 y PPKL (Farkas et al., 2007; Wang et al., 2008; Shi, 2009a). Como se
observa en el árbol filogenético de la Figura 2, las subunidades catalíticas de las fosfatasas
19
Introducción
PP2A, PP4 y PP6 están altamente relacionadas mientras que las PPKL son próximas a las
PP1. Por último, las PP5 forman junto con las PP7 un grupo separado de otras PPP.
Figura 2 | Árbol filogenético de la familia PPP de Arabidopsis thaliana. Las secuencias utilizadas
para el análisis filogenético corresponden a las subunidades catalíticas de las fosfatasas de la familia
PPP de A. thaliana. Cada grupo de fosfatasas está indicado con un círculo. PP = fosfatasas de
proteínas; PPP Kelch = fosfatasas de proteínas con repeticiones tipo kelch (PPKL). La barra
representa 0.2 sustituciones aminoacídicas por sitio en la estructura primaria. Los números de
acceso AGI de las fosfatasas son: TOPP1 = At2g29400, TOPP2 = At5g59160, TOPP3 = At1g64040,
TOPP4 = At2g39840, TOPP5 = At3g46820, TOPP6 = At4g11240, TOPP7 = At5g43380, TOPP8 =
At5g27840, PP1 iso8 = At3g05580, PP2A-1 = At1g59830, PP2A-2 = At1g10430, PP2A-3 =
At3g58500, PP2A-4 = At2g42500, PP2A-5 = At1g69960, PPX1 = At4g26720, PPX2 = At5g55260,
PAPP5 = At2g42810, AtFyPP1 = At1g50370, AtFyPP3 = At3g19980, AtPP7 = At5g63870, longPP7 =
At1g48120, inactive PP7 = At5g10900, BSU1 = At1g03445, BSL1 = At4g03080, BSL2 = At1g08420,
BSL3 = At2g27210. Tomada de Farkas et al., 2007.
20
Introducción
2.2 Fosfatasas de proteínas tipo 2A
Las fosfatasas de proteínas tipo 2A (PP2A) son responsables de una parte mayoritaria de la
actividad fosfatasa de serina/treonina en células eucariotas, llegando a representar casi el
1% del total de proteínas en algunos tipos celulares (Sontag, 2001). Estudios bioquímicos y
genéticos demostraron que, además de ser abundantes, las PP2As son ubicuas y muy
conservadas durante la evolución. Estas enzimas poseen un rol dinámico en la señalización
celular y están altamente reguladas. Sus funciones en levaduras y células animales han sido
ampliamente estudiadas y se ha descripto su participación en la regulación del ciclo de
división celular, la dinámica del citoesqueleto, la diferenciación, proliferación y muerte celular
y la síntesis proteica (Virshup, 2000; Janssens y Goris, 2001; Jiang, 2006; Westermarck y
Hahn, 2008).
2.2.1 Diversidad y complejidad estructural
Las fosfatasas PP2A son enzimas multiméricas que, en las células, presentan dos formas
básicas (Figura 3): un heterodímero (PP2AD), formado por una subunidad catalítica de 36
kDa (PP2Ac) unida a una subunidad estructural de 65 kDa (subunidad A o PR65), y un
heterotrímero, producto de la interacción de PP2AD con una subunidad regulatoria (Shi,
2009a). Las subunidades que forman el heterodímero pueden presentar más de una
isoforma y, por otro lado, existen tres familias de subunidades regulatorias: B (también
denominada B55 o PR55), B’ (B56 o PR61) y B’’ (PR48/PR59/PR72/PR130). Una cuarta
familia (B’’’ o PR93/PR110) ha sido también propuesta. Las subunidades regulatorias
muestran escasa similitud de secuencias entre familias. En los últimos años, diversos
análisis cristalográficos han brindado información relevante sobre la diversidad y
complejidad estructural de las PP2As (Shi, 2009b).
La subunidad estructural A contiene 15 repeticiones en tándem de una secuencia
semi-conservada de 39 aminoácidos llamada motivo HEAT. Cada uno de estos motivos
contiene un par de α-hélices antiparalelas y los 15 lazos entre las α-hélices de cada motivo
forman una cadena continua. Esta cadena constituye la interfase de interacción con las otras
subunidades de la holoenzima. En conjunto, los motivos HEAT le confieren a la subunidad A
una estructura alargada, similar a una herradura (Xing et al., 2006). PP2Ac interactúa con
los motivos 11 a 15 (región carboxilo-terminal) mientras que las subunidades regulatorias
reconocen los motivos de la región amino-terminal (Shi, 2009b). La interacción entre las
subunidades genera cambios conformacionales en la subunidad A; esta flexibilidad
estructural sería importante para la formación de la holoenzima y su actividad catalítica.
21
Introducción
PP2Ac posee una estructura globular y contiene dos átomos de manganeso
coordinados en el sitio activo (Xing et al., 2006). El “bolsillo” catalítico de esta subunidad se
encuentra orientado hacia la región amino-terminal de la subunidad A, sitio donde se
produce la unión de las subunidades regulatorias y el reconocimiento de los sustratos.
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Figura 3 | Estructura de PP2A. Estructura de
PP2AD unido a ácido okadaico (A) y del
heterotrímero
unido
a
microcistina
(en
magenta) y conteniendo una subunidad B (B) o
B’ (C). En A y C se muestran en rojo los
metales coordinados en el sitio activo de
PP2Ac. En A se indican en magenta los lazos
de los motivos HEAT de la subunidad A.
Tomada de Shi, 2009b.
Las subunidades regulatorias B contienen 7 repeticiones WD40 y una estructura tipo
β-propeller (Xu et al., 2008). La interacción con la subunidad A ocurre a través de los
motivos HEAT 1 a 7 y existen pocos contactos con PP2Ac. Las subunidades regulatorias
B’ contienen 8 repeticiones similares a motivos HEAT y, por lo tanto, una estructura
alargada que se asemeja a la de la subunidad A (Xu et al., 2006; Cho y Xu, 2007). La
superficie convexa de B’ se asocia con los motivos HEAT 2 a 8 de la subunidad A y la
superficie cóncava se orienta hacia PP2Ac. A diferencia de las subunidades B, las
subunidades B’ establecen numerosos contactos con la subunidad catalítica. Una
característica común de las holoenzimas que contienen subunidades B y B’ es que el
posible sitio de unión del sustrato está localizado en la superficie de la subunidad
regulatoria, en una posición próxima al sitio activo de PP2Ac (Shi, 2009b). Esto indica que
22
Introducción
una de las funciones de estas subunidades sería orientar la fosfoproteína sustrato para su
desfosforilación. Por último, las subunidades regulatorias B’’ y B’’’ contienen motivos EFhand de unión a calcio y repeticiones WD40, respectivamente (Moreno et al., 2000;
Janssens et al., 2003). Por el momento, no existen datos de cristalografía publicados sobre
las holoenzimas que contienen estas subunidades.
Las múltiples combinaciones posibles entre las diferentes isoformas de PP2Ac,
subunidades estructurales y regulatorias generan una gran cantidad de holoenzimas y dan
origen a la alta diversidad funcional de las fosfatasas PP2A.
2.2.2 Regulación
Como se muestra en la Figura 4, las fosfatasas PP2A son altamente reguladas; esto les
permite cumplir una función dinámica en numerosos procesos de señalización celular.
La combinación particular de subunidades de una holoenzima tiene una gran
importancia en la regulación de su actividad, especificidad de sustrato y localización
subcelular (Sontag, 2001; Virshup y Shenolikar, 2009). Las subunidades regulatorias son las
principales responsables de esta diversidad funcional. Distintos heterotrímeros muestran
diversas propiedades cinéticas y diferente sensibilidad frente a compuestos moduladores de
la actividad. Además, la naturaleza de la subunidad regulatoria influye ampliamente en la
especificidad de sustrato de la fosfatasa. Por último, distintas holoenzimas presentan una
expresión diferencial a nivel temporal y espacial, con una distribución diversa en tejidos y
células, llegando incluso a tener una localización subcelular restringida que puede cambiar
en respuesta a una señal.
El extremo carboxilo-terminal de PP2Ac tiene un rol importante en la regulación del
intercambio dinámico de subunidades regulatorias (Janssens et al., 2008). Todas las
secuencias conocidas de PP2Ac contienen en dicho extremo el motivo T304PDYFL309, el cual
es objeto de modificaciones post-traduccionales: metilación de la leucina309, fosforilación de
la tirosina307 y posiblemente también de la treonina304 (las posiciones corresponden a una
PP2Ac de humanos). La fosforilación de este motivo se asocia con la inactivación de la
enzima, mientras que la metilación no afecta en forma directa la actividad. A su vez, ambas
modificaciones influyen diferencialmente en la unión de las subunidades regulatorias. La
metilación es indispensable para la unión de subunidades B pero no es estrictamente
necesaria para la unión de las B’. La fosforilación en tirosina es desfavorable para ambas
interacciones, mientras que la fosforilación en treonina sólo afectaría la incorporación de
subunidades B. Por otro lado, ninguna de estas modificaciones influye en la unión de B’’.
23
Introducción
Finalmente, existen casos en los que la fosforilación de ciertas subunidades regulatorias
también modula la composición y actividad del heterotrímero.
La carboximetilación de PP2Ac es catalizada por una enzima metiltransferasa (LCMT)
y revertida por una metilestearasa (PME). Además de actuar como estearasa, PME puede
formar un complejo estable con PP2A, interactuando con la subunidad catalítica (Shi,
2009b). Como consecuencia de esta unión, PP2Ac pierde los iones coordinados en su sitio
activo y se mantiene catalíticamente inactiva. PTPA, una peptidil-prolil cis/trans-isomerasa
que actúa sobre la prolina190 de PP2Ac, permite la disociación de este complejo y la
reactivación de PP2A (Jordens et al., 2006; Janssens et al., 2008).
La actividad y la localización subcelular de las PP2As pueden ser también moduladas
por otras proteínas capaces de interactuar con las formas diméricas o triméricas de la
fosfatasa y, en algunos casos, con la subunidad catalítica libre (Janssens et al., 2008). Por
ejemplo, en levaduras, la proteína Tap42 interactúa con PP2Ac, formando un heterodímero
que estimula la síntesis proteica en respuesta a la disponibilidad de nutrientes (Janssens y
Goris, 2001).
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789
Figura 4 | Regulación de PP2A. Se resumen en la figura los principales mecanismos que regulan la
especificidad de sustrato, el nivel de actividad y la localización subcelular de las fosfatasas PP2A.
Adaptada de Sontag, 2001.
24
Introducción
Por otro lado, se ha descripto que compuestos como las ceramidas y los policationes
funcionan como activadores de las PP2As, mientras que existen inhibidores proteicos
específicos (I1PP2A e I2PP2A) capaces de interactuar con PP2Ac impidiendo su función
catalítica (Janssens y Goris, 2001; Sontag, 2001). Finalmente, numerosas toxinas de origen
natural son también potentes inhibidores de estas fosfatasas.
2.2.3 Fosfatasas PP2A descriptas en plantas
Las fosfatasas PP2A han sido descriptas en algunas especies vegetales. En Arabidopsis
thaliana se han caracterizado numerosas isoformas de las distintas subunidades de PP2A
(Farkas et al., 2007). Existen en esta especie cinco subunidades PP2Ac, tres subunidades
A, dos subunidades B, nueve B’ y seis B’’ (Tabla 2). La subunidad PP2Ac ha sido también
estudiada en arroz, trigo, alfalfa, tabaco, Nicotiana benthamiana y tomate (Tabla 3). Por otro
lado, es muy poco lo que se sabe sobre las subunidades A y B/B’/B” en otras especies.
Tabla 2 | Subunidades de PP2A descriptas en Arabidopsis thaliana. Se indica, para cada tipo de
subunidad, el total de isoformas encontradas en el genoma de A. thaliana. Algunas de ellas han sido
ampliamente estudiadas a nivel funcional.
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Diversos estudios funcionales han demostrado que las PP2As cumplen roles
importantes en procesos de desarrollo y señalización de hormonas en plantas. La subunidad
estructural RCN1 (Roots Curl in Naphthylphthalamic acid 1) de A. thaliana regula el
transporte polar de auxinas (Garbers et al., 1996; Michniewicz et al., 2007), el crecimiento,
desarrollo y morfología de la raíz (Rashotte et al., 2001; Blakeslee et al., 2008), el fenómeno
de gravitropismo (Muday et al., 2006), la elongación celular (Deruere et al., 1999) y la
señalización de etileno y ácido abscísico (Kwak et al., 2002; Larsen y Cancel, 2003). A su
25
Introducción
vez, la subunidad regulatoria TONNEAU2 de A. thaliana y sus homólogas DCD1 y ADD1
(Discordia 1 y Alternative Discordia 1) de maíz, tienen una función importante en la
organización del citoesqueleto cortical de microtúbulos y en la formación de la banda
preprofásica antes de la mitosis (Camilleri et al., 2002; Wright et al., 2009). Mutaciones en
estos genes afectan la forma y distribución de las células y, por lo tanto, alteran la
morfología de planta en su conjunto.
Tabla 3 | Subunidades catalíticas de PP2A descriptas en otras especies. Se indican las
isoformas de PP2Ac caracterizadas en distintas especies de monocotiledóneas (arroz, trigo) y
dicotiledóneas (alfalfa, tabaco, Nicotiana benthamiana, tomate).
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Por otro lado, algunos reportes indican que estas fosfatasas participan también en vías
de señalización de estrés salino y sequía, altas y bajas temperaturas, daño mecánico y
respuestas a patógenos (Monroy et al., 1998; Rojo et al., 1998; Yu et al., 2003; He et al.,
2004; Yu et al., 2005; Xu et al., 2007).
Son pocos los trabajos publicados sobre las proteínas blanco de estas fosfatasas en
plantas. Se han propuesto como sustratos la nitrato reductasa y la sacarosa-fosfato sintasa
de espinaca (MacKintosh, 1992; Weiner et al., 1993), la fosfoenolpiruvato carboxilasa de
plantas C4 y CAM (Carter et al., 1990; Dong et al., 2001), la H+-ATPasa de membrana
plasmática en A. thaliana y maíz (Camoni et al., 2000; Fuglsang et al., 2006), la telomerasa
de arroz (Oguchi et al., 2004) y, en A. thaliana, la fototropina Phot2, las proteínas PIN y/o
PINOID involucradas en el transporte de auxinas y la proteína CTR1 de la señalización de
etileno (Larsen y Cancel, 2003; Michniewicz et al., 2007; Tseng y Briggs, 2010). La mayoría
de estos sustratos han sido determinados en base a evidencias indirectas y ensayos in vitro,
por lo que deben ser corroborados in vivo.
Con respecto a la localización subcelular, en extractos de plantas se ha detectado
actividad de PP2A tanto en la fracción soluble como en la microsomal (MacKintosh et al.,
26
Introducción
1991). En Nicotiana benthamiana, una PP2Ac fusionada a GFP mostró una localización
nuclear y citoplasmática (Xu et al., 2007). A su vez, las subunidades A de A. thaliana han
sido detectadas en las regiones nuclear, perinuclear, citoplasmática y periférica (asociadas a
membrana plasmática) en células de la raíz (Blakeslee et al., 2008). Por último, se encontró
que las subunidades AtB’α y AtB’β poseen en su secuencia posibles señales de localización
nuclear (Latorre et al., 1997), mientras que estudios de microscopía de fluorescencia
demostraron que AtB’η y AtB’γ se localizan en citosol y núcleo, AtB’ζ en el citoplasma
(posiblemente asociada a la membrana mitocondrial) y AtB’θ en peroxisomas (Matre et al.,
2009).
Las PP2As en plantas son reguladas a nivel transcripcional (Yu et al., 2003) y a través
de la combinación de subunidades que pueden influir en el nivel de actividad (Deruere et al.,
1999) y la localización subcelular (Matre et al., 2009) de la holoenzima. A su vez, se ha
descripto que RCN1 es capaz de unir ácido fosfatídico, un segundo mensajero lipídico
implicado en respuestas a estrés (Testerink et al., 2004) y que las PP2As de A. thaliana
podrían ser reguladas por la ubiquitinación de la subunidad A (Luo et al., 2006). En A.
thaliana se ha caracterizado también una proteína homóloga a Tap42 (denominada Tap46)
que se induce por bajas temperaturas y es capaz de interactuar directamente con PP2Ac
(Harris et al., 1999). Es mucho lo que queda por investigar sobre la regulación de estas
fosfatasas en plantas, en particular, en lo referente a las modificaciones post-traduccionales
de PP2Ac.
3. Modelo biológico: Solanum tuberosum L.
La papa (Solanum tuberosum L.) es una dicotiledónea herbácea anual tetraploide (2n = 4x =
48), perteneciente a la familia Solanaceae (Aversano et al., 2007; Olmstead et al., 2008).
Esta familia agrupa alrededor de 100 géneros y 2500 especies, incluyendo varios cultivos
importantes a nivel mundial como el tomate, el tabaco, la berenjena y el pimiento. De las
2500 especies de solanáceas, aproximadamente 200 (S. tuberosum entre ellas) poseen la
capacidad de tuberizar. S. tuberosum ha sido dividida tradicionalmente en dos subespecies:
S. tuberosum ssp. andigena, cultivada principalmente en la región andina, y S. tuberosum
ssp. tuberosum, cultivada en el resto del mundo. Sin embargo, dado que existe una
compleja diversidad de especies y variedades tanto silvestres como cultivadas, esta
clasificación está siendo reevaluada (Spooner y Hetterscheid, 2006; Spooner et al., 2007).
La planta de papa es nativa de América. Su historia comienza con una gran cantidad
de especies silvestres distribuidas desde el sudoeste de los Estados Unidos de América
hasta el sur de Chile (Spooner y Hetterscheid, 2006). Entre 6000 y 10000 años atrás,
27
Introducción
algunas de estas especies fueron cultivadas por primera vez en la región andina de Perú y
Bolivia. Luego de la colonización española, el primer reporte de este cultivo fuera de
América del Sur corresponde al año 1562 en las Islas Canarias. A partir de ese momento, se
extendió el cultivo de papa a toda Europa y al resto del mundo. El proceso de selección
artificial originó un conjunto de cultivares con cualidades agronómicas mejoradas y
tubérculos de formas y colores más uniformes.
Figura 5 | Dibujo esquemático de una
planta de papa (Solanum tuberosum
L.).
Se
indican
las
3
estructuras
anatómicas principales. Los estolones
3
pueden dar origen a tubérculos o a
nuevos tallos aéreos. Imagen tomada
,
de CIP-FAO Año Internacional de la
Papa (http://www.potato2008.org).
$
' &
Esta planta posee tallos subterráneos denominados estolones a partir de los cuales
se desarrollan los tubérculos (Figura 5). Cuando termina el período de crecimiento, las hojas
y tallos se marchitan y los tubérculos se desprenden, funcionando como depósito de
nutrientes en condiciones ambientales desfavorables. Cada tubérculo tiene en su superficie
varias yemas vegetativas. A partir de estas yemas brotan nuevas plantas cuando las
condiciones son propicias. De este modo, la papa puede reproducirse vegetativamente. Tal
es así, que las variedades comerciales tienen una limitada capacidad de florecer ya que se
propagan a través de “tubérculos semilla”.
El tubérculo de la papa tiene una buena calidad como alimento (Camire et al., 2009).
Es rico en carbohidratos, tiene poca grasa y un contenido de proteínas alto en relación con
otros tubérculos y raíces tuberosas. A su vez, posee una elevada cantidad de vitamina C y
es una buena fuente de vitaminas B1, B2, B3 y B6, además de aportar minerales como
28
Introducción
potasio, fósforo y magnesio. Según datos de la FAO (http://faostat.fao.org), este cultivo
ocupa el cuarto lugar mundial en importancia como alimento luego del maíz, el arroz y el
trigo. Se estima que la producción mundial de papa en 2007 fue de 323 millones de
toneladas, mientras que la Argentina produjo casi 2 millones de toneladas durante el año
2008, siendo así el cuarto productor de América Latina luego de Perú, Brasil y Colombia.
4. Tuberización
La tuberización es un proceso morfofisiológico altamente coordinado que, en las plantas de
papa, ocurre en tallos modificados subterráneos (Sarkar, 2008). Este proceso representa
para la planta un mecanismo de supervivencia e involucra la interacción de numerosos
factores ambientales, bioquímicos y genéticos.
4.1 Factores que regulan el proceso de tuberización
Distintas características del ambiente influyen en el proceso de tuberización (Figura 6). A su
vez, se debe tener en cuenta que la respuesta de la planta frente a un dado estímulo
depende ampliamente de su genotipo, como así también de su edad y estado fisiológicos
(Jackson, 1999). Se sabe que, aún en condiciones favorables para la tuberización, las
plantas no inician este proceso hasta que alcanzan un cierto tamaño o edad (Ewing y Struik,
1992).
4.1.1 Fotoperíodo
Los días cortos (SD) inducen la tuberización en todas las variedades de papa (RodríguezFalcón et al., 2006). Sin embargo existe una variación considerable en el grado de
requerimiento de este estímulo para la formación del tubérculo. En las variedades cultivadas
actualmente, y debido a un proceso continuo de selección artificial, la transición hacia la
formación del tubérculo es relativamente independiente del fotoperíodo. Por otro lado, las
especies silvestres como S. tuberosum ssp. andigena y S. demissum son estrictamente
dependientes de SD para el inicio de la tuberización. Estas especies tuberizan sólo bajo SD
(típicamente 8 h de luz) y no producen tubérculos en condiciones de días largos (LD,
típicamente 16 h de luz). En estas especies se encontró que el factor responsable de la
inducción en SD es la cantidad total de horas de oscuridad, ya que un pulso de luz durante
una noche larga es capaz de bloquear el efecto inductor de SD.
Las hojas son el lugar principal de percepción de la señal del fotoperíodo (RodríguezFalcón et al., 2006). S. tuberosum posee genes homólogos a los reguladores de la floración
29
Introducción
en A. thaliana y se postula que estos podrían estar involucrados en la modulación
fotoperiódica de la tuberización. En este sentido, se determinó que el fitocromo B (PhyB)
regula negativamente la formación del tubérculo (Jackson et al., 1996) y que la sobreexpresión del gen CONSTANS de A. thaliana en plantas de papa retrasa el inicio de la
tuberización en SD (Martínez-García et al., 2002a).
Finalmente, se han encontrado también múltiples interacciones entre la señalización
fotoperiódica y la regulación de la tuberización por parte de las giberelinas (Martínez-García
et al., 2002b).
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Figura 6 | Factores que regulan el proceso de tuberización. Se resumen en la figura los
principales reguladores positivos y negativos del proceso de tuberización. Las flechas representan
niveles altos ( ) o bajos ( ) de los distintos factores.
4.1.2 Temperatura
Las altas temperaturas ejercen un efecto inhibitorio sobre la tuberización. En estas
condiciones, la partición de compuestos fotoasimilados se ve afectada, de modo que los
tubérculos reciben una menor cantidad de los mismos (Jackson, 1999). Las temperaturas
favorables para el desarrollo del tubérculo se encuentran en el rango de 15°C a 25°C (Nam
et al., 2008).
Existen evidencias de que la inhibición por altas temperaturas está mediada por la
modificación en los niveles de algunas hormonas como las giberelinas (Jackson, 1999) y
compuestos relacionados con el ácido jasmónico (Nam et al., 2008).
4.1.3 Intensidad lumínica
Niveles bajos de intensidad lumínica retrasan la tuberización de un modo similar a las altas
temperaturas. Este efecto estaría dado por los menores niveles de sacarosa generados en
condiciones de baja intensidad lumínica como consecuencia de menores tasas
30
Introducción
fotosintéticas. Se propuso también una influencia de la intensidad lumínica sobre los niveles
de giberelinas (Jackson, 1999; Fischer et al., 2008).
4.1.4 Nitrógeno
El proceso de tuberización puede ser alterado mediante la modificación del aporte de
nitrógeno ya sea en forma de amonio o nitrato (Krauss, 1985; Jackson, 1999). Experimentos
realizados con plantas de papa crecidas en hidroponia bajo condiciones inductoras de la
tuberización, mostraron que un aporte continuo de nitrógeno (de 1 a 3 mM) inhibía o
retrasaba marcadamente la formación del tubérculo. Esta inhibición podía revertirse
colocando las plantas en un medio de cultivo sin fuentes de nitrógeno. A su vez, si estas
plantas que habían comenzado a tuberizar recibían una vez más altas cantidades de este
nutriente, la tuberización era nuevamente inhibida. Por otro lado, se observó que la
reducción en el aporte de nitrógeno en plantas sometidas a condiciones no inductoras no
era capaz de estimular el desarrollo del tubérculo.
Los resultados anteriores indican que el nitrógeno no estaría involucrado directamente
en la inducción de la tuberización pero sería capaz de inhibir la formación del tubérculo en
condiciones inductoras. No se conoce con exactitud cuales son los mecanismos a través de
los cuales el nitrógeno ejerce su efecto. Se ha observado que la falta de nitrógeno en el
medio afecta los niveles de ciertas hormonas que modulan la tuberización, entre ellas las
giberelinas (Krauss, 1985) y, por otro lado, se ha propuesto que la relación entre los niveles
de carbohidratos y nitrógeno es importante para la regulación de este proceso (Jackson,
1999).
4.1.5 Sacarosa
La inducción de la tuberización in vitro depende en gran medida de la concentración de
sacarosa en el medio (Xu et al., 1998a). Concentraciones mayores a 2% inducen la
tuberización de una manera dosis-dependiente, siendo el rango de 6% a 8% de sacarosa el
ideal para estimular la formación de tubérculos in vitro.
Otras evidencias que apoyan el rol inductor de la sacarosa en el proceso de
tuberización indican que luego de dos días de exposición a condiciones inductoras, se
observa un incremento en la acumulación de almidón en las hojas, el cual estaría
acompañado por un aumento en la exportación de sacarosa hacia otros órganos de la planta
(Jackson, 1999). Se encontró también que al aumentar los niveles de sacarosa en los
estolones por silenciamiento post-transcripcional de una enzima necesaria para la síntesis
de almidón (la principal sustancia de reserva del tubérculo), se produjo un incremento en el
31
Introducción
número de tubérculos generados por la planta. Por otro lado, el silenciamiento posttranscripcional del transportador de sacarosa StSUT4 dio como resultado la generación de
plantas con una mayor producción de tubérculos y la capacidad de tuberizar en condiciones
no inductoras (Chincinska et al., 2008), reforzando el papel de la sacarosa en la regulación
de la tuberización.
Por último, se han encontrado varias evidencias de una fuerte interacción entre las
vías de señalización de sacarosa y giberelinas que, como se explica a continuación, son las
hormonas más importantes en la regulación de la tuberización (Xu et al., 1998a; Chincinska
et al., 2008; Fischer et al., 2008).
4.1.6 Giberelinas
Las giberelinas o ácidos giberélicos (GAs) conforman un amplio grupo de compuestos
diterpenoides cíclicos, de los cuales sólo una parte son biológicamente activos, entre ellos:
GA1, GA3, GA4 y GA7 (Olszewski et al., 2002). Numerosos trabajos han demostrado que
estas hormonas son importantes reguladores negativos de la tuberización (RodríguezFalcón et al., 2006). El comienzo de este proceso es retrasado por la aplicación de GAs,
mientras que inhibidores de la síntesis de estas hormonas estimulan la tuberización tanto in
vitro como en plantas crecidas en invernáculo. A su vez, el inicio de la formación del
tubérculo se correlaciona con una fuerte disminución en el contenido de GAs en el estolón
(Xu et al., 1998a).
Por otro lado, se ha descripto que la modificación en los niveles de expresión de genes
relacionados con la biosíntesis y el catabolismo de GAs afecta el proceso de tuberización.
Las enzimas GA 20-oxidasa y GA 3-oxidasa catalizan los últimos pasos de la síntesis de
GAs activas (Yamaguchi, 2008). Por el contrario, la GA 2-oxidasa es responsable de la
inactivación de estas hormonas. La sobre-expresión de StGA20ox1 (gen que codifica para
una GA 20-oxidasa de papa) dio origen a plantas altas con tuberización retrasada bajo SD
(Carrera et al., 2000). En contraposición, el silenciamiento post-transcripcional de este gen
resultó en plantas semi-enanas con tuberización temprana en SD. Se encontró también que
StGA2ox1 (gen que codifica para una GA 2-oxidasa de papa) se induce al inicio del
desarrollo del tubérculo en la región subapical del estolón (Kloosterman et al., 2007). La
sobre-expresión de este gen se correlacionó con una tuberización temprana, mientras que
su silenciamiento post-transcripcional retrasó el inicio de este proceso. Por último, se
observó que la inducción de StGA2ox1 es acompañada por una fuerte inhibición de
StGA3ox2 (gen que codifica para una GA 3-oxidasa de papa), lo cual permitiría una rápida
disminución en el contenido de GAs activas en el estolón.
32
Introducción
4.1.7 Otros reguladores de la tuberización
Algunos trabajos han reportado un efecto positivo del ácido abscísico (ABA) en la
tuberización (Rodríguez-Falcón et al., 2006). Sin embargo, la síntesis de esta hormona no
se requiere para su inducción, por lo que se considera que el ABA no tiene un rol importante
en la regulación de la tuberización y que sus efectos positivos se deben a su función como
antagonista de las GAs (Xu et al., 1998a). Algo similar a lo que sucede con el ABA se ha
postulado también para las auxinas. Por otro lado, compuestos relacionados con el ácido
jasmónico (JA) tendrían una función local promotora del crecimiento del tubérculo aunque no
participarían de la señalización inductora (Sarkar, 2008). Un rol similar en el crecimiento del
tubérculo se ha propuesto para las citoquininas (Rodríguez-Falcón et al., 2006). Por último,
se observó que cambios en los niveles de ciertas especies reactivas del oxígeno son
capaces de afectar el proceso de tuberización y que estos efectos estarían dados por
alteraciones en la concentración de GAs (Kim et al., 2007).
4.2 Integración de señales e inducción de la tuberización
Experimentos realizados con plantas injertadas demostraron hace muchos años que un
estímulo móvil inductor de la tuberización es producido en las hojas de plantas expuestas a
condiciones favorables para la iniciación de dicho proceso (Gregory, 1956). En estos
ensayos, un tallo con hojas, derivado de una planta crecida en SD, injertado sobre el tallo
(sin hojas) de una planta crecida en LD fue capaz de desencadenar la tuberización en los
estolones de la planta no inducida. También se ha propuesto la existencia de una señal
móvil inhibitoria (Jackson et al., 1998). Plantas de S. tuberosum ssp. andigena silenciadas
post-transcripcionalmente para el gen PhyB son capaces de tuberizar en SD y LD. Al injertar
un tallo con hojas de estas plantas sobre el tallo (sin hojas) de una planta wild-type (WT) se
observó que esta última fue capaz de tuberizar en LD. Por otro lado, la presencia de hojas
en el tallo WT anulaba este efecto. Estos resultados llevaron a la conclusión de que PhyB es
responsable de la generación y/o transporte de una señal móvil inhibidora de la tuberización
en condiciones de LD.
Este tipo de señalización a distancia ocurre también en el proceso de floración y, en
general, se pueden distinguir tres pasos sucesivos: (1) Inducción en las hojas con la
posterior exportación de la señal móvil (2) Determinación hacia la tuberización en el extremo
del estolón (3) Formación del tubérculo (Suárez-López, 2005). La pérdida de las condiciones
inductoras puede, sin embargo, llevar a una reversión del proceso de tuberización. Las
señales móviles se translocan por el floema y este mecanismo puede ser regulado en
33
Introducción
distintos niveles: síntesis de las señales, transporte hacia los haces vasculares, carga en el
floema, transporte a lo largo del floema, descarga del floema, entrada en los tejidos blanco y
sensibilidad de las células blanco frente a las señales.
Es poco lo que se conoce sobre las señales móviles que regulan la tuberización. Se ha
propuesto que tanto las GAs como la sacarosa podrían formar parte de estas señales; sin
embargo, esto no se ha demostrado con certeza (Jackson et al., 1998; Suárez-López, 2005).
Las evidencias más fuertes indican que el trasporte de moléculas de ARN sería, al menos
en parte, responsable de esta señalización a distancia. El ARNm de un factor de
transcripción denominado StBEL5 ha sido detectado en las células del floema y es capaz de
moverse a través de un injerto, llegando a localizarse en el extremo del estolón. Este
movimiento se origina en la vasculatura de las hojas y pecíolos, es inducido por SD,
regulado por los UTRs del ARNm y se correlaciona con un aumento en la producción de
tubérculos (Banerjee et al., 2006; Banerjee et al., 2009; Hannapel, 2010). Si bien el
fotoperíodo afecta el movimiento de este ARNm, la transcripción del gen StBEL5 en hojas es
activada por luz roja o azul independientemente del fotoperíodo y la intensidad lumínica
(Chatterjee et al., 2007). La proteína StBEL5 interactúa con un factor de transcripción tipo
KNOX llamado POTH1 formando un heterodímero capaz de unirse al promotor del gen
StGA20ox1, inhibiendo de esta forma la síntesis de GAs (Chen et al., 2004). Los niveles de
ARNm de POTH1 son constitutivos en tallos y estolones, mientras que los niveles de ARNm
de StBEL5 se incrementan en dichos tejidos en respuesta a SD (Hannapel, 2010).
Se ha encontrado recientemente que en las plantas S. tuberosum ssp. andigena
silenciadas post-transcripcionalmente para el gen PhyB, los transcriptos de StBEL5 se
mueven libremente desde las hojas hacia el extremo del estolón, aún en LD, y que este
movimiento se correlaciona con la inducción de la tuberización (Martin et al., 2009). A partir
de estos resultados, se postuló que PhyB sería responsable de inhibir la translocación del
ARNm de StBEL5 en LD (Hannapel, 2010). Por otro lado, se reportó también que un
microRNA, miR172, sería un regulador positivo de este proceso de señalización a distancia,
actuando río abajo de PhyB y río arriba de StBEL5 (Martin et al., 2009).
4.3 Cambios anatómicos asociados a la tuberización
Como se mencionó anteriormente, los tubérculos de S. tuberosum se forman a partir de
estolones. Los estolones son tallos subterráneos que crecen a partir de yemas laterales en
la base del tallo principal, por divisiones celulares transversales y elongación de las células
en la región apical (Xu et al., 1998b; Fernie y Willmitzer, 2001). Al inicio de la formación del
tubérculo, la elongación de los estolones se detiene y las células de la médula y la corteza
34
Introducción
aumentan su tamaño y se dividen longitudinalmente (Figura 7). Esto da inicio al
engrosamiento subapical del estolón.
Figura 7 | Cambios morfológicos asociados a la formación del tubérculo. (A) Diagrama de
secciones longitudinales de distintos estadíos del desarrollo del tubérculo en S. tuberosum cv Bintje.
