Curso de verano Universidad de Salamanca

Curso de verano
Universidad de Salamanca
Marcador es moleculares para la caracterización de Phytophtltorn
Prof. Dr. A ltino Branco Choupina
Instituto Politécnico de Bragan~a, EscoJa Superior Agrária, Campus Santa Apolónia.
Apartado 1172, 5301 -855 Braganc;:a- Portugal
En ia actualidad se dispone de varias técnicas que penniten revelar vru.iablilidades
a nivel de DKA. Características del DNA que diferencian dos o más individuos y que se
heredan genétic-amente, son conocidas como maracadores moleculares.
Los principales tipos de marcadores moleculares pueden ser clasificados en dos
grupos, según la merodología utilizada para identificarlos: Hibridación o amplificación
del D)IA. Entre los identificados por hibridación están los marc adores RFLP
("R estnctwn Fragrnent Length Polymorphism'') y :..1inisatélites o locus VNTR
("Variable 1\umber of Tandem Repeats"). Aquellos revelados por amp lificación
incluyen los marcadores del tipo RAPD ("Random Amplified Polyrnorphic DNA");
SCAR ('"Sequence Characte1ized .A.mplified Regions") o ASA (Amplified Specific
Amplicon); :-.1icrosatélites (o SSR - "Simple Sequence Repeats"); y AF LP (Amplified
Fragmem Length Pol)''lllOrphi sm). Las tecnolo gías de los marcadores moleculares están
e,·olucionando rápidamente y ya existen modificaciones para algunas de las técmcas
anteriormente mencionadas. Con todo, Jos tipos de marcadores aquí listados son los que
están siendo uti lizados para la caracteiización de cultivos. Puede encontrarse la
desc1ipción de cada uno de los tipos de marcadores mencionados en Milach (1998a) e
Feneira & Granapaglia ( 1995).
La técnica de RFLP es laboriosa, emplea más tiempo para la obtención de
resultados que otras técnicas, el coste es relati\'amente alto y pone de manifiesto un
grado de polimorfismo de íntem1edio a bajo, según la especie. A pesar de ello, los
RFLPs han sido utilizados en un gran número de estudios de caracteri zación (Gebhardt
er al., 1989; O ' Donoughue et al., 1994; Autrique et al., 1996). Todo ello debido
principalmente a su alta fiabilidad y reproductivilidad en la obtención de resultados.
Los minisatélites o locus VT:'-l'R son secuencias repetidas de DKA, adyac entes y
e.n número variab le (J effreys et al. , 1985). Esta técnica es similar a la de RFLP,
variando básicamente en el tipo de sonda utilizada y presentando las ventajas y
desventajas de la técnica anterior. Una Yeutaja adicion al de los minisatélites es el alto
grado de polimorfismo presentado, dependiendo de la variación de la distribución de los
sitios de restricción, de las sondas utilizadas, y del número y tipos de secuencias
repetidas. De hecho, utilizando una única sonda de minisaté1ites, :Nyb om y
c-olaboradores ( 1990) caracterizaron cuatro cultivos de Malus sp., cuatro de Prwms
sel'otina y ocho d e Rubus sp.
Entre las técnicas presentadas, la RAPD es la de menor costo, número de etapas
y tiempo de obtención de resultados, y es fácil de implementar. Aún con todo. una de
las desventajas es su baja reproductibilidad y poca fiabilidad de un laboratorio a o tro, Jo
que dificulta la comparación de datos obtenidos en diferentes zonas. Así mismo deben
de tomarse precauciones para la caracterización de los cu ltivos. El nivel de
polimorfismo obtenido con RA..PDs varía mucho con la especie en cuestión y ha sido
utilizada con éxito p ara la caracterización de vari edades de cebada (Tinker et al., 1993;
Penner et al., 1998) y anoz (MacKill, 1995), entre otras.
Los m arcadores SCAR son amplificados con "primers" específicos, diseñados
en base a secuencias ya mapeadas o caracterizadas (Paran & Michelmore, 1993).
Muchos de Jos "primers" se oblienen de la conversión de marcadores RAPD en
SCAR. Esta transfom1ación. en general resulta en la disminución del ni\'e1 de
polimorfismos obtenidos por SCAR. Con todo, esto puede atenuarse con la digestión de
enzimas de restricción de los productos amplificados. y con la secuenciación de las
bandas monomórficas y subsecuente diseño de "primers" que amplifiquen secuencias
más va1iables ~ntre los genotipos. La técnica de SCAR es muy semejante a la de RAPD,
con la \·emaja de ser más fiable y con la desventaja de implicar la utilización de
"primers" de elendo coste.
Los microsatélites implican el diseño de "primers" específicos, Jo cual es un
proceso laborioso y caro. Pero una vez que se disponga de estos, el costo de esta
técnica se asemeja a la de RAPD, con la excepción de que los geles p ara separaT los
fragmentos de DNA deben de ser de poliacdlamida, los cuales son de ele vado costo. La
gran ventaja de esta técnica es el a lto polimorfismo revelado, que le Yttelve una de las
mejores opciones para el uso de la caracterización de cultivos, principalmente en
gem10plasma emparentado y de baja variabilidad.
Por fin, la téc.nica de .AFLP posee una gran c apacidad para la detección de
variabilidad genética y para la caracterización de culti vos. De h echo, ha sido utilizada
con éxito para esta finalidad (Hongtrakul er al, 1997). Entre las ventajas de su uso, está
el alto grado de polimorfismo y el alto número de maTcadores detectados por gel
analizado. AFLP es la técnica más laboriosa entre las técnicas de PCR, necesita geles de
poliacri lamida para la separación de los fragmentos y e stá protegida por patente.
Algunas de estas técnicas hru1 sido ut ili zadas con éxito para la i dentificación y
caracterización de especies de Phytophthora, un hongo de interés fitopatógeno. Los
métodos moleculares de identificación de Phytopl11hora basados e n la amplificación p or
PCR de la región del genoma que codifica para los rR..:"\fAs, y concretamente, las
regiones ITS 1, 5.8S y ITS2, h an pemütido la identificación objetiva de especies de este
género (Cook er. al. , 2000).
En la EscoJa Superior Agraria de Braganrya, y en colaboración con la Cniversidad
de Salamanca hemos puesto a punto un SCAR capaz de identificar Plzywphlhora
cinnamomi con D"NA obtenido a partir de muestras de distintos sustratos.
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