instituto tecnológico de los mochis tesis “análisis de la

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE LOS MOCHIS
TESIS
“ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFENRENCIAL DE GENES
DURANTE LA FORMACIÓN DE BULBILOS EN Agave tequilana POR
MEDIO DE cDNA-AFLP”
PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOQUÍMICO
PRESENTA
MIRNA ISABEL OCHOA LUGO
Febrero de 2007
1
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Genética Molecular del
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico
Nacional Unidad Irapuato, bajo la dirección de la Dra. June K. Simpson
Williamson.
2
ÍNDICE
Página
I.- Resumen
5
II.- Introducción
7
III.- Antecedentes
10
III.1 Descripción del género Agave.
10
III.2 Descripción botánica de Agave tequilana Weber var. Azul
10
III.3 Descripción geográfica
11
III.4 Norma Oficial para la protección de cultivo de Agave y la calidad del tequila
12
III.5 Ubicación taxonómica.
13
III.6 Metabolismo de ácido crasuláceas
14
III.7 Nutrición
14
III.8 Floración de Agave tequilana
15
III.9 Fisiología y reproducción
16
III.9.1 Reproducción sexual
16
III.9.2 Reproducción asexual
17
III.9.2.1 Hijuelos de rizoma
17
III.9.2.2 Brotes basales o hijuelos
17
III.9.2.3 Plántulas pequeñas conocidas como bulbilos
17
III.9.2.3.1 Propagación de bulbilos
19
III.10 Aprovechamiento y Utilidad de Agave
20
III.11 TECNICAS MOLECULARES
22
III.11.1 Transcripción
22
III.11.1.1 Transcripción en eucariotas
23
III.11.2 cDNA-AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando DNA
complementario).
25
III.11.3 Técnica de Hibridación de Microarreglos (microarrays)
27
III.11.4 Técnica de despliegue diferencial
27
IV. JUSTIFICACIÓN
29
V. OBJETIVOS
30
V.1 OBJETIVO GENERAL
30
V.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
30
VI. ESTRATEGIA METODOLÓGICA
31
VI.1 Preparación del templado de cDNA
31
VI.2 cDNA-AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando
DNA complementario).
32
3
VII. MATERIALES Y MÉTODOS
35
VII.1 MATERIALES
35
VII.2 MÉTODOS
37
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIONES
48
IX. CONCLUSIONES
59
X. PERSPECTIVAS
60
XI. BIBLIOGRAFÍA
61
4
I. RESUMEN
El cultivo de Agave tequilana Weber var. Azul es económicamente importante en
México por ser el más apropiado para la producción de tequila. En campo, estas plantas
pueden propagarse por dos mecanismos: a) reproducción sexual (por semillas) y b)
reproducción asexual (hijuelos de rizoma, bulbilos). Los bulbilos son pequeños brotes
aereolados formando pequeñas rosetas en las axilas de los bractéolos de la inflorescencia. Los
bulbilos son plantados algunas veces para propagar especies como A. tequilana, A.
fourcroydes, A. sisalana, A. angustifolia y muchos otros.
En el presente estudio se realizó un análisis de la expresión diferencial de genes en las
diferentes etapas de la formación de bulbilos de Agave tequilana, mediante la técnica de
cDNA-AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando DNA
complementario). Las técnicas para huellas genéticas de RNA entre las que se encuentra la de
cDNA-AFLP han sido desarrolladas permitiendo la detección de fragmentos de DNA
derivados desde RNA usando síntesis de cDNA y una amplificación subsecuente por PCR. En
el desarrollo de este proyecto se monitorearon las plantas de Agave tequilana, impidiendo por
medio del corte de botones florales su fructificación y por lo tanto induciendo la formación de
bulbilos, se tomaron muestras en seis diferentes etapas de su formación describiéndose como
T0, T1, T2, T3, T4, T5, correspondientes a los 0, 14, 28, 30, 32 y 35 días respectivamente,
después del corte de los botones. A partir de estas muestras se llevo a cabo el aislamiento de
RNA total y mRNA, obteniéndose de muy buena calidad y en cantidad suficiente para la
preparación del templado de cDNA, obteniéndose una concentración promedio del templado
de cDNA de 138.51 ng/ μL. La alta calidad del templado cDNA fue importante para obtener
resultados de cDNA-AFLP reproducibles. En esta técnica se realizaron 12 amplificaciones
selectivas para cada etapa usando 12 combinaciones de primers (conteniendo 2 nucleótidos
selectivos), obteniéndose patrones de bandeo desde 30 a 650 Pb, observándose en este rango
un promedio de 116 bandas, para cada una de las combinaciones. En estas 12 combinaciones
se visualizan 912 patrones de expresión diferencial y 440 patrones de expresión constitutiva.
En estos patrones de expresión diferencial se observaron varios transcritos de expresión muy
notable, tal es el caso de transcritos que se expresan solo en una etapa y patrones de expresión
en los que se expresa en todas las etapas excepto en una de ellas. Los transcritos que se
expresan solo en las etapas T3 y T4, podrían ser de mayor interés, ya que debido a lo
observado en el estereo-microscopio, en la etapa T3 se presenta hinchamiento debajo de los
bractéolos y en la etapa T4 el hinchamiento es más visible y empiezan a sobresalir los
bulbilos. Algunos de los transcritos mas notables para la etapa T3, se observaron en las
5
combinaciones T-AG, M-AC localizado a 123.9 Pb; T-AG, M-CT localizado a 400.3 Pb; TCA, M-AG se localizaron dos transcritos a 159.1 Pb y 206.3 Pb. Sin embargo, la expresión
del transcrito que se expresa solo en la etapa T4, es demasiado notable, observándose esto en
11 de las 12 combinaciones, en las combinaciones T-GA, M-AC se localizaron dos transcritos
T4 a 327.4 y a 339.9 Pb; en T-GA, M-AG se localizo a 451.5 Pb; y en T-AC, M-AC se
localizo a 596.1, en estas combinaciones el transcrito o banda se podría extraer para
identificar por secuenciación a que gen pertenece ya que se encuentra muy separada de las
demás.
Se han observado también patrones de expresión diferencial de manera ascendente, lo que nos
permite suponer que podrían ser transcritos involucrados en el crecimiento de meristemos
vegetativos; y patrones de expresión diferencial de manera descendente de los cuales podría
suponerse que son transcritos de identidad de meristemo floral que se reprimen por la acción
de genes de meristemos vegetativos. En la combinación T-AG, M-AC se localizan algunos
patrones de manera ascendente a 173.8, 241.3 y 270.6 Pb; y en la combinación T-TC, M-CA
se localiza un patrón diferencial de manera descendente 503.0 Pb.
Este es el primer estudio que reporta un análisis de expresión diferencial de genes, en la
formación de bulbilos en A. tequilana.
6
II. INTRODUCCIÓN
Los agaves son plantas representativas de México, ya que es escenario del origen y
evolución del maguey, y poseen gran importancia en el país. La relación hombre-agave se ha
convertido en una simbiosis, describiendo ampliamente los usos más importantes del género
como son: alimento, bebidas (pulque, aguamiel, mezcal, tequila), fibras, medicina tradicional
y otros (Gentry, 1982).
La familia Agavaceae, cuenta con 9 géneros y 330 especies, es endémica de América;
se distribuye desde los límites entre Canadá y Estados Unidos hasta Bolivia, incluyendo las
islas del Caribe. El centro de mayor riqueza y diversidad se encuentra en México, donde se
localizan 251 especies, 76% de las descritas en el mundo, de las cuales 177 son endémicas, lo
que corresponde a 70%. Con 58 especies, Oaxaca es el estado más rico en agaváceas de
México. Los miembros de la familia crecen desde el nivel del mar hasta 3000 m, siendo
mayor su presencia entre 1500 y 2000 m (García-Mendoza, 2004).
La palabra Agave cuyo nombre viene del griego “noble” y del latín “admirable”, fue
descrita inicialmente por Linneo en 1753 (Gentry, 1982).
Son plantas adaptadas a condiciones de aridez, raíces someras y ramificadas, cutícula
gruesa, suculencia, estomas hundidos, metabolismo fotosintético y metabolismo ácido
crasuláceo (CAM), lo que permite a sus células la capacidad de fijar cantidades significativas
de CO2 en la oscuridad, lo que conduce a la síntesis y acumulación de ácido málico en la