Inicialmente, se muestra el estolón con un haz vascular continuo. Luego se representa el inicio del
engrosamiento subapical, debido principalmente al crecimiento de la médula (gris claro). Finalmente
comienza el engrosamiento de la región perimedular (gris oscuro), que constituye el componente
principal del tubérculo maduro. En paralelo, los haces vasculares pierden continuidad y quedan
distribuidos irregularmente en la región perimedular. Se indican con números las posiciones de los
nudos del tallo modificado en la zona de formación del tubérculo. Ø: diámetro. Tomada de Xu et al.,
1998b. (B) Foto mostrando los estadíos sucesivos en la formación del tubérculo de S. tuberosum cv
Spunta, variedad utilizada en este trabajo de tesis.
Cuando los tubérculos alcanzan un cierto diámetro (0.8 cm para la variedad Bintje), las
divisiones longitudinales cesan y, en la región perimedular, las células comienzan a dividirse
en planos orientados al azar y aumentan su tamaño. Este proceso continúa hasta que el
tubérculo finaliza su desarrollo.
35
Introducción
Los cambios en los planos de división celular durante la tuberización estarían
regulados por las GAs (Rodríguez-Falcón et al., 2006). Estas hormonas promueven la
elongación del estolón ya que inducen una orientación transversal de los microtúbulos
corticales. Por otro lado, niveles bajos de GAs permiten la reorientación de los microtúbulos
hacia direcciones longitudinales y oblicuas permitiendo la expansión radial del tubérculo.
La generación del tubérculo es acompañada por otros cambios morfológicos en la
planta (Ewing y Struik, 1992; Martínez-García et al., 2002b). Las hojas se hacen más
grandes y finas, adoptando un color verde pálido, los tallos se vuelven más gruesos y se
frena su elongación, se inhibe la ramificación de la planta, los pimpollos frenan su desarrollo
y se acelera la senescencia.
Los tubérculos son entonces tallos subterráneos modificados, con entrenudos cortos
engrosados y pequeñas hojas escamosas que protegen las yemas axilares dormidas,
conocidas como “ojos” del tubérculo (Rodríguez-Falcón et al., 2006). Cumplen la doble
función de ser órganos de reserva y sistema de propagación vegetativa. Una vez formados,
los tubérculos atraviesan un período de endodormición, en el cual no forman brotes aún en
condiciones favorables (Fernie y Willmitzer, 2001; Sonnewald, 2001). La duración de este
período (generalmente de unos pocos meses) depende de las características genéticas de
la planta y de las condiciones ambientales durante la tuberización, y se postula que este
proceso es regulado hormonalmente. Cuando las yemas axilares se reactivan dan origen a
nuevas plantas, idénticas genéticamente a la planta madre.
4.4 Cambios metabólicos y moleculares asociados a la tuberización
Los cambios morfológicos ocurridos durante la tuberización son acompañados por cambios
masivos en la fisiología, el metabolismo y los perfiles de expresión génica de la planta
(Fernie y Willmitzer, 2001). Durante su crecimiento, los tubérculos se transforman en el
principal destino metabólico de la planta, acumulando grandes cantidades de carbohidratos
(principalmente almidón) y también una cantidad significativa de proteínas. Luego, al
finalizar su desarrollo, disminuyen su actividad metabólica general, convirtiéndose en típicos
órganos de reserva.
Con respecto a la ruta de entrada de la sacarosa al tubérculo en formación, se ha
descripto que, en paralelo con las primeras señales visibles de la tuberización, ocurre una
transición desde el transporte apoplástico (predominante en el estolón) hacia el transporte
simplástico (Viola et al., 2001). Este cambio sería el responsable de la inducción de varios
genes involucrados en el metabolismo de la sacarosa. A su vez, ocurre en paralelo una
marcada disminución de la degradación de sacarosa por acción de invertasas, mientras que
36
Introducción
la vía de degradación dependiente de la sacarosa sintasa (SuSy) se vuelve predominante
(Appeldoorn et al., 1997).
Sacarosa
Sacarosa
Almidón
Glicólisis
Ciclo TCA
Respiración
Figura 8 | Conversión de sacarosa en almidón durante la formación del tubérculo. Se muestra
la vía de síntesis de almidón a partir de sacarosa y su compartimentalización en tubérculos de papa.
Fru, F: fructosa; Glc, G: glucosa; P: fosfato; Pi: fosfato inorgánico; PPi: pirofosfato inorgánico; ATP:
adenosina 5’-trifosfato; ADP: adenosina 5’-difosfato; UTP: uridina 5’-trifosfato; UDP: uridina 5’difosfato; PGA: ácido 3-fosfoglicérico; TCA: ciclo de los ácidos tricarboxílicos. (1) Sacarosa sintasa
(2) UDP-glucosa pirofosforilasa (3) Sacarosa-fosfato sintasa (4) Fructoquinasa (5) Fosfoglucomutasa
citosólica (6) Fosfoglucoisomerasa (7) Translocador de hexosa-fosfato (8) Translocador de triosafosfato (9) Fosfoglucomutasa plastídica (10) ADP-glucosa pirofosforilasa (11) Almidón sintasa soluble
(12) Almidón sintasa unida a gránulos (13) Enzima ramificadora (14) Translocador de adenilato.
Tomada de Geigenberger, 2003.
El almidón, sintetizado y almacenado en amiloplastos, constituye el 80% del peso
seco y entre el 15% y el 25% del peso fresco de los tubérculos (Fernie y Willmitzer, 2001).
La conversión de sacarosa en almidón constituye el flujo metabólico dominante durante la
formación del tubérculo (Figura 8) y las enzimas involucradas están altamente reguladas
37
Introducción
(Geigenberger, 2003; Geigenberger et al., 2004). En particular, el control principal de la
acumulación de almidón se encuentra en la transferencia de adenilato entre el citosol y el
amiloplasto.
Por otro lado, aproximadamente el 2% del peso fresco de un tubérculo está
conformado por proteínas, las que funcionan como reserva de nitrógeno (Fernie y Willmitzer,
2001). La proteína de reserva más abundante es la patatina, una glicoproteína vacuolar de
40 kDa que representa el 40% del total de proteínas solubles del tubérculo (Shewry, 2003).
La patatina constituye en realidad una familia de proteínas codificadas por múltiples genes
(Stupar et al., 2006). Estos genes se dividen en Clase I y Clase II según la presencia o
ausencia de una secuencia de 22 nucleótidos en su región 5’-UTR y presentan perfiles de
expresión diferenciales. La patatina presenta actividad enzimática como fosfolipasa A (Rydel
et al., 2003) y como antioxidante (Liu et al., 2003). Además, se ha descripto que esta
proteína tiene propiedades antimicrobianas e insecticidas (Strickland et al., 1995; Sharma et
al., 2004).
Los inhibidores de proteasas constituyen el segundo grupo en importancia dentro de
las proteínas del tubérculo (Agrawal et al., 2008). Existe un amplio espectro de inhibidores
con distintas especificidades; entre ellos, los inhibidores Pin1 y Pin2 junto con los inhibidores
de tipo Kunitz son los más abundantes. Además de cumplir funciones como proteínas de
reserva y de defensa contra el ataque de insectos, algunos de estos inhibidores participarían
en la regulación de la acumulación de proteínas en el tubérculo (Weeda et al., 2009).
A nivel molecular, el desarrollo del tubérculo es un proceso complejo que implica la
regulación de una gran cantidad de genes. Diversos estudios de transcriptómica
(Kloosterman et al., 2005; Kloosterman et al., 2008) y proteómica (Lehesranta et al., 2006;
Agrawal et al., 2008) han comenzado a dilucidar las características de estos eventos
moleculares.
En estos trabajos se observó que durante el proceso de tuberización se producen
cambios en la expresión de numerosos genes relacionados con el metabolismo de
carbohidratos. La transcripción del gen que codifica para la enzima SuSy aumenta
marcadamente mientras que se produce una disminución en la expresión de los genes de
las invertasas solubles. A su vez, se incrementa la transcripción de genes de enzimas
involucradas en la síntesis de almidón, como la sintasa de almidón soluble y la sintasa de
almidón unida a los gránulos. Se encontró también que al comienzo de la tuberización se
produce una inducción transitoria de genes relacionados con el ciclo celular y la traducción,
acompañada por una disminución transitoria en la expresión de genes asociados al
citoesqueleto.
38
Introducción
Por otro lado, a nivel del proteoma, se observó que el desarrollo del tubérculo se
caracteriza por una importante acumulación de las proteínas de reserva junto con enzimas
involucradas en reacciones de defensa como los inhibidores de proteasas o proteínas
relacionadas con la patogenia (proteínas PR). También se detectó un incremento de las
enzimas que metabolizan las especies reactivas del oxígeno, mientras que las aquellas
relacionadas con el metabolismo primario disminuyen su abundancia en los tubérculos
maduros.
5. Transducción de señales en condiciones de estrés
Se define como estrés cualquier condición adversa que impide el normal funcionamiento y
desarrollo de un sistema biológico (Bray et al., 2000). El estrés puede ser de origen biótico,
impuesto por otros organismos, o abiótico, producto de un exceso o déficit de algún factor
físico o químico en el ambiente. Las plantas están normalmente expuestas a numerosas
condiciones adversas, entre ellas: temperaturas extremas, alta salinidad en el agua y el
suelo, sequía, inundaciones, herbivoría y ataque de patógenos como hongos, bacterias y
virus (Mahajan y Tuteja, 2005). Estos factores de estrés les impiden expresar todo su
potencial genético y limitan la productividad de los cultivos.
A nivel molecular, las condiciones de estrés activan una red de señalización compleja
que controla la percepción de los estímulos bióticos y abióticos, la transducción de las
señales y la regulación coordinada de los niveles de distintas hormonas (Shao et al., 2007).
Todo esto permite la generación de respuestas para mitigar los afectos adversos de dichas
condiciones. Por otro lado, el estrés siempre ocurre en el contexto de la interacción de
diversos factores ambientales y las redes de señalización asociadas a todos los estímulos
percibidos interactúan entre sí (Chinnusamy et al., 2004).
5.1 Estrés abiótico
El estrés abiótico es la causa principal de disminución en el rendimiento de los cultivos en el
mundo (Wang et al., 2003). Este tipo de estrés desencadena en las plantas numerosos
cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares. A nivel celular, el plegado y
funcionamiento de las proteínas, así como también la integridad de las membranas se ven
afectados (Vinocur y Altman, 2005). Las redes moleculares asociadas a la percepción y
transducción del estrés abiótico son altamente complejas e involucran una gran cantidad de
componentes (Figura 9). Estas cascadas de señalización llevan a la activación de
mecanismos para restablecer la homeostasis.
39
Introducción
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Figura 9 | Cambios moleculares asociados al estrés abiótico. Se representan en el esquema los
componentes principales de la señalización frente a estrés abiótico. SOD: superóxido dismutasa;
APX: ascorbato peroxidasa; GR: glutatión reductasa; CAT: catalasa; HSP: proteínas de shock
térmico; LEA: proteínas abundantes en la embriogénesis tardía. Adaptada de Vinocur y Altman,
2005.
En general, los estreses abióticos primarios producen en las plantas efectos
secundarios similares, como estrés osmótico y estrés oxidativo. Una vez que se produce la
percepción del estrés, se inician vías de transducción que involucran la generación de
segundos mensajeros, en especial, calcio, especies reactivas del oxígeno (ROS) y
fosfoinositoles (Mahajan y Tuteja, 2005). Estas moléculas pueden regular cascadas de
40
Introducción
fosforilación y desfosforilación de proteínas, que modulan a su vez diversos factores de
transcripción. De esta forma se modifica la expresión de numerosos genes que codifican
para proteínas involucradas en la señalización o en el restablecimiento de la homeostasis
celular. Además, se producen modificaciones a nivel post-transcripcional, traduccional y
post-traduccional que regulan la abundancia y actividad de las proteínas (Hirayama y
Shinozaki, 2010).
Numerosos componentes accesorios participan en la modificación y ensamble de los
complejos de transducción, entre ellos, las enzimas que metilan, ubiquitinan o agregan
grupos lipídicos a otras proteínas y las proteínas de andamiaje (Mahajan y Tuteja, 2005).
Finalmente, estos procesos suelen ir asociados a circuitos de retroalimentación positiva y/o
negativa y a la modificación de los niveles de hormonas como el ABA, las cuales amplifican
la señal e inician nuevas rondas de transducción.
5.1.1 Estrés por bajas temperaturas
Cada especie vegetal tiene un rango óptimo de temperaturas para su desarrollo. Muchas
plantas, especialmente aquellas nativas de hábitats cálidos, muestran síntomas de daño
cuando son expuestas a temperaturas menores a los 10°C - 15°C (Mahajan y Tuteja, 2005).
Entre estos síntomas se encuentran una menor expansión foliar, marchitamiento, clorosis,
necrosis y alteraciones en el desarrollo reproductivo. Temperaturas menores a los 0°C
generan daños aún mayores debido a la formación de cristales de hielo en los tejidos. Estos
cristales producen daños mecánicos en la estructura de las células y su formación genera
una severa deshidratación. Algunas especies son capaces de tolerar el congelamiento si
previamente han sido expuestas a bajas temperaturas (Chinnusamy et al., 2007). Este
proceso se denomina aclimatación al frío.
A nivel celular, las bajas temperaturas producen inhibición directa de la actividad
metabólica, aumento en la rigidez de las membranas y deshidratación. Esto afecta la
integridad de las membranas, con el consiguiente escape de solutos, pérdida de la
compartimentalización celular e inhibición de la fotosíntesis (Mahajan y Tuteja, 2005). Se ha
propuesto que uno de los mecanismos de percepción de este estrés es justamente la
disminución en la fluidez de las membranas, junto con cambios en la conformación de
proteínas y ácidos nucleicos y/o alteraciones en la concentración de determinados
metabolitos (Chinnusamy et al., 2007). La transducción de señales asociadas al frío se da
en parte a través de la generación de ROS, aumentos en la concentración de calcio en el
citosol y modulación de la actividad de quinasas y factores de transcripción. Por otro lado,
41
Introducción
hormonas como el ABA y las GAs mediarían algunos de los efectos y respuestas frente a
este estrés (Penfield, 2008).
Entre otras respuestas, el estrés por frío induce la acumulación de compuestos
osmoprotectores como azúcares y prolina, así como también la inducción de genes que
codifican para proteínas de tipo LEA (Mahajan y Tuteja, 2005; Chinnusamy et al., 2007). Por
otro lado, se produce un incremento de la síntesis de ácidos grasos poli-insaturados con el
fin de favorecer la fluidez de las membranas (Penfield, 2008).
5.1.2 Estrés por alta salinidad
Altas cantidades de sal (típicamente NaCl) en el agua o el suelo desencadenan un
desbalance osmótico en la planta, de manera similar a una condición de sequía (Mahajan y
Tuteja, 2005). Este desbalance osmótico es acompañado por un desequilibrio iónico. A su
vez, el Na+ resulta tóxico para el metabolismo celular. El estrés salino produce una
disminución en la tasa de crecimiento, limitando de esta forma la productividad de la planta
(Parida y Das, 2005). Los niveles de clorofila y carotenoides disminuyen, la estructura de los
cloroplastos se desorganiza y la tasa fotosintética se reduce. Por otro lado, niveles altos de
Na+ impiden la normal incorporación de K+, un elemento esencial requerido por las plantas
en altas cantidades.
Se asume que tanto el componente osmótico como el componente iónico del estrés
salino son sensados por las células vegetales, aunque se desconoce la identidad de los
receptores de estos estímulos (Zhu, 2003). Una de las vías de transducción asociadas al
componente iónico ha sido caracterizada y se conoce como vía SOS (Salt Overly Sensitive)
(Bertorello y Zhu, 2009). El estrés salino induce un aumento en la concentración de calcio
intracelular. Este aumento es sensado por la proteína SOS3, la cual interactúa con la
quinasa SOS2 de manera calcio-dependiente. De esta forma SOS2 se activa y es capaz de
fosforilar a SOS1, un antiporter de Na+/H+ localizado en la membrana plasmática. Al ser
fosforilado, SOS1 bombea Na+ hacia el apoplasto. Además, el complejo SOS3-SOS2 activa
transportadores del tonoplasto que permiten la acumulación de Na+ en la vacuola. Se
postula también que este complejo podría regular negativamente los transportadores
utilizados por el Na+ para entrar a la célula (Zhu, 2003).
Además de las respuestas tendientes a restablecer la homeostasis iónica, las células
vegetales buscan evitar la pérdida de agua mediante la acumulación de solutos
compatibles (Parida y Das, 2005). Estos solutos son metabolitos osmóticamente activos
que no interfieren con el metabolismo e incluyen la prolina, la glicina-betaína, los azúcares y
polioles como el manitol. Estos solutos compatibles colaboran con el ajuste osmótico de la
42
Introducción
célula y protegen las estructuras celulares y macromoléculas frente al incremento de la
fuerza iónica en el medio. Por otro lado, el estrés salino desencadena la producción de
grandes cantidades de ROS. Para eliminar estos compuestos, la actividad de distintas
enzimas antioxidantes como la catalasa y la superóxido dismutasa aumenta en condiciones
de estrés. A su vez, los solutos compatibles también colaboran en la eliminación de
radicales libres.
Finalmente, en condiciones de alta salinidad, se produce un incremento significativo en
los niveles de la hormona ABA (Parida y Das, 2005). El ABA induce la expresión de
numerosos genes de respuesta a estrés y promueve el cierre de los estomas en situaciones
de estrés osmótico.
5.2 Herbivoría
El 45% de las especies de insectos se alimentan de plantas. La interacción entre las plantas
y los insectos fitófagos se ha moldeado durante millones de años, de modo que las distintas
especies vegetales han desarrollado sofisticados sistemas de percepción y generación de
respuestas frente a la herbivoría (Wu y Baldwin, 2009).
Frente a este tipo de estrés, las plantas son capaces de percibir patrones moleculares
asociados a la herbivoría (HAMPs), los cuales pueden ser clasificados en dos categorías: (1)
elicitores químicos presentes en las secreciones orales de los herbívoros y en los fluidos
asociados a la oviposición y (2) señales originadas en los patrones específicos de daño
mecánico. Entre los elicitores químicos se encuentran proteínas, como la β-glucosidasa
presente en las secreciones orales de algunos insectos, y péptidos como las inceptinas, que
son productos de la proteólisis de la ATP sintasa del cloroplasto (Wu y Baldwin, 2009).
Cuando esta enzima es digerida en el intestino de algunos lepidópteros se originan las
inceptinas, las cuales al ser reintroducidas en la planta funcionan como una señal de
herbivoría. Entre los elicitores químicos también se encuentran compuestos conjugados
formados por ácidos grasos derivados de las plantas y aminoácidos aportados por los
insectos. La conjugación de estas moléculas tiene lugar en el intestino del insecto y el
producto final es una molécula con propiedades anfifílicas que puede formar canales en las
membranas e inducir respuestas de defensa en las plantas. Por otro lado, el daño
mecánico es una consecuencia inevitable de la herbivoría (Maffei et al., 2007a). La
extensión y la intensidad del daño así como también la frecuencia y la forma de alimentación
del insecto aportan señales particulares que pueden ser utilizadas por las plantas para
generar respuestas específicas hacia distintos herbívoros.
43
Introducción
Como respuesta, las plantas reconfiguran su metabolismo y producen compuestos que
resultan tóxicos, repelentes o que dificultan el proceso de digestión en los herbívoros (Wu y
Baldwin, 2009). Entre ellos se encuentran compuestos alcaloides, fenólicos e inhibidores de
proteasas. Existen también barreras físicas que funcionan como defensas directas: la
cutícula, los tricomas y las espinas. Por otro lado, las plantas atacadas pueden emitir
compuestos volátiles o producir néctar extrafloral para atraer a los predadores de los
insectos fitófagos, generando una vía indirecta de defensa. Todas estas respuestas implican
un costo metabólico y son fuertemente reguladas a nivel espacial y temporal para mantener
un equilibrio entre crecimiento y defensa.
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#Figura 10 | Transducción de señales asociadas a herbivoría. La percepción de los elicitores
químicos y el daño mecánico desencadena vías de señalización dependientes e independientes de
JA que llevan a la inducción de diversos genes. La sistemina es una hormona peptídica generada en
las células del parénquima del floema que estimula la síntesis de JA en los haces vasculares. Esto
promueve la señalización a distancia y la defensa sistémica.
La percepción de los estímulos asociados a la herbivoría es seguida por la
despolarización de la membrana plasmática, el aumento de los niveles citoplasmáticos de
calcio y la activación de quinasas de proteínas activadas por mitógenos (MAPKs) y quinasas
de proteínas dependientes de calcio (CDPKs). Además se estimula la producción de ROS y
44
Introducción
se modifican los niveles de distintas hormonas y mensajeros químicos como el JA, el etileno,
el óxido nítrico y la sistemina (Ryan y Pearce, 2003; Howe, 2004; Maffei et al., 2007b; Wu y
Baldwin, 2009; Onkokesung et al., 2010). En particular, el JA es la hormona más importante
en las interacciones planta-herbívoro y se ha descripto que su forma conjugada con el
aminoácido isoleucina (JA-Ile) cumple un rol esencial en la inducción de las respuestas de
defensa frente a este estrés (Figura 10).
Por otro lado, a partir de la zona dañada se inicia un mecanismo de señalización a
distancia que induce respuestas de defensa en tejidos de la planta que no han sido
atacados (Schilmiller y Howe, 2005). Diversos estudios realizados en plantas de tomate han
aportado evidencias de que los jasmonatos serían la señal sistémica móvil responsable de
este proceso. A su vez, la sistemina, un péptido descripto en especies de la familia
Solanaceae, regula positivamente la defensa sistémica amplificando la producción de JA en
los tejidos vasculares. Finalmente, compuestos volátiles como los terpenos y el metiljasmonato (MeJA) son liberados por la planta dañada y pueden estimular respuestas de
defensa en plantas adyacentes (Wu y Baldwin, 2009).
5.3 Interacciones planta-patógeno
En su ambiente natural las plantas son afectadas por diferentes tipos de patógenos: hongos,
oomicetes, bacterias, virus y nematodos. Los mecanismos de defensa que se ponen en
marcha son complejos y presentan múltiples niveles (da Cunha et al., 2006). Las plantas
utilizan barreras físicas y químicas preformadas para impedir la entrada del patógeno y el
inicio de la infección, y también cuentan con una gran variedad de mecanismos de defensa
que se inducen luego del reconocimiento del patógeno. Estas defensas inducibles involucran
cambios a nivel molecular, bioquímico y metabólico.
El sistema inmune de las plantas se representa con un modelo de “zig-zag” (Jones y
Dangl, 2006). Patrones moleculares asociados a patógenos o, en general, microbios
(PAMPs o MAMPs) son sensados por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) y
esto resulta en un proceso de inmunidad desencadenada por PAMPs (PTI). Los
patógenos pueden secretar efectores capaces de suprimir la respuesta PTI, generando una
situación de susceptibilidad mediada por efectores (ETS). A su vez, la planta puede
reconocer el efector y activar la inmunidad desencadenada por efectores (ETI, Figura 11).
Los PAMPs son patrones moleculares conservados en los patógenos (Zipfel, 2009).
Uno de los PAMPs más estudiados es la proteína flagelina presente en las bacterias. Los
receptores PRR son típicamente proteínas transmembrana, por lo que la inmunidad de tipo
PTI se desencadena a nivel de la membrana plasmática (Jones y Dangl, 2006). Por otro
45
Introducción
lado, el proceso de ETI se inicia en general dentro de la célula y utiliza como receptores a
las proteínas polimórficas R codificadas por los genes de resistencia R. Estas proteínas
detectan la presencia de efectores del patógeno ya sea de forma directa (interactuando
directamente con los efectores) o indirecta (monitoreando la integridad de los blancos
celulares de dichos efectores). Los efectores del patógeno contribuyen a su virulencia
alterando las funciones de la célula vegetal. Aquellos que son detectados por los receptores
R se conocen como proteínas de avirulencia (Avr). Además de las moléculas derivadas de
los patógenos, las plantas también pueden reconocer señales provenientes de los tejidos
dañados durante la infección (Hematy et al., 2009; Zipfel, 2009). Estas señales se conocen
como patrones moleculares asociados al daño (DAMPs) e incluyen oligosacáridos liberados
a partir de la pared celular vegetal, como el ácido oligogalacturónico, y algunos péptidos
endógenos.
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Figura 11 | Modelo “zig-zag” del sistema inmune de las plantas. Se representan las principales
fases de las respuestas frente a patógenos. Los ciclos de ETS y ETI se repiten a medida que la
selección favorece la aparición de efectores y proteínas R nuevas o modificadas. Las abreviaturas se
encuentran aclaradas en el texto. Adaptada de Jones y Dangl, 2006.
El proceso de PTI se asocia con el incremento de los niveles intracelulares de calcio,
la generación de un estallido oxidativo, la síntesis de óxido nítrico, la activación de MAPKs,
la inducción de genes de respuesta a patógenos, la producción de enzimas líticas y
compuestos antimicrobianos junto con la deposición de calosa y lignina para reforzar la
pared celular en los sitios de infección (Chisholm et al., 2006; da Cunha et al., 2006;
Desender et al., 2007). Estas respuestas ayudan a prevenir el avance del patógeno. Por otro
46
Introducción
lado, la inmunidad de tipo ETI es una versión más rápida e intensa de la inmunidad PTI y
culmina, en general, con la inducción de un mecanismo similar a la muerte celular
programada, conocido como respuesta hipersensible (HR). La HR tiene lugar en el sitio de
infección y es efectiva contra patógenos que crecen en tejidos vivos (biótrofos) pero no
contra los necrótrofos, que matan los tejidos de la planta durante su colonización (Jones y
Dangl, 2006).
En el caso de los virus, el principal mecanismo de defensa de las plantas consiste en
la degradación del ARN viral (Chisholm et al., 2006; Ding y Voinnet, 2007; Alvarado y
Scholthof, 2009). La mayoría de los virus vegetales poseen genomas de ARN. Estructuras
secundarias del ARN viral o intermediarios de su replicación pueden originar moléculas de
ARN doble cadena que desencadenan el proceso de silenciamiento. De esta forma se frena
la dispersión sistémica del virus. A su vez, los virus suelen poseer efectores capaces de
suprimir el mecanismo de silenciamiento. Las plantas pueden reconocer estas proteínas
supresoras (u otras proteínas virales) dando lugar a un proceso de inmunidad de tipo ETI.
Por otro lado, el proceso de infección se asocia con cambios en los niveles de distintas
hormonas (Spoel y Dong, 2008; Bari y Jones, 2009). Dependiendo del tipo de interacción
planta-patógeno, diferentes hormonas actúan como reguladores positivos o negativos de la
defensa. En general, el ácido salicílico media las respuestas contra los biótrofos mientras
que el JA y el etileno son predominantes contra los necrótrofos (Figura 12). Otras hormonas
como el ABA, las auxinas, las GAs, las citoquininas y los brasinosteroides participarían
también de estos procesos. A su vez, los patógenos son capaces de manipular los
mecanismos regulatorios de la defensa mediante la producción de fitohormonas o
sustancias análogas. Esto genera un desbalance hormonal con la consiguiente activación de
respuestas inapropiadas, lo que favorece la colonización por parte del patógeno.
Las respuestas de defensa pueden ser también activadas en zonas de la planta que
aún no han sido colonizadas. Este proceso se denomina resistencia sistémica adquirida
(SAR) y requiere una señal sistémica móvil que se transloque desde el órgano colonizado
hacia el resto de la planta (Shah, 2009). El metil-salicilato, los jasmonatos, el ácido azelaico
y un compuesto diterpenoide han sido implicados en este proceso de señalización a
distancia. Por el contrario, las auxinas regularían negativamente la vía de SAR. Además de
las moléculas que se translocan por la vasculatura, compuestos volátiles también
participarían de este mecanismo.
47
Introducción
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Figura 12 | Regulación hormonal de las repuestas a patógenos. Las flechas indican una
regulación positiva o activación y las líneas cortadas una regulación negativa o represión. El ABA
puede regular positiva o negativamente la resistencia a necrótrofos dependiendo del patógeno. SA:
ácido salicílico; JA: ácido jasmónico; ET: etileno; ABA: ácido abscísico; GA: giberelina; CK:
citoquininas; BR: brasinosteroides. Adaptada de Bari y Jones, 2009.
48
Resultados Previos
RESULTADOS PREVIOS
Si bien se ha avanzado en el conocimiento de los cambios en la expresión génica y el
metabolismo asociados a la tuberización en Solanum tuberosum, los eventos que
transducen las señales reguladoras de este proceso no se conocen en detalle.
A partir de 1993, se comenzaron a estudiar en nuestro laboratorio los eventos
morfogenéticos asociados a la tuberización en la planta de papa. Para ello se estandarizó y
caracterizó bioquímica e histológicamente un sistema de tuberización in vitro (Ulloa et al.,
1997). En la búsqueda de eventos regulados por fosforilación durante el desarrollo del
tubérculo, se identificó a nivel bioquímico e inmunológico una quinasa tipo CDPK cuya
actividad es máxima al iniciarse el engrosamiento del estolón (MacIntosh et al., 1996).
Posteriormente, a partir de una biblioteca de ADNc de estolones inducidos a tuberizar,
se aislaron clones correspondientes a tres isoformas de CDPK, dos de las cuales se
inducen durante la tuberización (Raíces et al., 2001; Raíces et al., 2003a). Se encontró
también que el tratamiento con sacarosa de plantas de papa crecidas in vitro es capaz de
inducir la expresión de una de estas quinasas y que dicha inducción puede ser bloqueada
por inhibidores de fosfatasas PP1/PP2A (Raíces et al., 2003c). Por otro lado, en respuesta a
altas concentraciones de sacarosa, se detectó un incremento en la actividad de quinasas
CDPK y fosfatasas de serina/treonina (Raíces et al., 2003b).
Finalmente, a partir de una biblioteca de ADNc de estolones inducidos a tuberizar y
utilizando como sonda un fragmento parcial de la secuencia de la subunidad catalítica
PP2A-5 de Arabidopsis thaliana, se identificaron tres clones correspondientes a
subunidades catalíticas de fosfatasas tipo PP2A (Raíces, 2003). Se observó también que al
menos una de estas isoformas se induce durante la tuberización.
Además de estudiar la transducción de señales asociada al proceso de tuberización,
en nuestro laboratorio se caracterizó la participación de quinasas CDPK en las respuestas a
estrés (Chico et al., 2002; Capiati et al., 2006). Estos trabajos se realizaron en plantas de
tomate (Solanum lycopersicum) y demostraron la importancia de los procesos de
fosforilación de proteínas en la señalización frente a daño mecánico, estrés biótico y abiótico
en solanáceas.
49
Hipótesis y Objetivos
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Teniendo en cuenta los resultados previos de nuestro laboratorio y los estudios realizados
en otras especies, se planteó como hipótesis de trabajo que Solanum tuberosum posee
múltiples isoformas de fosfatasas PP2A y que éstas están involucradas en vías de
transducción de estímulos que regulan la formación del tubérculo, como así también en las
respuestas frente a estrés.
A partir de esta hipótesis, y con el fin de avanzar en el conocimiento del papel de los
procesos de fosforilación/desfosforilación de proteínas en el desarrollo y las respuestas a
estrés, se propuso como objetivo general la caracterización de las subunidades catalíticas
de PP2A (PP2Ac) en S. tuberosum y el estudio de su participación en la señalización
asociada a la tuberización y el estrés. Los objetivos particulares de este trabajo de tesis
fueron:
• Realizar búsquedas en bases de datos de ESTs de S. tuberosum con el fin de
evaluar la presencia de secuencias correspondientes a subunidades catalíticas de
PP2A.
• Estudiar los perfiles de expresión de las subunidades PP2Ac en diferentes órganos
de la planta y en estadíos sucesivos del proceso de tuberización.
• Evaluar la participación de fosfatasas tipo 2A en las vías de señalización asociadas a
factores que regulan la tuberización.
• Determinar los perfiles de expresión de las subunidades PP2Ac en respuesta a
estímulos que regulan la formación del tubérculo.
• Estudiar la actividad de fosfatasas PP1/PP2A en respuesta a estímulos que regulan
la tuberización.
• Evaluar la participación de fosfatasas de serina/treonina sensibles al ácido okadaico
en las vías de señalización asociadas al estrés biótico y abiótico.
• Determinar los perfiles de expresión de las subunidades PP2Ac en respuesta a
diversas condiciones de estrés biótico y abiótico.
• Sobre-expresar aquella(s) isoforma(s) que según su patrón de expresión resulte(n)
relevante(s) para los procesos estudiados.
50
Materiales y Métodos
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal
1.1
Plantas crecidas en invernáculo
Se utilizaron plantas de papa wild-type (Solanum tuberosum L. cv Spunta) crecidas en
invernáculo con fotoperíodo de 16 h de luz y un rango de temperaturas de 21-26ºC. El
sustrato contenía una mezcla de tierra fértil : turba : perlita en proporción 4:1:1. Estas
plantas fueron obtenidas a partir de tubérculos semilla libres de virus provistos por
Diagnósticos Vegetales S. A.
Para algunos experimentos se emplearon hojuelas cortadas a partir de plantas
crecidas durante 1-2 meses en invernáculo (Figura 13 A). Luego de ser cortadas, las
hojuelas fueron colocadas en recipientes individuales con agua en una cámara de cultivo a
22-24ºC por 36-48 h para permitir que los componentes de las respuestas al estrés por daño
mecánico retornen a sus niveles basales.
A
B
Figura 13 | Material vegetal. (A) Hojuelas
cortadas a partir de plantas crecidas en
invernáculo por 1-2 meses (B) Plantas de
papa micropropagadas in vitro a partir de
segmentos
nodales.
Inicialmente
se
cultivaron en medio MS-agar y luego se
transfirieron a medio MS líquido antes de
los experimentos.
51
Materiales y Métodos
1.2
Plantas crecidas in vitro
Se utilizaron plantas de papa wild-type (Solanum tuberosum L. cv Spunta) micropropagadas
in vitro a partir de segmentos nodales libres de virus (Figura 13 B). Estas plantas fueron
inicialmente generadas a partir de brotes de tubérculos esterilizados con etanol 70% (v/v) en
agua durante 10 min, lavados con agua estéril y colocados por 10 min en una solución de
hipoclorito de sodio 10% (v/v) en agua. Luego de la esterilización, se realizaron múltiples
lavados con abundante agua estéril y se separaron los brotes para ser colocados en tubos
con medio de cultivo estéril.
Los brotes y segmentos nodales fueron cultivados en medio Murashige – Skoog
comercial (MS; Prod Nº M519, PhytoTechnology Laboratories) con el agregado de 20 g/L de
sacarosa y solidificado con agar 0,7% (p/v). El pH del medio fue llevado a un valor de 5,7
utilizando KOH 1 M antes del agregado de agar. Las plantas se crecieron durante 2-3
semanas en una cámara de cultivo con fotoperíodo de 16 h de luz (intensidad 4000 lx) a 2224ºC y luego fueron transferidas a medio MS comercial líquido conteniendo 20 g/L de
sacarosa por 1 semana, antes de los tratamientos experimentales.
