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RESOLUCIÓN OENO 24/2004
DETERMINACIÓN DE MATERIAS PROTEICAS DE ORIGEN VEGETAL EN LOS VINOS Y EN LOS
MOSTOS
LA ASAMBLEA GENERAL,
Visto el artículo 2, párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el cual se creó la Organización
Internacional de la Viña y el Vino,
A propuesta de la Subcomisión de los métodos de análisis y de apreciación de los vinos,
DECIDE completar el Anexo A del Compendio de los métodos internacionales de análisis de los vinos
y de los mostos con el método de tipo IV siguiente:
DETERMINACIÓN DE LAS MATERIAS PROTEICAS VEGETALES EN LOS VINOS
Y EN LOS MOSTOS
La técnica presentada a continuación permite determinar la cantidad
eventualmente quedan en las bebidas tratadas, después del trasiego.
de
proteínas
que
1 PRINCIPIO
Las proteínas del mosto o del vino se precipitan con ácido tricloroacético, a continuación se
separan por electoforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS). la
adición de azul de Coomassie colora las proteínas. La intensidad de la coloración permite determinar
el contenido de proteína por medio de una curva patrón previamente realizada con soluciones de
proteínas de concentración conocida. El poder antigénico de los mostos y de los vinos tratados se
obtiene a través de un test de inmunoblotting.
2 PROTOCOLO
2.1 Concentración de las proteínas por precipitación con ácido tricloroacético (TCA)
2.1.1 Reactivos
2.1.1.1 Acido tricloroacético puro
2.1.1.2 TCA a 0,1 % preparado a partir de 2.1.1.1 : 0,1 g en 100 ml de agua
2.1.1.3 TCA a 100% preparado a partir de 2.1.1.1 : 100 g en 100 ml de agua
2.1.1.4 Hidróxido de sodio 0,5 M
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2.1.1.5 Tampón Tris/HCl 0,25 M pH = 6,8
Se disuelven en 300 ml de agua destilada 30,27 g de Tris-(hidroximetil)aminometano, El pH se
ajusta a 6,8 con ácido clorhídrico concentrado para análisis. Se completa el volumen a 1 l con agua
destilada. El tampón se conserva a 4°C.
2.1.1.6 Glicerol puro
2.1.1.7 Dodecilsulfato de sodio (SDS) puro
2.1.1.8 2 Mercaptoetanol puro
2.1.1.9 Solución tampón para las muestras
Tampón Tris/HCl 0,25 M, pH=6,8 (2.1.1.5) ; con 7,5 % de glicerol puro (2.1.1.6); 2 % de dodecil
sulfato de sodio (SDS) (2.1.1.7) y 5 % de 2-mercaptoetanol puro (2.1.1.8). Los porcentajes de los
diferentes reactivos corresponden a la concentración final en la solución tampón.
2.1.2 Procedimiento
En tubos de centrifugar de 50 ml se ponen sucesivamente 3 ml de ácido tricloroacético de 100%
(2.1.1.3) y 24 ml de vino o de mosto (tratado o no tratado). La concentración final de TCA en la
muestra es de ≈11 %.
Se mantienen las muestras 30 minutos a 4°C, y se centrifugan a 10.000rpm durante 30
minutos a la misma temperatura. El precipitado se lava con una solución acuosa de TCA de 0,1 %
(2.1.1.2), se centrifugan nuevamente y se ponen en suspensión en 0,24 ml de una mezcla (1:1,
v/v) de hidróxido de sodio 0,5 M (2.1.1.4) y de solución tampón para las muestras (2.1.1.9). Las
muestras se calientan a 100°C en baño de agua durante 10 minutos.
2.2 Electroforesis en Gel de Poliacrilamida en presencia de SDS
2.2.1 Reactivos
2.2.1.1 Tampón Tris/HCl 1,5 M pH=8,8
Se disuelven en 300 ml de agua destilada 181,6 g de Tris-(hidroximetil)aminometano. El pH
se ajusta a 8,8 con ácido clorhídrico concentrado para análisis. El volumen se completa a 1 l con
agua destilada. El tampón se conserva a 4°C.
2.2.1.2 Mezcla acrilamida (30 %)–bis-acrilamida (0.8 %)–glicerol (75 %)
Agregar lentamente 300 g de acrilamida y 8 g de bis-acrilamida a 600 ml de una solución de
glicerol de 75 %. Después de la disolución, ajustar el volumen a 1 l con glicerol de 75%. La mezcla
se conserva en la oscuridad y a temperatura ambiente.