vacuola (Nobel 1994). Los agaves son monocárpicos, semélparos, esto es, que solo tienen una
floración al cabo de la cual la planta muere (Gentry, 1978).
El Agave tequilana Weber variedad azul es la materia prima favorita para la
elaboración del tequila por sus cualidades, como la concentración de azucares y lo prolífico en
sus hijuelos de rizoma. Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-006-SCFI-2005, que
establece que solo A. tequilana var. Azul debe ser usada para este fin. Además señala como
territorio de denominación de origen, el comprendido por el estado de Jalisco, y algunos
municipios de los estados de Guanajuato, Michoacán, Nayarit y Tamaulipas (Diario Oficial,
2006).
En el inventario general de agave realizado por el Consejo Regulador del Tequila,
durante el 2005, se cuantificaron 22 137 158 plantas en el Territorio de Denominación de
Origen (TDO). Los trabajadores que dependen del cultivo son más de 36 mil familias en el
campo, mas de 5 000 obreros, 3 000 empleados y 1 000 técnicos (empleos directos), y un
7
sinnúmero de empleos indirectos. La planta de agave tiene un ciclo de vida de 7 a 12 años,
resultando una inversión muy importante y costosa para la cadena productiva agave-tequila
(Control Regulador del Tequila 2006).
En agave la movilización de reservas metabólicas (azucares) almacenados en la base
de la roseta o piña parece ser un proceso fisiológico irreversible. Una vez que el desarrollo del
eje floral ha sido disparado y las reservas basales empiezan a ser hidrolizadas y translocadas,
el esfuerzo reproductivo final y la resultante senescencia de la roseta no puede ser revertida
(Howell y Roth 1981). Aunque en varios casos daños severos en la inflorescencia puede
prolongar la vida de la planta por algún tiempo (Nobel 1988).
Estas plantas pueden propagarse por dos mecanismos: a) reproducción sexual (por
semillas) y b) reproducción asexual (multiplicación vegetativa).
Hay tres mecanismos de reproducción asexual existentes en agave:
a) hijuelos de rizoma que son tallos subterráneos generados de la base de la roseta y
emergen a una distancia de la planta madre, es la forma mas común de propagación (Nobel
1977, 1988; Gentry 1982; Barrientos et al. 1985);
b) brotes basales o hijuelos que son ramificaciones de los meristemos axilares mas
bajos de la roseta, formando nuevas rosetas que emergen en la periferia de la planta madre y
producen raíces adventicias las cuales permiten su crecimiento independiente (Gómez-Pompa
1963; Gentry 1982; Lock 1985)
c) plántulas pequeñas conocidas como bulbilos; la mayoría desarrolladas de las yemas
axilares en los lados de los pedicelos cuando las flores se caen.
Los bulbilos son pequeños brotes aereoladas formando pequeñas rosetas en el
meristemo de la inflorescencia (Gentry 1982; Robert M., García 1985; Lock 1985; Nobel
1988).
Algunas especies de plantas de agave son observadas en el campo con las
inflorescencias cubiertas con bulbilos y con muy pocas o sin cápsulas con semillas. Por lo que
también, las plantas que producen un alto número de cápsulas, generalmente tiene pocos o no
tienen bulbilos. Los bulbilos son plantados algunas veces para propagar especies cultivadas
como A. tequilana (Robert and García 1985), A. fourcroydes (Gentry 1982) y A. sisalana
(Barrientos et al. 1985; Lock 1985; Nobel 1988).
La formación de bulbilos no es exclusiva de la familia Agavaceae, esta presente en
otras familias, especialmente en otras monocotiledóneas que son taxonómicamente
relacionadas con las Agaváceas. Los bulbilos se forman en estructuras florales, por lo que han
sido confundidas con semillas vivíparas (Gómez-Pompa 1963; Bell 1991). En el contexto de
esta frecuente confusión, Bell (1991) define la formación de bulbilos como vivíparos falsos.
8
El presente trabajo reporta la identificación de fragmentos diferenciales de cDNA
relacionados con las diferentes etapas de formación de bulbilos, como paso previo a la
determinación de genes involucrados en su formación, para posteriormente aislar y secuenciar
los fragmentos con patrón de expresión interesante e identificar su identidad por medio de la
comparación con bases de datos e ir entendiendo mejor las vías de reproducción de esta planta.
Recientemente, las técnicas para huellas genéticas de RNA han sido desarrolladas
permitiendo la detección de fragmentos de DNA derivados de RNA, usando síntesis de cDNA
y una amplificación subsecuente por PCR (Mc Clelland et al., 1995). La técnica de cDNAAFLP usa un protocolo de AFLP genómico estándar sobre un templado de cDNA para
obtener un análisis diferencial (Bachem C. B et al, 1996).
cDNA-AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando DNA
complementario) es una tecnología confiable y altamente aplicable para identificar genes
involucrados en el desarrollo, finalmente con esta técnica se muestra una verificación rápida y
simple en la identificación de bandas obtenidas. Existen otras técnicas que han sido
ampliamente usadas para clonar genes expresados diferencialmente como son: Despliegue
Diferencial, Hibridación sustractiva, fingerprinting de ARN con PCR usando iniciadores
arbitrarios (RAP-PCR), Análisis de Diferencias Representativas y Análisis Seriales de la
Expresión Diferencial (SAGE). En la actualidad, una técnica que ha acelerado enormemente
el análisis de cDNA es la técnica de Hibridación de Microarreglos, pero el costo de
adquisición de los equipos necesarios hace difícil su uso.
9
III. ANTECEDENTES
III.1 Descripción del género Agave.
La familia Agavaceae, cuenta con 9 géneros y 330 especies, es endémica de América;
se distribuye desde los límites entre Canadá y Estados Unidos hasta Bolivia, incluyendo las
islas del Caribe. El centro de origen y diversidad se encuentra en México, donde se localizan
251 especies, 76% de las descritas en el mundo, de las cuales 177 son endémicas, lo que
corresponde a 70%. Con 58 especies, Oaxaca es el estado más rico en agaváceas de México.
El crecimiento de miembros de esta familia se localizan desde el nivel del mar hasta 3000 m,
siendo mayor su presencia entre 1500 y 2000 m sobre el nivel del mar (García-Mendoza,
2004). La palabra Agave cuyo nombre viene del griego “noble” y del latín “admirable”, fue
descrito inicialmente por Linneo en 1753 (Gentry, 1982).
Entre las familias de monocotiledóneas incluidas en el orden Asparagales por
Dahlgren et al. (1985) y Kubitzki (1998) se encuentran las Agavaceae, estos constituyen una
de las 10 familias de monocotiledóneas con mayor riqueza de especies en el estado de Oaxaca
(García- Mendoza, 2000).
III.2 Descripción botánica de Agave tequilana Weber var. Azul
Agave tequilana Weber var. Azul es descrita como una planta suculenta, extendida
radialmente, con una altura de 1.2 a 1.8 m, con tallos gruesos y cortos de 30 a 50 cm de altura
en su madurez. Las hojas son de 90 a 120 cm de largo y de 8 a 12 cm de ancho, lanceoladas y
acuminadas, de fibras firmes, la mayoría de ellas rígidamente estiradas cóncavas, ascendiendo
a horizontal, donde lo mas ancho de las hojas se encuentra a la mitad; disminuyendo y
engrosando hacia la base, generalmente de azulado glauco a verde grisáceo, algunas veces con
zonas de coloración cruzada, con un margen recto a ondulado o pando; los dientes son de
color café claro a obscuro, generalmente regulares en tamaño y en pocos casos irregulares, en
su mayoría de 3 a 6 mm de largo a través de la parte media de la hoja, se encuentran
separados de 1 a 2 cm, raramente son remotos o mas largos; las espinas son generalmente
cortas, de 1 a 2 cm de longitud, rara vez son mas largas achatadas o surcada abiertamente
arriba, con base ancha, de color café obscuro, decurrente o no decurrente; la panícula tiene de
5 a 6 m de altura con gran densidad de ramas con 20 a 25 umbelas grandes difusas de flores
verdes con estambres rosados; las flores tienen de 68 a 75 mm de largo, con cuello corto no
constricto terminado ligeramente en punta sobre la base; el tubo floral es de 10 mm de