2. Tratamientos experimentales
2.1
Tratamientos relacionados con tuberización
• Condiciones inductoras de la tuberización (alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio
de cultivo): plantas crecidas in vitro fueron transferidas a medio MS líquido modificado
conteniendo 80 g/L de sacarosa (sacarosa 230 mM), 0,165 g/L NH4NO3 y 0,19 g/L KNO3
(Xu et al., 1998a). Las plantas control fueron transferidas a medio MS líquido modificado
conteniendo 20 g/L de sacarosa, 1,65 g/L NH4NO3 y 1,9 g/L KNO3.
• Tratamientos con ácido giberélico (GA): hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en
invernáculo fueron tratadas con GA3 4 µM. Las hojuelas control se mantuvieron en agua.
La solución stock de GA3 (PhytoTechnology Laboratories) fue preparada en agua con una
concentración de 5 mM.
2.2
Tratamientos relacionados con estrés
• Estrés por bajas temperaturas: plantas crecidas in vitro u hojuelas aisladas a partir de
plantas crecidas en invernáculo fueron expuestas a 4ºC. Las plantas u hojuelas control
fueron mantenidas a 22ºC.
52
Materiales y Métodos
• Estrés por alta salinidad: hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo
fueron tratadas con NaCl 200 mM. Las hojuelas control se mantuvieron en agua. La
solución stock de NaCl fue preparada en agua con una concentración de 5 M.
• Daño mecánico: la nervadura principal y la lámina de las hojas de plantas crecidas in vitro
o de hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron dañadas con
una pinza “diente de ratón”. El daño no causó ninguna alteración visible en el resto de la
hoja, como necrosis o pérdida significativa de la turgencia.
• Elicitores fúngicos: hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron
tratadas con ácido poligalacturónico (PGA) 50 µg/mL o quitosano 100 µg/mL. El PGA es
un producto de la degradación de las paredes de las células vegetales y el quitosano es
un derivado desacetilado de la quitina, el principal componente de la pared celular de los
hongos. La solución stock de PGA (Sigma) fue preparada en agua con una concentración
de 5 mg/mL. La solución stock de quitosano (Sigma) fue preparada con una
concentración de 10 mg/mL disolviendo 100 mg del elicitor en 1,5 mL de H3PO4 85% (p/p)
y llevando a 10 mL con agua. Para los tratamientos con quitosano, el agua de los
recipientes fue reemplazada por buffer Tris-HCl 50 mM pH 6,5 para evitar la disminución
del pH al momento de agregar el elicitor. Las hojuelas control se mantuvieron en agua o
buffer, para los tratamientos con PGA y quitosano respectivamente.
3. Inhibidores de actividad fosfatasa de proteínas
• Ácido okadaico (Calbiochem) IC50 (PP2A) = 0,1 nM - IC50 (PP1) = 10-15 nM: fue utilizado
a una concentración final de 100 nM en ensayos con plantas crecidas in vitro u hojuelas
aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo. Su solución stock fue preparada en
DMSO con una concentración de 0,5 mM.
• Endotal (Calbiochem) IC50 (PP2A) = 90 nM - IC50 (PP1) = 5 µM: fue utilizado a una
concentración final de 10-20 µM en ensayos con plantas crecidas in vitro u hojuelas
aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo. Su solución stock fue preparada en
agua con una concentración de 50 mM.
4. Soluciones generales
4.1
Soluciones empleadas en técnicas relacionadas con bacterias
• Buffer TBF1: Acetato de potasio 30 mM, KCl 100 mM, CaCl2 10 mM, MnCl2 50 mM y
glicerol 15% (v/v). Ajustar a pH 5,8 con ácido acético 0,2 M y esterilizar por filtración.
53
Materiales y Métodos
• Buffer TBF2: MOPS 10 mM, CaCl2 75mM, KCl 10 mM y glicerol 15% (v/v). Ajustar a pH
6,5 con KOH 1M y esterilizar por filtración.
• Solución I (Buffer TGE): Tris-HCl 25 mM pH 8, glucosa 50 mM y EDTA 10 mM en agua.
• Solución II: NaOH 0,2 M y SDS 1% (p/v) en agua.
• Solución III: Acetato de sodio 3 M pH 4,8 en agua.
4.2
Soluciones empleadas en técnicas relacionadas con ADN y ARN
• TAE 50x: Disolver 242 g de Tris Base, 57,1 mL de ácido acético glacial y 100 mL de
EDTA 0,5 M pH 8 en 1 L de agua destilada.
• Buffer de siembra para ADN 6x: Azul de bromofenol 0,25% (p/v) o xilencianol 0,25%
(p/v) y glicerol 30% (v/v) en agua. En un gel de agarosa 1% (p/v) en TAE 1x, el azul de
bromofenol migra como un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb y el
xilencianol lo hace como un fragmento de 4000 pb.
• Buffer de Edwards: Mezclar 10 mL de Tris-HCl 1 M pH 8, 2,5 mL de NaCl 5M, 2,5 mL
de EDTA 5 M y 1,25 mL de SDS 20% (p/v). Llevar a un volumen final de 50 mL con agua
destilada.
• Buffer CTAB: Tris-HCl 100 mM pH 8, CTAB 2% (p/v), NaCl 1,4 M y EDTA 20 mM. Al
momento de usar, agregar β-mercaptoetanol 0,2% (v/v).
• CHURCH: (a) Disolver 35,5 g de Na2HPO4 anhidro en 500 mL de agua destilada. Ajustar
a pH 7,2 con 2-4 mL de H3PO4 85% (b) Disolver 10 g de BSA en 100 mL de agua
destilada, hidratando la BSA lentamente y con agitación. Agregar 0,372 g de EDTA y
llevar a 200 mL con agua destilada (c) A los 500 mL de la solución (a) se añaden 70 g de
SDS y se disuelven con agitación y calor. El volumen se lleva a 800 mL con agua
destilada y se unen las soluciones (b) y (c).
• MOPS 10x: Disolver 41,8 g de MOPS en 800 mL de agua destilada y ajustar a pH 7 con
NaOH 10 N. Añadir 16,6 mL de acetato de sodio 3 M pH 5,2 y 20 mL de EDTA 0,5 M pH
8. Llevar el volumen a 1 L con agua destilada y autoclavar.
• SSC 20x: Disolver 88,4 g de citrato de sodio y 175,3 g de NaCl en 1 L de agua destilada.
Ajustar a pH 7,5 con HCl y autoclavar.
4.3
Soluciones empleadas en técnicas relacionadas con proteínas
• Reactivo de Bradford: Se utilizó el reactivo de Bio-Rad diluido 1/5 con agua destilada.
• Buffer de siembra para proteínas 5x: Glicerol 50% (v/v), DTT 7,7% (p/v), SDS 10%
(p/v), Tris-HCl 0,4M pH 6,8 y azul de bromofenol 0,002% (p/v) en agua.
54
Materiales y Métodos
• Tris-Glicina 10x: Disolver 30,3 g de Tris Base y 144 g de glicina en 1 L de agua
destilada.
• Tris-Glicina-SDS 1x: Agregar a 1 L de buffer Tris-Glicina 1x 10 mL de SDS 10% (p/v). El
pH final debe ser 8,3.
• Buffer de transferencia: Buffer Tris-Glicina 1x con el agregado de metanol 20% (v/v).
• TBS 10x: Disolver 30,3 g Tris Base y 90 g de NaCl en 1 L de agua destilada. Llevar a pH
8 con HCl.
• TBS 1x-Tween20: TBS 1x con el agregado de Tween20 0,05% (v/v).
5. Cepas bacterianas
• Escherichia coli DH5α
α: F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG
Φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–
• Escherichia coli TOP10 (Invitrogen): F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15
DlacX74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG
• Agrobacterium tumefaciens EHA101: Esta cepa contiene una resistencia cromosómica
para cloranfenicol y el plásmido Ti desarmado pEHA101, que aporta resistencia a
kanamicina (Hood et al., 1986).
6. Medios de cultivo de bacterias y antibióticos
• Medio LB: NaCl 1% (p/v), peptona de carne 1% (p/v), extracto de levaduras 0,5% (p/v)
en agua.
• Medio LB-agar: Medio LB con el agregado de agar 2% (p/v).
• Ampicilina (Sigma): Utilizada a una concentración final de 100 mg/L. Su solución stock
fue preparada en agua destilada con una concentración de 100 mg/mL y luego
esterilizada por filtración.
• Kanamicina (Sigma): Utilizada a una concentración final de 50 mg/L. Su solución stock
fue preparada en agua destilada con una concentración de 50 mg/mL y luego esterilizada
por filtración.
• Cloranfenicol (Sigma): Utilizado a una concentración final de 25 mg/L. Su solución
stock fue preparada en etanol con una concentración de 25 mg/mL.
• Espectinomicina (PhytoTechnology Laboratories): Utilizada a una concentración final
de 100 mg/L. Su solución stock fue preparada en agua destilada con una concentración
de 100 mg/mL y luego esterilizada por filtración.
55
Materiales y Métodos
7. Vectores
• pGEM-T Easy (Promega): Este plásmido presenta inicialmente una estructura lineal, con
dos timinas desapareadas en los extremos 3’. Flanqueando este sitio de inserción se
encuentra el sitio múltiple de clonado con secuencias de reconocimiento para numerosas
enzimas de restricción. El pGEM-T Easy facilita el clonado de productos de PCR
generados con polimerasas (como la Taq polimerasa) que dejan adeninas desapareadas
en los extremos 5’ de dichos productos. Confiere resistencia a ampicilina, su tamaño es
de 3015 pb y posee alto número de copias, sistema de β-galactosidasa para la
identificación de los clones bacterianos positivos y secuencias promotoras para las ARN
polimerasas T7 y SP6.
• pZErO-2 (Invitrogen): Este plásmido tiene un tamaño de 3297 pb, confiere resistencia a
kanamicina y posee secuencias promotoras para las ARN polimerasas T7 y SP6. Se
utiliza en combinación con la cepa TOP10 de E. coli. En la región del sitio múltiple de
clonado posee el gen ccdB fusionado a parte del gen lacZα. La proteína CcdB impide el
normal funcionamiento de la ADN-girasa, una enzima esencial para las bacterias. La
inserción de un fragmento de ADN en el vector, impide la expresión de esta proteína
permitiendo el crecimiento de las bacterias, mientras que las bacterias que contienen
vectores no recombinantes no proliferan. De esta forma se seleccionan los clones
positivos.
• pHAP12: Este plásmido tiene un tamaño de aproximadamente 4500 pb y confiere
resistencia a ampicilina. Posee una versión extendida del promotor 35S del Virus del
Mosaico del Coliflor (35S (L) CaMV), la secuencia potenciadora de la traducción Ω del
Virus del Mosaico del Tabaco (TMV) y la secuencia terminadora de la transcripción de la
nopalina sintetasa (tNOS). Entre la secuencia Ω y el terminador tNOS existe un sitio
múltiple de clonado. A su vez, río arriba del promotor y río abajo del terminador existen
sitios de corte para distintas enzimas de restricción, los cuales permiten el subclonado del
cassette [35S (L) CaMV - Ω - gen de interés - tNOS] en un vector binario. Este vector fue
gentilmente cedido por el Dr. Fernando Bravo Almonacid.
• pPZP-Npt: Este plásmido es un vector binario de aproximadamente 8000 pb (Romano et
al., 2001). Confiere resistencia a espectinomicina / estreptomicina (para la selección de
los clones bacterianos transformados) y a kanamicina (para la selección de las células
vegetales transformadas). Posee los bordes izquierdo y derecho del ADN-T. Río abajo
del borde izquierdo, se encuentra el gen NPT (confiere resistencia a kanamicina)
flanqueado por las secuencias promotoras y terminadoras del gen de la nopalina
56
Materiales y Métodos
sintetasa de Agrobacterium tumefaciens y, a continuación, un sitio múltiple de clonado río
arriba del borde derecho. Este vector fue gentilmente cedido por el Dr. Fernando Bravo
Almonacid.
8. Oligonucleótidos iniciadores (Primers)
8.1
Primers específicos para PP2Ac
- UP3UTRC1: 5´-CCGAATACTTGAGCTGACTG-3´ (T°m = 60°C)
- DN3UTRC1: 5´-ATTACAAATCACAATGGACC-3´ (T°m = 56,1°C)
- UP3UTRC2a: 5´-TTCCAATATCTGCGCTTG-3´ (T°m = 59,9°C)
- DN3UTRC2a: 5´-GAACAGAATGTACCATGTTGC-3´ (T°m = 59,5°C)
- UP3UTRC2b: 5´-GAGAGTTGAGAAGAGGCACTG-3´ (T°m = 60,8°C)
- DN3UTRC2b: 5´-CTATGGAATACCAAATATACAGAC-3´ (T°m = 55,1°C)
- UP3UTRC3: 5´-ATGTGATGGAGAGCAATATC-3´ (T°m = 56,4°C)
- DN3UTRC3: 5´-CCTAACATAGGTTAGAATATGAC-3´ (T°m = 52,9°C)
- UP5UTRC4: 5´-CCACTCGCTCACTCACTCA-3´ (T°m = 63°C)
- DN5UTRC4: 5´-GTGGGTCCAGAGGTAACTC-3´ (T°m = 58,5°C)
- UP3UTRC5: 5´-TCAGAGCTGCACAAACTTGGTG-3´ (T°m = 67,6°C)
- DN3UTRC5: 5´-AATGATACATGCATAGTGACTCC-3´ (T°m = 59,4°C)
8.2
Primers para sonda conservada de PP2Ac
- UPCATCON2: 5´-CCATCTATTGAAACCCTTG-3´ (T°m = 56,9°C)
- DNCATCON2: 5´-CTGCCCAAAAGTGTATCCAG-3´ (T°m = 62°C)
8.3
Primers para marcadores de estrés
- UPStHB7: 5´-AATAAGATGTTTGATGCAGG-3´ (T°m = 48,2°C)
- DNStHB7: 5´-CAATTCTGATTCAAGACCAG-3´ (T°m = 48,7°C)
- UPStTAS14: 5´-GATCAAAGATGGCACAATAC-3´ (T°m = 49,1°C)
- DNStTAS14: 5´-ACTCACATGACGATTACTAC-3´ (T°m = 49,0°C)
- Le25up: 5´-CGGAGAGGATGACGACGAG-3´ (T°m = 66,1°C)
- Le25dn: 5´-AATCTTAAAAGCCAACACCCACAC-3´ (T°m = 65,7°C)
- quitinasaFW: 5´-TCTTGTCTCTTTTTCTTGTTC-3´ (T°m = 55,2°C)
- quitinasaRV: 5´-TTGATTGTTACAGTCCAA-3´ (T°m = 51,7°C)
57
Materiales y Métodos
8.4
Primers para control de RT-PCR
- 18Sfw: 5´-GGGCATTCGTATTTCATAGTCAGAG-3´ (T°m = 55,4°C)
- 18Srv: 5´-CGGTTCTTGATTAATGAAAACATCCT-3´ (T°m = 54°C)
8.5
Primers para 3’RACE-PCR de StPP2Ac2b
- 3raceTTadapt: 5’-GACTCGAGTCGACATCG(T)17-3’ (T°m = 72,1°C)
- 3raceadapt: 5’-GACTCGAGTCGACATCG-3´ (T°m = 57,7°C)
- raceC2b-3UTR: 5´-CAATGGTTGCACTAGTTG-3´ (T°m = 54,8°C)
- nestedC2b-3UTR: 5´-AAGGTCTGTCATGTATATTG-3´ (T°m = 51,2°C)
8.6
Primers para la sobre-expresión de StPP2Ac2b
- FwC2bfullUTR: 5´-TGGAATTCGCAGATCGGTGAG-3´ (T°m = 57,2°C)
- RvC2bfullUTR: 5´-CGATGAGCTACAAACAACTAGTGC-3´ (T°m = 55,9°C)
- FwC2bfullNEST: 5´-CACTGGATAACATACGATCATTGG-3´ (T°m = 53,5°C)
- StPP2Ac2bfw: 5´-CGGGATCCATGCCGTCGAACGCAG-3´ (T°m = 66,1°C)
Este primer contiene un sitio de corte para la enzima BamHI (subrayado) y el codón ATG
correspondiente al inicio de la secuencia codificante de StPP2Ac2b (negrita).
- StPP2Ac2brv: 5´-CCGGAATTCTCACAAGAAGTAATCAGGAG-3´ (T°m = 58,6 °C)
Este primer contiene un sitio de corte para la enzima EcoRI (subrayado) y la secuencia TCA
complementaria al codón stop TGA de StPP2Ac2b (negrita).
- prom35S: 5´-ATCTCCACTGACGTAAGGGA-3´ (T°m = 54,9°C)
- tNos: 5´-TGATAATCATCGCAAGACCG-3´ (T°m = 52,5°C)
9. Técnicas de ADN recombinante
9.1
Amplificación por PCR
La mezcla de reacción para las amplificaciones por PCR constó de:
• ADN molde: aproximadamente 1-5 ng para plásmidos, 100-300 ng para ADN genómico ó
3 µL de una dilución ½ de la mezcla de síntesis de ADNc
• 0,5-2,5 U de Taq polimerasa (Fermentas) o polimerasa Phusion de alta fidelidad
(Finnzymes)
• Buffer de reacción 1x (se utilizó el buffer provisto con cada polimerasa)
• MgCl2 1,5-2,5 mM
58
Materiales y Métodos
• 0,2 mM de cada dNTP
• 0,2-1 M de cada primer
• Agua destilada estéril hasta un volumen final de 40-50 L
Se realizó, en cada reacción, un control negativo utilizando la misma mezcla pero
reemplazando el ADN molde por agua. Los ciclos de amplificación se realizaron de la
siguiente forma:
• Desnaturalización inicial del ADN: 3 min a 94°C para reacciones con Taq polimerasa, o 12 min a 98°C para reacciones con polimerasa Phusion .
• Aproximadamente 25-35 ciclos de:
-
Desnaturalización: 0,5-1 min a 94°C para reacciones con Taq polimerasa, o 10-20 s
a 98°C para reacciones con polimerasa Phusion.
-
Unión de los primers: 0,5-1 min a una T°a 3-6°C menor que la T°m más ba ja de los
primers para reacciones con Taq polimerasa, o 10-30 s a una T°a 1-3°C mayor que
la T°m más baja de los primers para reacciones con polimerasa Phusion.
-
Elongación: 1 min/kb a 72°C para reacciones con Taq polimerasa, o 15-30 s/kb a
72°C para reacciones con polimerasa Phusion.
• Elongación final: 10 min a 72°C para reacciones con Taq polimerasa o polimerasa
Phusion.
Para evaluar el resultado de las reacciones, se sembraron 2-5 L de la mezcla en geles de
agarosa 1-1,5% (p/v) en TAE 1x.
9.2
Separación de fragmentos de ADN en geles de agarosa
Se utilizaron geles de agarosa nativos 1-1,5% (p/v). Estos se prepararon con buffer TAE 1x
con el agregado de 0,5 µg/mL de bromuro de etidio (Promega). Las corridas electroforéticas
se realizaron a 5-10 V/cm (voltaje constante). Antes de sembrar, se agregó a cada muestra
el volumen correspondiente de buffer de siembra para ADN. Se utilizaron como marcadores
de peso molecular el Ladder de 100 pb y el Ladder de 400 pb (Productos Bio-Lógicos). Los
geles fueron visualizados y fotografiados con un equipo transiluminador UV (Syngene).
9.3
Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa
Para la purificación de fragmentos de ADN (productos de PCR, vectores digeridos, etc.) a
partir de geles de agarosa se recortó la porción del gel que contenía el material a purificar y
se procesó la muestra utilizando el kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
59
Materiales y Métodos
9.4
Cuantificación de ADN
Para cuantificar las muestras de ADN, éstas se sembraron en geles de agarosa junto con 5
µL de los marcadores Ladder de 100 pb o Ladder de 400 pb (Productos Bio-Lógicos). Las
diferentes bandas de estos marcadores tienen masas de ADN conocidas. De esta manera,
se estimó la cantidad de ADN presente en el volumen de muestra (o dilución de muestra)
sembrado, por comparación con la intensidad de las bandas del marcador.
9.5
Digestión con enzimas de restricción
Para las reacciones de digestión de vectores e insertos se utilizaron enzimas de restricción
de New England Biolabs o Promega. La mezcla de reacción constó de:
• ADN a digerir (1-4 µg de vector ó 1 µg de inserto)
• 1-5 U de enzima de restricción por µg de ADN a digerir
• Buffer de reacción 1x (se utilizó el buffer recomendado por el fabricante para cada
enzima)
• BSA 100 µg/mL (se utilizó sólo para aquellas enzimas que lo requieren)
• Agua destilada hasta un volumen final de 20-30 µL
Las reacciones se incubaron durante 2-3 h a la temperatura indicada por el fabricante para
cada enzima y el producto de las digestiones se analizó en geles de agarosa 1-1,5% (p/v).
9.6
Eliminación de fosfatos en extremos 5’
En caso de ser necesario, los vectores fueron tratados con fosfatasa alcalina de camarón
(SAP, Promega) luego de ser digeridos. Este tratamiento impide la re-ligación de los
mismos. La mezcla de reacción constó de:
• 0,1-1 µg del vector digerido
• 1 U de SAP por µg de ADN
• Buffer SAP 1x (provisto con la enzima)
• Agua destilada hasta completar un volumen final de 30 µL
La reacción se incubó 15 min a 37°C y luego se inac tivó la enzima por calentamiento a 65°C
durante 15 min.
60
Materiales y Métodos
9.7
Agregado de fosfatos en extremos 5’
Para las reacciones de ligación entre extremos romos, los productos de PCR utilizados
como insertos fueron tratados con la enzima T4 Polinucleótido Quinasa (T4 PNK, New
England Biolabs) para el agregado de fosfatos en los extremos 5’. La mezcla de reacción
constó de:
• 250-500 ng de productos de PCR
• 10-20 U de enzima T4 PNK
• Buffer de reacción de la enzima T4 ADN Ligasa 1x (New England Biolabs). Este buffer es
compatible con la enzima T4 PNK y contiene ATP 1 mM como donante de los grupos
fosfato
• Agua destilada hasta completar un volumen final de 30 L
La reacción se incubó 30 min a 37°C y luego se inac tivó la enzima por calentamiento a 65°C
durante 20 min.
9.8
Reacciones de ligación
El vector pGEM-T Easy fue utilizado para clonar productos de PCR obtenidos con la enzima
Taq polimerasa. Las reacciones de ligación se realizaron empleando los reactivos provistos
en el kit pGEM-T Easy Vector System (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las reacciones de ligación con los otros vectores empleados en este trabajo se
realizaron utilizando la enzima T4 ADN Ligasa de New England Biolabs. La mezcla de
reacción constó de:
• Aproximadamente 30-60 ng de vector digerido
• Distintas cantidades de inserto según la relación vector : inserto deseada
• 1000-2000 U de enzima T4 ADN Ligasa
• Buffer de reacción de la enzima T4 ADN Ligasa 1x (provisto con la enzima)
• Agua destilada hasta un volumen final de 10 µL
Las reacciones de ligación entre extremos cohesivos se incubaron a 37°C por 1-3 h o a 48°C ON. Las reacciones de ligación entre extremos r omos se incubaron a 16°C ON. Una vez
concluido el tiempo de incubación, se utilizó la mezcla de reacción para transformar
bacterias competentes como se indica en la Sección 10.2.
En todos los casos se utilizaron diferentes relaciones molares de vector : inserto (en
general, 1:1 y 1:3) manteniendo constante la masa de vector y variando la cantidad de
inserto. Se calculó la masa de inserto a utilizar en cada caso utilizando la siguiente fórmula:
61
Materiales y Métodos
ng vector * (tamaño inserto/tamaño vector)*(relación inserto/vector) = ng inserto
Se incluyó además un control de re-ligación de los vectores reemplazando el inserto por
agua en las reacciones.
9.9
Chequeo de las construcciones recombinantes
Las construcciones generadas fueron amplificadas por transformación de bacterias
Escherichia coli (ver Sección 10). Los plásmidos aislados a partir de los diferentes clones de
bacterias fueron chequeados mediante reacciones de PCR y digestiones con enzimas de
restricción elegidas teniendo en cuenta el mapa de restricción del vector y su inserto. Por
ejemplo, en el caso del vector pGEM-T Easy, se emplearon las enzimas EcoRI (Sigma) o
NotI (New England Biolabs) para la liberación de los insertos. Por otro lado, se determinó la
secuencia de los plásmidos obtenidos utilizando el servicio de secuenciación de Macrogen
Inc. (Seoul, Corea). En las reacciones de secuenciación se utilizaron primers específicos del
inserto y/o primers cuyas secuencias de reconocimiento pertenecían al vector, como los
primers correspondientes a los promotores T7 y SP6 en los vectores pGEM-T Easy y
pZErO-2.
Luego,
las
secuencias
fueron
analizadas
con
el
programa
BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
10.
Transformación y obtención de ADN plasmídico a partir de
bacterias Escherichia coli
10.1
Preparación de bacterias competentes
La preparación de bacterias Escherichia coli (cepas DH5α y TOP10) competentes para
transformación por shock térmico se realizó utilizando el siguiente protocolo:
•
Se plaquearon bacterias sobre LB-agar y se crecieron a 37°C ON.
•
Se inoculó una colonia en 5 mL de LB líquido y se incubó a 37°C ON con agitación.
•
Se transfirió 1-2 mL de este cultivo a 100 mL de LB líquido y se incubó a 37°C con
agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm fuera igual a 0,5.
•
Se colocó el cultivo en hielo por 5-10 min.
•
Se centrifugó a 2500-3000g a 4°C durante 5-10 min y se descartó el sobrenadan te.
62
Materiales y Métodos
•
Las bacterias se resuspendieron cuidadosamente en 40 mL de buffer TFB1 frío y se
incubaron 5 min en hielo.
•
Se centrifugó a 2500-3000g a 4°C durante 5-10 min y se descartó el sobrenadan te.
•
Las bacterias se resuspendieron cuidadosamente en 4 mL de buffer TFB2 frío y se
incubaron 15 min en hielo.
•
Las bacterias se alicuotaron en tubos eppendorf estériles en volúmenes de 50-100 L
congelándose inmediatamente en nitrógeno líquido y guardando las alícuotas a -70°C.
10.2
Transformación por shock térmico
Para cada transformación por shock térmico se utilizaron 50-100 µL de bacterias
competentes. Las bacterias se descongelaron en hielo y se les agregó 2-10 µL de la mezcla
de ligación. Se incubó en hielo por 30 min, se sometió a un shock térmico a 42°C durante
1,5-2 min y luego se colocó nuevamente en hielo por 10 min. A continuación, se agregaron
400
L de LB y se incubó a 37°C durante 1 hora. Finalmen te, se plaqueó 100 µL de la
reacción de transformación en medio LB-agar con el antibiótico necesario para la selección
de las bacterias transformadas. El resto de la reacción se centrifugó a 1200g por 5 min, se
descartó la mayor parte del sobrenadante, se resuspendió el pellet en el líquido remanente y
se plaqueó también en LB-agar con antibiótico. Las placas se incubaron a 37°C durante 1824h.
Para las transformaciones realizadas con el vector pGEM-T Easy, el medio LB-agar
contenía, además del antibiótico ampicilina, IPTG 0,5 mM y X-Gal 50 µg/mL para la
selección de los clones positivos mediante el sistema de β-galactosidasa. Los clones
positivos que contienen el inserto presentan color blanco mientras que los negativos tienen
color azul.
10.3
Purificación de ADN plasmídico
Se realizaron mini-preparaciones empleando el método de lisis alcalina (Birnboim y Doly,
1979) modificado como se indica a continuación:
•
Se partió de 3-5 mL de un cultivo bacteriano realizado en medio LB líquido con el
antibiótico necesario para la selección del vector de interés. Este cultivo se creció a 37°C
ON con agitación.
•
Se centrifugó el cultivo a 3000g durante 15 min a 4°C.
•
Se eliminó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 200 L de Solución I.
63
Materiales y Métodos
•
Se agregaron 300 L de Solución II, preparada en el momento, se mezcló suavemente
por inversión y se dejó 5 min en hielo (lisis).
•
Se agregaron 300 L de Solución III, se mezcló suavemente y se dejó en hielo 5 min
(neutralización).
•
Se centrifugó a 16000g por 10-20 min a T°amb para eliminar el ADN cromosómico y se
tomó el sobrenadante.
•
Se agregó ARNasa A (libre de ADNasa) a una concentración final de 20
g/mL y se
incubó por 0,5-1h a 37°C.
•
Se hicieron 2 extracciones con 400 L de cloroformo. La separación de fases se realizó
por centrifugación a 16000g durante 1 min a T°amb. Se tomó la fase superior (acuosa).
•
Se precipitó el ADN plasmídico agregando 1 volumen de isopropanol y centrifugando a
16000g durante 10-20 min a 4°C.
•
El pellet se lavó con 500 L de etanol 70% (v/v) y se centrifugó a 16000g durante 10 min
a T°amb.
•
El pellet se secó, se resuspendió en 15-25 L de agua destilada estéril y se guardó a 20°C hasta ser utilizado.
Alternativamente, para obtener ADN plasmídico de alta calidad para reacciones de
secuenciación, se realizaron mini-preparaciones utilizando el kit Wizard Plus SV Minipreps
(Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante.
11.
Transformación y obtención de ADN plasmídico a partir de
bacterias Agrobacterium tumefaciens
11.1
Preparación de bacterias competentes
La preparación de bacterias Agrobacterium tumefaciens (cepa EHA101) competentes para
transformación por shock térmico se realizó utilizando el siguiente protocolo:
•
Se plaquearon bacterias sobre LB-agar (con kanamicina y cloranfenicol) y se crecieron a
28°C en oscuridad por 24-48 h.
•
Se inoculó una colonia en 2 mL de LB líquido (con kanamicina y cloranfenicol) y se
incubó a 28°C en oscuridad por 16-24 h con agitació n.
•
Se transfirió este cultivo a 50 mL de LB líquido (con kanamicina y cloranfenicol) y se
incubó a 28°C en oscuridad con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm fuera
igual a 0,5-1.
•
Se colocó el cultivo en hielo por 15 min.
64
Materiales y Métodos
•
Se centrifugó a 5000g por 5 min a 4°C y se descartó el sobrenadante.
•
Las células se resuspendieron en 1 mL de una solución de CaCl2 20 mM con el
agregado de glicerol 10% (v/v). Esta solución fue previamente enfriada a 4°C.
•
Las bacterias se alicuotaron en tubos eppendorf estériles en volúmenes de 100
L
congelándose inmediatamente en nitrógeno líquido y guardando las alícuotas a -70°C.
11.2
Transformación por shock térmico
Para cada transformación por shock térmico se utilizaron 100 µL de bacterias competentes.
Las bacterias se descongelaron en hielo y se les agregó 1 µg de ADN plasmídico. Se incubó
en hielo por 30 min y luego se colocó el tubo con las bacterias en nitrógeno líquido por 2
min. Se transfirió rápidamente a 37°C y se incubó por 5 min a esa temperatura. Finalmente
se agregó 1 mL de LB y se incubó por 2 h a 28°C en oscuridad.
Finalmente, se plaqueó 100 µL de la reacción de transformación en medio LB-agar con
antibióticos (kanamicina, cloranfenicol y el antibiótico necesario para la selección de las
bacterias transformadas con el plásmido de interés). El resto de la reacción se centrifugó a
1200g por 5 min, se descartó la mayor parte del sobrenadante, se resuspendió el pellet en el
líquido remanente y se plaqueó en LB-agar con antibióticos. Las placas se incubaron a 28°C
en oscuridad durante 48-72 h.
11.3
Purificación de ADN plasmídico
Se realizaron mini-preparaciones empleando el método de lisis alcalina (Birnboim y Doly,
1979) modificado como se indica a continuación:
• Se partió de 6-10 mL de un cultivo bacteriano realizado en medio LB líquido con
antibióticos (kanamicina, cloranfenicol y el antibiótico necesario para la selección del
vector de interés) y se creció a 28°C en oscuridad por 16-24 h con agitación.
• Se centrifugó el cultivo a 3000g durante 15 min a 4°C.
• Se eliminó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 300 µL de la Solución I con el
agregado de ARNasa A (libre de ADNasa) a una concentración final de 20
g/mL y
lisozima (una punta de espátula de lisozima por cada 1 mL de Solución I).
• Se agregaron 300 µL de la Solución II preparada en el momento, se mezcló suavemente
por inversión y se incubó 5 min a T°amb (lisis).
• Se agregaron 300 µL de la Solución III, se mezcló suavemente por inversión y se incubó
por 10 min en hielo (neutralización).
65
Materiales y Métodos
• Se centrifugó a 16000g por 15 min a 4°C para eliminar el ADN cromosómico y se tomó el
sobrenadante.
• Se centrifugó nuevamente a 16000g por 10 min a 4°C y se tomó el sobrenadante.
• Se precipitó el ADN plasmídico agregando 0,7 volúmenes de isopropanol y centrifugando
a 16000g durante 20 min a 4°C.
• El pellet se lavó con 500 L de etanol 70% (v/v) y se centrifugó a 16000g durante 10 min
a T°amb.
• El pellet se secó, se resuspendió en 10-20 L de agua destilada estéril y se guardó a –
20°C hasta ser utilizado.
12.
Transformación de Solanum
Agrobacterium tumefaciens
tuberosum
mediada
por
12.1 Reactivos utilizados para la transformación
• Acetosiringona (AS, PhytoTechnology Laboratories): Compuesto utilizado para
estimular la transformación mediada por A. tumefaciens. Utilizado a una concentración
final de 10 mg/L. Su solución stock fue preparada disolviendo 0,1 g de AS en 2,5 mL de
DMSO y llevando el volumen a 10 mL con agua destilada (concentración final del stock:
10 mg/mL). Luego se esterilizó por filtración.
• Cefotaxima (Laboratorios Richet): Antibiótico empleado para impedir el crecimiento de
las bacterias A. tumefaciens luego de la trasformación. Utilizado a una concentración
final de 400 mg/L. Su solución stock fue preparada en agua destilada con una
concentración de 200 mg/mL y luego esterilizada por filtración.
• Ácido 3-Indol-Acético (AIA, PhytoTechnology Laboratories): Hormona tipo auxina.
Utilizada a una concentración final de 5 µM. Su solución stock fue preparada disolviendo
100 mg de AIA en 10 mL de NaOH 1 M y llevando el volumen a 100 mL con agua
destilada (concentración final del stock: 5,7 mM). Luego se esterilizó por filtración.