2.2.1.3 SDS al 10 %
10 g de SDS se disuelven en 100 ml de agua destilada. Conservar a temperatura ambiente.
2.2.1.4 N,N,N’,N’ –tetrametiléndiamina (TEMED) para electroforesis
2.2.1.5 Persulfato de amonio al 10 %
1 g de persulfato de amonio se disuelve en 10 ml de agua destilada. Conservar a 4°C.
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2.2.1.6 Solución de azul de bromofenol al 0,1 %
10 mg de azul de bromofenol para electroforesis se disuelven en 10 ml de agua destilada.
-
2.2.1.7 Solución para gel de separación (15 % de acrilamida)
Debe prepararse en el momento de su utilización:
1,5 ml de Tris/HCl 1,5 M, pH=8,8 (2.2.1.1),
1,5 ml de agua destilada,
3 ml de mezcla acrilamida glicerol (2.2.1.2),
50 µl de SDS al 10 % (2.2.1.3),
10 µL de N,N,N’,N’-tetrametiléndiamina (TEMED) para electroforesis (2.2.1.4)
20 µl de persulfato de amonio (2.2.1.5)
1 gota de azul de bromofenol (2.2.1.6)
2.2.1.8 Tampón Tris/HCl 0,5 M pH=6,8
Se disuelven en 400 ml de agua destilada 60,4 g de Tris-(hidroximetil)aminometano. El pH se
ajusta a 6,8 con ácido clorhídrico concentrado para análisis. El volumen se completa a 1 l con agua
destilada. El tampón debe conservarse a 4°C.
2.2.1.9 Mezcla acrilamida (30 %)–bis-acrilamida (0.8 %)–agua
Agregar lentamente 300 g de acrilamida y 8 g de bis-acrilamida a 300 ml de agua. Una vez
disuelto, ajustar el volumen a 1 l con agua destilada. La mezcla debe conservarse al abrigo de la luz
y a temperatura ambiente.
-
2.2.1.10 Gel de concentración de 3,5% de acrilamida
Debe prepararse en el momento de su utilización :
0,5 ml de Tris/HCl 0,5 M pH=6,8 (2.2.1.8),
1,27 ml de agua destilada,
0,23 ml de la mezcla acrilamida agua (2.2.1.9),
20 µl de SDS 10 % (2.2.1.3),
5 µl de N,N,N’,N’ tetrametiléndiamina (TEMED) para electroforesis (2.1.1.4)
25 µL de persulfato de amonio (2.2.1.5),
1 gota de azul de bromofenol (2.2.1.6).
2.2.1.11 Tampón de migración
Se disuelven en 600 ml de agua destilada 30,27 g de Tris-(hidroximetil)aminometano, 144 g
de glicina y 10 g de SDS. El pH se ajusta a 8,8 con ácido clorhídrico concentrado para análisis. El
volumen se completa a 1 l con agua destilada. El tampón se conserva a 4°C. En el momento de su
utilización, la solución se diluye al 1/10 con agua destilada.
2.2.1.12 Solución de coloración
Se mezclan sucesivamente :
- 16 ml de azul de Coomassie Brillante G-250 ultrapuro al 5 % (5 g en 100 ml de agua destilada),
- 784 ml de una solución de 100 g de sulfato de amonio y 13,8 ml de ácido ortofosfórico de 85 %
para análisis, en 1 l de agua destilada.
- y 200 ml de etanol absoluto para análisis.
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2.2.1.13 Solución de decoloración
Se mezclan sucesivamente:
- 100 ml de ácido acético glacial 100 % para análisis,
- 200 ml de etanol absoluto para análisis.
- 700 ml de agua destilada.
2.2.2 Procedimiento
La solución para el gel de separación (2.2.1.7) se vierte entre dos láminas de vidrio de un
tamaño de 7 x 10 cm. La superficie superior del gel se nivela añadiendo 2 gotas de agua destilada.
Después de la polimerización del gel de separación y eliminación del agua, 1 ml de gel de
concentración (2.2.1.10) se vierte sobre el gel de separación con una pipeta de 1 ml. A continuación
se coloca el peine para formar los pocillos donde se aplican las muestras.