profundidad, de 12 mm de ancho, funeliforme y surcado; los tépalos son desiguales de 25 a 28
mm de longitud con 4 mm de ancho, lineares, erectos, pero rápidamente flojos en antesis,
10
tornándose en café y secos; los filamentos son de 45 a 50 mm de longitud doblados hacia
adentro contra el pistilo, instados a 7 y 5 mm arriba de la base del tubo; las anteras miden 25
mm de largo; el fruto es una cápsula ovada o brevemente cuspidada. (Gentry, 1982).
FIGURA 1. Fenotipo de Agave tequilana Weber Var. Azul
III.3 Descripción geográfica
México es el centro de origen del genero agave y su distribución se localiza
principalmente en las zonas áridas y semiáridas de México y Norteamérica; por el noroeste
hasta el estado de Utah y al noreste el de Maryland; al sur el limite conocido es Colombia
(Berger, 1915).
Actualmente, algunas especies han cobrado gran importancia al ser cultivadas para la
producción de destilados alcohólicos. El Agave tequilana Weber var. Azul es un cultivo
económicamente distinguible en México y es el más apropiado para la producción de tequila.
El agave tequilero se cultiva solo en regiones muy restringidas, establecidas como
territorios protegido por la Denominación de Origen del tequila.
El 9 de diciembre de 1974, se publicó en el "Diario Oficial" de la Federación la
resolución del 22 de noviembre de 1974 de la entonces Secretaría de Industria y Comercio,
por la cual se otorgó la protección a la denominación de origen tequila estableciendo un
territorio de denominación de origen, para esa bebida; habiendo sufrido modificaciones el 13
11
de octubre de 1977, el 3 de noviembre de 1999, y el 26 de junio de 2000, el TDO, a la fecha
actual, comprende 180 municipios:
• todos los municipios del Estado de Jalisco, es decir 124,
• 8 municipios de Nayarit,
• 7 municipios de Guanajuato,
• 30 municipios de Michoacán y
• 11 municipios de Tamaulipas
FIGURA 2. Denominación de Origen del Tequila
III.4 Norma Oficial para la protección de cultivo de Agave y la calidad del tequila
El 28 de octubre de 2005, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de
Seguridad al Usuario, Información Comercial y Prácticas de Comercio, aprobó por
unanimidad la norma referida; que la Ley Federal sobre Metrología y Normalización
establece que las normas oficiales mexicanas se constituyen como el instrumento idóneo para
la protección de los intereses del consumidor, se expide la siguiente:
Norma Oficial Mexicana NOM-006-SCFI-2005 Bebidas alcohólicas Tequila, el tequila se
define como sigue:
“Bebida alcohólica regional obtenida por destilación de mostos, preparados directa y
originalmente del material extraído, en las instalaciones de la fábrica de un Productor
Autorizado la cual debe estar ubicada en el territorio comprendido en la Declaración,
derivados de las cabezas de Agave tequilana Weber variedad Azul, previa o posteriormente
hidrolizadas o cocidas, y sometidos a fermentación alcohólica con levaduras, cultivadas o no,
siendo susceptibles los mostos de ser enriquecidos y mezclados conjuntamente en la
12
formulación con otros azúcares hasta en una proporción no mayor de 49% de azúcares
reductores totales expresados en unidades de masa, en los términos establecidos por esta
NOM y en la inteligencia que no están permitidas las mezclas en frío (Aguilar 2005).
III.5 Ubicación taxonómica.
Uno de los principales problemas en cuanto a taxonomía del género Agave es situarlo en la
familia a la que pertenece, ya que, aun cuando se clasifica en Agavaceae, existen referencias
bibliográficas que lo incluyen en otras familias. Hutchinson, en 1934 incluyó la familia
Agavaceae al genero Agave, los géneros que incluye esta familia pertenecían a las Liliaceae y
las Amarilidaceae (Granados, 1993). Algunos géneros importantes que Hutchinson incluyó
en esta nueva familia son: Agave, Hesperaloe, Yucca, Samuela, Dracaena, Nolina, Calibanus,
Dasylirion, Furcraea, Prochnyanthes y otros mas que suman en total 19 géneros para esta
familia. Por otro lado, Cronquist (1968) propone la unión de Amarylidaceae y Liliaceae en
una sola familia, manteniendo a Agavaceae como una familia aparte. Otra clasificación
propuesta es la de Takhtajan (1980), este autor reordena la familia Agavaceae, dejando solo 3
tribus: Hosteae, Yucceae y Agaveae. Con una visión un poco diferente, Dahlgren y Clifford
(1982) proponen una nueva clasificación: manteniendo a la familia Agavaceae, la dividen en
dos subfamilias: Yuccoideae y Agavaideae (Granados, 1993).
División
Angiospermae
Clase
Monocotiledoneae
Orden
Liliales
Otros 11 órdenes
Familia
Agavaceae
Otras 14 familias
Subfamilias
Agavoideae
Agaveae
Dicotiledoneae
Yuccoideae
Polyntheae
Nolineae
Dracaeneae
Yucceae
Formieae
Género
Agave
13
Subgénero
Littaea
Agave
CUADRO I. Relaciones taxonómicas de los Agaves dentro de las angiospermas
(Cronquist 1981).
III.6 Metabolismo de ácido crasuláceas
Las plantas de este tipo son plantas adaptadas a condiciones de aridez, raíces someras
y ramificadas, cutícula gruesa, suculencia, estomas hundidos, metabolismo fotosintético y
metabolismo ácido crasuláceo (CAM), lo que permite a sus células con cloroplastos la
capacidad de fijar cantidades significativas de CO2 en la oscuridad, lo que conduce a la
síntesis y acumulación de ácido málico en la vacuola (Nobel 1994).
Las plantas MAC son suculentas y están representadas en las familias Cactaceae,
Crassulaceae, Euphorbiaceae, Liliaceae, Agavaceae y Airoaceae; también incluye miembros
epífitos de las familias Orchidaceae y Bromeliaceae (Granados, 1993).
El CAM según Ting (1985), cumple los siguientes aspectos:
a) Fluctuación diurna de ácidos orgánicos;
b) Fluctuación en el almacén de carbohidratos, como son: almidón, poliglucanos o hexosas
solubles;
c) Alta actividad de la enzima PEP-carboxilasa y una descarboxilasa;
d) Plantas con células altamente vacuoladas y de gran capacidad de almacén, así como alto
contenido de cloroplastos en la célula;
e) Plantas suculentas con un gran porcentaje de clorénquima;
f) El intercambio de gases ocurre en la noche.
III.7 Nutrición
El buen desarrollo de una planta depende en gran parte de la cantidad de nutrimentos (macro
y micro) que existan en su cuerpo. El aporte de estos alimentos en su mayoría los toma del
suelo en forma de humus (restos de organismos aun no descompuestos) que constituyen una
reserva que se va agotando lentamente (Granados, 1993).
Nobel y Col (1983) en un trabajo con varias especies de cactáceas observaron que el
nitrógeno y el sodio son elementos indispensables en el MAC, ya que la síntesis de ácidos
orgánicos se incrementa.
En general, los agaves viven en suelos rocosos arcillosos y bien drenados; ricos en
nutrientes, especialmente nitrógeno, que parece ser el elemento mas limitante de la actividad
metabólica de algunos agaves. Los niveles de elementos en el suelo afectan la distribución en
14
sus hábitats nativos. Estas plantas son relativamente sensibles a la salinidad, sobre todo en
estado juvenil; pero no son muy sensibles a altas concentraciones de Ca ni a metales pesados
como el Cu, y el Zn. El pH óptimo es entre 5 y 8, fuera de este rango son muy sensibles
(Epstein, 1972).
III.8 Floración de Agave tequilana
La floración del agave se inicia con el cambio de la estructura foliar de la roseta, que se
extiende para captar más luz y además pierde turgencia por las perdidas de humedad. El brote
del quiote o eje floral es rodeado por hojas acintadas, que son mas largas que anchas, de color
verde pálido. Al terminar el crecimiento del quiote prosigue el desarrollo de los brazos o
pedúnculos, donde se diferencian los agrupamientos florales. Con la floración se consigue la
reproducción sexual y la formación de bulbilos (Valenzuela, 1997).
a)
b)
FIGURA 3. Floración de Agave tequilana. a) Eje floral o quiote, b) Agrupamientos florales.
Agave tequilana Weber var. Azul florece de los seis a los doce años de edad,