• trans-Zeatín
Ribósido
(ZR,
PhytoTechnology
Laboratories):
Hormona
tipo
citoquinina. Utilizada a una concentración final de 5 µM. Su solución stock fue preparada
disolviendo 10 mg de ZR en 0,2 mL de NaOH 1 M y llevando el volumen a 2 mL con
agua destilada (concentración final del stock: 14 mM). Luego se esterilizó por filtración.
• Kanamicina (Sigma): Agente selector para las células vegetales transformadas.
Utilizado a una concentración final de 50 mg/L. Su solución stock fue preparada como se
indica en la Sección 6.
66
Materiales y Métodos
12.2 Transformación
Los inóculos de Agrobacterium tumefaciens para la transformación de discos de tubérculos
se prepararon de la siguiente forma:
• Se inoculó un cultivo líquido con las bacterias transformadas con el vector de interés.
Este cultivo se realizó en 5 mL de LB líquido con antibióticos (kanamicina, cloranfenicol y
el antibiótico necesario para la selección del vector de interés) y se creció a 28°C en
oscuridad por 16-24 h con agitación.
• Se realizó una dilución 1/100 del cultivo anterior y se incubó a 28°C en oscuridad con
agitación hasta que su densidad óptica a 600 nm fuera de 0,6-1. Este cultivo en fase
exponencial de crecimiento fue usado como inóculo para la transformación.
Los explantos utilizados para la transformación fueron discos de tubérculos no brotados de
S. tuberosum cv Spunta y se obtuvieron de la siguiente forma:
• Para cada transformación, dos minitubérculos fueron lavados con agua y detergente,
luego se les extrajo la peridermis y se lavaron nuevamente de la misma forma,
enjuagando con abundante agua.
• A continuación, los tubérculos se sumergieron en etanol 70% (v/v) por 2 min y luego
durante 20 min en una solución de hipoclorito de sodio 20% (v/v) en agua estéril con el
agregado de 5 gotas del detergente Tween20.
• Luego de la esterilización se realizaron tres lavados de 5 min, un lavado de 45 min y dos
lavados de 15 min utilizando en total 1 L de agua estéril.
• Finalmente, utilizando un bisturí se cortaron discos de un espesor menor a 1 mm y se
colocaron en placas de Petri conteniendo 20 mL de medio MS líquido comercial. Se
emplearon 60-80 discos para cada transformación y se separaron 20-30 discos para
realizar controles de regeneración y selección (no inoculados).
Para la transformación de los explantos se realizaron los siguientes co-cultivos:
• Co-cultivo I (directo): se agregaron 200 µL del inóculo a las placas de Petri
conteniendo los discos y se incubó a T°amb por 3-5 min con agitación. Luego los discos
se secaron sobre papel de filtro estéril.
• Co-cultivo II (indirecto): se colocaron los explantos en placas con medio MS-agar
0,7% (p/v) conteniendo acetosiringona 10 mg/L y se incubó por 30-36 h a 24°C en
oscuridad. Luego de la incubación se lavaron los discos con una solución de cefotaxima
400 mg/L en agua y se secaron sobre papel de filtro estéril.
Los discos fueron colocados en frascos estériles con 40 mL de medio MS-agar 0,7% (p/v)
con 20 g/L de sacarosa suplementado de la siguiente forma:
67
Materiales y Métodos
•
Control de Regeneración: cefotaxima 400 mg/L + AIA 5 µM + ZR 5 µM
•
Control de Selección y Explantos Inoculados: cefotaxima 400 mg/L + AIA 5 µM + ZR
5 µM + kanamicina 50 mg/L (agente selector)
12.3 Repique de explantos
Los explantos se repicaron cada 15 días manteniendo la composición del medio de cultivo
indicada en la Sección 12.2 para cada grupo de discos (controles y explantos inoculados).
Cuando los brotes surgidos a partir de los explantos alcanzaron 1-3 cm, se repicaron en
tubos con 10-15 mL de medio MS-agar 0,7% (p/v) con 20 g/L de sacarosa y cefotaxima 400
mg/mL (las plantas de papa no requieren el agregado de hormonas para la formación de las
raíces adventicias). Los brotes surgidos de explantos inoculados se pasaron a tubos sin
kanamicina (agente selector) para facilitar la formación de las raíces adventicias y así poder
realizar el chequeo preliminar de las plantas obtenidas.
12.4 Chequeo preliminar de las plantas obtenidas
Se aisló ADN a partir de las hojas de las plantas obtenidas luego de la transformación y
propagación in vitro. Para ello se utilizó el siguiente protocolo:
• Se homogeneizó el tejido en un tubo eppendorf de 1,5 mL.
• Se agregaron 400 µL de buffer de Edwards y se incubó a T°amb por 10 min.
• Se centrifugó a 14000g por 1-2 min.
• Se tomaron 300 µL del sobrenadante y se colocaron en un nuevo tubo eppendorf.
• Se agregaron 300 µL de isopropanol y se incubó a T°amb por al menos 2 min.
• Se centrifugó a 14000g por 5-10 min a T°amb.
• Se descartó el sobrenadante, se secó el pellet y se resuspendió en 100 µL de agua
destilada estéril.
El ADN obtenido (2 µL de una dilución 1/5 de los extractos) se utilizó como molde en una
reacción de PCR empleando los primers FwC2bfullNEST y tNos.
13.
Diseño y obtención de sondas para Southern y Northern Blot
13.1 Sondas para PP2Ac
Se generaron sondas específicas para las seis isoformas de PP2Ac presentes en papa con
los primers indicados en la Tabla 4. Estas sondas corresponden a las regiones 5´UTR o
3´UTR de los ARNm. Se obtuvieron por PCR a partir de ADN genómico o ADNc sintetizado
68
Materiales y Métodos
a partir de ARNm de tubérculos en formación y fueron clonadas en el vector pGEM-T Easy.
Estas sondas se utilizaron para analizar el perfil de expresión de las subunidades PP2Ac a
nivel de ARNm por Northern Blot.
Por otro lado, para la técnica de Southern Blot se diseñó una sonda correspondiente a
una región altamente conservada en todas las isoformas de las PP2Ac de papa. Esta sonda
se obtuvo por PCR con los primers UPCATCON2 y DNCATCON2 (diseñados según la
secuencia de la isoforma StPP2Ac3) usando como molde ADN genómico. La región
reconocida por la sonda no contiene intrones (al menos en el caso de la isoforma StPP2Ac3)
ni sitios de corte para las enzimas utilizadas. El grado de identidad entre las distintas
isoformas es de 80-90% en esta región.
Tabla 4 | Sondas utilizadas para la detección de PP2Ac en ensayos de Southern y Northern
Blot. Se indican, para cada sonda, los primers utilizados para su amplificación, la longitud del
producto y la región que reconoce.
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13.2 Otras sondas
• Patatina: gen que codifica para la principal proteína de reserva del tubérculo. Para la
detección de su ARNm se utilizó una sonda de aproximadamente 500 pb obtenida por
digestión de un plásmido con la enzima de restricción SacI (Yamagishi et al., 1993). Este
plásmido confiere resistencia al antibiótico kanamicina y fue gentilmente cedido por el Dr.
Yoshio Kikuta. La sonda corresponde al ADNc de una isoforma de Patatina (secuencia
M21879.1 del GeneBank). Dado que este gen pertenece a una familia multigénica, no se
puede excluir la posibilidad de que la sonda reconozca más de una isoforma de Patatina.
• Pin2: gen que codifica para un inhibidor de proteasas. Para la detección de su ARNm se
utilizó una sonda de aproximadamente 550 pb obtenida por digestión de un plásmido con
la enzima de restricción PstI (Sánchez-Serrano et al., 1986). Este plásmido confiere
69
Materiales y Métodos
resistencia al antibiótico ampicilina y fue gentilmente cedido por la Dra. Salomé Prat. La
sonda corresponde al ADNc de una isoforma de Pin2 (secuencia X03778.1 del
GeneBank). Dado que este gen pertenece a una familia multigénica, no se puede excluir
la posibilidad de que la sonda reconozca más de una isoforma de este inhibidor de
proteasas.
• HB7: gen que codifica para un factor de transcripción inducible por frío y estrés salino en
hojas de plantas de papa (Rensink et al., 2005). La sonda empleada para detectar el
ARNm de este gen fue diseñada contra su secuencia codificante (secuencia TC140026
del DFCI Potato Gene Index) y su tamaño es de 775 pb. Fue obtenida por PCR con los
primers UPStHB7 y DNStHB7, utilizando como molde ADNc sintetizado a partir de ARNm
aislado de hojas de plantas de papa expuestas a 4°C por 24 h.
• Tas14: gen que codifica para una dehidrina inducible por frío y estrés salino en hojas de
plantas de papa (Rensink et al., 2005). La sonda empleada para detectar el ARNm de
este gen fue diseñada contra su secuencia codificante (secuencia TC140026 del DFCI
Potato Gene Index) y su tamaño es de 553 pb. Fue obtenida por PCR con los primers
UPStTAS14 y DNStTAS14, utilizando como molde ADNc sintetizado a partir de ARNm
aislado de hojas de plantas de papa expuestas a 4°C por 4 h.
• Le25: gen inducible por estrés osmótico y ABA en plantas de tomate; codifica para una
proteína tipo LEA (Cohen y Bray, 1990, 1992; Imai et al., 1996). La sonda empleada fue
diseñada contra parte de su secuencia codificante y 3’-UTR; se obtuvo por PCR a partir
de ADN genómico de tomate con los primers Le25up y Le25dn y tiene 327 pb. Reconoce
al ARNm homólogo en plantas de papa (secuencia TC153563 del DFCI Potato Gene
Index).
• Quitinasa A: gen que codifica para una proteína PR inducible por infecciones fúngicas y
elicitores en plantas de papa (Buchter et al., 1997). La sonda empleada para detectar su
ARNm fue diseñada contra la región codificante de un gen de quitinasa A (acídica, clase
II; secuencia U49969.1 del GeneBank) y tiene aproximadamente 700 pb. Se obtuvo por
PCR con los primers quitinasaFW y quitinasaRV utilizando como molde ADNc sintetizado
a partir de ARNm aislado de hojas de plantas de papa expuestas al elicitor quitosano por
4 h. Dado que este gen pertenece a una pequeña familia multigénica, no se puede excluir
la posibilidad de que la sonda reconozca más de un ARNm.
70
Materiales y Métodos
14.
Marcación radiactiva de sondas para Southern y Northern Blot
Las sondas se marcaron utilizando el sistema Prime-a-Gene Labeling System de Promega.
Se realizó una reacción estándar partiendo de 25 ng de sonda que se llevaron a 32 L con
agua libre de nucleasas. Luego la sonda se expuso a 100°C durante 2 min y se colocó en
hielo. Para realizar la marcación, se agregaron 10 L de buffer de marcación 5x, 2 L de una
mezcla de dATP, dGTP y dTTP en relación 1:1:1 (concentración final de cada uno: 20 M), 2
L de una solución de BSA libre de nucleasas (concentración final: 400 g/mL), 5 U de ADN
polimerasa I (fragmento Klenow) y 3
L de [α-32P]dCTP (10
Ci/ L, 3000 Ci /mmol; New
England Nuclear). El volumen final de la mezcla de reacción fue de 50
L. Se incubó la
mezcla a 37°C durante 1-3 h y luego se purificó la sonda pasando dicha mezcla por una
columna de filtración molecular MicroSpin S-300 HR (GE Healthcare) que retuvo el dCTP
radiactivo libre (no incorporado).
Alternativamente, se realizó la marcación utilizando la técnica de PCR. Esta reacción
se llevó a cabo en un volumen final de 100 L y la mezcla de reacción constó de:
• ADN molde: 20 ng de sonda
• 5 U de enzima Taq polimerasa (Fermentas)
• Buffer de la polimerasa 1x (provisto con la enzima)
• MgCl2 1,5 mM
• dATP, dGTP, dTTP 0,2 mM cada uno
• dCTP 0,01 mM
• [γ-32P]dCTP 50 Ci
• 0,4 M de cada primer
• Agua destilada estéril hasta un volumen final de 100 L
Los ciclos de amplificación se realizaron según se indica en la Sección 9.1. El producto de la
PCR se purificó utilizando columnas de filtración molecular, como se indica más arriba.
Las sondas marcadas se guardaron a -20°C hasta su utilización y antes de realizar la
hibridación, se calentaron a 100°C por 2 min y se c olocaron en hielo.
15.
Southern Blot
15.1 Extracción de ADN genómico
El procedimiento seguido para la extracción de ADN genómico fue el siguiente:
71
Materiales y Métodos
• Se partió de 1-3 g de hojas de plantas de papa crecidas en invernáculo. El material
cosechado fue congelado en nitrógeno líquido y guardado a –70°C hasta el momento de
la extracción. En un mortero previamente enfriado, se disgregó el material hasta obtener
un polvo fino.
• Se agregó al mortero buffer CTAB pre-calentado a 65°C (5 mL de buffer cada 1 g de
tejido) y se transfirió el material a un tubo de polipropileno.
• Se incubó 30 min-1 h a 65°C agitando manualmente cada 10 min.
• Se agregó 1 volumen de cloroformo y se agitó 5-10 min empleando un vortex.
• Se centrifugó a 5000g por 10 min a 4°C.
• Se transfirió la fase superior (acuosa) a un nuevo tubo y se repitió la extracción con
cloroformo 1 ó 2 veces más.
• Luego de la última extracción con cloroformo, se transfirió la fase acuosa a un tubo de
vidrio.
• Se agregó ARNasa A a una concentración de 100 µg/mL y se incubó por 30 min a 37°C.
• Se agregaron 0,6 volúmenes de isopropanol enfriado a 4°C y se mezcló suavemente por
inversión.
• Se centrifugó a 10000g por 20 min a 4°C.
• Se lavó el pellet con 1 mL de etanol 70% (v/v) y se centrifugó a 3000g por 2 min a 4°C.
• Se secó el pellet y se resuspendió en 0,5-1 mL de agua destilada estéril. Para una mejor
resuspensión, las muestras se dejaron a 4°C ON en contacto con el agua. El ADN se
guardó a -20°C hasta el momento de su utilización.
15.2 Cuantificación de ADN genómico
Para la cuantificación y chequeo de la integridad del ADN genómico purificado se realizaron
diluciones 1/10 de las muestras y se sembraron 1-10 µL en geles de agarosa 0,7-0,8% (p/v)
en TAE 1x. Se estimó la cantidad de ADN presente en el volumen sembrado por
comparación con la intensidad de las bandas de los marcadores de peso molecular Ladder
de 100 pb o Ladder de 400 pb (Productos Bio-Lógicos). En paralelo, el ADN genómico se
cuantificó por espectrofotometría mediante lecturas de absorbancia a 260 nm. El cálculo de
la concentración se realizó utilizando la siguiente fórmula:
Concentración de ADN ( g/ L) = A260 nm* (50 g / 1000 L) * factor de dilución
72
Materiales y Métodos
15.3 Digestión de ADN genómico
Se digirieron 10 µg de ADN genómico con distintas enzimas de restricción (EcoRI, EcoRV,
HindIII y XbaI de New England Biolabs). Se utilizaron 5 U de enzima por cada µg de ADN a
digerir. Las reacciones se realizaron en un volumen de 25 µL por µg de ADN con el
agregado de espermidina 1 mM y se incubaron a 37°C ON. Una vez transcurrido el tiempo
de incubación, las muestras se concentraron por evaporación al vacío hasta un volumen
final de 30-40 µL.
15.4 Electroforesis de ADN genómico
Al ADN genómico digerido se le agregó buffer de siembra para ADN con azul de bromofenol
y se sembró todo el volumen en un gel de agarosa 0,8% (p/v) en TAE 1x con bromuro de
etidio 0,5 µg/mL. La longitud del gel fue de aproximadamente 16 cm y la corrida
electroforética se realizó a 50 mA (corriente constante) durante 15-20 h, hasta que el
colorante azul de bromofenol alcanzó el borde gel. Se utilizó como indicador de peso
molecular el marcador 1kb Ladder de Invitrogen. El gel fue visualizado y fotografiado con un
equipo transiluminador UV (Syngene).
15.5 Transferencia e hibridación de ADN genómico
Luego de la corrida, se realizó la transferencia del ADN genómico a una membrana de nylon
Hybon N+ (GE Healthcare). Para ello, el gel se lavó con agua destilada y se lo incubó a
T°amb en agitación con las siguientes soluciones:
• HCl 0,25 M durante 10 min
• NaOH 0,5 M – NaCl 1,5 M durante 20 min (desnaturalización)
• Tris-HCl 0,5 M pH 7,5 – NaCl 1,5 M durante 20 min (neutralización)
A continuación, se transfirió por capilaridad durante la noche, utilizando SSC 20x. Una vez
finalizada la transferencia, el ADN se fijó a la membrana (crosslinking) exponiéndola a
120000 J de radiación ultravioleta utilizando el equipo UV Stratalinker 1800 (Stratagene).
La membrana se lavó con agua destilada y se pre-hibridó con solución CHURCH a 54°C
durante 2-4 h en un horno de hibridación. Luego, se agregó la sonda marcada
radiactivamente y se hibridó ON a 54-58°C. Al día s iguiente, se descartó la solución de la
sonda y se enjuagó la membrana con SSC 2x - SDS 0,1% (p/v). A continuación, se
realizaron lavados sucesivos utilizando soluciones de diferente fuerza iónica: SSC 2x - SDS
0,1% (p/v), SSC 1x - SDS 0,1% (p/v) y SSC 0,5x - SDS 0,1% (p/v). El tiempo de lavado fue
73
Materiales y Métodos
de 10-15 min para cada solución y las temperaturas utilizadas fueron de 50-60°C.
Finalmente, la membrana se expuso a una placa radiográfica (GE Healthcare) en un
cassette con pantalla amplificadora durante 7 d a -70°C. Al ternativamente, se registró la
señal empleando el equipo Phosphor-Imager Storm 820 (Pharmacia Biotech).
16.
Análisis de expresión a nivel de ARNm por Northern Blot
16.1 Extracción de ARN total a partir de material vegetal
El material vegetal cosechado fue congelado inmediatamente en nitrógeno líquido y
guardado a –70°C hasta el momento de la extracción. Todo el material plástico y las
soluciones empleadas en este procedimiento fueron previamente esterilizados en autoclave
(1 atmósfera de presión durante 20 minutos) para eliminar fuentes de ARNasas. El
procedimiento seguido para la extracción fue el siguiente:
•
En un mortero previamente enfriado se disgregó el material hasta obtener un polvo fino.
Durante todo el proceso el material se mantuvo siempre congelado por el agregado de
nitrógeno líquido.
•
Se agregaron 750 µL de TRIzol Reagent (Invitrogen) por cada 150 mg de material
vegetal.
•
La mezcla se pasó a un tubo eppendorf y se centrifugó a 15000xg durante 10 min a 4°C.
•
El sobrenadante se pasó a otro tubo y se mantuvo a temperatura ambiente durante 5
min para permitir la completa disociación de los complejos nucleoproteicos.
•
Se agregaron 200 µL de cloroformo por cada 750 µL de TRIzol inicial. A continuación los
tubos se agitaron durante 15 segundos y se incubaron a temperatura ambiente 2-3 min.
•
La mezcla se centrifugó a 15000xg durante 15 min a 4°C.
•
La fase acuosa (superior) se transfirió a un nuevo tubo y se le agregó 250 µL de
isopropanol más 250 µL de una solución citrato de sodio 0,8 M con NaCl 1,2 M.
•
La mezcla se incubó 20 min a 4°C; luego se precipi tó el ARN centrifugando a 15000xg
durante 20 min a 4°C y se descartó el sobrenadante.
•
Al pellet se le agregó 250 µL de acetato de sodio 3 M pH 5,2. Se centrifugó a 15000xg
durante 10 min a 4°C y se descartó el sobrenadante.
•
El pellet se lavó con 750 µL de etanol 75% preparado con agua destilada estéril y se
centrifugó a 15000xg durante 10 min a 4°C. Luego de eliminar el sobrena dante, se
centrifugó nuevamente a 15000xg durante 5 min a 4°C para extraer el etanol remanent e.
74
Materiales y Métodos
•
El pellet se secó y se resuspendió en 30-60 L de agua destilada estéril. El ARN se
guardó a -70°C hasta el momento de su utilización.
16.2 Cuantificación de ARN
La determinación de la concentración de ARN en las muestras obtenidas a partir de material
vegetal se realizó por espectrofotometría mediante lecturas de absorbancia a 260 nm. El
cálculo de la concentración se realizó teniendo en cuenta que una unidad de absorbancia a
260 nm corresponde a 40
g/mL de ARN y considerando la dilución realizada a las
muestras. La fórmula empleada fue la siguiente:
Concentración de ARN ( g/ L) = A260 nm * (40 g / 1000 L) * factor de dilución
En general, se realizaron diluciones entre 1/100 y 1/200 de las muestras con buffer Tris-HCl
10 mM pH 8,5.
16.3 Electroforesis de ARN
10-20
g de ARN total se separaron en un gel 1,2% de formaldehído-agarosa. Para la
preparación del gel 1,44 g de agarosa se disolvieron en 100 mL de buffer MOPS 1x y luego
se añadió 20 mL de formaldehído. La cantidad de ARN total a separar (10-20 g) se llevó a
un volumen de 20 L con agua destilada estéril. A este volumen de muestra se le agregó 30
L de una mezcla que contenía, cada 46 L, 6 L de buffer MOPS 10x, 30 L de formamida
desionizada, 9
L de formaldehído y 1
L de bromuro de etidio (1 mg/mL, Sigma). El
volumen final de 50 L se incubó a 65°C durante 15 min para desnaturaliz ar la estructura
secundaria del ARN. Luego se incubó en hielo durante 5 min. El buffer utilizado para la
electroforesis contenía, por cada 300 mL, 30 mL de buffer MOPS 10x, 45 mL de
formaldehído y 225 mL de agua destilada estéril. El gel se corrió durante 3-4 h a 70 V y
luego de la corrida fue visualizado y fotografiado con un equipo transiluminador UV
(Syngene).
16.4 Transferencia e hibridación de ARN
Tras la separación electroforética, el ARN se transfirió por capilaridad durante la noche a
una membrana de nylon Hybon N+ (GE Healthcare) utilizando buffer SSC 10x. Al día
siguiente, se fijó el ARN a la membrana (crosslinking) exponiéndola a 120000
J de
75
Materiales y Métodos
radiación ultravioleta mediante un equipo UV Stratalinker 1800 (Stratagene). Luego la
membrana se lavó 5 min con SSC 2x y se pre-hibridó con solución CHURCH a 55°C durante
2-4 h en un horno de hibridación. A continuación se agregó la sonda marcada
radiactivamente y se hibridó ON a la temperatura adecuada (entre 52°C y 60°C según la
longitud de la sonda). Al día siguiente se realizaron lavados sucesivos utilizando soluciones
de diferente fuerza iónica: SSC 2x - SDS 0,1%, SSC 1x - SDS 0,1%, SSC 0,5x - SDS 0,1%,
SSC 0,2x - SDS 0,1%, SSC 0,1x - SDS 0,1%. El rango de fuerza iónica utilizado, la
temperatura durante el lavado (40°C-60°C) y el tiem po de lavado (5-20 min por cada
solución) se determinaron en función de las características de cada sonda (longitud de la
sonda, abundancia del ARNm a detectar, etc). Por último, la membrana se expuso a una
placa autorradiográfica en un cassette con pantalla amplificadora durante 1-7 d a -70°C.
Alternativamente, se registró la señal empleando un Phosphor-Imager Storm 820
(Pharmacia Biotech).
16.5 Deshibridación de membranas
Para re-hibridar una membrana ya utilizada, se lavó dicha membrana con una solución de
SDS 0,5% (p/v), previamente calentada a 100°C, por 1-2 h con agitación. Esto permite
eliminar las sondas unidas al ARN. Se confirmó la ausencia de marca radioactiva
empleando el equipo Phosphor-Imager Storm 820 (Pharmacia Biotech) y se pre-hibridó con
solución CHURCH, continuando con el procedimiento ya detallado.
17.
Análisis de expresión a nivel de ARNm por RT-PCR semicuantitativa
17.1 Tratamiento con ADNasa
Las muestras de ARN se obtuvieron como se indica en la Sección 16.1 y luego se trataron
con ADNasa para eliminar posibles contaminaciones con ADN genómico. La mezcla de
reacción constó de:
• 10 µg de ARN
• 10 U ADNasa RQ1 libre de ARNasas (Promega)
• Buffer ADNasa 1x (provisto con la enzima)
• 20-40 U del inhibidor de ARNasas RNAseOUT (Invitrogen)
• Agua destilada estéril hasta un volumen final de 30 µL
76
Materiales y Métodos
La reacción se incubó a 37°C durante 30 min y se inactivó la enzima por calentamiento a
75°C durante 10 min. El ARN se precipitó ON a -20°C con 0,1 volúmenes de acetato de
sodio 3 M pH 5,2 y 2 volúmenes de etanol absoluto. A continuación, se centrifugó a 15000g
por 20 min a 4ºC y se lavó el pellet con 180 µL de etanol 70% (v/v). Se centrifugó
nuevamente a 15000g por 20 min a 4ºC, se secó el pellet y se resuspendió en 20 µL de
agua destilada estéril. El ARN tratado con ADNasa se cuantificó como se indica en la
Sección 16.2 y se guardó a -70°C hasta su utilización.
17.2 Síntesis de ADNc por transcripción reversa
A partir del ARN tratado con ADNasa, se sintetizó ADNc utilizando la enzima transcriptasa
reversa del virus de la leucemia murina (M-MLV RT, Promega). La síntesis se realizó según
el siguiente protocolo:
• 3-5 µg de ARN, 0,5 µg de un primer oligo-(dT)12-18 junto con 0,5 µg de primers
hexámeros al azar (BioDynamics) y 1 µL de una mezcla de los cuatro dNTPs (stock 10
mM) se llevaron a un volumen de 12 µL con agua destilada estéril.
• Se incubó la mezcla de reacción a 65ºC durante 5 min y luego se enfrió en hielo. Este
paso permite desnaturalizar la estructura secundaria del ARN.
• Se agregaron 4 µL del buffer de reacción 5x provisto con la enzima, 2 µL de DTT 0,1 M y
1 µL (40 U) del inhibidor de ARNasas RNAseOUT (Invitrogen).
• Se incubó a 37ºC durante 2 min.
• Se agregó 1 µL (200 U) de la enzima M-MLV RT (Promega)
• Se incubó a 37ºC durante 50 min y se inactivó la enzima por calentamiento a 70ºC por
15 min.
• Por último, se agregaron 2 U de ARNasa H (Invitrogen) y se incubó a 37ºC durante 20
min.
Las muestras se guardaron a -20ºC hasta el momento de su utilización.
17.3 Reacción de PCR semi-cuantitativa
El ADNc generado fue diluido ½ con agua destilada estéril y se utilizó como molde para una
reacción de PCR con primers específicos para las distintas isoformas de PP2Ac. Las
reacciones se llevaron a cabo empleando Taq polimerasa con el protocolo descripto en la
Sección 9.1, utilizando un volumen final de 40 µL. Para cada reacción se empleó como
molde 3 µL del ADNc diluido. Los primers utilizados para cada isoforma fueron los mismos
que se emplearon para el clonado de las sondas específicas y se indican en la Tabla 5.
77
Materiales y Métodos
Estos reconocen secuencias en las regiones 5´ o 3´-UTR de los ARNm. Para cada conjunto
de muestras se analizó también el nivel del ADNc del ARNr 18S como control constitutivo
(Nicot et al., 2005). Éste fue amplificado con los primers 18Sfw y 18Srv dando origen a un
producto de 100 pb. En cada reacción se agregó un control negativo reemplazando el molde
por 3 µL de agua destilada estéril y un control positivo utilizando 5 ng de los plásmidos
pGEM-T Easy donde se clonaron las sondas específicas para las distintas isoformas ó 100
ng de ADN genómico para 18S. El número de ciclos utilizados durante la amplificación se
eligió de modo que no se alcance la saturación de la reacción. En la Tabla 5 se indican las
condiciones de los ciclos utilizados en cada caso.
Luego de la reacción se agregó a cada tubo 6,5 µL de buffer de siembra para ADN y
los productos de PCR fueron separados en geles de agarosa 1,5% (p/v) en TAE 1x con
bromuro de etidio. El volumen de reacción sembrado fue de 12 µL para 18S, StPP2Ac2b y
StPP2Ac3, 15-20 µL para StPP2Ac4 y StPP2Ac5 y 30 µL para StPP2Ac1 y StPP2Ac2a. Las
imágenes correspondientes a estos geles fueron invertidas utilizando el programa Adobe
Photoshop CS3 para una mejor visualización.
Tabla 5 | Primers y condiciones de amplificación utilizados para el análisis de expresión a
nivel de ARNm por RT-PCR semi-cuantitativa. Las secuencias amplificadas corresponden a las
regiones 5’ ó 3’-UTR de las distintas isoformas de PP2Ac. T°a: temperatura de annealing utilizada
para la unión de los primers al ADN molde.
°
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Determinación de sitios alternativos de poliadenilación por
3’RACE-PCR
Los sitios de terminación de los transcriptos maduros de StPP2Ac2b fueron determinados
por 3´-RACE PCR. Para ello se extrajo ARN total a partir de hojuelas tratadas con el elicitor
quitosano por 8 h (condición en la que aumenta el nivel del ARNm de esta isoforma) y se
78
Materiales y Métodos
sintetizó ADNc como se indica en la Sección 17.2. Para la síntesis se utilizó un primer
adaptador conteniendo una secuencia poli-T (primer “3raceTTadapt”) capaz de unirse a la
cola de poli-A de los ARNm. Para la amplificación específica de StPP2Ac2b se empleó el
primer “raceC2b-3UTR” que se une al inicio del 3’-UTR y el primer adaptador “3raceadapt”
como primer reverso. El producto de la reacción (10 µL) se corrió en un gel de agarosa 1%
(p/v) y se tomó una muestra de cada banda observada empleando un tip de micropipeta. El
material colectado con el tip se resuspendió en 10 µL de agua destilada estéril y se utilizó 1
µL de esta solución como molde en una reacción de PCR con los mismos primers
mencionados arriba (“raceC2b-3UTR” y “3raceadapt”). Las muestras que dieron un resultado
positivo en esta reacción se analizaron realizando una PCR anidada para confirmar la
especificidad de los fragmentos obtenidos. Para ello se empleó el primer “nestedC2b-3UTR”
que se une 150 pb río abajo del primer “raceC2b-3UTR” y el primer reverso “3raceadapt”.
Aquellos fragmentos que resultaron positivos en la PCR anidada fueron amplificados,
purificados a partir de un gel de agarosa 1% (p/v) y clonados en el vector pGEM-T Easy
(Promega) para ser secuenciados. Los sitios de clivaje y poliadenilación se determinaron
buscando en las secuencias obtenidas el comienzo de la cola de poli-A.
19.
Análisis de expresión a nivel de proteínas por Western Blot
19.1 Extracción de proteínas
El material vegetal cosechado luego de los tratamientos fue congelado inmediatamente en
nitrógeno líquido y guardado a –70°C hasta el momen to de la extracción. Las muestras
fueron disgregadas en un mortero con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. A
continuación se agregó el buffer de extracción Tris-HCl 50 mM pH 7,5 conteniendo βmercaptoetanol 2 mM, EDTA 1 mM, glicerol 20% (v/v) suplementado al momento de usar
con inhibidores de proteasas (fenilmetilsulfonil fluoruro 0,5 mM, benzamidina 1 mM, inhibidor
de tripsina de soja 2 µg/mL y aprotinina 25 U/mL). Se utilizó 1 mL de buffer por cada g de
tejido fresco. Las suspensiones resultantes fueron centrifugadas a 2000g por 30 min a 4°C y
el sobrenadante de cada muestra fue utilizado para los ensayos de Western Blot.
Finalmente, las proteínas se guardaron a -70°C hast a el momento de su utilización.
79
Materiales y Métodos
19.2 Cuantificación de proteínas
A partir de diluciones 1/10 ó 1/20 de los extractos obtenidos, se determinó la concentración
de proteínas por el método de Bradford (Bradford, 1976). Se utilizó una microplaca de 96
pocillos y se realizaron las siguientes mezclas por triplicado:
• Muestras: 200 L de reactivo de Bradford + 10 L de la dilución de la muestra.
• Curva Patrón: 200
L de reactivo de Bradford + 10
L de soluciones de BSA de
concentración conocida (0,05 - 0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 - 0,5 g/ L).
• Blanco de Lectura: 200 L de reactivo de Bradford + 10 L de agua.
Las lecturas de absorbancia se hicieron a 620 nm en un equipo lector de ELISA. A
continuación, se construyó una curva de A620 nm versus masa ( g) de BSA y a partir de ella
se obtuvo el valor de g de proteínas presentes en los 10 L de la dilución de la muestra.
19.3 Electroforesis de proteínas
Las muestras fueron separadas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE)
12% (p/v) de acuerdo con el método de Laemmli (Laemmli, 1970). Los geles se armaron y
corrieron en el equipo de electroforesis E5889 de Sigma. Cada gel contenía una parte
concentradora (superior) y una parte separadora (inferior). El espesor de los geles fue de 1,5
mm y fueron preparados de la siguiente manera:
•
Gel concentrador: 830 µL de una mezcla acrilamida/bisacrilamida (29:1) 30% (p/v) + 630
µL de Tris-HCl 1 M pH 6,8 + 50 µL de SDS 10% (p/v) + 50 µL de APS 10% (p/v) + 5 µL
de TEMED + agua hasta un volumen final de 5 mL.
•
Gel separador 12%: 4,0 mL de una mezcla acrilamida/bisacrilamida (29:1) 30% (p/v) +
2,5 mL de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 + 100 µL de SDS 10% (p/v) + 100 µL de APS 10% (p/v)
+ 4 µL de TEMED + agua hasta un volumen final de 10 mL.
Antes de la electroforesis se agregó a cada muestra buffer de siembra para proteínas, se
incubó durante 5 min a 100°C y se colocó en hielo. Se sembraron entre 30 y 50 µg de
proteínas y la corrida electroforética se realizó a 20 y 40 mA de corriente constante para el
gel concentrador y separador, respectivamente. Como buffer de corrida se usó Tris-GlicinaSDS 1x y como marcadores de peso molecular se empleó el marcador Page Ruler Prestained Protein Ladder (Fermentas).
80
Materiales y Métodos
19.4 Transferencia de proteínas
Luego de la corrida electroforética, las proteínas fueron transferidas a una membrana de
nitrocelulosa (Hybond ECL, GE Healthcare) utilizando un equipo para transferencia semiseca (Biometra). Para ello se colocaron sobre dicho equipo el gel separador y la membrana
de nitrocelulosa entre papeles Whatman 3MM. Tanto la membrana como los papeles fueron
humedecidos previamente con buffer de transferencia. Las proteínas se transfirieron a
corriente constante (1,5 mA/cm2 gel) durante 1 h. Luego las membranas se tiñeron con el
colorante Ponceau S (0,1% p/v Ponceau S en ácido acético 5% v/v) para verificar que la
masa de proteínas sembradas en cada calle fuera similar y que la transferencia se haya
producido correctamente.