Las muestras patrón se preparan en una mezcla (1:1, v/v) de hidróxido de sodio 0,5 M
(2.1.1.4) y de solución tampón (2.1.1.9) de manera tal que la concentración de proteínas esté
comprendida entre 5 µg/ml y 50 µg/ml.
En los pocillos se introducen de 20 a 30µl de muestras y de .
Después de la migración (bajo una tensión constante de 90 V) a temperatura ambiente
durante alrededor de 6 horas, los geles se retiran del molde. Inmediatamente se sumergen en 50 ml
deuna solución acuosa de TCA al 20% durante 30 minutos, y a continuación en 50ml de solución de
coloración (2.2.1.12).
Las proteínas aparecen en forma de bandas coloreadas en azul. El gel se decolora
inmediatamente con 50 ml de solución de decoloración (2.2.1.13). Cuando el fondo del gel es
transparente, se coloca en agua destilada para su conservación.
3 ANALISIS CUANTITATIVO
La intensidad de cada mancha se evalua con un scanner para gel equipado con un programa
de analizador de imagen. La cantidad de proteína presente en el gel se determina por el cálculo de
la densidad media de los pixels de la banda y por integración del ancho de la banda. El contenido de
proteína de cada muestra se determina por comparación con una curva patrón. Los puntos de esta
curva se obtienen trazando los valores de concentraciones conocidas de proteína vegetal dispuesta
sobre el gel en función de la superficie de integración correspondiente.
El límite de cuantificación se sitúa a 0,030 ppm para los guisantes y en 0,36 ppm para el gluten, en
un medio concentrado 100 veces. El coeficiente de variación es siempre inferior a 5 %.
4 DETERMINACIÓN POR IMMUNOBLOTTING DEL PODER ANTIGENICO DE LOS VINOS Y DE
LOS MOSTOS TRATADOS
Se evalúa luego la capacidad antigénica de las proteínas eventualmente presentes en las
bebidas tratadas, después del trasiego.
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4.1 PRINCIPIO
Después de la electroforesis, los geles se someten a la técnica de immunoblotting. Las
proteínas se transfieren sobre una membrana y se adsorben. Un complejo antígeno-anticuerpos se
forma por la unión de anticuerpos anti-proteína vegetal (por ejemplo anticuerpos anti–gliadinas si la
proteína vegetal es de gluten). El sistema se revela por la unión de anticuerpos dirigidos contra los
anticuerpos anti-proteína vegetal acoplados a la fosfatasa. En presencia del sustrato cromógeno de
la enzima, se desarrollará una coloración cuya intensidad será proporcional a la cantidad de
inmunocomplejos. Esta inmunoreactividad se cuantificará a partir de una curva patrón realizada con
soluciones de proteína vegetal de concentración conocida.
4.2 PROTOCOLO
4.2.1: Reactivos
4.2.1.1 Tampón de transferencia
3,03 g de Tris, 14,4 g de glicina (R), 200 ml de metanol (R), se mezclan y se completan a 1 l
con agua destilada.
4.2.1.2 Gelatina al 1 %
Se disuelven en 800 ml de agua destilada 8,77 g de cloruro de sodio (R), 18,6 g de ácido
etiléndiaminotetraacético (EDTA) para análisis, 6,06 g de Tris y 0,5 ml de Triton X. El pH se ajusta a
7,5 con ácido clorhídrico concentrado para análisis. Se añaden 10 g de gelatina y el volumen se
completa a 1 l,
4.2.1.3 Gelatina 0,25 %
Se disuelven en 800 ml de agua destilada 8,77 g de cloruro de sodio (R), 18,6 g de ácido
etiléndiaminotetraacético (EDTA) para análisis, 6,06 g de Tris y 0,5 ml de Triton X. El pH se ajusta a
7,5 con ácido clorhídrico concentrado para análisis. Se agregan 2,5 g de gelatina y el volumen se
completa a 1 l.
4.2.1.4 Solución de anticuerpos policlonales (de comercio o descrito en anexo)
- 10 µl de anticuerpos policlonales anti-proteína vegetal
- c.s.p. en 10 ml de gelatina al 0,25 % (4.2.1.3).
4.2.1.5 T ampón TBS
Se disuelven 29,22 g de cloruro de sodio para análisis y 2.42 g de tris en 1 l de agua destilada.