dependiendo del lugar donde se cultive y del manejo agronómico (Valenzuela, 1997).
III.9 Fisiología y reproducción
Una vez transcurrido el tiempo durante el cual la producción de salvia ha pasado de las hojas
al tallo, se inicia la formación del tallo floral en la parte central de la planta. Esto se lleva
acabo en la primera quincena del mes de febrero, el desarrollo del tallo floral tarda
aproximadamente 55 días, al terminar este se forman las yemas florales en la segunda
quincena de abril; posteriormente, la fructificación se efectúa los primeros quince días de
mayo. Cuando se presentan lluvias tempranas se acelera todo este proceso. Por otra parte, el
periodo de tiempo que tarda en realizarse la floración y la fructificación es similar para las
especies presentes en el área: A. tequilana, A. subtilis, y A. longisepala (Granados, 1981).
15
La estructura de esta planta esta conformada por hojas, raíz y el eje floral (en el cual se
desarrollan las flores). En agave la movilización de reservas metabólicas (azucares)
almacenados en la base de la roseta o piña parece ser un proceso fisiológico irreversible. Una
vez que el eje floral ha sido disparado y las reservas basales empiezan a ser hidrolizadas y
translocadas, el esfuerzo reproductivo final y la resultante senescencia de la roseta no puede
ser revertida (Howell y Roth 1981). Aunque en varios casos, daños severos en la
inflorescencia puede prolongar la vida de la planta por algún tiempo (Nobel 1988).
FIGURA 4. Reproducción de Agave (Arizaga, S., and E. Ezcurra 2002).
Estas plantas pueden propagarse por dos mecanismos: a) reproducción sexual (por
semillas) y b) reproducción asexual (multiplicación vegetativa).
III.9.1 Reproducción sexual
La reproducción sexual a través de semillas no es muy usual en el cultivo de Agave
tequilana Weber var. Azul ya que, la inflorescencia es eliminada para evitar la disminución en
el contenido de azúcares fermentables en el tallo. Por lo anterior, en cultivos comerciales es
propagado de manera asexual (Valenzuela, 1997). Aun cuando exista alta producción de
semillas en la reproducción sexual, debido a su gran depredación y también a que las
condiciones de germinación no son siempre muy adecuadas, su reproducción es
principalmente en forma asexual (Gentry, 1978). Debido al largo tiempo requerido y a los
cuidados que necesita (secado, selección de semilla, riego, etcétera), la reproducción por
semilla en este agave no se practica (Gonzatti, 1946).
16
a) Botones florales
b) Frutos
c) Cápsula de semillas
FIGURA 5. Reproducción sexual de Agave por semillas.
III.9.2 Reproducción asexual
Hay tres mecanismos de reproducción asexual existentes en agave:
III.9.2.1 Hijuelos de rizoma
Son tallos subterráneos generados de la base de la roseta y emergen junto de la planta madre y
son separados después de tres o cuatro años para su cultivo, es la forma mas común de
propagación. En general cada agave puede llegar a producir de 10 a 25 hijuelos de rizoma
durante su periodo de vida de 7 a 12 años (Nobel 1977, 1988; Gentry 1982; Barrientos et al.
1985).
FIGURA 6. Reproducción asexual de Agave por hijuelos de rizoma.
III.9.2.2 Brotes basales o hijuelos
Son ramificaciones de los meristemos axilares mas bajos de la roseta, formando nuevas
rosetas que emergen en la periferia de la planta madre y producen raíces adventicias las cuales
permiten su crecimiento independiente (Gómez-Pompa 1963; Gentry 1982; Lock 1985).
III.9.2.3 Plántulas pequeñas conocidas como bulbilos
La mayoría desarrolladas de las yemas axilares en los lados de los pedicelos cuando las flores
se caen, estas plántulas después de algún tiempo de su desarrollo se desprenden y caen al
suelo para desarrollar raíces.
Los bulbilos son pequeños brotes aereoladas formando pequeñas rosetas en el
meristemo de la inflorescencia (Gentry 1982; Robert y García 1985; Lock 1985; Nobel 1988).
17
FIGURA 7. Agave tequilana Weber Var. Azul con bulbilos en el meristemo de la inflorescencia.
a) Botones florales
b) Tallos florales sin botones
c) Bulbilos
FIGURA 8. Reproducción asexual de Agave por bulbilos.
Los bulbilos ocurren en estructuras florales, por lo que han sido confundidas con
semillas vivíparas (Gómez-Pompa 1963; Bell 1991). En el contexto de esta frecuente
confusión, Bell (1991) define la formación de bulbilos como vivíparos falsos.
Algunas especies de agave son observadas en el campo con las inflorescencias
cubiertas con bulbilos y con muy pocas o sin cápsulas con semillas. Por lo que también, las
plantas que producen un alto número de cápsulas, generalmente tiene pocos o no tienen
bulbilos. La formación de bulbilos no es exclusiva de la familia Agavaceae, también esta
presente
en
otras
familias,
especialmente
en
otras
monocotiledóneas
que
son
taxonómicamente relacionadas con la Agavaceae (CUADRO 2).
18
CUADRO 2. Especies que forman bulbilos de diferentes familias de plantas.
(Arizaga, S., and E. Ezcurra 1995).
III.9.2.3.1 Propagación de bulbilos
En huerto familiar. Sé efectúa en cuanto los bulbilos empiezan a desprenderse de la
inflorescencia, se dejan secar de 2 a 3 días y se insertan en pequeños agujeros que pueden o
no estar alineados, con distancia de 20 cm entre cada planta.
En viveros. Generalmente los establecen personas con grandes extensiones de terreno
disponibles para el cultivo de esta planta.
Se recolectan los bulbilos crecidos para sembrarlos durante el periodo de mayo-junio, antes de
la época de lluvias (Gómez Lavanatt, 1984).
19
FIGURA 9. Crecimiento de los bulbilos.
CUADRO 3. Formas de propagación de diferentes especies del género Agave
(Arizaga, S., and E. Ezcurra 2002).
Como se muestra en el CUADRO 3, la producción de bulbilos en A. tequilana no se ha
reportado, sin embargo, se tiene conocimiento de comunicación personal que de cada planta
se obtiene un promedio de 3000 bulbilos, independientemente de que provengan de un vivero
o un huerto familiar.
III.10 Aprovechamiento y Utilidad de Agave
La utilización del agave es una muestra de la capacidad del hombre para sobrevivir en un
medio ambiente hostil y poco fértil, aprovechando al máximo sus recursos. Uno de los usos
ampliamente aplicable ha sido la elaboración del tequila mediante Agave tequilana Weber
variedad azul es la materia prima favorita por sus cualidades.
La siguiente lista nos ofrece una visión más amplia de los usos del agave en México.
20
Categoría
Alimento
Parte de la planta usada
Especies
Tallos, base de hojas, Agave
americana,
A.
angustiarum,
A.
pedúnculo floral, flores
angustifolia, A. applanata, A. chiapensis, A.
karwinskii, A. marmorata, A.potatorum, A.
rhodacantha, A. salmiana, A. seemanniana.
Furcraea longaeva.
Yucca elephantipes, Y. periculosa.
Bebidas
Jugos de tallos y hojas
Agave americana var. americana, A. americana
fermentadas
var. oaxacensis, A. mapisaga, A. salmiana var.
(aguamiel
y
feroz, A. salmiana var. salmiana.
pulque)
Bebidas
Jugos de tallos y base de Agave americana var. americana, A. americana
destiladas
hojas cocidos
var. oaxacensis, A. angustifolia, A. convallis, A.
(mezcal)
karwinskii, A.marmorata, A.potatorum, A.
rhodacantha, A. seemanniana.
Medicina
Hojas: cutículas, jugos
Agave americana, A. angustiarum, A. marmorata,
A. potatorum.
Fibras
Hojas
Agave americana var. americana, A. americana
var. oaxacensis, A. angustiarum, Agave
angustifolia var.angustifolia, Agave angustifolia
var. Rubescens, A. convallis, A.horrida.
Furcraea longaeva.
Construcción
Pedúnculo floral, hojas
Agave americana, A. angustifolia, A. atrovirens,
A. marmorata, A. salmiana.
Yucca periculosa
Forraje
Inflorescencias, hojas
Ornato
Agave americana, A. angustifolia, A. atrovirens,
A. ghiesbreghtii, A. karwinskii, A. macroacantha,
A. rhodacantha, A.salmiana, A. Scaposa, A.
Stricta.
Furcraea longaeva, F. macdougallii.
Planta
completa, Agave americana ‘Marginata’, A. applanata,
inflorescencis
dasyliriodes, A. guiengola, A. isthmensis,
macroacantha, A. salmiana, A. stricta.