19.5 Detección de proteínas PP2Ac mediante anticuerpos
Las membranas fueron bloqueadas con buffer TBS 1x - Tween20 0,05% (v/v) suplementado
con leche descremada 5% (p/v). Luego se incubaron con un anticuerpo IgG monoclonal antiPP2Ac producido en ratón (clon 1D6, Upstate) durante 1 h a T°amb con agitación. Este
anticuerpo se utilizó en una dilución 1 µg/mL en TBS 1x - Tween20 0,05% (v/v)
suplementado con BSA 1% (p/v). A continuación se realizaron lavados con TBS 1x Tween20 0,05% (v/v) y se incubó durante 1 h a T°amb en agitación con un anticuerpo
secundario policlonal anti-IgG de ratón producido en cabra (Perkin-Elmer). Este anticuerpo
está acoplado a la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y se utilizó diluido 1/5000 en TBS 1x
- Tween20 0,05% (v/v) suplementado con BSA 1% (p/v). Después de lavar con TBS 1x Tween20 0,05% (v/v) se realizó el revelado con el sistema de quimioluminiscencia ECL (GE
Healthcare). Se cubrió la membrana con la mezcla reveladora durante 1 min y luego, en
oscuridad, se la expuso a una placa radiográfica (Kodak) durante 2-10 min.
El anticuerpo monoclonal 1D6 fue producido utilizando como epitope un péptido de
15 aminoácidos correspondientes al extremo carboxilo-terminal de una PP2Ac humana (Wei
et al., 2001; Yu et al., 2001). Dicho péptido es altamente conservado en todas las PP2Ac
descriptas y, por lo tanto, se espera que reconozca todas las isoformas presentes en papa.
Se ha descripto que la metilación de la leucina carboxilo-terminal de las PP2Ac puede
dificultar la unión de los anticuerpos que reconocen dicho extremo. Por lo tanto, como
control, las muestras fueron sometidas a un pre-tratamiento con NaOH 0,1 M por 5 min en
hielo para eliminar posibles metilaciones antes de la corrida electroforética (Yu et al., 2001).
No se observaron diferencias significativas en los patrones de expresión obtenidos con
muestras pre-tratadas o no. Esto podría deberse a que no ocurren cambios en la posible
81
Materiales y Métodos
metilación de las PP2Ac en las condiciones estudiadas o al hecho de que el anticuerpo 1D6
no sea capaz de detectar dichos posibles cambios. En este sentido, se sabe que el clon 1D6
no presenta una alta sensibilidad a la metilación.
20.
Densitometría de bandas
La intensidad relativa de las bandas correspondientes a los ensayos de Northern Blot, RTPCR y Western Blot fue analizada con el programa ImageJ (National Institutes of Health;
http://rsb.info.nih.gov/ij). Un incremento igual o mayor al 100% o una disminución igual o
mayor al 50% fueron considerados cambios significativos.
Las bandas correspondientes a los ARNm analizados por Northern Blot fueron
cuantificadas y normalizadas con respecto al ARN ribosomal (ARNr). Gracias a la tinción de
las muestras con bromuro de etidio, las bandas de ARNr fueron visualizadas y fotografiadas
en el gel de agarosa antes de la transferencia, utilizando un equipo transiluminador UV
(Syngene).
Las bandas detectadas en los ensayos de RT-PCR fueron cuantificadas y
normalizadas con respecto al control del ARNr 18S.
En el caso de muestras provenientes de hojas, las bandas correspondientes a las
proteínas PP2Ac en los ensayos de Western Blot fueron cuantificadas y normalizadas con
respecto a la subunidad mayor de la Rubisco. Esta última corresponde a la banda más
intensa detectada por la tinción de las membranas con el colorante Ponceau S. En el caso
de muestras provenientes de otros órganos, sólo se determinó la intensidad de las bandas
de PP2Ac, sin normalizar con respecto a la tinción por Ponceau S.
21.
Determinación de la actividad fosfatasa
21.1 Soluciones y reactivos empleados en los ensayos de actividad
• Buffer de reacción para el método del p-nitrofenil-fosfato: 20 mM MgCl2, Tris-HCl 50
mM pH 8,5 y 1 mM DTT.
• p-Nitrofenil-fosfato (pNPP, Sigma): al momento de realizar los ensayos se preparó una
solución stock de pNPP 100 mM disolviendo el reactivo en el buffer de reacción. La
concentración final empleada en los ensayos fue de 15 mM.
• Reactivo verde de malaquita: (a) disolver 4,2 g de molibdato de amonio en 100 mL de
HCl 4 M (b) disolver 2,72 g de colorante verde de malaquita-oxalato en 100 mL de agua
destilada (c) mezclar 50 mL de la solución (a) con 3 mL de la solución (b) y llevar a un
82
Materiales y Métodos
volumen final de 200 mL con agua destilada. Agitar durante 30 min, filtrar con papel
Whatman y agregar 200 µL de detergente NP-40 2% (p/p) por cada 10 mL de reactivo.
Guardar a 4°C en oscuridad.
21.2 Método del p-Nitrofenil-fosfato
La determinación de actividad fosfatasa utilizando el reactivo pNPP como sustrato se realizó
según (DeGuzmán y Lee, 1988). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 200 µL
conteniendo 30 µg de extracto proteico (llevado a un volumen de 20 µL con buffer de
reacción), 30 µL del stock de pNPP 100 mM y 150 µL de buffer de reacción. Se realizó
también un blanco reemplazando el extracto por 20 µL buffer de reacción. Se incubó durante
15 min a 30°C con agitación, se frenó la reacción con el agregado de 1 mL de Na2CO3 0,5 M
y se midió la absorbancia a 405 nm. Luego se realizó una curva de calibración empleando el
producto de la reacción (p-nitrofenol) para la conversión de los valores de absorbancia en
nmoles de p-nitrofenol producidos por min y por mg de extracto proteico (nmol/min/mg). Los
extractos se obtuvieron como se indica en la Sección 19.1 y los ensayos fueron realizados
por triplicado. En las condiciones empleadas, las actividades medidas fueron lineales con
respecto al tiempo y a la cantidad de extracto utilizado.
21.3 Método de la Fosforilasa a
Para la realización de este método, se empleó el kit Protein Phosphatase Assay System
(Life Technologies, GIBCO BRL) que utiliza como sustrato la proteína glucógeno fosforilasa
a, la cual puede ser reconocida y desfosforilada por fosfatasas tipo PP1 y PP2A (Ingebritsen
y Cohen, 1983). El fosfato inorgánico (Pi) liberado fue detectado mediante el colorante
indicador verde de malaquita (Hohenwallner y Wimmer, 1973; Fusari et al., 2006). Este
método de detección tiene un alto grado de sensibilidad, comparable con los métodos
radiométricos que emplean 32P para la detección del Pi liberado.
En primer lugar se realizó la fosforilación del sustrato utilizando ATP no radiactivo y
siguiendo las indicaciones del fabricante. Luego se llevó a cabo la reacción de
desfosforilación en un volumen final de 40 µL conteniendo el sustrato fosforilado, el buffer de
reacción provisto con el kit y 1,5 µg de extracto proteico. Se incubó 10 min a 30ºC con
agitación. Luego se agregaron 800 µL del reactivo verde de malaquita, se incubó 1 min a
T°amb y se finalizó la reacción con 100 µL de citrato de sodio 34% (p/v), el cual estabiliza el
color durante aproximadamente 1 h. Por último, se midió la absorbancia a 630 nm.
83
Materiales y Métodos
Los extractos se obtuvieron como se indica en la Sección 19.1 y los ensayos fueron
realizados por duplicado. Para cada muestra se hicieron controles reemplazando el sustrato
por su buffer de dilución, para determinar el aporte de Pi hecho por el extracto proteico.
Además, se realizaron blancos utilizando el buffer de reacción junto con el buffer de dilución
del sustrato o el buffer de reacción más el sustrato. Para la conversión de los valores de
absorbancia en nmoles de Pi producidos por min y por mg de extracto proteico
(nmol/min/mg) se empleó una curva de calibración generada con cantidades conocidas de
fosfato (aportado en la forma de KH2PO4). En las condiciones empleadas, las actividades
medidas fueron lineales con respecto al tiempo y a la cantidad de extracto empleado.
22.
Determinación del contenido relativo de agua (RWC) en hojas
Para evaluar la tolerancia al estrés salino de hojuelas sometidas a diferentes tratamientos se
determinó su contenido relativo de agua, RWC (Capiati et al., 2006). Este parámetro se
calculó según la siguiente fórmula:
RWC (%) = [(FW – DW) / (TW – DW)] * 100
donde:
•
FW (Fresh Weight): es el peso fresco de las hojuelas luego de los tratamientos
•
TW (Turgor Weight): es el peso de las hojuelas luego de una re-hidratación de 24 h
realizada luego de la determinación del FW
•
DW (Dry Weight): es el peso seco de las hojuelas luego de exponerlas a 80°C por 24 h
luego de la determinación del TW
Un mayor grado de deshidratación implica un menor valor de RWC (%).
Los valores de RWC (%) en cada figura representan el promedio ± desvío estándar de
4-8 hojuelas obtenidas de diferentes plantas al azar. En cada caso, se muestra un resultado
representativo de al menos 2 experimentos independientes. Para el análisis estadístico se
empleó la prueba t de Student donde valores de p < 0,05 fueron considerados significativos.
Las hojuelas se obtuvieron a partir de plantas de papa WT de 1,5 meses y se
colocaron en recipientes plásticos con agua como se indica en la Sección 1.1. La
deshidratación se indujo por agregado de NaCl 250 mM y se evaluó el efecto de los
inhibidores ácido okadaico y endotal sobre la pérdida de agua provocada por la sal. Los
detalles de los tratamientos se indican al pie de cada figura.
84
Resultados
RESULTADOS
1. Familia de PP2Ac en Solanum tuberosum L.
Para comenzar con la caracterización de las subunidades catalíticas PP2Ac de S.
tuberosum, se realizaron búsquedas bioinformáticas en la base de datos DFCI Potato Gene
Index (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi). A partir de esta base de datos se obtuvieron
todas las secuencias de TCs y ESTs que presentaban un alto grado de identidad con
respecto a las secuencias codificantes de las PP2Ac de Arabidopsis thaliana (Ariño et al.,
1993; Casamayor et al., 1994; Pérez-Callejón et al., 1998). Las secuencias obtenidas fueron
alineadas y analizadas con el programa Vector NTI (Invitrogen), lo que permitió la
reconstrucción de seis secuencias de ADNc homólogas a PP2Ac. Estas secuencias fueron
analizadas con el programa ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) para
determinar la presencia de marcos abiertos de lectura. Se encontró que cinco de ellas
incluyen una secuencia codificante completa homóloga a PP2Ac, flanqueada por regiones
5’- y 3’-UTR, mientras que la restante corresponde a una secuencia parcial que abarca la
región 3’ del transcripto.
Las distintas isoformas fueron designadas según su homología con las isoformas de
tomate (Solanum lycopersicum), inicialmente descriptas en He et al., 2004: StPP2Ac1
(TC140898 + TC142763), StPP2Ac2a (TC133492 + TC148791), StPP2Ac2b (TC135479 +
TC142684), StPP2Ac3 (TC144550 + TC141350), StPP2Ac4 (TC153075), StPP2Ac5
(EST560167, secuencia parcial). Las secuencias codificantes de StPP2Ac1, StPP2Ac2a,
StPP2Ac2b y StPP2Ac4 poseen 921 pb, mientras que la secuencia codificante de StPP2Ac3
presenta 939 pb. La secuencia parcial de StPP2Ac5 incluye sólo 277 pb de la región
codificante de esta isoforma. En la Tabla 6 se muestra el porcentaje de identidad existente
entre las secuencias codificantes de las seis isoformas de PP2Ac.
A continuación, se realizó la traducción de las secuencias codificantes utilizando los
programas ORF Finder y ExPASy Translate Tool (http://www.expasy.ch/tools/dna.html). Las
secuencias aminoacídicas obtenidas fueron comparadas para determinar el grado de
identidad y similitud entre las proteínas PP2Ac de S. tuberosum (Tabla 7).
Por otro lado, el peso molecular y el punto isoeléctrico teóricos de las proteínas PP2Ac
fueron calculados empleando el programa ExPASy Compute pI/Mw Tool. Estos datos, junto
con el número de aminoácidos de cada una de las isoformas, se muestran en la Tabla 8.
85
Resultados
Tabla 6 | Porcentaje de identidad entre las secuencias codificantes de las isoformas de PP2Ac
de S. tuberosum. Las secuencias codificantes se alinearon utilizando el programa BLAST para la
comparación de dos secuencias nucleotídicas (bl2seq-blastn, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Para la isoforma StPP2Ac5 se utilizó la secuencia codificante parcial.
)
)
*
H
+
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=&H
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H
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H
H
H
'H
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H
H
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H
=&H
*
+
,
H
Tabla 7 | Porcentajes de identidad y similitud entre las secuencias aminoacídicas de las
isoformas de PP2Ac de S. tuberosum. Las secuencias se compararon utilizando el programa
BLAST para el alineamiento de dos proteínas (bl2seq-blastp, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Para la isoforma StPP2Ac5 se utilizó la secuencia aminoacídica parcial. En cada caso se muestra el
porcentaje de identidad seguido por el porcentaje de similitud.
)
H-
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H
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H
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+
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=H-==H
4H-=(H
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& H-& H
H-
H
H-
*
H
H-
+
H
&4H-&4H
H-
,
H
Tabla 8 | Número de aminoácidos, peso molecular y punto isoeléctrico teóricos de las
proteínas PP2Ac de S. tuberosum. Estos parámetros fueron calculados utilizando el programa
ExPASy Compute pI/Mw Tool (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html). nd: no determinado.
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8
& 4
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' '
%
86
Resultados
Las secuencias aminoacídicas de las PP2Ac fueron analizadas también utilizando
programas
para
la
predicción
de
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)
la
localización
y
PSORT
subcelular:
TargetP
(http://wolfpsort.org/),
1.1
ambos
configurados para el análisis de proteínas de plantas. En ningún caso se detectaron
péptidos señal asociados a localización en cloroplastos, mitocondrias o vías de secreción,
siendo el citoplasma la localización más probable para estas proteínas.
Para evaluar la presencia de dominios funcionales en la estructura primaria de las
proteínas PP2Ac de S. tuberosum se empleó el programa SMART. En todos las isoformas
de las que se conoce su secuencia completa, se detectó la presencia de un dominio
catalítico “PP2Ac” típico de las subunidades catalíticas de PP2A (Tabla 9). En el caso de la
isoforma StPP2Ac5, se utilizó para el análisis su secuencia aminoacídica parcial y se
detectó también la presencia de parte del dominio “PP2Ac”.
Tabla 9 | Dominios funcionales de las isoformas de PP2Ac de S. tuberosum. El análisis de los
dominios funcionales fue realizado utilizando el programa SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/).
Se indica la posición que ocupa el dominio catalítico en la secuencia aminoacídica y un valor que
refleja el grado de confianza con el que fue determinado dicho dominio (Valor E).
$
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0
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- (
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=
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+
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(
-
A continuación, se realizó un alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídicas
de las PP2Ac utilizando el programa ClustalW (Figura 14). Se observó que las cinco
isoformas de las que se conoce su secuencia completa poseen, en su dominio catalítico,
todos los residuos conservados del motivo fosfoesterasa típico de las fosfatasas de la familia
PPP (Shi, 2009a): GDxHG(x)nGDxVDRG(x)nGNHE (donde n = aproximadamente 25). Por
otro lado, las seis isoformas poseen el motivo carboxilo-terminal TPDYFL que contiene los
sitios de metilación y fosforilación implicados en la regulación del intercambio dinámico de
subunidades regulatorias (Janssens et al., 2008).
87
Resultados
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
------MPSHADVDRQIEQLMECKPLSEAEVKTLCEQARAILVEEWNVQPVKCPVTVCGD
------MPSHADLDRQIEQLMECKPLSEADVKTLCDQARAILVEEWNVQPVKCPVTVCGD
------MPSNADVDRQIEQLMECKPLPEAEVKTLCEQARAILVEEWNVQPVKCPVTVCGD
MSSDLIANTHGNLDEQISQLMQCKPLSEPEVRALCEKAKEILMEESNVQPVKSPVTICGD
------MDSVGNLDEQIGLLMQCKPLSEQAVRGLCEKAKEILVQESNVQPVKSPVTICGD
------------------------------------------------------------
54
54
54
60
54
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
IHGQFYDLIELFRIGGNAPDTNYLFMGDYVDRGYYSVETVSLLVALKVRYRDRITILRGN
IHGQFYDLIELFRIGGNAPDTNYLFMGDYVDRGYYSVETVTLLVALKVRYRDRITILRGN
IHGQFYDLIELFRIGGNAPDTNYLFMGDYVDRGYYSVETVSLLVALKVRYRDRITILRGN
IHGQFHDLAELFRIGGQCPDTNYLFMGDYVDRGYYSVETVTLLVALKVRYPQRLTILRGN
IHGQFHDLAELFRIGGKCPDTNYLFMGDYVDRGYYSVETVSLLVALKVRYPQRITILRGN
------------------------------------------------------------
114
114
114
120
114
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
HESRQITQVNGFYDECLRKYGNANVWKYFTDLFDYLPLTALIESQIFCLHGGLSPSLDTL
HESRQITQVYGFYDECLRKYGNANVWKYFTDLFDYLPLTALIESQIFCLHGGLSPSLDTL
HESRQITQVYGFYDECLRKYGNANVWKYFTDLFDYLPLTALIESQVFCLHGGLSPSLDTL
HESRQITQVYGFYDECLRKYGNANVWKTFTDLFDYFPLTALVESEIFCLHGGLSPSIETL
HESRQITQVYGFYDECLRKYGNANVWKTFTDLFDYFPLTALVESEIFCLHGGLSPTIETL
------------------------------------------------------------
174
174
174
180
174
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
DNIRALDRIQEVPHEGPMCDLLWSDPDDRCGWGISPRGAGYTFGQDIASQFNHTNGLSLI
DNIRALDRIQEVPHEGPMCDLLWSDPDDRCGWGISPRGAGYTFGQDIASQFNHTNGLTLI
DNIRSLDRIQEVPHEGPMCDLLWSDPDDRCGWGISPRGAGYTFGQDIASQFNHTNGLTLI
DNVRSFDRVQEVPHEGAMCDLLWSDPDDRCGWGMSPRGAGYTFGQDISEQFHHTNNLKLI
DDIRNFDRVQEVPHEGAMCDLLWSDPDDRCGWGISPRGAGYTFGQDISEQFNHTNNLNLI
-----------------------------------------TFGQDISEQFNHTNGLKLI
******:.**:***.*.**
234
234
234
240
234
19
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
SRAHQLVMEGFNWCQEKNVVTVFSAPNYCYRCGNMAAILEISENMEQNFLQFDPAPRQIE
SRAHQLVMEGFNWCQDKNVVTVFSAPNYCYRCGNMAAILEIGENMEQNFLQFDPAPRQIE
SRAHQLVMEGFNWCQDKNVVTVFSAPNYCYRCGNMAAILEIGENMEQNFLQFDPAPRQIE
ARAHQLVMEGYNWSHEQKVVTIFSAPNYCYRCGNMASILEVDDCRGHTFIQFDPAPRRGE
ARAHQLVMEGFNWAHDQKVVTIFSAPNYCYRCGNMASILEVDDAKDRTFIQFEPAPRRGE
ARAHQLVMEGFNWAHDQKVVTIFSAPNYCYRCGNMASILEVDDCNGHTFIQFEPAPRRGE
:*********:**.::::***:**************:***:.:
:.*:**:****: *
294
294
294
300
294
79
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
PDTTRKTPDYFL
PDTTRKTPDYFL
PDTTRKTPDYFL
PDVTRRTPDYFL
PDVTRRTPDYFL
PDVTRRTPDYFL
**.**:******
306
306
306
312
306
91
Figura 14 | Alineamiento múltiple de las secuencias aminoacídicas de las proteínas PP2Ac de
S.
tuberosum.
Las
secuencias
fueron
alineadas
utilizando
el
programa
ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw). Bajo las secuencias, las identidades se indican con asteriscos, las
sustituciones conservadas con dos puntos y las sustituciones semi-conservadas con un punto. Los
residuos no alineados se indican con guiones. Sobre las secuencias, el dominio catalítico se indica
con una línea verde, el motivo fosfoesterasa GDxHG(x)nGDxVDRG(x)nGNHE (conservado en todas
las fosfatasas PPP) con líneas azules y el motivo carboxilo-terminal TPDYFL (conservado en todas
las PP2Ac) con una línea roja.
88
Resultados
En las fosfatasas de la familia PPP, la coordinación de los dos iones metálicos
involucrados en la catálisis se realiza a través de tres histidinas, dos ácidos aspárticos y una
asparragina (Shi, 2009a). Estos seis aminoácidos se encuentran altamente conservados en
las fosfatasas de dicha familia, incluyendo las PP2As. A partir del alineamiento múltiple de la
Figura 14, se observó que las cinco isoformas de las que se conoce su secuencia completa
poseen dichos aminoácidos en su dominio catalítico (Tabla 10). A su vez, en las fosfatasas
de la familia PPP existen tres aminoácidos (dos argininas y una histidina) importantes para
la unión del fosfato (Shi, 2009a). Estos residuos también se encuentran presentes en las
cinco isoformas de secuencia completa (Tabla 10).
Tabla 10 | Aminoácidos conservados en la estructura primaria de las proteínas PP2Ac de S.
tuberosum. Se indican los aminoácidos importantes para la interacción de las PP2Ac con los iones
metálicos coordinados en el sitio activo y con el fosfato (residuos conservados en las fosfatasas de la
familia PPP). También se indican los aminoácidos importantes para la interacción de la subunidad
catalítica con la subunidad estructural A y con el inhibidor ácido okadaico, según fueron
determinados por cristalografía en una fosfatasa PP2A de humanos. Los aminoácidos que sólo se
conservan en algunas de las isoformas se indican como “parcialmente conservados”.
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2
1
-
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Por otro lado, estudios de cristalografía realizados con una fosfatasa PP2A de
humanos (Xing et al., 2006) permitieron detectar trece residuos de la subunidad catalítica
que son importantes para su interacción con la subunidad estructural A. Analizando el
alineamiento múltiple de las PP2Ac de S. tuberosum (Figura 14) se encontró que diez de
estos residuos se encuentran totalmente conservados en las cinco isoformas de las que se
conoce su secuencia completa, mientras que los tres restantes sólo están presentes en
algunas de las isoformas (Tabla 10). Además, en los estudios de cristalografía antes
mencionados, se identificaron catorce aminoácidos importantes para la interacción de las
subunidades catalíticas de PP2A con el inhibidor ácido okadaico. Trece de estos residuos
89
Resultados
están conservados en las cinco isoformas de secuencia completa, mientras que el restante
se encuentra presente en la mayoría de ellas (Tabla 10).
A continuación, se construyó un árbol filogenético de las proteínas PP2Ac de S.
tuberosum, tomate (S. lycopersicum), arroz (Oryza sativa) y A. thaliana. Se utilizó para ello
el programa MEGA 4.1 y el método de Máxima Parsimonia (Figura 15). En concordancia con
lo reportado en otras especies vegetales, se encontró que las proteínas PP2Ac de S.
tuberosum se agrupan en dos subfamilias, designadas como Subfamilia I y Subfamilia II de
acuerdo con lo establecido para las PP2Ac de tomate en He et al., 2004. La Subfamilia I
contiene las isoformas StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b, mientras que la Subfamilia II
incluye a StPP2Ac3, StPP2Ac4 y StPP2Ac5.
Teniendo en cuenta esta subdivisión, en el alineamiento múltiple de la Figura 14 se
observa que en el extremo carboxilo-terminal se ubican algunos aminoácidos distintivos de
cada subfamilia, mientras que en el extremo amino-terminal se encuentran aminoácidos
específicos de las diferentes isoformas de PP2Ac. Estos resultados coinciden con lo
previamente reportado para arroz y A. thaliana (Yu et al., 2003).
Por otro lado, se realizó una búsqueda de proteínas homólogas a las PP2Ac de S.
tuberosum utilizando el programa BLAST y la base de datos no redundante de proteínas. En
la Tabla 11 se muestran algunas de las proteínas de mayor similitud con las subunidades
catalíticas de papa, en particular, aquellas de las que se tiene evidencias sobre su función
y/o lugar de expresión. De esta forma, se obtuvo información preliminar sobre los procesos
en los que podrían estar involucradas las PP2Ac de S. tuberosum.
Finalmente, para confirmar la presencia de múltiples genes de PP2Ac en el genoma
de S. tuberosum, se realizaron ensayos de Southern Blot empleando una sonda
correspondiente a una región altamente conservada del dominio catalítico de estas
proteínas. En la Figura 16 se observa que en la calle 4 (correspondiente al ADN genómico
digerido con la enzima HindIII) fue posible detectar múltiples bandas. Estos resultados
apoyan la hipótesis de la existencia de una familia multigénica de PP2Ac en S. tuberosum.
90
Resultados
II
I
Figura 15 | Árbol filogenético de las proteínas PP2Ac de papa, tomate, arroz y Arabidopsis
thaliana. El árbol filogenético se construyó según el método de Máxima Parsimonia utilizando el
programa MEGA 4.1 (http://www.megasoftware.net/index.html). Las subunidades catalíticas
PP2Ac de papa (Solanum tuberosum, St) fueron comparadas con las siguientes proteínas de A.
thaliana (At): AtPP2A-1 (secuencia NP_176192 del GenBank), AtPP2A-2 (NP_172514), AtPP2A-3
(NP_567066), AtPP2A-4 (NP_973672), AtPP2A-5 (NP_177154); arroz (Oryza sativa, Os):
OsPP2A-1 (secuencia AAC72838 del GenBank), OsPP2A-2 (AAD22116), OsPP2A-3 (AAD41126),
OsPP2A-4 (AAD48068), OsPP2A-5 (AAF86353) y tomate (Lycopersicon esculentum, Le;
actualmente Solanum lycopersicum): LePP2Ac1 (secuencia AAQ67225 del GenBank), LePP2Ac2
(AAQ67226), LePP2Ac3 (secuencia TC124303 del DFCI Tomato Gene Index, traducida con ORF
Finder), LePP2Ac4 (secuencia TC124304 del DFCI Tomato Gene Index, traducida con ORF
Finder), LePP2Ac5 (secuencia BT013374 del GenBank, traducida con ORF Finder). Las flechas
marcan la ubicación de las isoformas de PP2Ac de papa. Las Subfamilias se indican como I y II
según lo establecido en He et al., 2004.
91
Resultados
Tabla 11 | Proteínas PP2Ac homólogas a las subunidades catalíticas de las fosfatasas PP2A de
S. tuberosum. Las búsquedas de proteínas homólogas se realizaron con el programa BLAST
(blastp, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) empleando la base de datos no redundante.
6
7
8
8
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2 7
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K
2 7
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(
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M
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E
N
(
(*) Información asociada a la secuencia en la base de datos GenBank
92
Resultados
1 2 3 4
kpb
12,2
10,1
7,1
5,0
4,0
Figura 16 | Análisis de la familia génica de PP2Ac
3,0
mediante Southern Blot. El ADN genómico de S.
tuberosum fue digerido con las enzimas EcoRV (1),
2,0
1,6
EcoRI (2), XbaI (3), HindIII (4). Las muestras se
separaron en un gel de agarosa 0,8% (p/v), se
transfirieron a una membrana de nylon y se hibridaron
1,0
con una sonda diseñada contra una región conservada
del dominio catalítico de las PP2Ac.
Recientemente se ha generado una versión preliminar de la secuencia del genoma de
Solanum phureja, una especie diploide altamente relacionada con S. tuberosum
(http://www.potatogenome.net). Utilizando las secuencias codificantes y las regiones 3’-UTR
de las seis isoformas de S. tuberosum, se realizaron búsquedas en la base de datos
asociada a este proyecto. Se detectaron al menos seis secuencias altamente similares a las
PP2Ac reportadas en esta tesis, con porcentajes de identidad máximos de 97%-100% para
las secuencias codificantes y 95%-99% para las regiones 3’-UTR. Estos datos sugieren la
presencia de al menos seis genes para PP2Ac en el genoma de ambas especies.
2. Expresión de PP2Ac en distintos órganos de la planta
En primer lugar, para determinar los niveles de las proteínas PP2Ac en distintos órganos de
la planta, se utilizó la técnica de Western Blot. Para ello se empleó un anticuerpo
monoclonal (clon 1D6, Upstate) que reconoce un epitope carboxilo-terminal altamente
conservado en todas las PP2Ac descriptas y que está presente también en las seis
subunidades catalíticas encontradas en S. tuberosum. Por lo tanto, se espera que este
anticuerpo sea capaz de detectar todas las isoformas presentes en papa.
Como se observa en la Figura 17, las PP2Ac fueron detectadas en todos los órganos
analizados, aunque con distintos niveles de expresión. La abundancia de estas proteínas es
mayor en las flores, el ápice del vástago, el tallo y las hojas en comparación con los
pimpollos y la raíz, donde las PP2Ac presentan niveles mucho menores.
93
Resultados
P
F
A
H
T
R
P
F
A
H
T
R
PP2Ac
NaOH 0,1M
unidades arbitrarias
200
150
100
50
0
P
F
A
H
T
R
Figura 17 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en distintos órganos de la planta. Se
realizaron ensayos de Western Blot utilizando muestras obtenidas a partir de plantas crecidas por 1-2
meses en invernáculo. Alícuotas de los extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del
ensayo, como se indica en “Materiales y Métodos”. El gráfico de barras muestra el análisis
cuantitativo de las bandas; barras grises: extractos no tratados con NaOH, barras negras: extractos
tratados con NaOH. El resultado mostrado es representativo de dos experimentos independientes,
cada uno corrido dos veces, en distintos geles. P: pimpollo, F: flor, A: ápice del vástago, H: hoja, T:
tallo, R: raíz.
Por otro lado, ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa realizados con primers
específicos para cada isoforma permitieron determinar los niveles de transcriptos de las
distintas PP2Ac en los diferentes órganos de la planta (Figura 18).
Se observó que StPP2Ac1 tiene una alta expresión en los pimpollos y las flores,
mientras que su ARNm es menos abundante en el ápice del vástago y las hojas. Sus
transcriptos son casi indetectables en el tallo y no se encontraron en la raíz. El ARNm de
StPP2Ac2a está presente en todos los órganos analizados, con altos niveles en el ápice del
vástago. StPP2Ac2b posee un alto nivel de expresión en las flores, las hojas y el tallo, un
menor nivel en los pimpollos y el ápice del vástago mientras que su transcripto no se detectó
en la raíz. El ARNm de StPP2Ac3, StPP2Ac4 y StPP2Ac5 está presente en todos los
órganos estudiados, pero en la raíz los niveles de StPP2Ac3 y StPP2Ac4 son más bajos que
en el resto de los órganos. En general, las isoformas que presentan una distribución más
uniforme en los distintos órganos analizados pertenecen a la Subfamilia II.
94
Resultados
F
A
H
T
R
StPP2Ac1
UA
P
18S
F
A
H
T
F
A
H
T
R
P
F
A
H
T
R
P
F
A
H
T
R
P
F
A
H
T
R
P
F
A
H
T
R
P
F
A
H
T
R
R
StPP2Ac2a
UA
P
P
18S
F
A
H
T
R
StPP2Ac2b
UA
P
18S
P
F
A
H
T
R
UA
StPP2Ac3
18S
F
A
H
T
R
StPP2Ac4
UA
P
18S
F
A
H
T
R
StPP2Ac5
UA
P
18S
Figura 18 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en distintos órganos de la planta. Se
realizaron ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa con primers específicos para cada isoforma de
PP2Ac, utilizando muestras obtenidas a partir de plantas crecidas por 1-2 meses en invernáculo. Los
gráficos de barras muestran el análisis cuantitativo de las bandas correspondientes a cada isoforma,
normalizado con respecto al control del ARNr 18S. El resultado mostrado es representativo de dos
experimentos independientes. P: pimpollo, F: flor, A: ápice del vástago, H: hoja, T: tallo, R: raíz, UA:
unidades arbitrarias.
95
Resultados
A continuación, se determinó el perfil de expresión de las PP2Ac a nivel de proteínas y
ARNm a lo largo del proceso de tuberización. Para ello se analizaron cuatro estadíos
sucesivos del desarrollo del tubérculo (Figura 19 A). Estos estadíos fueron clasificados
según su morfología y tamaño y, para cada uno, se recolectaron muestras al azar a partir de
diferentes plantas crecidas en invernáculo por aproximadamente 2 meses. Estas muestras
se juntaron formando un pool correspondiente a cada categoría. Se analizaron también los
niveles de las PP2Ac en estolones obtenidos a partir de plantas crecidas en invernáculo por
1-2 meses y en brotes originados a partir de tubérculos que rompieron la dormición (estas
muestras también fueron procesadas formando un pool para cada categoría).
Los ensayos de Western Blot mostraron que las proteínas PP2Ac aumentan su
abundancia durante el desarrollo del tubérculo (Figura 19 B). Se observó también que el
nivel de las PP2Ac es relativamente alto en los estolones y bajo en los brotes.
A
E1 E2
E3
E4
1 cm
B
ES
E1
E2
E3
E4
B
ES E1
E2
E3
E4
B
PP2Ac
+ NaOH 0,1M
unidades arbitrarias
200
150
100
50
0
ES
E1
E2
E3
E4
B
Figura 19 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas a lo largo del proceso de tuberización. Se
realizaron ensayos de Western Blot (B) utilizando muestras correspondientes a cuatro estadíos
sucesivos del desarrollo del tubérculo (A), estolones y brotes. Alícuotas de los extractos proteicos
fueron tratadas con NaOH antes del ensayo, como se indica en “Materiales y Métodos”. El gráfico de
barras muestra el análisis cuantitativo de las bandas; barras grises: extractos no tratados con NaOH,
barras negras: extractos tratados con NaOH. El resultado mostrado es representativo de dos
experimentos independientes, cada uno corrido dos veces, en distintos geles. ES: estolón, E1-4:
estadíos 1 a 4, B: brotes.