4.2.1.6 Tampón fosfatasa alcalina
Se disuelven en 800 ml de agua destilada 5,84 g de cloruro de sodio (R), 1,02 g de cloruro
de magnesio (R) y 12,11 g de Tris. El pH se ajusta a 9,5 con acido chlorhydrico concentrado y el
volumen se completa a 1 l.
4.2.1.7 Revelador
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Se disuelven en 100 ml
de tampón fosfatasa alcalina (4.2.1.6)15 g de fosfato de
bromocloroindol (BICP), 30 g de azul de nitrotetrazolio (NBT).
4.2.2 Procedimiento
Después de la electroforesis, las proteínas se transfieren del gel a una membrana de
difluoruro de polivinilideno por elución electroforética : 16 horas a 4°C bajo 30 V en el tampón de
transferencia (4.2.1.1). Las membranas se saturan con gelatina al 1 % (4.2.1.2) y lavadas 3 veces
con gelatina al 0,25 % (4.2.1.3). La gelatina se fija en los sitios libres e impide la adsorción no
específica de los reactivos inmunológicos. La membrana se sumerge en 10 ml de la solución de
anticuerpos policlonales anti-proteína vegetal (4.2.1.4). En el caso del gluten, los anticuerpos antigliadinas provienen del comercio. Los otros tipos de anticuerpos se preparan según el método que
figura en el anexo. El complejo antígeno IgG se detecta por adición del agregado de 10 µl de
anticuerpos anti-IgG de conejo marcados con fosfatasa alcalina. Las membranas se lavan dos veces
con la gelatina de 0,25 % (4.2.1.3) y una vez con el tampón TBS (4.2.1.5). Después de incubación
en el revelador (4.2.1.7), se forma un precipitado de color violeta fuerte en el lugar en el que la
enzima se fija.
4.3 ANALISIS CUANTITATIVO
Para calcular la cantidad de inmunoreactividad residual de un vino comercializado, se prepara
una curva patrón : concentraciones conocidas de proteína vegetal depositadas sobre el gel (y
transferidas a la membrana) en relación a las superficies obtenidas por integración de la intensidad
de las manchas correspondientes a la formación de los inmunocomplejos. El análisis se realiza con el
mismo equipo que el utilizado para analizar los geles de electroforesis.
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ANEXO
Producción de los anticuerpos policlonales anti-guisantes
Los anticuerpos policlonales anti-guisante necesarios para la determinación de la capacidad
antigénica de las proteínas de guisantes en los vinos y en los mostos tratados se preparan en los
animales.
1 PRINCIPIO
Los sueros que contienen los anticuerpos policlonales se obtienen en el conejo New Zealand
después de inyección intradérmica del antígeno;
2 PROTOCOLO
2.1 Reactivos
2.1.1 Tampón fosfato PBS pH=7.4: Se disuelven en 300 ml de agua destilada 8 g de NaCl,
200 mg de KCl, 1,73 de Na2HPO4 H2O y 200 mg de KH2PO4. Se ajusta el pH a 7,4 con soda 1M. El
volumen se completa a 1 l con agua destilada.
2.1.2 Antígenos
Se disuelven en 5 ml de tampón fosfato PBS (2.1.1)10 mg de proteína de guisantes. La
solución se filtra inmediatamente en forma estéril con filtros de 0,2 µm y se conserva a -20°C hasta
el momento de la inmunización.
2.2 Procedimiento
1 ml de solución 2.1.2 se mezcla con 1 ml de coadyuvante completo de Freund. 1 ml de esta
mezcla se inyecta intradérmicamente en un conejo New Zealand de un peso de alrededor de 3 kg.
Esta inyección se repite a los 15, 30 y 45 días.
60 días después de la primera inyección, se extraen 100 µl de sangre a nivel de la vena
auricular y se analiza su capacidad antigénica. Esta evaluación se realiza por immunoblotting como
se describe en el capítulo 4.2 del método de análisis a partir de un gel sobre el cual la proteína de
guisante ha migrado.
Después de la verificación de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo, se extraen 15
ml de sangre a nivel de la vena auricular. La sangre se mantiene a 37°C durante 30 minutos. El
suero que contiene los anticuerpos policlonales anti-guisante se extrae después de la centrifugación
de la sangre a 3000 rpm durante 5 minutos.
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