Beschorneria albiflora.
Furcraea longaeva, F. macdougallii.
Polianthes tuberosa.
Yucca elephantipes, Y. periculosa.
Sustituto
del Rizoma, restos de fibras Furcraea longaeva, F. macdougallii.
jabón
de hojas
Manfreda hauniensis.
Ceremonial
Inflorescencias
Polinthes tuberosa.
Cercas vivas
Planta completa
Agave
americana,
A.
angustiarum,
angustifolia, A. ghiesbreghtii, A. karwinskii,
macroacantha, A. rhodacantha, A.salmiana,
Stricta.
Furcraea macdougallii.
Combustible
Planta completa seca
A.
A.
A.
A.
A.
Agave americana, A. angustifolia, A. karwinskii,
A. salmiana, A. stricta
21
CUADRO 4. Agaváceas: principales usos, órganos de la planta empleados y especies importantes para la
obtención de benefactores para el hombre (García-Mendoza, 2004).
El hombre ha considerado a las plantas de la familia Agavácea, desde hace por lo menos 9000
años, para satisfacer y complementar una serie de necesidades básicas: alimento, bebidas
(pulque, aguamiel, mezcal, tequila), forraje, fibras, medicamentos tradicionales y construcción
entre otros (Gentry, 1982). En la actualidad Agave tequilana Weber var. Azul es una de las
plantas de mayor importancia económica a nivel industrial en México, debido a que esta
especie es la única materia prima permitida para la producción de tequila 100% de Agave, los
trabajadores que dependen del cultivo son más de 36 mil familias en el campo, mas de 5 000
obreros, 3 000 empleados y 1 000 técnicos (empleos directos), y un sinnúmero de empleos
indirectos (Control Regulador del Tequila 2006). Esto nos demuestra cuan importante es
estudiar esta planta. Los estudios existentes en el género Agave han sido enfocados
principalmente a la composición bioquímica y la producción de azucares, por lo que ha sido
muy poco estudiado a nivel genómico, y en cuanto a sus formas de reproducción, los reportes
existentes son sólo de estudios morfológicos y fisiológicos, siendo de gran importancia el
inicio de análisis a nivel genómico, que permitan conocer y establecer la función de los genes
involucrados en las diferentes etapas de desarrollo, para posteriormente poder manipularlos.
Para esto es necesario tener conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en la
expresión génica.
III.11 TECNICAS MOLECULARES
III.11.1 Transcripción
La síntesis de RNA se produce por la incorporación de los ribonucleótidos que cataliza la
RNA polimerasa dependiente de DNA.
La cadena (+), que no es molde, tiene la misma secuencia de bases que el RNA producto de la
transcripción (excepto por la sustitución de U por T), por lo que también se denomina cadena
codificadora. La polimerización tiene lugar desde el extremo 5’ al extremo 3’ del gen debido
a que la cadena molde de DNA, también llamada cadena (-), y la molécula de RNA recién
sintetizadas son antiparalelas. Como se ha señalado, la transcripción genera varios tipos de
RNA, de los cuales los rRNA, tRNA y mRNA participan directamente en la síntesis de
proteínas.
22
DNA
(+)
5’___TTTGGACAACGTCCAGCGATC ___ 3’ cadena no molde
3’___AAACCTGTTGCAGGTCGCTAG ___ 5’ cadena molde
(-)
RNA
5’___UUUGGACAACGUCCAGCGAUC ___ 3’
Es el RNA más abundante en la célula, y puede purificarse fácilmente. Una célula típica
contiene 10 veces más RNA que DNA. El azúcar presente en el RNA es la ribosa. Esto indica
que en la posición 2' del anillo del azúcar hay un grupo hidroxilo (OH) libre. Por este motivo,
el RNA es químicamente inestable, de forma que en una disolución acuosa se hidroliza
fácilmente. En el RNA la base que se aparea con la A es U, a diferencia del DNA, en el cual
la A se aparea con T. En la mayor parte de los casos es un polímero monocatenario, pero en
ciertos casos puede presentar zonas en su secuencia con apareamientos intracatenarios
(Lodish, 2003).
III.11.1.1 Transcripción en eucariotas
La transcripción en eucariota esta regulada por un elevado numero de factores de
transcripción que deben ensamblarse de forma precisa antes de que pueda empezar la
transcripción. Sin embargo, el proceso eucariota posee las características singulares
siguientes:
II.11.1.1.1 Actividad de RNA polimerasa. Las eucariotas poseen tres RNA polimerasas
nucleares, cada una de las cuales se diferencia en la clase de RNA que sintetiza, la estructura
de subunidades y las cantidades relativas. La RNA polimerasa I, que se encuentra dentro del
nucléolo, transcribe los rRNA grandes. Los precursores de los mRNA y de la mayoría de los
snRNA se transcriben por la RNA polimerasa II, y la RNApolimerasa III es responsable de la
transcripción de los precursores de los tRNA y del rRNA 55S. Las enzimas eucariotas no
pueden iniciar por si mismas la transcripción de forma diferente a la RNA polimerasa
procariota. Antes de que pueda empezar la transcripción, deben unirse al promotor varios
factores de transcripción (Lodish, 2003).
23
FIGURA 10. Inicio de la transcripción en las eucariotas (Lodish 2003).
III.11.1.1.2 Promotores. Antes que la RNA polimerasa pueda comenzar a transcribir un gen,
los factores de transcripción deben ensamblarse en un complejo. El proceso comienza cuando
el TFIID se une a la secuencia TATA. El TFIID, que consta de TBP (una proteína de unión a
TATA) y varias proteínas asociadas, se une al DNA duplex en la secuencia TATA y lo
desenrolla. A continuación se une el TFIIB y, posteriormente, el TFIIE, el TFIIH y el TFIIJ.
El TFIIF se une directamente a la RNA polimerasa II. Debido a que las reacciones de
fosforilación que cataliza el TFIIH, la RNA polimerasa II se activa y comienza la
transcripción (Lodish, 2003).
III.11.1.1.3 Procesamiento. En el procesamiento posterior a la transcripción, los transcritos
pre-mRNA o hnRNA se asocian con alrededor de 20 clases de proteínas nucleares en
partículas ribonucleoprotéicas (hnRNP). Inmediatamente tras comenzar la transcripción de los
transcritos primarios, se produce una modificación del extremo 5´ que se denomina formación
de la caperuza. La estructura de la caperuza que consta de 7-metilguanosina ligada al mRNA
mediante un enlace trifosfato, protege al extremo 5´ de las exonucleasas e impulsa la
traducción por los ribosomas. Por razones desconocidas, la RNA polimerasa II transcribe
bastante mas allá del pasado el extremo funcional del transcrito primario. Tras finalizar la
transcripción, el transcrito se fracciona en un lugar específico cerca de la secuencia
AAUAAA. Inmediatamente después, se añaden entre 100 y 250 residuos de adenilato por la
poli A polimerasa al extremo 3´. Esta cola de poli A se cree que desempeña varias funciones,
24
entre las que se encuentran el amortiguamiento de la perdida de secuencias criticas del
extremo 3´ del mRNA mediante la acción de 3´,5´-exonucleasas y promoviendo la
exportación de los mRNA al citoplasma y su traducción por los ribosomas. Las reacciones de
procesamiento drásticas y complejas son las que eliminan los intrones. Durante este proceso,
denominado corte y empalme, cada intrón se corta en una configuración poco habitual que se
llama lazo. El corte y empalme tiene lugar en el espliceosoma, una estructura con varios
componentes (40-60 S) que contiene varios snRNA, así como varias proteínas (Lodish, 2003).
Recientemente, las técnicas para huellas genéticas de RNA han sido desarrolladas
permitiendo la detección de fragmentos de DNA derivados desde RNA, usando síntesis de
cDNA y una amplificación subsecuente por PCR (Mc Clelland et al., 1995).
Estas técnicas han sido ampliamente usadas para clonar genes expresados
diferencialmente como son: cDNA-AFLP, Despliegue Diferencial, Hibridación sustractiva,
fingerprinting de ARN con PCR usando iniciadores arbitrarios (RAP-PCR), Análisis de
Diferencias Representativas y Análisis Seriales de la Expresión Diferencial (SAGE). En la
actualidad, una técnica que ha acelerado enormemente el análisis de cDNA es la técnica de
Hibridación de Microarreglos (microarrays). A continuación se describen tres de estas
técnicas más usuales:
III.11.2 cDNA-AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando
DNA complementario).
Esta técnica de cDNA-AFLP usa un protocolo de AFLP genómico estándar sobre un
templado de cDNA para obtener un análisis diferencial abierto (Bachem C. B et al, 1996). Es
una tecnología confiable y altamente aplicable para identificar genes regulados en el
desarrollo, finalmente con esta técnica se muestra una verificación rápida y simple en la
identificación de bandas obtenidas. Este método consiste en:
- El aislamiento de RNA total eucariótico, que puede ser de plantas y animales.
- La purificación y aislamiento de mRNA a partir de RNA total.
- Síntesis cDNA. Una vez aislado, el mRNA es convertido en DNA monocatenario mediante
la enzima transcriptasa reversa y luego se sintetiza una cadena estable de DNA de doble
cadena mediante la enzima DNA polimerasa. Este DNA es llamado DNA complementario
(cDNA) porque la primera de las hebras es complementaria al mRNA del cual fue producido.
Se produce cDNA porque es un compuesto mucho más estable que el mRNA y porque al ser
25
obtenido a partir de un mRNA (en el cual no hay regiones no codificantes) representa
únicamente la secuencia de DNA expresada.
Después de la preparación de doble cadena del templado cDNA, hay cinco pasos básicos:
1. Digestión Restricción del templado cDNA con enzimas Taql y Msel para generar
fragmentos dentro de un rango de tamaños variables.
2. Ligación de Adaptadores donde los adaptadores conocidos son ligados en los
extremos de los fragmentos de cDNA producidos durante digestión restricción.
3. Pre-Amplificación con primers
complementarios a las secuencias de los
adaptadores para amplificar los fragmentos de cDNA.
4. Amplificación Selectiva el uso de primers conteniendo 2 nucleótidos extras para el
extremo 3’ de los primers de preamplificación, permite la amplificación de sólo un grupo de
fragmentos de restricción.
5. Electroforesis Los fragmentos amplificados son posteriormente separados en un gel
de poliacrilamida desnaturalizante y visualizados.
FIGURA 11: Protocolo cDNA-AFLP
Las ventajas del uso de la tecnología de cDNA-AFLP son:
a) No se requiere información previa de secuencia del genoma;
26
b) Se puede estudiar una fracción muy grande de todos los genes expresados.
c) Es una técnica muy sensible que permite la detección de transcritos de baja abundancia.
d) Permite la identificación de genes novedosos y proporciona perfiles de expresión
cuantitativa (Pessino, 2006).
III.11.3 Técnica de Hibridación de Microarreglos (microarrays)
Los microarreglos de ADN son una herramienta que permite realizar análisis genéticos
diversos basados en la miniaturización de procesos biológicos. El funcionamiento de los
microarreglos de expresión se basa en la capacidad de las moléculas complementarias de
ADN de hibridar entre sí. Pequeñas cantidades de ADN, correspondientes a diversos genes
cuya expresión se desea medir, son depositadas en una base de cristal. Para ello se utilizan
robots de precisión que usan unas agujas especiales para obtener las moléculas de sus
recipientes y depositarlas en las coordenadas adecuadas denominadas dianas. En un
microarreglo típico, una superficie de 2 x 2 cm puede contener más de 10.000 dianas en forma
de pequeños puntos separados adecuadamente. De las células que queramos medir su
expresión obtendremos una muestra de ARN que se convertirá en ADN complementario
(ADNc) y se marcará con una molécula fluorescente. A esta muestra marcada la
denominaremos sonda y se enfrentará a las dianas del microarreglo. Cada molécula de ADNc
marcada de la sonda se moverá por difusión hacia la diana que contenga su molécula
complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada allí. Después de un tiempo para que
la mayoría de las cadenas complementarias hibriden, el microarreglo y se lava y se procede a
hacer una medición relativa de la cantidad de ADN de la sonda que ha quedado fijada en cada
diana. El objetivo de un experimento de microarreglos es medir la cantidad de copias de cada
gen en un tejido en estudio y compararla con la de un tejido control (Moreno V. et al 2004).
III.11.4 Técnica de despliegue diferencial
La técnica de despliegue diferencial de mensajeros desarrollada por Pardee y Liang en
1992 la cual es una poderosa herramienta que permite identificar RNA que son expresados en
una población específica pero ausente en otra con las mismas características pero con la
presencia de un factor alterador. El protocolo consiste de 2 pasos generales, la síntesis de
cDNA y una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) diferencial usando un primer poly-dT
(3’) y oligonucleotidos arbitrarios para el primer (5’). En ellos, el diseño de los iniciadores
“primers” es crítico para el éxito y reproducibilidad de los resultados. Los fragmentos
27
amplificados son posteriormente separados en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y
visualizados autoradiográficamente.
Esta técnica presenta varios inconvenientes experimentales: el elevado número de
análisis necesarios para estudiar los cambios totales en la expresión de genes de una muestra y
la cantidad elevada de falsos positivos. En plantas esta técnica tiende a dar una
preponderancia de secuencias no traducidas 3’ en los resultados de los fragmentos DNA, los
cuales hacen difícil poder identificar homologáis en la comparación con bases de datos (P.
Liang and AB Pardee, 1997).
28
IV. JUSTIFICACIÓN
El Agave tequilana Weber var. Azul es una de las plantas de mayor importancia económica a
nivel industrial en México. Según la Norma Oficial Mexicana (NOM-006-SCFI-2005), esta
especie es la única materia prima permitida para la producción de tequila 100% de Agave,
debido a su alta concentración de azúcares, bajo contenido en fibras, etc., siendo una de las
mas codiciadas no sólo en México, sino en el mundo.
Agave tequilana var. Azul puede propagarse por dos mecanismos: a) reproducción
sexual (por semillas) y b) reproducción asexual (hijuelos de rizoma, bulbilos). La propagación
por hijuelos de rizoma ha sido la más utilizada a nivel industrial, y ha sido la mas investigada
dejando a un lado las otras dos formas de propagación. La propagación por semillas es poco
eficiente debido al bajo porcentaje de germinación y en cuanto a la reproducción por bulbilos
aún hay muy poca información.
En el presente trabajo se ha logrado generar información básica de reproducción
asexual por bulbilos en Agave tequilana, realizándose un análisis diferencial de la expresión
de genes involucrados en las diferentes etapas de su crecimiento, usando la técnica de cDNAAFLP
(Amplificación
de
Fragmentos
de
Longitud
Polimórfica
usando
DNA
complementario); este es un método de huella genética de RNA, basado en AFLP, el cual
permite la caracterización detallada de la expresión de genes en un amplio rango de procesos
biológicos. Es una tecnología confiable y altamente aplicable para identificar genes regulados
en el desarrollo, finalmente con esta técnica se muestra una verificación rápida y simple en la
identificación de bandas obtenidas. Al secuenciar transcritos expresados diferencialmente se
puede identificar su presencia en las bases de datos para determinar su función y así entender
mejor las vías de reproducción de esta planta.
Conocer los genes involucrados en los diferentes procesos de desarrollo de Agave
tequilana, nos permitirá en un futuro manipularlos, para generar plantas más resistentes a
patógenos (hongos, bacterias y virus), logrando obtener una mejor propagación de plántulas
así como una mayor calidad en éstas, brindando beneficios a los productores de tequila.
29
V. OBJETIVOS
V.1 OBJETIVO GENERAL:
Realizar un análisis de la expresión diferencial de genes durante la formación de bulbilos en
Agave tequilana, utilizando la técnica de cDNA-AFLP.
V.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Llevar a cabo la inducción de bulbilos en plantas de Agave tequilana.