96
Resultados
E2
E3
E4
StPP2Ac1
UA
E1
18S
E2
E3
E2
E3
E4
E1
E2
E3
E4
E1
E2
E3
E4
E1
E2
E3
E4
E1
E2
E3
E4
E1
E2
E3
E4
E4
StPP2Ac2a
UA
E1
E1
18S
E2
E3
E4
StPP2Ac2b
UA
E1
18S
E2
E3
E4
StPP2Ac3
UA
E1
18S
E2
E3
E4
StPP2Ac4
UA
E1
18S
E2
E3
E4
StPP2Ac5
UA
E1
18S
Figura 20 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en distintos estadíos del proceso de
tuberización. Se realizaron ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa con primers específicos para
cada isoforma de PP2Ac, utilizando muestras correspondientes a cuatro estadíos sucesivos del
desarrollo del tubérculo (mostrados en la Figura 19A). Los gráficos de barras muestran el análisis
cuantitativo de las bandas correspondientes a cada isoforma, normalizado con respecto al control del
ARNr 18S. El resultado mostrado es representativo de dos experimentos independientes. E1-4:
estadíos 1 a 4, UA: unidades arbitrarias.
97
Resultados
Por otro lado, se realizó también el análisis de los niveles de ARNm de las distintas
isoformas de PP2Ac mediante ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa (Figuras 20 y 21). Se
encontró que los niveles de ARNm de StPP2Ac1, StPP2Ac2a, StPP2Ac2b y StPP2Ac5 son
muy bajos o indetectables en los estadíos E1 y E2, pero aumentan significativamente en los
estadíos E3 y E4. Los transcriptos de StPP2Ac3 se detectan en todos los estadíos, siendo
levemente más abundantes en E3 y E4. Finalmente, la expresión de StPP2Ac4 es
relativamente alta en los estadíos E1 y E4 pero baja en los estadíos intermedios (E2 y E3).
Se observó también que los ARNm de todas las isoformas están presentes tanto en
estolones como en brotes y que la abundancia de sus transcriptos es similar en ambos
tejidos.
ES
B
ES
StPP2Ac2b
18S
18S
18S
0,5
0,0
1,0
UA
1,0
0,5
0,0
ES
ES
B
0,0
ES
ES
B
0,5
B
ES
ES
B
B
B
StPP2Ac3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
18S
18S
18S
1,5
1,0
1,0
1,0
UA
1,5
UA
1,5
0,5
0,5
0,5
0,0
0,0
0,0
ES
B
StPP2Ac2a
UA
UA
ES
StPP2Ac1
1,0
UA
B
B
ES
B
ES
B
Figura 21 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en estolones y brotes. Se realizaron ensayos
de RT-PCR semi-cuantitativa con primers específicos para cada isoforma de PP2Ac, utilizando
muestras correspondientes a estolones (obtenidos a partir de plantas crecidas por 1-2 meses en
invernáculo) y brotes (obtenidos a partir de tubérculos que rompieron la dormición). Los gráficos de
barras muestran el análisis cuantitativo de las bandas correspondientes a cada isoforma,
normalizado con respecto al control del ARNr 18S. El resultado mostrado es representativo de dos
experimentos independientes. ES: estolón, B: brote, UA: unidades arbitrarias.
98
Resultados
3. Participación de PP2A en vías de señalización de tuberización
Como se mencionó en la “Introducción”, el modelo actual de la inducción de la tuberización
se basa en la existencia de una señal móvil que viaja desde las hojas hasta el estolón. En
este contexto, la integración de las señales reguladoras de la tuberización en las hojas es de
suma importancia para el inicio de este proceso de desarrollo.
Al ser expuestas a condiciones que favorecen la tuberización, las plantas de papa
presentan cambios metabólicos y morfológicos tanto en el estolón como en el resto de sus
órganos (Ewing y Struik, 1992; Lorenzen y Ewing, 1992; Fernie y Willmitzer, 2001; MartínezGarcía et al., 2002b). En estas condiciones se activa la expresión de genes como Patatina y
Pin2 en el tubérculo en desarrollo. El gen Patatina codifica para la principal proteína de
reserva del tubérculo (Shewry, 2003), mientras que Pin2 codifica para un inhibidor de serinaproteasas (Keil et al., 1989; Ussuf et al., 2001). Si bien estos genes son considerados como
“específicos del tubérculo” también se inducen en las hojas en respuesta a ciertos estímulos.
En particular, algunos de los factores que regulan el proceso de tuberización son capaces
de modular su expresión. En general, las condiciones inductoras (como un alto nivel de
sacarosa en el medio) generan un aumento en la abundancia de sus transcriptos en las
hojas; por otro lado, las GAs (reguladores negativos de la tuberización) disminuyen la
acumulación de la proteína Patatina en los pecíolos de hojas correspondientes a segmentos
nodales cultivados en condiciones inductoras (Hannapel et al., 1985; Rocha-Sosa et al.,
1989; Wenzler et al., 1989; Lorberth et al., 1992; Grierson et al., 1994; Fischer et al., 2008).
Aunque no se conoce el significado fisiológico de la inducción de estos genes en las hojas
durante la tuberización, los mismos pueden utilizarse como marcadores moleculares para
monitorear las respuestas de las hojas frente a señales relacionadas con la tuberización.
Para evaluar la participación de fosfatasas tipo PP2A en la señalización que ocurre en
las hojas frente a factores reguladores de la tuberización, se estudió la expresión de los
genes Patatina y Pin2 en presencia y ausencia de los inhibidores ácido okadaico y endotal.
El ácido okadaico es un ácido graso de tipo poliéter producido por dinoflagelados marinos
(Swingle et al., 2007). Este compuesto ha sido ampliamente utilizado como inhibidor de
fosfatasas PP1/PP2A, aunque otras fosfatasas de serina/treonina menos abundantes, como
PP4, PP5 y PP6, son también afectadas por concentraciones nanomolares de este inhibidor
(Prickett y Brautigan, 2006; Swingle et al., 2007). El herbicida endotal bloquea
preferentemente la actividad de PP2A en relación con otras fosfatasas (Li y Casida, 1992; Li
et al., 1993) y se ha empleado exitosamente para determinar el rol de estas fosfatasas en la
regulación de distintos procesos, tanto en animales (Snabaitis et al., 2006; Yi y Simpkins,
2008) como en plantas (Rakwal et al., 2001; Larsen y Cancel, 2003). Las células son
99
Resultados
permeables a ambos inhibidores y estos han sido previamente utilizados en ensayos in vivo
en sistemas vegetales.
Además de estudiar la expresión de los genes marcadores Patatina y Pin2, se
determinó el perfil de expresión de las PP2Ac a nivel de proteínas y ARNm en respuesta a
estímulos inductores e inhibidores de la tuberización.
3.1
Alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo
Solanum tuberosum cv Spunta es una de las variedades comerciales más importantes en
Argentina y pertenece a la subespecie tuberosum (S. tuberosum ssp. tuberosum). En las
variedades que forman parte de esta subespecie, la inducción de la tuberización no requiere
estrictamente el estímulo de días cortos (Rodríguez-Falcón et al., 2006). Cuando la
regulación fotoperiódica no está presente, otros factores como los niveles de sacarosa y
GAs cobran mayor importancia en la modulación de la tuberización (Fischer et al., 2008).
Como se mencionó en la “Introducción”, la sacarosa regula positivamente la
tuberización mientras que altas cantidades de nitrógeno en el medio resultan inhibitorias. El
efecto inductor de una alta relación carbohidratos/nitrógeno podría deberse a que, frente a
condiciones de bajo nitrógeno, el crecimiento vegetativo se ve inhibido resultando en una
alta disponibilidad de carbohidratos para el desarrollo del tubérculo (Jackson, 1999).
En primer lugar, para evaluar la participación de fosfatasas tipo PP2A en la
señalización asociada a condiciones inductoras de la tuberización, se estudió la expresión
de los genes Patatina y Pin2 en respuesta a una alta relación sacarosa/nitrógeno en el
medio de cultivo (condición promotora de la tuberización in vitro). Frente a este estímulo, se
observó un aumento en los niveles de transcriptos de Patatina y Pin2 en las hojas de plantas
de papa crecidas in vitro (Figura 22 A y B). Se encontró que tanto el ácido okadaico como el
endotal son capaces de bloquear significativamente este incremento y que los efectos del
endotal son dependientes de la dosis. Los tratamientos control realizados con estos
inhibidores muestran que ninguno de ellos per se es capaz de modificar significativamente
los niveles de ARNm de Patatina y Pin2 en las condiciones empleadas en los experimentos
(Figura 22 A y C). Estos resultados sugieren que la actividad de fosfatasas tipo 2A sería
requerida para la activación transcripcional de los genes Patatina y Pin2 en las hojas frente
a señales inductoras de la tuberización.
Para evaluar la participación de las diferentes isoformas de PP2Ac en la señalización
asociada a condiciones inductoras de la tuberización, se evaluó la expresión de sus ARNm
en las hojas frente a una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio. Este análisis se
realizó a diferentes tiempos mediante ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa (Figura 23).
100
Resultados
A
↑S:N
+
-
Patatina
Pin2
+ AO
Patatina
UA
-
UA
C
Pin2
ARNr
C
C
+AO
S:N
C
S:N
+AO
C
+AO
↑S:N ↑ S:N
+AO
B
↑S:N
-
Pin2
Patatina
10 20 end (µM)
Patatina
UA
-
UA
C
Pin2
ARNr
C
S:N
C
S:N
S:N
+end +end
10 µM 20 µM
S:N
S:N
S:N
+end +end
10 µM 20 µM
C
Patatina
10 20 end (µM)
Patatina
0
UA
0
10 20 end (µM)
Pin2
ARNr
ARNr
Endotal (µM)
Figura 22 | Efecto del ácido okadaico y del endotal sobre la expresión de Patatina y Pin2
inducida por una alta relación sacarosa/nitrógeno. (A – B) Plantas de papa crecidas in vitro
fueron expuestas a una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo ( S:N) por 20 h, en
ausencia o presencia de ácido okadaico (AO) 100 nM (A) o endotal (end) 10-20 µM (B). (C) Plantas
de papa crecidas in vitro fueron expuestas a endotal (end) 10-20 µM por 20 h. En todos los casos, se
extrajo el ARN total a partir de las hojas y se realizaron ensayos de Northern Blot utilizando sondas
para la detección de los transcriptos de Patatina y Pin2. El tiempo de muestreo para analizar la
expresión de los genes marcadores se eligió según resultados previos del laboratorio. Los gráficos
de barras muestran el análisis cuantitativo de las bandas correspondientes a cada ARNm,
normalizado con respecto al ARNr. Los resultados mostrados son representativos de tres
experimentos independientes. C: control, ARNr: ARN ribosomal, UA: unidades arbitrarias.
101
Resultados
↑S:N
4h
8h
16h
24h
StPP2Ac1
UA
C
18S
C
4h
8h
↑S:N
4h
8h
16h
24h
↑S:N
24h
StPP2Ac2a
UA
C
16h
18S
C
4h
8h
↑S:N
4h
8h
16h
24h
↑S:N
24h
StPP2Ac2b
UA
C
16h
18S
C
4h
8h
↑S:N
4h
8h
16h
24h
↑S:N
24h
StPP2Ac3
UA
C
16h
18S
C
4h
8h
↑S:N
4h
8h
16h
24h
↑S:N
24h
StPP2Ac4
UA
C
16h
18S
C
4h
8h
↑S:N
4h
8h
16h
24h
↑S:N
24h
StPP2Ac5
UA
C
16h
18S
C
4h
8h
16h
24h
↑S:N
Figura 23 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en respuesta a una alta relación
sacarosa/nitrógeno.
102
Resultados
Figura 23 | Continuación. Plantas de papa crecidas in vitro fueron expuestas a una alta relación
sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo ( S:N) por los tiempos indicados. Se extrajo el ARN total
a partir de las hojas y se realizaron ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa con primers específicos
para cada isoforma de PP2Ac. Los gráficos de barras muestran el análisis cuantitativo de las bandas
correspondientes a cada isoforma, normalizado con respecto al control del ARNr 18S. Los resultados
mostrados son representativos de al menos dos experimentos independientes. C: control, UA:
unidades arbitrarias.
Asimismo, se determinaron los niveles de proteínas PP2Ac por Western Blot (Figura
24), utilizando el anticuerpo monoclonal 1D6 (Upstate). Se observó que estas condiciones
no generan cambios significativos en los niveles de ARNm de ninguna de las isoformas. En
concordancia, los niveles de proteínas PP2Ac tampoco se modifican en respuesta a una alta
relación sacarosa/nitrógeno en el medio.
↑S:N
C
↑S:N
8h 16h 24h
C
8h 16h 24h
PP2Ac
Ponceau
unidades arbitrarias
NaOH 0,1M
C
8h
16h
24h
↑S:N
Figura 24 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en respuesta a una alta relación
sacarosa/nitrógeno. Plantas de papa crecidas in vitro fueron expuestas a una alta relación
sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo ( S:N) por los tiempos indicados. Se obtuvieron extractos
proteicos a partir de las hojas y se realizaron ensayos de Western Blot empleando un anticuerpo
anti-PP2Ac. Alícuotas de los extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del ensayo, como
se indica en “Materiales y Métodos”. El gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo de las
bandas, normalizado con respecto a la subunidad mayor de la Rubisco; barras grises: extractos no
tratados con NaOH, barras negras: extractos tratados con NaOH. Los resultados mostrados son
representativos de tres experimentos independientes. C: control.
103
Resultados
A continuación, se estudió la actividad fosfatasa en extractos proteicos de hojas de
plantas crecidas in vitro y expuestas a una alta relación sacarosa/nitrógeno por distintos
tiempos. En primer lugar, se utilizó como sustrato el p-nitrofenil-fosfato (pNPP). Este
compuesto es un sustrato cromogénico inespecífico que puede ser hidrolizado por
fosfatasas de serina/treonina, fosfatasas de tirosina, fosfatasas ácidas o alcalinas y por
ATPasas (Takai y Mieskes, 1991; Li et al., 1996; Montalibet et al., 2005). En cuanto a las
fosfatasas de serina/treonina, las PP2As presentan una actividad fosfatasa de pNPP mucho
más alta que las fosfatasas PP1 o PP2C (Takai y Mieskes, 1991). La hidrólisis del pNPP da
origen al p-nitrofenol, el cual, en condiciones alcalinas, se transforma en p-nitrofenolato. El
p-nitrofenolato es un producto soluble de un color amarillo intenso, cuya absorbancia se
mide a 405 nm.
En este ensayo se observó un leve aumento de la actividad fosfatasa de pNPP en
respuesta a una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio (Figura 25). Dicho aumento
resultó significativo a 8 y 24 h de tratamiento.
B
80,0
70,0
**
*
60,0
50,0
40,0
30,0
20,0
nmol pNP/min
nmol pNP/min/mg
A
2,0
1,0
0,0
0
20
40
60
µg de extracto
10,0
0,0
C
4h
8h
16h
24h
↑S:N
Figura 25 | Actividad fosfatasa de pNPP en respuesta a una alta relación sacarosa/nitrógeno.
(A) Plantas de papa crecidas in vitro fueron expuestas a una alta relación sacarosa/nitrógeno en el
medio de cultivo ( S:N) por los tiempos indicados. Se obtuvieron extractos proteicos a partir de las
hojas y se realizaron ensayos de actividad fosfatasa empleando pNPP como sustrato, según se indica
en “Materiales y Métodos”. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba t de Student.
Las diferencias fueron consideradas significativas cuando los valores de p resultaron menores a 0,05.
Se muestra el promedio ± desvío estándar de dos experimentos independientes. ** p < 0,001 y * p <
0,05, con respecto al control. (B) Como control, se realizaron determinaciones de nmoles de pNP
producidos por minuto empleando distintas cantidades de un extracto control para confirmar la
linealidad de las actividades medidas con respecto a la masa de proteínas, en las condiciones del
ensayo. C: control, pNP: p-nitrofenol.
104
Resultados
Por otro lado, se realizaron mediciones de actividad fosfatasa empleando la proteína
glucógeno fosforilasa a como sustrato. Esta proteína es el sustrato clásico para la
determinación de la actividad de fosfatasas tipo PP1 y PP2A (Ingebritsen y Cohen, 1983). El
Pi liberado fue detectado utilizando el reactivo verde de malaquita. Este método se basa en
la reacción del Pi con el molibdato del reactivo y la unión del fosfo-molibdato con el colorante
básico verde de malaquita para dar origen a un complejo de color verde cuya absorbancia
se mide a 630 nm (Hohenwallner y Wimmer, 1973; Fusari et al., 2006).
Se encontró que una alta relación sacarosa/nitrógeno es capaz de incrementar la
actividad de fosfatasas tipo PP1/PP2A en las hojas de plantas de papa crecidas in vitro
(Figura 26). Este aumento resultó significativo a 8, 16 y 24 h de tratamiento.
En conjunto, estos resultados indican que una alta relación sacarosa/nitrógeno en el
medio de cultivo es capaz de estimular la actividad de fosfatasas tipo PP1/PP2A en las
hojas, sin modificar los niveles de las PP2Ac, ni a nivel de ARNm ni a nivel de proteínas.
B
A
nmol Pi/min/mg
90,0
80,0
**
70,0
60,0
50,0
*
nmol Pi/min
0,2
0,1
0,0
*
0
0,5
1
1,5
2
2,5
µg de extracto
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
C
4h
8h
16h
24h
↑S:N
Figura 26 | Actividad de fosfatasas tipo PP1/PP2A en respuesta a una alta relación
sacarosa/nitrógeno. (A) Plantas de papa crecidas in vitro fueron expuestas a una alta relación
sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo ( S:N) por los tiempos indicados. Se obtuvieron extractos
proteicos a partir de las hojas y se realizaron ensayos de actividad fosfatasa empleando glucógeno
fosforilasa a como sustrato, según se indica en “Materiales y Métodos”. El análisis estadístico se llevó
a cabo utilizando la prueba t de Student. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando los
valores de p resultaron menores a 0,05. Se muestra el promedio ± desvío estándar de dos
experimentos independientes. ** p < 0,01 y * p < 0,05, con respecto al control. (B) Como control, se
realizaron determinaciones de nmoles de Pi producidos por minuto empleando distintas cantidades de
un extracto control para confirmar la linealidad de las actividades medidas con respecto a la masa de
proteínas, en las condiciones del ensayo. C: control, Pi: fosfato inorgánico.
105
Resultados
3.2
Giberelinas
Los cambios morfológicos, metabólicos y en la expresión génica que tienen lugar en las
hojas de plantas inducidas a tuberizar están acompañados por una reducción en los niveles
de GAs (Machackova et al., 1998; Carrera et al., 2000; Rodríguez-Falcón et al., 2006). Por
otro lado, en condiciones no inductoras de la tuberización, los niveles endógenos de GAs en
las hojas son relativamente más altos.
En primer lugar, para evaluar la participación de fosfatasas tipo PP2A en la
señalización asociada a condiciones inhibidoras de la tuberización, se estudió la expresión
de los genes Patatina y Pin2 en respuesta a un tratamiento con la giberelina GA3. Se
encontró que los niveles de ARNm de Patatina y Pin2 disminuyen en las hojuelas tratadas
con esta giberelina (Figura 27 A y B) y que esta disminución no es significativamente
afectada por el ácido okadaico ni por el endotal. Los tratamientos control realizados con
estos inhibidores muestran que ninguno de ellos per se es capaz de modificar
significativamente los niveles de ARNm de Patatina y Pin2 en las condiciones empleadas en
los experimentos (Figura 27 C).
A continuación, mediante ensayos de RT-PCR semi-cuantitativa, se determinaron los
niveles de ARNm de las distintas isoformas de PP2Ac en respuesta a GA3 (Figura 28). Se
observó que la abundancia de los transcriptos de StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b,
isoformas pertenecientes a la Subfamilia I, es significativamente menor en las hojuelas
tratadas con esta giberelina. Los niveles de StPP2Ac1 y StPP2Ac2a permanecen bajos
hasta las 24 h, mientras que la abundancia de StPP2Ac2b retorna a sus niveles basales
luego de ese tiempo. Por otro lado, el tratamiento con GA3 no modificó significativamente los
niveles de ARNm de las isoformas de la Subfamilia II (StPP2Ac3, StPP2Ac4 y StPP2Ac5).
A su vez, se determinaron también los niveles de proteínas PP2Ac por Western Blot
(Figura 29). En concordancia con lo observado en los ensayos de RT-PCR semicuantitativa, los niveles de proteínas PP2Ac en las hojuelas disminuyen significativamente
luego de la aplicación de GA3.
En conjunto, estos resultados sugieren que las isoformas de PP2Ac pertenecientes a
la Subfamilia I participarían de la señalización asociada a las giberelinas en las hojas de las
plantas de papa.
106
Resultados
A
C
-
-
GA
AO end
UA
Patatina
ARNr
GA
B
C
-
+
AO
Pin2
GA
+end
C
GA
-
-
UA
-
GA
GA
+AO
+ end
Pin2
UA
C
ARNr
ARNr
C
GA
C
GA
+AO
C
GA
GA
+end
C AO end
Pin2
UA
Patatina
Patatina
Pin2
ARNr
C
AO
end
Figura 27 | Efecto del ácido okadaico y del endotal sobre la expresión de Patatina y Pin2 en
respuesta a GA. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron expuestas a:
(A-B) GA3 4 µM por 8 h, en ausencia o presencia de ácido okadaico (AO) 100 nM o endotal (end) 20
µM (C) ácido okadaico (AO) 100 nM o endotal (end) 20 µM. Se extrajo el ARN total y se realizaron
ensayos de Northern Blot utilizando sondas para la detección de los transcriptos de Patatina (A-C) y
Pin2 (B-C). En estos ensayos se realizó una sobre-exposición intencional de las placas radiográficas
con el fin de obtener señales intensas en condiciones basales para un mejor análisis de los efectos
inhibitorios de la GA3. El tiempo de muestreo para analizar la expresión de los genes marcadores se
eligió a partir de experimentos de tiempo-respuesta. Los gráficos de barras muestran el análisis
cuantitativo de las bandas correspondientes a cada ARNm, normalizado con respecto al ARNr. Los
resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. C: control, ARNr:
ARN ribosomal, UA: unidades arbitrarias.
107
Resultados
GA
C
2h
4h
8h
24h
UA
StPP2Ac1
18S
C
GA
C
2h
4h
8h
2h
4h
8h
24h
GA
24h
UA
StPP2Ac2a
18S
C
2h
4h
GA
C
2h
4h
8h
24h
GA
8h
24h
UA
StPP2Ac2b
18S
C
2h
4h
GA
C
2h
4h
8h
24h
GA
8h
24h
UA
StPP2Ac3
18S
C
2h
4h
GA
C
2h
4h
8h
24h
GA
8h
24h
UA
StPP2Ac4
18S
C
2h
4h
GA
C
2h
4h
8h
24h
GA
8h
24h
UA
StPP2Ac5
18S
C
2h
4h
8h
24h
GA
Figura 28 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en respuesta a GA.
108
Resultados
Figura 28 | Continuación. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron
expuestas a GA3 4 µM por los tiempos indicados. Se extrajo el ARN total y se realizaron ensayos de
RT-PCR semi-cuantitativa con primers específicos para cada isoforma de PP2Ac. Los gráficos de
barras muestran el análisis cuantitativo de las bandas correspondientes a cada isoforma,
normalizado con respecto al control del ARNr 18S. Los resultados mostrados son representativos de
tres experimentos independientes. Las calles correspondientes al panel de StPP2Ac3 pertenecían a
un mismo gel pero no eran adyacentes; sus imágenes fueron editadas utilizando el programa Adobe
Photoshop CS3. C: control, UA: unidades arbitrarias.
GA
GA
C
2h 4h 8h 24h
C
2h 4h 8h 24h
PP2Ac
Ponceau
unidades arbitrarias
NaOH 0,1M
C
2h
4h
8h
24h
GA
Figura 29 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en respuesta a GA. Hojuelas aisladas a
partir de plantas crecidas en invernáculo fueron expuestas a GA3 4 µM por los tiempos indicados. Se
obtuvieron extractos proteicos y se realizaron ensayos de Western Blot empleando un anticuerpo
anti-PP2Ac. Alícuotas de los extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del ensayo, como
se indica en “Materiales y Métodos”. El gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo de las
bandas, normalizado con respecto a la subunidad mayor de la Rubisco; barras grises: extractos no
tratados con NaOH, barras negras: extractos tratados con NaOH. Los resultados mostrados son
representativos de tres experimentos independientes. C: control.
109
Resultados
4. Participación de PP2A en vías de señalización de estrés
Para evaluar si las respuestas a estrés en S. tuberosum son mediadas por fosfatasas de
serina/treonina como las PP2As, se estudió la expresión de genes marcadores de respuesta
a estrés bajo diferentes condiciones (bajas temperaturas, alta salinidad, daño mecánico y
elicitores fúngicos) en presencia o ausencia del inhibidor ácido okadaico. El tiempo de
muestreo para analizar la expresión de los genes marcadores se eligió en función de datos
bibliográficos y experimentos de tiempo-respuesta.
A continuación, se estudiaron los perfiles de expresión de las distintas isoformas de
PP2Ac en respuesta a las condiciones de estrés antes mencionadas, mediante la técnica de
Northern Blot. Las sondas empleadas reconocen secuencias de las regiones 5’ o 3’-UTR de
los ARNm de las PP2Ac. La comparación de las secuencias no traducidas de las distintas
isoformas (realizada con el programa BLAST), demostró que los transcriptos de PP2Ac no
presentan similitud significativa entre sí en dichas regiones. Por lo tanto, las sondas
diseñadas son específicas de cada isoforma.
A su vez, se determinó también el nivel de proteínas PP2Ac utilizando la técnica de
Western Blot.
4.1
Estrés abiótico
4.1.1 Estrés por bajas temperaturas
Para evaluar la participación de fosfatasas de serina/treonina sensibles al ácido okadaico en
la señalización asociada a las bajas temperaturas, se utilizaron como marcadores de estrés
los genes de papa homólogos a ATHB7 y Tas14. ATHB7 codifica para un factor de
transcripción inducible por estrés osmótico y ABA en A. thaliana (Henriksson et al., 2005),
mientras que Tas14 codifica para una dehidrina inducible por estrés osmótico y ABA en
plantas de tomate (Godoy et al., 1990; Godoy et al., 1994; Parra et al., 1996). Los
homólogos de ambos genes se inducen por bajas temperaturas y estrés salino en hojas de
plantas de papa (Rensink et al., 2005).
Como se muestra en la Figura 30, los transcriptos de HB7 y Tas14 incrementan sus
niveles en hojuelas expuestas a 4°C y el tratamiento con ácido okadaico 100 nM no modifica
significativamente esta respuesta. Esto sugiere que las fosfatasas de serina/treonina tipo 2A
no son requeridas para la inducción por frío de HB7 y Tas14 en las hojas de plantas de
papa.
110
Resultados
A
4h
8h
22ºC
AO
-
+
4ºC
-
24h
22ºC
+
-
+
4ºC
-
22ºC
+
-
+
4ºC
-
+
HB7
1,0
1,3
1,0
1,3
1,0 1,5
ARNr
B
24h
22ºC
AO
-
+
4ºC
-
+
Tas14
1,0 1,3
ARNr
Figura 30 | Efecto del ácido okadaico sobre la expresión de los genes marcadores de estrés por
frío, HB7 y Tas14. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron expuestas a
4°C por los tiempos indicados, en ausencia o presencia de ácido okadaico (AO) 100 nM. El inhibidor
fue agregado 1 h antes del inicio del tratamiento a 4°C. Las plantas control se mantuvieron a 22°C. Se
extrajo el ARN total y se realizaron ensayos de Northern Blot utilizando sondas para la detección de
los transcriptos de HB7 (A) y Tas14 (B). Los números corresponden al análisis cuantitativo de las
bandas de los ARNm detectados, normalizado con respecto al ARNr (unidades arbitrarias). Los
resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes. ARNr: ARN
ribosomal.
A continuación, mediante ensayos de Northern Blot, se determinó el patrón de
expresión de las distintas isoformas de PP2Ac en las hojas de plantas de papa expuestas a
bajas temperaturas (Figura 31). Se observó que el frío no modifica significativamente los
niveles de ARNm de ninguna de las isoformas. Como control, se analizó el nivel del
transcripto de HB7 en estas mismas muestras (Figura 32) y se confirmó que el tratamiento
aplicado es capaz de desencadenar una respuesta frente al estrés por frío (inducción de
HB7). Finalmente, en concordancia con los resultados obtenidos a nivel de ARNm, tampoco
se detectaron cambios en la abundancia de las proteínas PP2Ac en estas condiciones
(Figura 33).
111
Resultados
Figura 31 | Expresión de PP2Ac a nivel de
4ºC
ARNm en respuesta al estrés por bajas
22ºC
2h
4h
8h
24h
48h
temperaturas. Plantas de papa crecidas in vitro
StPP2Ac1
fueron expuestas a 4°C por los tiempos indicados.
Las plantas control se mantuvieron a 22°C. Se
StPP2Ac2a
extrajo el ARN total a partir de las hojas y se
StPP2Ac2b
realizaron ensayos de Northern Blot utilizando
sondas específicas para la detección de cada
StPP2Ac3
isoforma de PP2Ac. Los gráficos de barras
muestran el análisis cuantitativo de las bandas
StPP2Ac4
correspondientes a cada isoforma, normalizado
con respecto al ARNr. Los resultados mostrados
son
representativos
de
dos
StPP2Ac5
experimentos
independientes, cada uno realizado por duplicado.
ARNr
ARNr: ARN ribosomal, UA: unidades arbitrarias.
2
2
StPP2Ac2a
StPP2Ac1
1,5
UA
UA
1,5
1
0,5
1
0,5
0
0
22°C
2h
4h
8h
24h
22°C
2h
4h
4°C
48h
24h
48h
24h
48h
2
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
1,5
UA
1,5
UA
24h
4°C
2
1
0,5
1
0,5
0
0
22°C
2h
4h
8h
24h
48h
22°C
2h
4h
4°C
8h
4°C
2
2
StPP2Ac4
1,5
StPP2Ac5
1,5
UA
UA
8h
1
0,5
1
0,5
0
0
22°C
2h
4h
8h
4°C
24h
48h
22°C
2h
4h
8h
4°C
4
°C
112
Resultados
4ºC
4h
8h
24h 48h
HB7
ARNr
unidades arbitrarias
22°C 2h
8
7
6
5
4
3
2
1
0
22°C
2h
4h
8h
24h
48h
4°C
Figura 32 | Expresión del gen marcador HB7 en respuesta al tratamiento de estrés por bajas
temperaturas. Las muestras de ARN total correspondientes a los experimentos mostrados en la
Figura 31, fueron analizadas mediante ensayos de Northern Blot utilizando una sonda para la
detección del transcripto del gen marcador HB7. El gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo
de las bandas del ARNm detectado, normalizado con respecto al ARNr. ARNr: ARN ribosomal.
4ºC
22ºC 4h
8h
4ºC
24h 22ºC
4h
8h
24h
PP2Ac
Ponceau
NaOH 0,1 M
Figura 33 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en respuesta al estrés por bajas
temperaturas. Plantas de papa crecidas in vitro fueron expuestas a 4°C por los tiempos indicados.
Las plantas control se mantuvieron a 22°C. Se obtuvieron extractos proteicos a partir de las hojas y
se realizaron ensayos de Western Blot empleando un anticuerpo anti-PP2Ac. Alícuotas de los
extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del ensayo, como se indica en “Materiales y
Métodos”. Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos independientes.
4.1.2 Estrés por alta salinidad
Para evaluar la participación de fosfatasas de serina/treonina sensibles al ácido okadaico en
la señalización asociada al estrés salino, se utilizaron como marcadores de estrés los genes
de papa homólogos a Le25 y Tas14. Le25 codifica para una proteína tipo LEA (abundante
en la embriogénesis tardía) y se induce por estrés osmótico y ABA en plantas de tomate
(Cohen y Bray, 1990, 1992; Imai et al., 1996). Se cree que las proteínas tipo LEA tienen
113
Resultados
como función la protección de las células en situaciones de deshidratación, permitiendo una
mayor tolerancia frente al estrés causado por condiciones de sequía y/o alta salinidad en el
suelo.
Una secuencia codificante homóloga a Le25 fue encontrada en la base de datos de
ESTs de papa DFCI Potato Gene Index (secuencia TC153563). Como se observa en la
Figura 34 A, la abundancia de su ARNm se incrementa en hojuelas expuestas a NaCl y este
aumento no es afectado por el tratamiento con ácido okadaico 100 nM. Esto sugiere que
fosfatasas de serina/treonina tipo 2A no son requeridas para la inducción por NaCl de Le25
en las hojas de plantas de papa.
Por otro lado, se observó que los transcriptos de Tas14 también incrementan su nivel
en hojuelas expuestas a NaCl y que, en este caso, el tratamiento con ácido okadaico 100
nM bloquea significativamente dicho aumento (Figura 34 B). Estos resultados indican que
fosfatasas de serina/treonina sensibles al ácido okadaico actúan como reguladores positivos
de las vías de señalización que llevan a la inducción de Tas14 en hojuelas de papa
expuestas a estrés salino.
A
B
C
AO
-
C
NaCl
+
-
AO
+
-
NaCl
+
-
+
Tas14
Le25
1,0
1,0 0,4
0,9
ARNr
ARNr
Figura 34 | Efecto del ácido okadaico sobre la expresión de los genes marcadores de estrés
salino, Le25 y Tas14. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron tratadas
con NaCl 200 mM por 8 h, en ausencia o presencia de ácido okadaico (AO) 100 nM. El inhibidor fue
agregado 1 h antes del inicio del tratamiento con NaCl. Se extrajo el ARN total y se realizaron
ensayos de Northern Blot utilizando sondas para la detección de los transcriptos de Le25 (A) y Tas14
(B). Los números corresponden al análisis cuantitativo de las bandas de los ARNm detectados,
normalizado con respecto al ARNr (unidades arbitrarias). Los resultados mostrados son
representativos de dos experimentos independientes. C: control, ARNr: ARN ribosomal.
114
Resultados
Figura 35 | Expresión de PP2Ac a nivel de
NaCl
ARNm en respuesta al estrés salino. Hojuelas
C
2h
4h
8h
24h
aisladas a partir de plantas crecidas en
StPP2Ac1
invernáculo fueron tratadas con NaCl 200 mM
por los tiempos indicados. Se extrajo el ARN
StPP2Ac2a
total y se realizaron ensayos de Northern Blot
utilizando sondas específicas para la detección
de cada isoforma de PP2Ac. Los gráficos de
StPP2Ac2b
barras muestran el análisis cuantitativo de las
bandas correspondientes a cada isoforma,
normalizado
con
respecto
al
ARNr.
Los
StPP2Ac3
resultados mostrados son representativos de
dos experimentos independientes, cada uno
ARNr
realizado por duplicado. C: control, ARNr: ARN
ribosomal, UA: unidades arbitrarias.
StPP2Ac4
StPP2Ac5
ARNr
5
StPP2Ac1
4
4
3
3
UA
UA
5
2
StPP2Ac2a
2
1
1
0
0
C
2h
4h
8h
24h
C
2h
4h
24h
8h
24h
NaCl
NaCl
5
8h
5
StPP2Ac2b
4
3
3
StPP2Ac3
UA
UA
4
2
2
1
1
0
0
C
2h
4h
8h
NaCl
24h
C
2h
4h
NaCl
115
Resultados
3
3
StPP2Ac4
StPP2Ac5
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
2h
4h
8h
NaCl
24h
C
2h
4h
8h
24h
NaCl
Figura 35 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en respuesta al estrés salino. Continuación.
A continuación, mediante ensayos de Northern Blot, se estudió el perfil de expresión
de las distintas isoformas de PP2Ac en hojuelas tratadas con NaCl (Figura 35). Se encontró
que, frente al estrés salino, se produce un incremento significativo de los niveles de ARNm
de todos los miembros de la Subfamilia I de PP2Ac (StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b) y
de StPP2Ac3. En general, el efecto de la exposición a NaCl es relativamente rápido y
transitorio. Los transcriptos de las isoformas StPP2Ac4 y StPP2Ac5 no presentan cambios
significativos en estas condiciones. Como control, se analizó el nivel del ARNm de Le25 en
las muestras utilizadas para el estudio de los perfiles de expresión y se confirmó que el
tratamiento aplicado es capaz de desencadenar una respuesta frente al estrés por alta
salinidad (inducción de Le25). En la Figura 36 se muestra un experimento control
representativo.
Finalmente, en concordancia con los resultados obtenidos a nivel de ARNm, se
detectó un aumento significativo en la abundancia de las proteínas PP2Ac en hojuelas
expuestas a estrés salino (Figura 37).
Dado que los resultados mencionados anteriormente sugieren que las PP2As podrían
actuar como moduladores positivos en la señalización frente al estrés salino, se evaluó si la
inhibición de dichas fosfatasas afectaba el contenido relativo de agua (RWC) de hojuelas
expuestas a NaCl. Para ello, se realizaron tratamientos con NaCl en presencia o ausencia
de ácido okadaico o endotal (Figura 38). En las condiciones utilizadas para la realización de
estos ensayos, no se observaron diferencias significativas entre ambos tratamientos.
116
Resultados
C
2h
4h
8h
unidades arbitrarias
NaCl
24h
Le25
ARNr
8
7
6
5
4
3
2
1
0
C
2h
4h
8h
24h
NaCl
Figura 36 | Expresión del gen marcador Le25 en respuesta al tratamiento de estrés salino. Las
muestras de ARN total correspondientes a los experimentos mostrados en la Figura 35, fueron
analizadas mediante ensayos de Northern Blot utilizando una sonda para la detección del transcripto
del gen marcador Le25. El gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo de las bandas del ARNm
detectado, normalizado con respecto al ARNr. C: control, ARNr: ARN ribosomal.
NaCl
C
2h
4h
8h
NaCl
24h
C
2h
4h
8h
24h
PP2Ac
Ponceau
NaOH 0,1 M
unidades arbitrarias
4
3
2
1
0
C
2h
4h
8h
24h
NaCl
Figura 37 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en respuesta al estrés salino. Hojuelas
aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron tratadas con NaCl 200 mM por los tiempos
indicados. Se obtuvieron extractos proteicos y se realizaron ensayos de Western Blot empleando un
anticuerpo anti-PP2Ac. Alícuotas de los extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del
ensayo, como se indica en “Materiales y Métodos”. El gráfico de barras muestra el análisis
cuantitativo de las bandas, normalizado con respecto a la subunidad mayor de la Rubisco; barras
grises: extractos no tratados con NaOH, barras negras: extractos tratados con NaOH. Los resultados
mostrados son representativos de dos experimentos independientes. C: control.
117
Resultados
B
A
105
100
100
90
*
*
RWC (%)
RWC (%)
95
85
*
*
NaCl
NaCl+end
90
85
80
80
C
NaCl
NaCl+AO
C
C
D
100
100
95
95
*
85
*
*
90
RWC (%)
*
90
RWC (%)
95
85
80
80
75
75
70
70
C
NaCl
NaCl+end
C
NaCl
NaCl+end
Figura 38 | Contenido relativo de agua (RWC) de hojuelas expuestas a estrés salino en
presencia o ausencia de ácido okadaico o endotal. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas
en invernáculo fueron tratadas con: (A) NaCl 250 mM en ausencia o presencia de ácido okadaico
(AO) 100 nM, por 4 h (B-C-D) NaCl 250 mM en ausencia o presencia de endotal (end) 20 µM, por 4 h
(B), 6 h (C) y 8 h (D). Los inhibidores fueron agregados 1 h antes del inicio del tratamiento con NaCl.
La determinación del RWC (%) se realizó según se indica en “Materiales y Métodos”. Los valores de
RWC (%) en cada figura representan el promedio ± desvío estándar de 4-8 hojuelas obtenidas de
diferentes plantas al azar. En cada caso, se muestra un resultado representativo de al menos 2
experimentos independientes. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando la prueba t de Student.
Las diferencias fueron consideradas significativas cuando los valores de p resultaron menores a 0,05.
Ni el ácido okadaico ni el endotal son capaces de generar diferencias per se en el RWC (%) de las
hojuelas (experimentos control no mostrados). C: control. * p<0,05 con respecto al control.
118
Resultados
4.2
Daño mecánico
Para evaluar la participación de fosfatasas de serina/treonina sensibles al ácido okadaico en
la señalización asociada al daño mecánico, se utilizó como marcador de estrés el gen Pin2.
Este gen codifica para un inhibidor de serina-proteasas y, además de estar regulado durante
el desarrollo del tubérculo, se induce en respuesta al daño mecánico y la herbivoría en las
plantas de papa (Ussuf et al., 2001). La proteína Pin2 disminuye la digestibilidad y la calidad
nutricional de las hojas, contribuyendo de este modo con la defensa de la planta frente a los
insectos fitófagos (Johnson et al., 1989). Su síntesis representa una de las principales
respuestas frente a este tipo de estrés en las plantas de la familia Solanaceae y por lo tanto
el gen Pin2 ha sido ampliamente utilizado como marcador de daño mecánico (Bowles,
1998).
Como se observa en la Figura 39, el nivel de ARNm de Pin2 aumenta en las hojas en
respuesta al daño mecánico y este incremento no es afectado por el tratamiento con ácido
okadaico 100 nM. Esto sugiere que fosfatasas de serina/treonina tipo 2A no son requeridas
para la inducción de Pin2 en las hojas de plantas de papa sometidas a daño mecánico.
C
AO
-
Daño
+
-
+
Pin2
1,0
1,0
ARNr
Figura 39 | Efecto del ácido okadaico sobre la expresión del gen marcador de estrés por daño
mecánico, Pin2. Plantas de papa crecidas in vitro fueron sometidas a daño mecánico en ausencia o
presencia de ácido okadaico (AO) 100 nM. El inhibidor fue agregado 1 h antes del inicio del
tratamiento y a continuación se dañó cada una de las hojas de la planta con una pinza “diente de
ratón”. Luego de 8 h se cosecharon las hojas, se extrajo el ARN total y se realizaron ensayos de
Northern Blot utilizando una sonda para la detección del transcripto de Pin2. Los números
corresponden al análisis cuantitativo de las bandas del ARNm detectado, normalizado con respecto al
ARNr (unidades arbitrarias). Los resultados mostrados son representativos de dos experimentos
independientes. C: control, ARNr: ARN ribosomal.
119
Resultados
Figura 40 | Expresión de PP2Ac a nivel de
Daño
ARNm en respuesta al estrés por daño
C
2h
4h
8h
24h
mecánico. Hojuelas aisladas a partir de
plantas
crecidas
en
invernáculo
StPP2Ac1
fueron
ARNr
dañadas utilizando una pinza “diente de
ratón”. Las hojuelas se cosecharon luego de
StPP2Ac2a
los tiempos indicados. Se extrajo el ARN
total y se realizaron ensayos de Northern
ARNr
Blot utilizando sondas específicas para la
detección de cada isoforma de PP2Ac. Los
StPP2Ac2b
gráficos de barras muestran el análisis
cuantitativo de las bandas correspondientes
ARNr
a cada isoforma, normalizado con respecto
StPP2Ac3
al ARNr. Los resultados mostrados son
representativos
de
dos
experimentos
independientes, cada uno realizado por
StPP2Ac4
duplicado. C: control, ARNr: ARN ribosomal,
ARNr
UA: unidades arbitrarias.
StPP2Ac5
ARNr
3
3
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
2h
4h
8h
24h
C
2h
4h
Daño
3
8h
24h
8h
24h
Daño
3
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
2h
4h
8h
Daño
24h
C
2h
4h
Daño
120
Resultados
3
3
StPP2Ac4
2
StPP2Ac5
UA
UA
2
1
1
0
0
C
2h
4h
8h
24h
C
2h
4h
Daño
8h
24h
Daño
Figura 40 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en respuesta al estrés por daño mecánico.
Continuación.
A continuación, mediante ensayos de Northern Blot, se estudió el patrón de expresión
de las distintas isoformas de PP2Ac en hojuelas dañadas con una pinza “diente de ratón”
(Figura 40). Se observó que el daño mecánico produce un aumento transitorio en los niveles
de los transcriptos de StPP2Ac2b, una isoforma perteneciente a la Subfamilia I, mientras
que las restantes isoformas no muestran cambios significativos en la abundancia de sus
ARNm. Como control, se analizó el nivel del transcripto de Pin2 en las muestras utilizadas
para el estudio de los patrones de expresión y se confirmó que el tratamiento aplicado es
capaz de desencadenar una respuesta frente al daño mecánico (inducción de Pin2). En la
Figura 41 se muestra un experimento control representativo.
Por último, en concordancia con los resultados obtenidos en los ensayos de Northern
Blot, se detectó un aumento significativo en la abundancia de las proteínas PP2Ac en
hojuelas sometidas a daño mecánico (Figura 42).
Daño
2h
4h
8h
24h
Pin2
ARNr
unidades arbitrarias
5
C
4
3
2
1
0
C
2h
4h
8h
24h
Daño
Figura 41 | Expresión del gen marcador Pin2 en respuesta al tratamiento de daño mecánico.
121
Resultados
Figura 41 | Continuación. Las muestras de ARN total correspondientes a los experimentos
mostrados en la Figura 40, fueron analizadas mediante ensayos de Northern Blot utilizando una
sonda para la detección del transcripto del gen marcador Pin2. El gráfico de barras muestra el análisis
cuantitativo de las bandas del ARNm detectado, normalizado con respecto al ARNr. C: control, ARNr:
ARN ribosomal.
Daño
C
2h
4h
8h
Daño
24h
C
2h
4h
8h
24h
PP2Ac
Ponceau
NaOH 0,1 M
unidades arbitrarias
4
3
2
1
0
C
2h
4h
8h
24h
Daño
Figura 42 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en respuesta al estrés por daño mecánico.
Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron dañadas utilizando una pinza
“diente de ratón”. Las hojuelas se cosecharon luego de los tiempos indicados. Se obtuvieron extractos
proteicos y se realizaron ensayos de Western Blot empleando un anticuerpo anti-PP2Ac. Alícuotas de
los extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del ensayo, como se indica en “Materiales y
Métodos”. El gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo de las bandas, normalizado con
respecto a la subunidad mayor de la Rubisco; barras grises: extractos no tratados con NaOH, barras
negras: extractos tratados con NaOH. Los resultados mostrados son representativos de dos
experimentos independientes. C: control.
122
Resultados
4.3
Elicitores fúngicos
Un elicitor es una molécula producida por el patógeno o generada a partir de su hospedador
durante la infección, que puede desencadenar respuestas de defensa en la planta
(Desender et al., 2007). Muchos patógenos, incluidos los hongos, liberan enzimas
hidrolíticas durante el proceso de infección (Oeser et al., 2002; Hematy et al., 2009; Kikot et
al., 2009). La degradación de la pared celular vegetal da origen a diversas moléculas que
pueden funcionar como elicitores. En particular, el ácido poligalacturónico (PGA) es un
producto de la degradación de la pectina de las paredes celulares y es capaz de estimular
las respuestas de defensa de la planta frente a la infección (D'Ovidio et al., 2004). Por otro
lado, el quitosano es un derivado desacetilado de la quitina (principal componente de la
pared celular de los hongos) que actúa como un potente elicitor de las respuestas frente a
patógenos fúngicos (Amborabe et al., 2008).
Para evaluar la participación de fosfatasas de serina/treonina sensibles al ácido
okadaico en la señalización asociada a las infecciones fúngicas, se estudió la expresión de
un gen que codifica para una Quitinasa A en respuesta al tratamiento con los elicitores PGA
y quitosano. La proteína Quitinasa A pertenece al grupo de proteínas PR (relacionadas con
la patogenia) y su gen se induce en respuesta a infecciones por hongos y tratamientos con
elicitores fúngicos (Buchter et al., 1997). Su función consiste en degradar el polímero quitina
presente en las paredes celulares de los hongos.
Como se observa en la Figura 43, el tratamiento con ácido okadaico 100 nM estimula
la expresión del gen Quitinasa A en hojuelas de plantas de papa, aún en ausencia de los
elicitores fúngicos PGA y quitosano. Tratamientos control realizados con DMSO (diluyente
del ácido okadaico) demostraron que éste no afecta per se los niveles del gen marcador
analizado (Figura 43 C). Estos resultados sugieren la existencia de una vía de señalización
dependiente de fosfatasas sensibles al ácido okadaico, que mantiene reprimido al gen
Quitinasa A en condiciones basales.
Por otro lado, mediante ensayos de Northern Blot, se estudió el perfil de expresión de
las distintas isoformas de PP2Ac en hojuelas tratadas con PGA y quitosano (Figuras 44 y
45, respectivamente). Se observó que ambos elicitores causan un aumento significativo en
los niveles de ARNm de las isoformas StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b, todas ellas
pertenecientes a la Subfamilia I. Luego de 24 h de tratamiento, la abundancia de estos
transcriptos retorna a sus niveles basales.
123
Resultados
A
4h
8h
C
AO
-
PGA
+
-
+
C
-
24h
PGA
+
-
C
+
-
PGA
+
-
+
QuitA
UA
ARNr
B
C
24h
C
AO
-
DMSO
quitosano
+
-
C
+
4h
8h
24h
QuitA
QuitA
ARNr
ARNr
UA
UA
3,00
2,00
1,00
0,00
C
4h
8h
24h
DMSO
Figura 43 | Efecto del ácido okadaico sobre la expresión del gen marcador de estrés biótico,
Quitinasa A. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron expuestas a los
elicitores ácido poligalacturónico (PGA) 50 µg/mL (A) o quitosano 100 µg/mL (B) por los tiempos
indicados, en ausencia o presencia de ácido okadaico (AO) 100 nM. El inhibidor fue agregado 1 h
antes del inicio del tratamiento con los elicitores. Se realizó también un experimento control con el
diluyente del AO (C), exponiendo a las hojuelas a la misma cantidad de DMSO que se incorpora junto
con el inhibidor al realizar los tratamientos (1 µL de DMSO en 5 mL de agua). Se extrajo el ARN total
y se realizaron ensayos de Northern Blot utilizando una sonda para la detección del transcripto de
Quitinasa A (QuitA). Los gráficos de barras muestran el análisis cuantitativo de las bandas
correspondientes al ARNm detectado, normalizado con respecto al ARNr. Los resultados mostrados
son representativos de dos experimentos independientes. Las calles correspondientes al panel A (8 y
24 h), como también las del panel C, pertenecían a un mismo gel pero no eran adyacentes; sus
imágenes fueron editadas utilizando el programa Adobe Photoshop CS3. C: control, ARNr: ARN
ribosomal, UA: unidades arbitrarias, DMSO: dimetil-sulfóxido.
124
Resultados
Figura 44 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm
PGA
en respuesta al elicitor fúngico PGA. Hojuelas
C
4h
8h
16h 24h
aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo
StPP2Ac1
fueron expuestas al elicitor ácido poligalacturónico
(PGA) 50 µg/mL por los tiempos indicados. Se
StPP2Ac2a
extrajo el ARN total y se realizaron ensayos de
Northern Blot utilizando sondas específicas para la
StPP2Ac2b
detección de cada isoforma de PP2Ac. Los gráficos
de barras muestran el análisis cuantitativo de las
bandas
correspondientes
a
cada
StPP2Ac3
isoforma,
normalizado con respecto al ARNr. Los resultados
StPP2Ac4
mostrados son representativos de dos experimentos
StPP2Ac5
independientes. C: control, ARNr: ARN ribosomal,
UA: unidades arbitrarias.
ARNr
3
3
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
4h
8h
16h
C
24h
4h
8h
PGA
3
16h
24h
PGA
3
StPP2Ac2b
2
StPP2Ac3
UA
UA
2
1
1
0
0
C
4h
8h
16h
24h
C
4h
8h
PGA
3
16h
24h
16h
24h
PGA
3
StPP2Ac5
StPP2Ac4
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
4h
8h
16h
PGA
24h
C
4h
8h
PGA
125
Resultados
Figura 45 | Expresión de PP2Ac a nivel de ARNm en
Quitosano
respuesta al elicitor fúngico quitosano. Hojuelas
C
4h
8h
24h
aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo
StPP2Ac1
fueron expuestas al elicitor quitosano 100 µg/mL por los
StPP2Ac2a
tiempos indicados. Se extrajo el ARN total y se
realizaron ensayos de Northern Blot utilizando sondas
StPP2Ac2b
específicas para la detección de cada isoforma de
StPP2Ac3
PP2Ac. Los gráficos de barras muestran el análisis
cuantitativo de las bandas correspondientes a cada
StPP2Ac4
isoforma, normalizado con respecto al ARNr. Los
StPP2Ac5
resultados mostrados son representativos de dos
ARNr
experimentos independientes. C: control, ARNr: ARN
ribosomal, UA: unidades arbitrarias.
3
3
StPP2Ac1
StPP2Ac2a
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
4h
8h
24h
C
4h
Quitosano
3
8h
24h
Quitosano
3
StPP2Ac2b
StPP2Ac3
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
4h
8h
C
24h
4h
8h
24h
Quitosano
Quitosano
3
3
StPP2Ac5
StPP2Ac4
2
UA
UA
2
1
1
0
0
C
4h
8h
Quitosano
24h
C
4h
8h
24h
Quitosano
126
Resultados
Como control, se analizó el nivel del ARNm de Quitinasa A en estas mismas muestras
(Figura 46) y se confirmó que el tratamiento aplicado es capaz de desencadenar una
respuesta frente a los elicitores fúngicos (inducción de Quitinasa A).
Finalmente, en coincidencia con los resultados obtenidos en los ensayos de Northern
Blot, tanto el PGA como el quitosano estimulan significativamente la acumulación de las
proteínas PP2Ac en las hojuelas expuestas a dichos elicitores (Figura 47).
A
PGA
4h
8h
16h
24h
QuitA
ARNr
unidades arbitrarias
C
5
4
3
2
1
0
C
4h
8h
16h
24h
PGA
B
Quitosano
4h
8h
24h
QuitA
ARNr
unidades arbitrarias
C
5
4
3
2
1
0
C
4h
8h
24h
Quitosano
Figura 46 | Expresión del gen marcador Quitinasa A en respuesta al tratamiento con los
elicitores fúngicos PGA y quitosano. Las muestras de ARN total correspondientes a los
experimentos mostrados en las Figuras 44 (A) y 45 (B) fueron analizadas mediante ensayos de
Northern Blot utilizando una sonda para la detección del transcripto del gen marcador Quitinasa A
(Quit A). El gráfico de barras muestra el análisis cuantitativo de las bandas del ARNm detectado,
normalizado con respecto al ARNr. C: control, PGA: ácido poligalacturónico, ARNr: ARN ribosomal.
127
Resultados
PGA
C
4h
8h
Quitosano
C
24h
4h
8h
PGA
24h
C
Quitosano
4h 8h 24h 4h 8h 24h
PP2Ac
Ponceau
NaOH 0,1 M
unidades arbitrarias
3
2
1
0
C
4h
8h
24h
PGA
unidades arbitrarias
3
2
1
0
C
4h
8h
24h
Quitosano
Figura 47 | Expresión de PP2Ac a nivel de proteínas en respuesta a los elicitores fúngicos PGA
y quitosano. Hojuelas aisladas a partir de plantas crecidas en invernáculo fueron expuestas a los
elicitores ácido poligalacturónico (PGA) 50 µg/mL o quitosano 100 µg/mL por los tiempos indicados
Se obtuvieron extractos proteicos y se realizaron ensayos de Western Blot empleando un anticuerpo
anti-PP2Ac. Alícuotas de los extractos proteicos fueron tratadas con NaOH antes del ensayo, como
se indica en “Materiales y Métodos”. Los gráficos de barras muestran los análisis cuantitativos de las
bandas, normalizados con respecto a la subunidad mayor de la Rubisco; barras grises: extractos no
tratados con NaOH, barras negras: extractos tratados con NaOH. Los resultados mostrados son
representativos de dos experimentos independientes. C: control.
128
Resultados
5. Poliadenilación alternativa de StPP2Ac2b
En algunos de los ensayos de Northern Blot mostrados en la Sección 4 (ver la Figura 44
como ejemplo), se observó claramente que la isoforma StPP2Ac2b, perteneciente a la
Subfamilia I, presenta al menos dos transcriptos maduros de diferente peso molecular. Para
determinar si los distintos transcriptos detectados surgen de un proceso de poliadenilación
alternativa, se estudió el extremo 3’ del ARNm de StPP2Ac2b mediante la técnica de 3´RACE PCR.
Para ello, se sintetizó ADNc a partir del ARN total aislado de hojuelas expuestas a
quitosano por 8 h, utilizando un primer adaptador que contiene una secuencia poli-T capaz
de unirse a la cola de poli-A de los ARNm. Luego, para la amplificación específica de
StPP2Ac2b, se empleó un primer que se une al inicio de su 3’-UTR y el primer adaptador
(sin la secuencia poli-T) como primer reverso. El producto de la reacción se analizó en un
gel de agarosa (Figura 48 A) y se tomó una muestra de las distintas bandas observadas
(bandas 1 a 4). La especificidad de dichas bandas se evaluó realizando una PCR anidada y
a continuación, los fragmentos obtenidos a partir de las bandas específicas (2 y 4) fueron
clonados y secuenciados (el detalle del procedimiento seguido se indica en “Materiales y
Métodos”). Los sitios de clivaje y poliadenilación se determinaron buscando en las
secuencias el comienzo de la cola de poli-A de los ARNm.
Como se observa en la Figura 48 B, la secuenciación de los productos de la reacción
de 3´-RACE PCR demostró la presencia de al menos tres sitios diferentes de poliadenilación
en el transcripto de StPP2Ac2b. Estos sitios se localizan en las posiciones +1137, +1189 y
+1467. El sitio en la posición +1467 corresponde a la banda 2 y los sitios en +1137 y +1189
a la banda 4. Esta última contenía al menos dos tipos de fragmentos, ya que a partir de ella
se clonaron dos insertos con distintos sitios de poliadenilación.
Dado que las secuencias de ADNc de esta isoforma reportadas en la base de datos
DFCI Potato Gene Index continúan más allá del tercer sitio de clivaje detectado en este
trabajo, es posible que exista al menos un sitio más de poliadenilación en el ARNm de
StPP2Ac2b.
Finalmente, teniendo en cuenta las señales de poliadenilación descriptas en A.
thaliana (Loke et al., 2005), se encontraron algunas posibles señales de tipo NUE (Near
Upstream Element) en la región 3´-UTR de StPP2Ac2b (Figura 48 B).
129
Resultados
A
3´RACEPCR
Ladder
100 pb
PCR anidada
Clonado
(bandas 2 y 4)
1
2
3
4
500 pb
Secuenciación
B
codón
codón stop
stop
900
GACTCCTGATTACTTCTTGTGATTCCAATGGTTGCACTAGTTGTTTGTAG
950
CTCATCGATGTCGTATTGCTGTAGATGTGTCTTAAAAAGAGGAGTTTTGT
NUE
1000 CATTCTTTTGTTTGGAGGTCGTTCTGCAGTTGACTTTGAATATATGCACC
NUE
1050 TTCTGAGAGTTGAGAAGAGGCACTGAAGGTCTGTCATGTATATTGTTTTC
1100 TTAAGGGAGCAGCATTAACATGGTGCATTGTGTCCTATAATTTTGTGCTA
NUE
1150 GAAACCCAAATCTTTCGTCAGTAATCAACTAGGTTCCACTAAATTCGTGC
1200 GTGGTGATTACGACTGATATTGGTGCCATTTCTAACGGCATTGCCTCCGT
1250 CCCCCTCTCCTCTCTCTTTTATGGACATATTTCTAATTGTGCAGAAGGAA
1300 TACTAGGCGTTTGTCTGTATATTTGGTATTCCATAGGATGTATCTTGAGT
NUE
1350 TGAATTTTCCTCTTCCTTGTGGTCTTGAGTTGAATTTTCCTCTTCCTTGT
NUE
1400 GGTCTTTGGTGAATCATAGTTAAAATTTATGTATGACAGTTTAAGTTGAA
NUE
1450 TTAGAATATACAGTTTTTGAAAAATGTTGATACATCTCCAATTTAAAATT
1500 TGAATTTTTTTTCCTG
Figura 48 | Sitios de clivaje y poliadenilación determinados en el ARNm de StPP2Ac2b por
3’RACE-PCR. (A) 10 µL de la reacción de 3’RACE-PCR se separaron en un gel de agarosa 1%
(p/v). Se indican las bandas analizadas (1-4) y los pasos principales seguidos para su
caracterización. La imagen correspondiente a este gel fue invertida utilizando el programa Adobe
Photoshop CS3 para una mejor visualización. (B) Secuencia de la región 3’-UTR de StPP2Ac2b. Los
sitios de clivaje detectados se indican con flechas. El codón stop y las posibles señales de
poliadenilación de tipo NUE (Near Upstream Element) se indican con líneas por debajo de la
secuencia. La posición +1 corresponde al nucleótido A del codón de inicio ATG.
130
Futuros Experimentos
FUTUROS EXPERIMENTOS: Sobre-expresión de StPP2Ac2b en
Solanum tuberosum L.
Para realizar un estudio más detallado de la participación de las PP2As en los mecanismos
de respuesta a estrés, se realizaron construcciones con el fin de sobre-expresar la isoforma
StPP2Ac2b en plantas de papa. Como se mostró en “Resultados”, esta isoforma aumenta su
expresión en respuesta a la mayoría de los estreses analizados en este trabajo de tesis.
En primer lugar, se obtuvo la secuencia codificante completa de StPP2Ac2b. Para ello
se sintetizó ADNc a partir de muestras de ARN total aislado de hojuelas expuestas a
quitosano por 8 h (condición en la que aumenta el nivel del transcripto de StPP2Ac2b).
Utilizando este ADNc como molde y una polimerasa de alta fidelidad (polimerasa Phusion,
Finnzymes), se realizó una reacción de PCR empleando primers que se unen a las regiones
5’- y 3’-UTR de esta isoforma (FwC2bfullUTR y RvC2bfullUTR). De este modo, se pudo
amplificar de forma específica la secuencia codificante de StPP2Ac2b, junto con parte de
sus regiones no codificantes. Los fragmentos obtenidos en esta reacción fueron clonados en
el vector pZErO-2 (Invitrogen) digerido con la enzima EcoRV (ligación entre extremos
romos). La especificidad de los fragmentos clonados se confirmó realizando una PCR
anidada con los primers FwC2bfullNEST y RvC2bfullUTR, que se unen a la región
codificante y a la región 3’-UTR, respectivamente.
A continuación, utilizando esta construcción como molde y la polimerasa de alta
fidelidad, se realizó una reacción de PCR empleando los primers StPP2Ac2bfw y
StPP2Ac2brv, los cuales se unen al inicio y al final de la secuencia codificante de
StPP2Ac2b y contienen sitios de corte para las enzimas BamHI y EcoRI, respectivamente.
Los fragmentos amplificados en esta reacción fueron digeridos con BamHI y EcoRI, y luego
ligados al vector pHAP12 (previamente digerido con las mismas enzimas). En la Figura 49 A
se muestra un esquema de esta construcción (pHAP12 – StPP2Ac2b). En ella, la secuencia
codificante de StPP2Ac2b se encuentra río abajo de la versión extendida del promotor 35S
del Virus del Mosaico del Coliflor (35S (L) CaMV) y de la secuencia potenciadora de la
traducción Ω del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV), y río arriba de la secuencia
terminadora de la transcripción de la nopalina sintetasa (tNOS).
Finalmente, a partir de la construcción anterior, se obtuvo el cassette [35S (L) CaMV Ω - StPP2Ac2b - tNOS] por digestión con la enzima HindIII. Este fragmento se subclonó en
el vector binario pPZP-Npt (Romano et al., 2001), también digerido con HindIII (Figura 49 B).
Este vector posee los bordes izquierdo y derecho del ADN-T y, río abajo del borde izquierdo,
el gen NPT que confiere resistencia a kanamicina para la selección de las células vegetales
transformadas.
131
Futuros Experimentos
A
35S (L) CaMV
HindIII
Ω
BamHI
Ampicilina R
StPP2Ac2b
pHAP12 – StPP2Ac2b
EcoRI
tNOS
HindIII
ori
B
LB
NPT
HindIII
35S (L) CaMV
Ω
Estrep/Espect
R
StPP2Ac2b
tNOS
pPZP-Npt – StPP2Ac2b
HindIII
RB
ori
Figura 49 | Esquema de las construcciones realizadas para la sobre-expresión de StPP2Ac2b
en plantas de papa. (A) Vector pHAP12 conteniendo la secuencia codificante de StPP2Ac2b. (B)
Vector binario pPZP-Npt conteniendo el cassette [35S (L) CaMV - Ω - StPP2Ac2b - tNOS] subclonado
a partir del vector pHAP12. En ambos esquemas se indican con flechas los sitios de corte de las
enzimas de restricción empleadas para el clonado. Los tamaños de los bloques no son
proporcionales al tamaño real (en pb) de cada elemento. La secuencia codificante de StPP2Ac2b
abarca 921 pb. El tamaño de los vectores (sin tener en cuenta el inserto) es de aproximadamente 4,5
kpb para pHAP12 y 8,0 kpb para pPZP-Npt. Continúa en la página siguiente.
132
Futuros Experimentos
Figura 49 | Continuación. Ampicilina
R
: gen que confiere resistencia al antibiótico ampicilina,
R
Estrep/Espect : gen que confiere resistencia a los antibióticos estreptomicina y espectinomicina, ori:
origen de replicación bacteriano, 35S (L) CaMV: versión extendida del promotor 35S del Virus del
Mosaico del Coliflor, Ω: secuencia potenciadora de la traducción del Virus del Mosaico del Tabaco,
tNOS: secuencia terminadora de la transcripción de la nopalina sintetasa, LB: borde izquierdo del
ADN-T, RB: borde derecho del ADN-T, NPT: gen que codifica para la neomicina fosfotransferasa y
confiere resistencia al antibiótico kanamicina.
En todos los casos, las construcciones recombinantes realizadas en pHAP12 y pPZPNpt fueron chequeadas mediante reacciones de PCR utilizando primers que se unen a
StPP2Ac2b (StPP2Ac2bfw, StPP2Ac2brv y FwC2bfullNEST) en combinación con primers
específicos del promotor 35S (L) CaMV o del terminador tNOS (primers prom35S y tNos,
respectivamente). Además, se realizaron digestiones con diferentes enzimas de restricción y
la construcción seleccionada para llevar a cabo la transformación (pPZP-Npt-StPP2Ac2b)
fue analizada por secuenciación.
A continuación, se transformaron bacterias Agrobacterium tumefaciens con la
construcción pPZP-Npt-StPP2Ac2b. La incorporación del vector binario recombinante se
confirmó realizando mini-preparaciones del ADN plasmídico de las bacterias, seguidas por
reacciones de PCR con los primers mencionados en el párrafo anterior.
Finalmente, se llevó a cabo la transformación mediada por A. tumefaciens de S.
tuberosum cv Spunta utilizando discos de tubérculos como explanto y siguiendo el protocolo
detallado en “Materiales y Métodos”. En la Figura 50 se muestran distintas etapas del
proceso regeneración de las plantas.
Hasta el momento, se obtuvo un total de catorce brotes a partir de los explantos
inoculados y cada una de estas líneas está siendo propagada in vitro. Dos de ellas fueron
analizadas en forma preliminar con el fin de evaluar la presencia del transgén (Figura 50 D y
E). Para ello se extrajo ADN a partir de las hojas y se llevó a cabo una reacción de PCR
empleando los primers FwC2bfullNEST y tNos. En ambos casos se amplificó un fragmento
del peso molecular esperado. Por otro lado, este fragmento no se amplificó al utilizar como
molde ADN de una planta obtenida a partir del control de regeneración (explantos no
inoculados).
133
Futuros Experimentos
A
Control de Regeneración
Control de Selección
B
Explantos Inoculados
C
D
E
1
2
3
4
5
6
500 pb
1: ADN genómico de planta WT
2: pPZP-Npt
3: pPZP-Npt-StPP2Ac2b
4: Control de regeneración
5: Línea 1
Línea 1
Línea 2
6: Línea 2
Figura 50 | Regeneración y chequeo preliminar de las plantas obtenidas. (A) Explantos
correspondientes a los controles de regeneración y selección (no inoculados) y explantos expuestos a
A. tumefaciens (inoculados), luego de 1 mes de cultivo. En el caso de los discos inoculados, se indica
con una flecha un explanto que posee nódulos meristemáticos. (B-C) Brotes obtenidos a partir de los
explantos inoculados, luego de 2-3 meses de cultivo, antes (B) y después (C) de ser repicados para
su propagación in vitro. (D) Plantas correspondientes a las líneas que fueron analizadas
preliminarmente. (E) La reacción de PCR realizada para la evaluación preliminar de las líneas 1 y 2
fue analizada en un gel de agarosa 1% (p/v). La imagen correspondiente a este gel fue invertida
utilizando el programa Adobe Photoshop CS3 para una mejor visualización. Continúa en la página
siguiente.
134
Futuros Experimentos
Figura 50 | Continuación. La extracción de ADN a partir de las plantas propagadas in vitro se realizó
como se indica en “Materiales y Métodos”, y dichas muestras se utilizaron como molde para la
amplificación (Calle 4: planta control de regeneración, Calles 5 y 6: plantas correspondientes a las
líneas 1 y 2, respectivamente). Para los controles negativos se empleó como molde ADN genómico
obtenido a partir de una planta WT y el vector pPZP-Npt (Calles 1 y 2, respectivamente). Para el
control positivo se utilizó como molde la construcción pPZP-Npt-StPP2Ac2b (Calle 3). WT (wild-type):
tipo silvestre.