Colectar muestras de tallos florales desde la inducción hasta la formación de los
bulbilos.

Extraer RNA total y RNA mensajero de los tejidos de las diferentes etapas colectadas.

Llevar a cabo la síntesis de cDNA a partir del RNA mensajero.

Realizar el análisis de expresión de genes en las diferentes etapas usando la técnica de
cDNA- AFLP.

Determinar las diferencias en expresión de los genes en todas etapas colectadas de la
formación de bulbilos.
30
VI. ESTRATEGIA METODOLÓGICA
VI.1 Preparación del templado de cDNA
- Aislamiento de RNA total. Invitrogen life technologies. TRIZOL Reagent. (Chomezynsqui
y Sacchi 1987) Es usado para el aislamiento de RNA total de células y tejidos. El reactivo es
una solución monofásica de fenol e isotiocianato guanidina. Durante la homogeneización o
rompimiento de la muestra, el “TRIZOL Reagent” mantiene la integridad del RNA, mientras
se destruyen las células y los componentes celulares se disuelven. La adición de cloroformo
seguida por centrifugación, permite la separación entre la fase acuosa y la fase orgánica. El
RNA se mantiene exclusivamente en la fase acuosa. Después de transferir la fase acuosa a un
tubo nuevo, el RNA es obtenido por precipitación con alcohol isopropílico.
- Aislamiento de mRNA. DYNAL BIOTECH. Dynabeads Oligo (dT)25. Es diseñado para la
purificación y aislamiento rápido de mRNA, de RNA total eucariótico de plantas, células y
extracto de tejido animal. Los dynabeads son partículas uniformes, superparamagneticas,
partículas poliméricas monodispersas. El uso de Dynabeads Oligo (dT)25 depende de la unión
de las colas de poliA de la mayoría de los mRNA con las secuencias de oligo dT unidas a la
superficie de las Dynabeads. Dos μg de poliA o mRNA puede ser aislado por 200 μL de
Dynabeads Oligo (dT)25, dependiendo del tipo tejido o células y del nivel de expresión del
mRNA.
FIGURA 12. Extracción de mRNA poli A+ por la técnica Dynabeads Oligo (dT) 25
31
-
Síntesis cDNA. SuperScript II reverse transcriptasa. Una vez aislado, el mRNA es
convertido de manera eficiente en DNA de una hebra mediante la enzima transcriptasa
reversa y luego se sintetiza una cadena estable de DNA de doble cadena mediante la
enzima DNA polimerasa. Este DNA es llamado DNA complementario (cDNA)
porque la primera de las hebras es complementaria al mRNA del cual fue producido.
Se produce cDNA porque es un compuesto mucho más estable que el mRNA y porque
al ser obtenido a partir de un mRNA (en el cual no hay regiones no codificantes)
representa únicamente la secuencia de DNA expresada.
VI.2 cDNA-AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando DNA
complementario).
Después de la preparación de doble cadena del templado cDNA, hay cinco pasos básicos:
1. Digestión Restricción del templado cDNA con dos enzimas de restricción TaqI
(T/CGA) y MseI (T/TAA), ambos de corte frecuente, para generar fragmentos dentro de un
rango de tamaños específicos. Los fragmentos obtenidos presentan las características
siguientes:
CGNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNAT
2. Ligación de Adaptadores donde los adaptadores conocidos son ligados en los
extremos de los fragmentos de cDNA producidos durante digestión restricción, presentando
las siguientes características:
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
3’TACTCAGGACTGGCNNNNNNNNNNNNATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
3. Pre-Amplificación se lleva a cabo mediante un PCR (Reacción en cadena de la
polimerasa), es una técnica que permite amplificar secuencias específicas de DNA
complementario (cDNA), el procedimiento consiste en realizar ciclos repetitivos de
desnaturalización de cDNA. Los componentes requeridos para un PCR son: cDNA;
iniciadores (oligonucleótidos) específicos que flanquean el gen o segmento que actúa como
molde para la amplificación, los primers complementarios pueden ser TaqI+0 y MseI+0, en el
presente trabajo se usaron TaqI+0 y MseI+A, MseI+C; mezcla de desoxinucleótidos (dNTPs);
solución amortiguadora de reacción y DNA polimerasa (Arredondo, 1991). Cada uno de los
ciclos de reacción consta de tres pasos:
32

Desnaturalización
(94°C, 30 segundos), en el cual se separan las dos cadenas
complementarias del cDNA.
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
3’TACTCAGGACTGGCNNNNNNNNNNNNATGAGTCCTGAGTAGCAG5’

Alineamiento
(56°C, 1 min.) una vez que el cDNA está desnaturalizado se disminuye la
temperatura para que se realice el apareamiento específico entre los oligonucleótidos y
las cadenas simples del fragmento de ADN que se va a amplificar.
MseI+A
MseI+C
AAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
3’TACTCAGGACTGGCNNNNNNNNNNNNATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGA
3’TACTCAGGACTGGCNNNNNNNNNNNNATGAGTCCTGAGTAGCAG5
5’GACGATGAGTCCTGACCGA
TaqI+0

CAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
TaqI+0
Extensión
(72°C, 1min.), en el que la ADN polimerasa extiende la longitud de los
oligonucleótidos apareados al ADN molde, al ir polimerizando los desoxinucleótidos
libres, como resultado se obtienen dos dobles hélices idénticas a partir de una doble
hélice presente al inicio de la reacción (Barrera A. H, 1993).
MseI+A
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNN AAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
3’TACTCAGGACTGGCNNNNNNNNNNNNATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGA NNNNNNNNNNNNACTCAGGACTCATCGTC
TaqI+0
MseI+C
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNN CAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
3’TACTCAGGACTGGCNNNNNNNNNNNNATGAGTCCTGAGTAGCAG5
5’GACGATGAGTCCTGACCGANNNNNNNNNNNNACTCAGGACTCATCGTC
TaqI+0
Estas preamplificaciones permiten determinar fragmentos en condiciones mas especificas,
debido a que solo amplifica fragmentos con nucleótidos A y C, hacia dentro del marco de
lectura.
Amplificación Selectiva consta de un PCR, en este se usaron primers con dos nucleótidos
selectivos para el extremo 3’ de los primers preamplificación, permitiendo la amplificación de
sólo un grupo de fragmentos.

Desnaturalización
(94°C por 30 segundos). 23 ciclos
MseI+A
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNN AAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
TaqI+0
MseI+C
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNN CAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
TaqI+0
33

Alineamiento
(65°C a30 segundos) 12 ciclos (56°C a 30 segundos) 23 ciclos
TaqI+0NN
TaqI+0NN
5’GATGAGTCCTGACCGANN
5’GATGAGTCCTGACCGANN
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNNAAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNN CAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
NAAATGAGTCCTGAGTAG5’
NCAATGAGTCCTGAGTAG5’
MseI+AN

Extensión (72°C
MseI+CN
a1 minuto) 23 ciclos
TaqI+0NN
TaqI+0NN
5’GATGAGTCCTGACCGANNNNNNNNNTTTACTCAGGACTCATCGTC
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNNAAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNNAAATGAGTCCTGAGTAG5’
MseI+AN
5’GATGAGTCCTGACCGANNNNNNNNNGTTACTCAGGACTCATCGTC
CTGCTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNNCAATGAGTCCTGAGTAGCAG5’
5’GACGATGAGTCCTGACCGNNNNNNNNNNNNTACTCAGGACTCAT3’
CTG CTACTCAGGACTGNNNNNNNNNNNNNCAATGAGTCCTGAGTAG5’
MseI+CN
5. Electroforesis los fragmentos amplificados son posteriormente separados en un gel de
poliacrilamida desnaturalizante y visualizados.
34
VII. MATERIALES Y MÉTODOS
VII.1 MATERIALES
VII.1.1 MATERIAL VEGETAL
Se muestrearon plantas en un campo de Agave tequilana Weber var. Azul situado en la ciudad
de Irapuato, Guanajuato en el período de Marzo a Julio del 2006. Se seleccionaron estas
plantas, ya que estaban en la etapa de floración, en la cual se impidió la producción de
semillas para que se indujera la producción de bulbilos y se tomaron muestras de tallos
florales porque es donde se da la producción de bulbilos, desde el día del corte de los botones
hasta el día en que emergieron los brotes de estos. Las muestras fueron en seis diferentes
etapas T0, T1, T2, T3, T4, T5, correspondientes a los 0, 14, 28, 30, 32 y 35 días
respectivamente como se observa en el CUADRO 4.
Etapas colectadas de la inducción de bulbilos:
Los tallos florales inducidos
T0: 0 días
(sin botones florales) están
iguales que los que tienen
flores.
Los tallos florales inducidos
T1: 14 días
están iguales que el día del
corte de los botones, sin
cambio,
pero
en
la
superficie donde se cortó el
botón hay una cutícula seca.
Hay un ligero hinchamiento
T2: 28 días
debajo de los bractéolos.
Hay hinchamiento marcado
debajo de los bractéolas.
T3: 30 días
35
Empiezan a salir los brotes
vegetativos.
T4: 32 días
T5: 35 días
Los brotes ya se ven a
simple vista, su tamaño es
de 1-2 mm.
CUADRO 5. “Muestras colectadas durante la formación de bulbilos en Agave tequilana”.
VII.1.2 MATERIALES

Morteros estériles y pistilos (esterilizar a 200°C, 18 hr. y enfriar a – 20 °C).

Espátulas pequeñas (esterilizar a 200°C, 18 hr. y enfriar a – 20 °C).