Las restantes líneas se analizarán también mediante una reacción de PCR y luego se
llevará a cabo un ensayo de Southern Blot para confirmar la integración del transgén.
Además, este ensayo permitirá seleccionar las líneas independientes con las que se
continuará la caracterización. Una vez confirmada la sobre-expresión de StPP2Ac2b, se
evaluarán las respuestas moleculares y fisiológicas de estas plantas frente a diferentes
condiciones de estrés, como así también su rendimiento al tuberizar.
135
Discusión
DISCUSIÓN
En este trabajo de tesis se caracterizó la familia de subunidades catalíticas de las fosfatasas
de proteínas tipo 2A en Solanum tuberosum L. y se estudió su participación en vías de
transducción asociadas a factores reguladores de la tuberización y a condiciones de estrés.
Los resultados comunicados en esta tesis, junto con algunos estudios previos realizados en
nuestro laboratorio, constituyen la primera caracterización de una familia de fosfatasas de
proteínas en S. tuberosum.
Familia de PP2Ac en Solanum tuberosum L.
Las búsquedas bioinformáticas realizadas en la base de datos de ESTs DFCI Potato Gene
Index revelaron la existencia de seis isoformas de PP2Ac en S. tuberosum. Estas fueron
designadas según su homología con las isoformas previamente descriptas en tomate
(Solanum lycopersicum): StPP2Ac1, StPP2Ac2a, StPP2Ac2b, StPP2Ac3, StPP2Ac4 y
StPP2Ac5. De las isoformas StPP2Ac1, 2a, 2b, 3 y 4 fue posible obtener su secuencia
codificante completa junto con las regiones 5’- y 3’-UTR; de la isoforma restante (StPP2Ac5)
sólo se cuenta con la región 3’ de su transcripto, conteniendo una parte de la secuencia
codificante junto con la región 3’-UTR.
Los resultados del ensayo de Southern Blot apoyan la hipótesis de la existencia de
una familia multigénica de PP2Ac en esta especie. En el mismo sentido, las búsquedas de
secuencias homólogas en la base de datos asociada a la versión preliminar del genoma de
Solanum phureja, indican que en estas especies relacionadas habría al menos seis genes
para PP2Ac.
El grado de identidad entre las secuencias codificantes de las distintas isoformas es
relativamente alto (superior al 70%). Esta similitud resulta aún más evidente al comparar sus
secuencias aminoacídicas. A su vez, las estructuras primarias de las PP2Ac de papa (al
menos, las correspondientes a las cinco isoformas de las que se conoce su secuencia
completa) presentan el dominio funcional típico de las subunidades catalíticas de las PP2As,
como así también todos los aminoácidos requeridos para la actividad fosfatasa de
serina/treonina. Se detectó además, en dichas secuencias aminoacídicas, el motivo
“TPDYFL” característico del extremo carboxilo-terminal de las PP2Ac, junto con todos los
aminoácidos requeridos para la interacción con el fosfato y con los iones metálicos
coordinados en su sitio activo. Por otro lado, se conserva casi la totalidad de los residuos
necesarios para la interacción con la subunidad estructural A y con el inhibidor ácido
okadaico, según han sido caracterizados en estudios cristalográficos de una fosfatasa PP2A
136
Discusión
de humanos. Todos estos resultados sugieren que las isoformas de PP2Ac descriptas en S.
tuberosum (al menos, aquellas de las que se conoce su secuencia completa) serían
funcionales.
A su vez, en ninguna de las PP2Ac de papa se detectaron señales específicas de
localización subcelular. Los resultados de estos análisis realizados in silico concuerdan con
el hecho de que son las subunidades regulatorias (y no las catalíticas) las principales
responsables de definir la localización subcelular de las fosfatasas PP2A.
Por otro lado, se encontró que las PP2Ac de S. tuberosum se agrupan en dos
subfamilias. Las isoformas StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b pertenecen a la Subfamilia
I, mientras que la Subfamilia II incluye a StPP2Ac3, StPP2Ac4 y StPP2Ac5. La división en
dos grupos también ha sido reportada para las familias multigénicas de PP2Ac descriptas en
otras especies como Arabidopsis thaliana (Ariño et al., 1993; Casamayor et al., 1994; PérezCallejón et al., 1998), arroz (Yu et al., 2003; Yu et al., 2005), tomate y Nicotiana
benthamiana (He et al., 2004).
Se observó también que estas subunidades catalíticas caracterizadas en papa
presentan un alto grado de identidad con las PP2Ac descriptas en otras especies vegetales,
e incluso con las subunidades catalíticas de las PP2As de humanos (la identidad a nivel de
aminoácidos con HsPP2Acα es de aproximadamente 80%). Esta gran similitud a nivel de
secuencias, número de aminoácidos y peso molecular entre las PP2Ac de distintas
especies, pone en evidencia el alto grado de conservación de estas proteínas a lo largo de
la evolución. Probablemente, las particularidades funcionales de las fosfatasas PP2A en
diferentes especies están dadas por el complemento de subunidades regulatorias presentes
en cada una de ellas, sin descartar la posibilidad de que algunas de sus funciones puedan
estar conservadas en las células animales y vegetales.
Con respecto a las subunidades estructurales (A) y regulatorias (B/B’/B’’), a partir de
búsquedas preliminares realizadas en la base de datos de ESTs de S. tuberosum (DFCI
Potato Gene Index), se encontraron secuencias homólogas a las subunidades de tipo A y
B/B’/B’’ de A. thaliana. El estudio de estas subunidades permitirá conocer la diversidad de
holoenzimas de PP2A presentes en las plantas de papa y aportará una comprensión más
profunda de sus funciones en esta especie.
Finalmente, sería interesante evaluar también si los mecanismos de regulación de las
PP2Ac descriptos en células animales (como las modificaciones post-traduccionales en su
extremo carboxilo-terminal) ocurren también en las células vegetales.
137
Discusión
Expresión de PP2Ac en distintos órganos de la planta
Las proteínas PP2Ac fueron detectadas en todos los órganos analizados, con mayores
niveles en las flores, el ápice del vástago, el tallo y las hojas con respecto a los pimpollos y
la raíz, donde su abundancia es menor. A su vez, se observó que su nivel aumenta en
paralelo con el progreso de la tuberización y que son detectables también en los estolones y
los brotes del tubérculo.
Los perfiles de expresión de las seis isoformas a nivel de ARNm en los distintos
órganos varían según la isoforma estudiada. Las isoformas de la Subfamilia I (StPP2Ac1,
StPP2Ac2a y StPP2Ac2b) presentan niveles diferentes según la parte de la planta
considerada, sugiriendo que las mismas podrían participar en vías de señalización
específicas de un dado tejido u órgano. Por otro lado, los miembros de la Subfamilia II (en
particular las isoformas StPP2Ac3 y StPP2Ac5) muestran una distribución más uniforme en
los distintos órganos, lo que sugiere que podrían estar involucrados en vías relacionadas
con el mantenimiento de las funciones celulares básicas.
Se ha reportado que las isoformas de PP2Ac caracterizadas en arroz modifican la
abundancia de sus transcriptos en un dado órgano a lo largo del crecimiento de la planta (Yu
et al., 2003; Yu et al., 2005). Teniendo en cuenta este resultado, sería interesante evaluar en
futuros experimentos, el perfil temporal de expresión de las PP2Ac de S. tuberosum en
diferentes órganos a lo largo del desarrollo de la planta. Este análisis permitiría determinar si
la expresión de las isoformas estudiadas se asocia con algún momento particular de la
maduración de los órganos.
Por otro lado, se observó que los transcriptos de la mayoría de las isoformas son más
abundantes en los estadíos tardíos del desarrollo del tubérculo. Esta regulación durante el
proceso de tuberización permite suponer que las PP2As cumplirían un rol en las vías de
señalización que se activan durante la formación del tubérculo.
Se ha descripto que las fosfatasas PP2A cumplen un rol en la organización del
citoesqueleto cortical de microtúbulos y en la formación de la banda preprofásica antes de la
mitosis, tanto en Arabidopsis thaliana como en maíz (Camilleri et al., 2002; Wright et al.,
2009). Esta función es importante para la correcta orientación de los planos de división
celular y se relaciona con la forma y distribución de las células en un tejido. Por otro lado, se
ha propuesto que estas fosfatasas tienen entre sus sustratos a la enzima sacarosa-fosfato
sintasa, involucrada en el metabolismo de la sacarosa (Weiner et al., 1993). Durante la
formación del tubérculo, los cambios en los planos de división celular y la modulación del
metabolismo de los hidratos de carbono son procesos de suma importancia (Xu et al.,
1998b; Geigenberger, 2003; Geigenberger et al., 2004) y, teniendo en cuenta los resultados
138
Discusión
mencionados previamente, estos podrían estar regulados por las fosfatasas caracterizadas
en este trabajo de tesis.
Finalmente, se encontró que a nivel de ARNm la abundancia de las diferentes
isoformas es similar en los estolones y los brotes del tubérculo. Esto no coincide con lo
observado a nivel de proteínas, donde las PP2Ac son más abundantes en los estolones con
respecto a los brotes. Estos resultados podrían deberse a la existencia de algún tipo de
regulación post-transcripcional que module los niveles de proteínas PP2Ac en los estolones
y/o los brotes del tubérculo.
Participación de PP2A en vías de señalización de tuberización
Los eventos de fosforilación y desfosforilación de proteínas tienen un rol importante en el
crecimiento y desarrollo de las plantas. Resultados previos de nuestro laboratorio
demostraron que diversos procesos de fosforilación reversible tienen lugar durante el
desarrollo del tubérculo, en respuesta a altas concentraciones de sacarosa (MacIntosh et al.,
1996; Ulloa et al., 1997; Raíces et al., 2001; Raíces et al., 2003a; Raíces et al., 2003b;
Raíces et al., 2003c). Estos estudios también demostraron que los eventos de
fosforilación/desfosforilación de proteínas están involucrados en la regulación de la
expresión de genes “específicos del tubérculo”. Sin embargo, las cascadas de señalización
que se inician en las hojas en respuesta a los factores que regulan la tuberización no se
conocen en detalle.
Una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo (condición promotora de la
tuberización) incrementa los niveles de ARNm de los genes Patatina y Pin2 en las hojas.
Los experimentos realizados con los inhibidores ácido okadaico y endotal sugieren que la
actividad de fosfatasas tipo 2A sería requerida para la inducción de dichos genes. Por otro
lado, no se observaron cambios significativos en los niveles de proteínas PP2Ac ni en la
abundancia del ARNm de las distintas isoformas en respuesta a una alta relación
sacarosa/nitrógeno. Sin embargo, esta condición incrementa la actividad de fosfatasas
PP1/PP2A. Los resultados mencionados apoyan la hipótesis de que una alta relación
sacarosa/nitrógeno aumenta la actividad de fosfatasas PP2A pre-existentes, sin modificar su
abundancia, y de este modo regula positivamente las vías de transducción que llevan al
aumento en la expresión de Patatina y Pin2.
Por otro lado, la GA3 (regulador negativo de la tuberización) disminuye los niveles de
transcriptos de Patatina y Pin2 en las hojas. La inhibición de la actividad de PP2A por el
ácido okadaico 100 nM y el endotal 20 µM no produjo ningún efecto significativo en los
niveles de ARNm de Patatina y Pin2, en presencia o ausencia de la GA3. Esto sugiere que la
139
Discusión
represión de dichos genes por las giberelinas ocurriría por una vía independiente de las
fosfatasas PP2A.
A su vez, esta hormona disminuye la abundancia de los transcriptos de todas las
isoformas de PP2Ac de la Subfamilia I (StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b), lo que se
correlaciona con una menor cantidad de proteínas PP2Ac. En este sistema experimental, es
difícil determinar si las giberelinas tienen un efecto directo sobre la actividad enzimática de
las fosfatasas PP2A, ya que el tratamiento con la GA3 regula negativamente los niveles de
PP2Ac y esto generaría indirectamente una disminución en el nivel de actividad.
En conjunto, estos resultados sugieren que una alta relación sacarosa/nitrógeno
estimula la expresión de Patatina y Pin2 posiblemente mediante el aumento de la actividad
de fosfatasas tipo 2A, sin afectar los niveles de ARNm y proteínas de PP2Ac. Por otro lado,
la GA3 reprime la expresión de las isoformas de PP2Ac correspondientes a la Subfamilia I, lo
que se correlaciona con una menor cantidad de proteínas PP2Ac. Esta disminución causada
por el ácido giberélico inhibiría las señales de tuberización río abajo de los efectos
inductores de una alta relación sacarosa/nitrógeno (Figura 51).
Diversos trabajos indican que existe una fuerte interacción entre las vías de
señalización de la sacarosa y las GAs. Se ha reportado que la sacarosa regula la formación
del tubérculo en parte a través de su influencia sobre los niveles de las GAs bioactivas (Xu
et al., 1998a; Gibson, 2004). Se encontró también que el transportador de sacarosa StSUT4
está involucrado en la señalización de las GAs y que existe una regulación recíproca entre
StSUT4 y dichas hormonas durante la tuberización (Chincinska et al., 2008). Finalmente, el
estudio de plantas de papa mutantes que tuberizan en forma constitutiva demostró que las
giberelinas inhiben la tuberización río abajo de los efectos inductores de la sacarosa y otros
reguladores positivos (Fischer et al., 2008).
Teniendo en cuenta los resultados presentados en esta tesis, las fosfatasas PP2A
podrían ser uno de los elementos a través de los cuales las GAs modulan la sensibilidad a la
sacarosa, regulando de ese modo la inducción de la tuberización. En este sentido sería
interesante evaluar la expresión de los genes Patatina y Pin2 en respuesta a un tratamiento
conjunto con GAs y una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio de cultivo.
A su vez, los resultados obtenidos en este trabajo apoyan la hipótesis de que las
PP2As modulan positivamente las respuestas a señales inductoras de la tuberización en
hojas. Los factores que afectan la formación del tubérculo modifican la transcripción de
numerosos genes, los cuales podrían estar regulados por vías de transducción comunes.
Esto permite plantear como hipótesis que, además de regular la abundancia de los ARNm
de Patatina y Pin2, las PP2As podrían modular la transcripción de otros genes en respuesta
140
Discusión
a los estímulos que afectan la formación del tubérculo. La posibilidad de que estas
fosfatasas regulen la expresión de genes involucrados en la señalización a distancia que
ocurre durante la inducción de la tuberización es una hipótesis de trabajo que será estudiada
en futuros experimentos.
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Figura 51 | Esquema simplificado de las vías de señalización asociadas a la expresión de
Patatina y Pin2 en las hojas de Solanum tuberosum L. Los resultados de los experimentos
realizados con los inhibidores ácido okadaico y endotal, junto con los perfiles de expresión de las
PP2Ac frente a condiciones que regulan la tuberización, muestran que una alta relación
sacarosa/nitrógeno en el medio ( S:N, condición promotora de la tuberización) estimula la expresión
de Patatina y Pin2 en las hojas, posiblemente mediante el aumento de la actividad de PP2A, sin
afectar los niveles de ARNm y proteínas de PP2Ac. Por otro lado, las giberelinas (GAs, reguladores
negativos de la tuberización) reprimen la expresión de Patatina y Pin2, posiblemente por una vía
independiente de las PP2As, y disminuyen el nivel de ARNm de las isoformas StPP2Ac1, StPP2Ac2a
y StPP2Ac2b, lo que se correlaciona con una menor cantidad de proteínas PP2Ac. Esta disminución
causada por las giberelinas inhibiría las señales de tuberización río abajo de los efectos inductores de
una alta relación sacarosa/nitrógeno.
141
Discusión
Finalmente, son muchas las preguntas que aún no han sido aclaradas con respecto a
la señalización de las GAs durante la tuberización, en particular, en lo referido a la
interacción entre las GAs y el fotoperíodo (Carrera et al., 1999; Carrera et al., 2000;
Martínez-García et al., 2002b; Kloosterman et al., 2007). El presente trabajo fue realizado en
una variedad de papa perteneciente a la subespecie S. tuberosum ssp. tuberosum que no
requiere estrictamente días cortos para iniciar la formación del tubérculo. Sería interesante
realizar estudios similares en plantas de la subespecie S. tuberosum ssp. andigena que
poseen un requerimiento fotoperiódico estricto para tuberizar. Estos ensayos permitirían
analizar las vías de señalización asociadas al fotoperíodo en relación con las PP2As y los
demás factores que regulan la tuberización.
Participación de PP2A en vías de señalización de estrés
La comprensión de los mecanismos por los cuales se perciben y transducen las señales
asociadas al estrés para la generación de respuestas adaptativas, es de gran importancia
para el conocimiento de la biología de las plantas y vital para la generación de estrategias
de mejoramiento biotecnológico tendientes a incrementar la tolerancia a estrés en los
cultivos.
Los procesos de fosforilación reversible de proteínas tienen un papel esencial en las
vías de señalización asociadas a las condiciones de estrés. Estas redes de transducción
llevan a la generación de las respuestas que permiten la adaptación fisiológica de las
plantas en dichas condiciones. A diferencia de lo que sucede con las quinasas de proteínas,
el conocimiento de los roles funcionales de las fosfatasas en estas respuestas ha sido
principalmente desarrollado en los últimos años.
En particular, se han encontrado evidencias de que las fosfatasas PP2A participarían
en algunas vías de señalización asociadas a estrés. En arroz (Oryza sativa), los ARNm de
las subunidades catalíticas de PP2A aumentan su abundancia frente al estrés salino y su
expresión es regulada diferencialmente en respuesta a la sequía y al estrés por altas
temperaturas (Yu et al., 2003; Yu et al., 2005). A su vez, la sobre-expresión de la subunidad
catalítica TaPP2Ac-1 de trigo (Triticum aestivum) en Nicotiana benthamiana confiere una
mayor tolerancia frente a condiciones de sequía (Xu et al., 2007) y se ha demostrado que
RCN1, una de las subunidades A de A. thaliana, modula positivamente las respuestas a
estrés iónico, osmótico y oxidativo en las raíces (Blakeslee et al., 2008). Por otro lado, se ha
descripto que las PP2As de alfalfa (Medicago sativa) disminuyen su actividad en respuesta
al frío (Monroy et al., 1998), mientras que el ARNm de la subunidad regulatoria AtB’γ de A.
thaliana aumenta su abundancia frente al estrés por altas temperaturas (Latorre et al.,
142
Discusión
1997). Se ha reportado también que las PP2As participarían en vías de señalización
asociadas al daño mecánico en A. thaliana (Rojo et al., 1998) y que el silenciamiento de las
subunidades catalíticas NbNPP4-1 y NbNPP4-2 en Nicotiana benthamiana es capaz de
generar la activación constitutiva de diversas respuestas de defensa frente a patógenos (He
et al., 2004).
A su vez, las PP2As han sido implicadas en la señalización asociada al ABA, una de
las hormonas más importantes para la generación de respuestas frente al estrés abiótico. En
este sentido, se encontró que la expresión de la subunidad regulatoria MsPP2A-Bβ de alfalfa
es estimulada por esta hormona (Toth et al., 2000), mientras que la subunidad catalítica
PP2Ac-2 de A. thaliana fue descripta como un regulador negativo de la señalización del ABA
(Pernas et al., 2007). Por otro lado, la mutación del gen que codifica para RCN1 genera
insensibilidad al ABA en A. thaliana, impidiendo el cierre de los estomas inducido por esta
hormona (Kwak et al., 2002).
Para evaluar la participación de fosfatasas de serina/treonina en la señalización
asociada al estrés en las hojas de S. tuberosum, se estudió la expresión de genes
marcadores de respuesta a estrés en presencia o ausencia de ácido okadaico 100 nM.
El ácido okadaico ha sido ampliamente utilizado como inhibidor de fosfatasas PP1 y
PP2A. Estudios realizados en A. thaliana demostraron que en extractos proteicos de plantas
expuestas in vivo a ácido okadaico 1 µM, se alcanza un grado de inhibición de la actividad
fosfatasa equivalente al obtenido in vitro con ácido okadaico 1 nM (Rojo et al., 1998).
Teniendo en cuenta estos resultados y el hecho de que las fosfatasas PP2A son
aproximadamente 100 veces más sensibles al ácido okadaico que las PP1 (IC50 PP2A = 0,1
nM - IC50 PP1 = 10-15 nM), es probable que la concentración del inhibidor empleada en este
trabajo de tesis (100 nM) esté afectando principalmente a las PP2A, con respecto a las PP1.
De todos modos, no se puede descartar que otras fosfatasas de serina/treonina menos
abundantes como las PP4, PP5 y PP6, estén siendo también inhibidas.
En conjunto, los experimentos realizados con este inhibidor indican que las fosfatasas
de serina/treonina sensibles a ácido okadaico cumplirían funciones regulatorias en distintas
respuestas a estrés en S. tuberosum. La presencia del inhibidor no afecta la expresión de
Le25 en respuesta al estrés salino pero si es capaz de bloquear la inducción de Tas14 en
dichas condiciones. Por otro lado, el ácido okadaico no afecta la expresión de Tas14 ni de
HB7 en respuesta a las bajas temperaturas, como tampoco modifica la inducción de Pin2
luego de un daño mecánico. Finalmente, se observó que este inhibidor es capaz de inducir
per se la expresión del gen Quinasa A, en ausencia de los elicitores fúngicos PGA y
quitosano.
143
Discusión
Estos resultados sugieren que fosfatasas sensibles a ácido okadaico (posiblemente
fosfatasas de tipo 2A) actuarían como moduladores positivos en las vías de señalización
asociadas al estrés salino y como reguladores negativos en las vías que llevan a la
inducción del gen Quitinasa A. Finalmente, en los casos de estrés por bajas temperaturas y
daño mecánico, no se puede descartar totalmente la participación de este tipo de fosfatasas
en las respuestas asociadas a dichos estreses, ya que sólo se evaluaron algunos genes
marcadores para cada condición.
Para continuar con el estudio de la participación de las fosfatasas PP2A en la
señalización asociada al estrés en las hojas de S. tuberosum, se analizó su perfil de
expresión a nivel de proteínas y ARNm en respuesta a condiciones de bajas temperaturas,
alta salinidad, daño mecánico y elicitores fúngicos.
Los cambios en los niveles de expresión de los componentes de las vías de
transducción (como las quinasas y fosfatasas de proteínas) son mecanismos utilizados
habitualmente durante la transducción de señales en plantas (Trewavas, 2009). La
activación o inhibición de componentes de señalización pre-existentes ocurre rápidamente
luego de la percepción del estímulo (generalmente, en segundos o minutos) y lleva a la
generación de respuestas tempranas, mientras que los cambios en los niveles de expresión
de diversos genes ocurren en horas o días y dan origen a respuestas tardías de adaptación
fisiológica a largo plazo.
En estos experimentos, se observó que el nivel de proteínas PP2Ac se incrementa en
respuesta a tratamientos con NaCl, daño mecánico y elicitores fúngicos. Se estudió también
la expresión de estas proteínas frente a condiciones de bajas temperaturas; en este caso,
no se observaron diferencias significativas en los niveles de las PP2Ac de las plantas
expuestas al estrés con respecto a las plantas control.
Los incrementos observados a nivel de proteínas coinciden con aumentos en la
expresión a nivel de ARNm de algunas de las isoformas de PP2Ac: StPP2Ac1, 2a, 2b y 3 en
respuesta al estrés salino; StPP2Ac2b frente al daño mecánico; StPP2Ac1, 2a y 2b en
respuesta a los elicitores fúngicos PGA y quitosano. Con excepción de StPP2Ac3, todas las
isoformas mencionadas corresponden a la Subfamilia I. Finalmente, no se observaron
cambios en la abundancia de los transcriptos de ninguna de las isoformas luego de los
tratamientos con bajas temperaturas.
En conjunto, los resultados de los experimentos con ácido okadaico y los perfiles de
expresión de las PP2Ac sugieren:
• que las fosfatasas PP2A no participarían de las vías de transducción asociadas al
estrés por bajas temperaturas en las hojas de S. tuberosum
144
Discusión
• que las isoformas StPP2Ac1, StPP2Ac2a, StPP2Ac2b y StPP2Ac3 serían
reguladores positivos de las respuestas frente a estrés salino en las hojas de S.
tuberosum
• que StPP2Ac2b participaría de la transducción de señales asociada al daño
mecánico en las hojas de S. tuberosum
• que las isoformas StPP2Ac1, StPP2Ac2a y StPP2Ac2b serían reguladores
negativos de las respuestas frente a elicitores fúngicos en las hojas de S.
tuberosum
En el caso del estrés por bajas temperaturas, sería interesante determinar también la
actividad de las fosfatasas tipo PP1/PP2A en dichas condiciones, ya que, como se ha
reportado para las PP2As de alfalfa (Monroy et al., 1998), la actividad de estas fosfatasas
podría disminuir en respuesta al frío sin que se produzcan cambios en sus niveles de
proteínas.
Con respecto al estrés por alta salinidad, la determinación del contenido relativo de
agua (RWC) de hojuelas tratadas con NaCl en presencia o ausencia de ácido okadaico o
endotal, no permitió confirmar el rol positivo de las PP2As en la señalización asociada a esta
condición. Los experimentos de sobre-expresión de la isoforma StPP2Ac2b en plantas de
papa serán utilizados para evaluar con más detalle la función de las PP2Ac en la
transducción del estrés salino.
Por otro lado, dado que el ácido okadaico no afecta la inducción de Pin2, es posible
que la isoforma StPP2Ac2b esté involucrada en vías de transducción independientes de las
que estimulan la expresión de Pin2 en respuesta al daño mecánico.
Finalmente, los resultados que indican que las PP2Ac de la Subfamilia I serían
reguladores negativos de las respuestas frente a elicitores fúngicos, coinciden con estudios
previos en los cuales se encontró que el silenciamiento de las isoformas de la Subfamilia I
de PP2Ac desencadena una serie de respuestas típicas de la defensa ante patógenos en
Nicotiana benthamiana (He et al., 2004). Otros estudios realizados utilizando inhibidores de
fosfatasas, demostraron que la inactivación de las respuestas de defensa a patógenos por
acción de las fosfatasas de serina/treonina es un mecanismo común en las plantas
(MacKintosh et al., 1994; Chandra y Low, 1995; Lecourieux-Ouaked et al., 2000). La
inducción de moduladores negativos de la defensa frente a los patógenos podría tener una
función protectora, ya que estas respuestas incluyen estallidos oxidativos y procesos de
muerte celular localizada que pueden resultar muy dañinos para las células (da Cunha et al.,
2006). En consecuencia, estos mecanismos deben ser finamente regulados para evitar
daños extensos en los tejidos de las plantas.
145
Discusión
De todos modos, más experimentos son necesarios para confirmar esta posibilidad y
no se puede descartar que los patrones de expresión de las PP2Ac sean diferentes en
respuesta a otros elicitores.
El hecho de que las mismas PP2Ac puedan actuar en diferentes vías de transducción
como moduladores positivos o negativos frente a distintas condiciones de estrés, podría
deberse a una regulación diferencial llevada a cabo por las subunidades regulatorias de
dichas fosfatasas. En este sentido, sería interesante determinar la identidad de las
subunidades estructurales A y regulatorias B/B’/B’’ que acompañan a las subunidades
catalíticas en las diferentes condiciones estudiadas. Para ello se podría utilizar alguna de las
estrategias que combinan la purificación por afinidad del complejo del interés, seguida por la
identificación de las proteínas presentes en dicho complejo mediante la técnica de
espectrometría de masa (Chen y Gingras, 2007; Glatter et al., 2009).
Por otro lado, el análisis conjunto de los perfiles de expresión a nivel de ARNm de las
PP2Ac de S. tuberosum, muestra que las isoformas que modifican su abundancia en
respuesta a los estímulos estudiados pertenecen en general a la Subfamilia I, mientras que
las isoformas de la Subfamilia II presentan niveles más uniformes frente a las diferentes
condiciones evaluadas. El estudio de los promotores de los miembros de ambas subfamilias
génicas y el análisis de las secuencias regulatorias presentes en ellos, permitiría comenzar
a dilucidar las causas de estas diferencias y su significado funcional.
Por último, a partir de experimentos similares realizados en nuestro laboratorio con la
especie Solanum lycopersicum, se determinó que existen diferencias en la participación de
las fosfatasas PP2A en las vías de transducción asociadas a las bajas temperaturas y al
estrés salino en las plantas de papa y tomate, ambas pertenecientes al mismo género (País
et al., 2009). En las plantas de tomate, las PP2As no parecen participar de la transducción
de señales asociada al estrés salino; por otro lado, estas fosfatasas actuarían como
reguladores negativos en la señalización asociada al frío. Estas diferencias entre ambas
especies podrían explicarse por las condiciones ambientales disímiles en las que fueron
domesticadas. Existen evidencias de que la domesticación de la papa tuvo lugar en la región
andina (Spooner y Hetterscheid, 2006) mientras que el tomate comenzó a ser cultivado en
América Central (Bai y Lindhout, 2007). En consecuencia, la selección artificial durante la
domesticación habría favorecido el surgimiento de distintas respuestas moleculares frente a
los estímulos del ambiente, permitiendo la adaptación a condiciones ambientales diferentes.
Estos estudios demuestran la importancia de analizar las vías de señalización de
estrés en las distintas especies vegetales de interés, ya que las diferencias en el grado de
tolerancia de una especie o variedad frente a un dado estrés ambiental se correlacionan en
146
Discusión
general con características diferenciales de los mecanismos moleculares subyacentes
(Rorat et al., 2006; Aghaei et al., 2008; Oufir et al., 2008; Aghaei et al., 2009).
Poliadenilación alternativa de StPP2Ac2b
A partir del estudio del extremo 3’ del ARNm de StPP2Ac2b mediante la técnica 3´-RACE
PCR, se detectó que el transcripto de esta isoforma presenta más de un sitio de clivaje y
poliadenilación. Este proceso de poliadenilación alternativa genera ARN mensajeros de
distinto tamaño que, a su vez, dan origen a más de una banda en los ensayos de Northern
Blot realizados con la sonda específica para StPP2Ac2b.
En particular, se encontraron tres sitios diferentes de poliadenilación y es posible que
exista al menos un sitio más, ya que las secuencias de ADNc de StPP2Ac2b reportadas en
la base de datos DFCI Potato Gene Index continúan más allá del tercer sitio de clivaje
detectado en este trabajo.
Típicamente, la señal consenso en el sitio de clivaje presenta una secuencia “TA” o
“CA”, mientras que la secuencia canónica de las señales de poliadenilación de tipo NUE
(Near Upstream Element, normalmente ubicadas entre 10 y 40 nucleótidos río arriba del sitio
de clivaje) es “AATAAA” (Loke et al., 2005). En el caso de StPP2Ac2b, sólo los dos primeros
sitios de clivaje poseen una secuencia típica (“TA”), mientras que el tercer sitio presenta el
dinucleótido “TG”. Por otro lado, no se encontraron señales canónicas de poliadenilación,
aunque existen varias secuencias similares, como por ejemplo, dos sitios “AATATA”.
La existencia de sitios de poliadenilación alternativa ha sido también descripta en los
transcriptos de las subunidades catalíticas OsPP2A-3 de arroz y LePP2Ac1 de tomate (Yu et
al., 2003; País et al., 2009). Ambas isoformas pertenecen a la Subfamilia I de PP2Ac, al
igual que StPP2Ac2b.
Se estima que el proceso de poliadenilación alternativa ocurre en al menos el 25% de
los genes de A. thaliana, y en alrededor del 50% de los genes de arroz (Shen et al., 2008;
Xing y Li, 2009). Si bien no se conoce en detalle el significado fisiológico de este fenómeno
en las células vegetales, se postula que la variación en la longitud de la región 3’-UTR
tendría un rol en la regulación del transporte, estabilidad y traducción de los ARN
mensajeros.
Perspectivas: Sobre-expresión de StPP2Ac2b en Solanum tuberosum L.
Para realizar un estudio más detallado de la participación de las PP2As en los mecanismos
de respuesta a estrés en S. tuberosum, se decidió sobre-expresar la isoforma StPP2Ac2b
147
Discusión
en plantas de papa. Se eligió esta isoforma ya que la abundancia de su transcripto aumenta
en respuesta a la mayoría de los estreses analizados en este trabajo de tesis.
Como se mencionó anteriormente, la sobre-expresión en Nicotiana benthamiana del
gen que codifica para la subunidad catalítica de trigo TaPP2Ac-1 fue capaz de conferir
tolerancia al estrés por sequía (Xu et al., 2007). Esto demuestra que este tipo de
experimentos no sólo ayudan a caracterizar la función de una proteína, sino que además
pueden contribuir a la generación de estrategias de ingeniería genética para conferir
tolerancia frente a un dado estrés, mediante la expresión de genes involucrados en las vías
de señalización asociadas a dicha condición.
148
Conclusiones
CONCLUSIONES
• Existen al menos seis isoformas de la subunidad catalítica de PP2A (PP2Ac) en Solanum
tuberosum L. Las mismas se agrupan en dos subfamilias y sus secuencias son altamente
similares entre sí. En cinco de las isoformas, se pudo confirmar la presencia de todos los
motivos aminoacídicos característicos de estas proteínas. La isoforma StPP2Ac2b,
perteneciente a la Subfamilia I, presenta sitios de poliadenilación alternativa.
• La expresión de las isoformas de la Subfamilia I presenta, con respecto a las isoformas
de la Subfamilia II, una regulación más compleja en los distintos órganos de la planta y
frente a las diferentes condiciones estudiadas, lo que sugiere que los miembros de la
Subfamilia II podrían estar involucrados en vías relacionadas con el mantenimiento de las
funciones celulares básicas.
• Una alta relación sacarosa/nitrógeno en el medio (condición promotora de la tuberización)
estimula la expresión de Patatina y Pin2 en las hojas, posiblemente mediante el aumento
de la actividad de PP2A, sin afectar los niveles de ARNm y proteínas de PP2Ac. Por otro
lado, las giberelinas (reguladores negativos de la tuberización) reprimen la expresión de
Patatina y Pin2, posiblemente por una vía independiente de las PP2As. Estas hormonas
disminuyen también el nivel de ARNm de las isoformas de la Subfamilia I, lo que se
correlaciona con una menor cantidad de proteínas PP2Ac. La disminución en la
abundancia de las PP2Ac, causada por las giberelinas, inhibiría las señales de
tuberización río abajo de los efectos inductores de una alta relación sacarosa/nitrógeno.
• La expresión de las PP2Ac es diferencialmente regulada en respuesta a diversas
condiciones de estrés, siendo la Subfamilia I la más afectada por estos estímulos. Estas
proteínas tendrían un rol positivo en la señalización asociada al estrés salino, mientras
que regularían negativamente las vías de transducción relacionadas con los elicitores
fúngicos.
Silvia Marina País
Lic. En Ciencias Biológicas
Dra. María Teresa Téllez-Iñón
Dra. Daniela Andrea Capiati
Directora de Tesis
Directora Asistente de Tesis
149
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