Tubos eppendorf

Tubos para PCR

Gradillas

Recipientes térmicos para hielo

Termos para nitrógeno líquido

Micropipetas (2 μL, 10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL)

Balanza granataria

Termobloc (LAB LINE MULTI BLOK HEATER)

Magneto de Dynabeads

Vortex (EQUIPAR, SYBRON, Thermolyne)

Microcentrifuga (Kendro Laboratory Products, Biofuge, pico, Heraeus)

Cámaras de Electroforesis (Hoefer HE 33, Mini Horizontal Submarine Unit)

Fuente de Voltaje para Electroforesis (HOEFER SCIENTIFIC INSTRUMENTS SAN FRANCISCO)

Fotodocumentador

Termociclador (Applied Biosystems, GeneAmp PCR System 2700)
36
VII.2 MÉTODOS
Se congelaron las muestras en nitrógeno líquido y se guardaron a -70 °C hasta su molienda y
posteriores análisis.
VII.2.1 Molienda de Muestras
Se molió 10 g de tejido en un mortero, con N2 líquido para cada etapa T0, T1, T2, T3, T4, T5
correspondientes a los 0, 14, 28, 30, 32 y 35 días respectivamente. El tejido se molió
perfectamente agregando perlas de vidrio como abrasivo.
Para la Extracción de RNA total:
-
Se pesó 100 mg de tejido molido en un tubo eppendorf sin dejar que se descongelara
(poniendo N2 liquido),
-
Se guardó la muestra molida a -70 °C hasta la extracción.
La molienda de cada muestra duró aproximadamente 1 hora.
Se requieren mínimo 50 μg de RNA total, para obtener mínimo 500 ng de mRNA final.
Aproximadamente 1% de RNA total es poli A+ (mRNA).
VII.2.1.1 Precauciones en la extracción de RNA
En la manipulación de RNA el principal problema es la degradación por RNasas, por lo que
se debe usar un inhibidor de estas en la preparación de todas las soluciones que entren en
contacto con el RNA, generalmente DEPC (dietil pirocarbonato).
Cuando se trabaja con TRIZOL Reagent es importante estar muy protegidos:
1) Uso de bata.
2) Uso de guantes nuevos. Es necesario su uso debido a que las manos son una fuente
potencial de contaminación por RNasas.
3) Uso de gogles o lentes de seguridad reservados para extracción de RNA, que son
requeridos en la manipulación de buffers, los cuales generalmente contienen mezclas de
solventes orgánicos fenol y cloroformo (tóxicos).
4) Evitar el contacto con la ropa, con otros químicos y vapor.
5) Desinfectar el área de trabajo ya sea con etanol 70% o fenol.
6) Usar siempre las mismas pipetas o pipetas especiales, para extracción de RNA (tratadas
con DEPC), para evitar contaminación por RNasas).
7) Usar material de plástico nuevo, certificado y estéril.
8) Esterilizar en horno a 200 °C toda la noche el material de vidrio y porcelana.
37
9) Todas las soluciones deben ser preparadas con agua desionizada tratada con DEPC y
esterilizadas en autoclave.
VII.2.1.2 Determinación de la concentración de RNA y DNA, mediante el
Espectrofotómetro.
La concentración y pureza de muestras de RNA y DNA son determinadas mediante la
habilidad que tienen los ácidos nucleicos para absorber luz ultravioleta a 260 nm, medida en
una celda (de cuarzo) de 1cm2 de sección. Las mediciones de absorbancia permite el cálculo
directo de la concentración de muestras de ácidos nucleicos.
En el espectrofotómetro se hace pasar un haz de luz de una longitud de onda (λ) a 260nm a
través de una celda en la cual se puso:
1. Blanco: H2O o Buffer TE (10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.5).
2.
Muestras: H2O o Buffer TE + RNA.
La absorbancia medida (también llamada densidad óptica) esta en relación con la
concentración y se calculó con la siguiente fórmula:
[RNA] (µg/mL) = Absorbancia 260nm x dilución X 40
Factor de dilución =1000 (1µL RNA en 1mL H2O o Buffer TE)
Coeficiente de extinción de RNA = 40
Para el DNA el coeficiente de extinción es de 50.
VII.2.1.3 Determinación de la concentración de RNA y DNA, mediante el Nanodrop.
Este equipo permite realizar medidas de espectrofotometría en un amplio rango de longitudes
de onda sin necesidad de utilizar celdas. Tan sólo requiere un volumen de muestra de 1-2 µL
(según el tipo de muestra) y además el software asociado al equipo incorpora una serie de
aplicaciones específicas para el tipo de medición que se desee realizar (ácidos nucleicos a
260nm, proteínas a 280 nm, cuantificación de marcajes fluorescentes, etc.). De pequeño
tamaño y fácil manejo, permite medir un gran número de muestras en poco tiempo. La
información es transmitida al ordenador a través de un cable de fibra óptica y los resultados se
obtienen en formatos totalmente compatibles con los soportes informáticos convencionales
para su almacenamiento y manipulación.
38
VII.2.2 Preparación del templado de cDNA
VII.2.2.1 Extracción de RNA total (miniprep), para las étapas (T0, T1, T2, T3, T4, T5)
de desarrollo de bulbilos.
Se utilizó el método de TRIZOL Reagent. Invitrogen life technologies. (Chomezynsqui y
Sacchi 1987).
-
Se pesó 0.1g de tejido molido
-
Se adicionó 1mL de Trizol y se agitó en Vortex
-
Se incubó 5 minutos a temperatura ambiente
-
Se adicionó 200 μL de cloroformo 4°C
-
Se agitó por inversión
-
Se incubó 3 min. a temperatura ambiente
-
Se centrifugó a 12000 rpm 15min. a 4°C
-
Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo
-
Se precipitó con 500 μL de isopropanol
-
Se incubó 10 min. a temperatura ambiente
-
Se centrifugó 10 min. a 12000 rpm a 4°C
-
Se decantó
-
Se lavó dos veces con etanol 70 % (1 mL de etanol, se agitó en vortex y se centrifugó
2 min. con 5000 rpm a temperatura ambiente.
-
Se resuspendió en agua DEPC 30 μL.
Determinación de la calidad del RNA total mediante gel de electroforesis.
- Se preparó un gel de agarosa 1.2% + EtBr
-
Se preparó TAE 1X con DEPC
-
Se cargó el marcador en el primer pozo y se cargo una muestra de RNA total de las 6
etapas en cada pozo.
-
Se corrió el gel por electroforesis a 70 Volts aprox. 30 min.
Para determinar la concentración de RNA total de las 6 etapas, se uso el espectrofotómetro y
el Nanodrop.
39
VII.2.2.2 Extracción de RNA mensajero (poli A).
Se utilizó el método Dynabeads Oligo (dT) 25. DYNAL BIOTECH.
- Se usó 150 μg de RNA total.
Concentraciones obtenidas de RNA total y volumen necesario para la extracción de mRNA.
Etapas
T0
T1
T2
T3
T4
T5
Concentración de RNA total Volumen para la Extracción de mRNA
650 ng/μL
230.76 μL
880 ng/μL
170.45 μL
820 ng/μL
182.92 μL
476 ng/μL
315.12 μL
704 ng/μL
213.06 μL
684 ng/ μL
219.29 μL l
- Se adicionó un volumen igual de Binding Buffer.
- Se calentó en el Termoblock a 65 °C.
- Se tomó 150 μL de dynabeads bien resuspendidas y pusieron en un tubo de Eppendorf, se
puso en el imán y se quitó el buffer sobrenadante.
- Se lavó una vez con Binding Buffer y se quitó el buffer sobrenadante.
- Se centrifugó brevemente RNA + Binding Buffer.
- Se adicionó a las partículas el RNA + Binding Buffer y se mezcló rotando el tubo.
- Se puso en el imán 10 min. y se quitó el sobrenadante
- Se diluyó el buffer de la RT (FS 5X) a 1X
- Se lavó con buffer de lavado A, resuspendiendo en Vortex lentamente,
- Se puso en el imán y se quitó el sobrenadante.
- Se lavó con buffer de lavado B, resuspendiendo en Vortex lentamente,
- Se puso en el imán y se quitó sobrenadante.
- Se lavó con Buffer de la RT y se quitó sobrenadante
- Se puso 7 μL de H2O DEPC a las partículas
- Se puso a 65 °C, 5 min. en el Termoblock.
- Se puso en el imán, se quitó sobrenadante (mRNA) y se puso en un tubo nuevo.
- Se pusieron otros 7 μL de H2O DEPC a las partículas
- Se puso a 65 °C, 5 min. en el Termoblock.
- Se puso en el imán, se quitó sobrenadante (mRNA) y se puso en el tubo.
- Determinación de la calidad del mRNA mediante gel de electroforesis.
- Se midió la concentración de mRNA de las 6 etapas, en el Nanodrop.
40
VII.2.2.3 Síntesis de 1ra cadena.
Se utilizó el método de SuperScript II reverse transcriptase.
Se uso 500 ng de mRNA
Adicionar los siguientes componentes a un tubo para PCR.
mRNA
3.9 μL
H2O Kit
7.1 μL
11.0 μL
Oligo dT
1.0 μL
dNTPs
1.0 μL
13.0 μL
Centrifugar brevemente
Termociclador:
65°C, 5 min.
45°C, 90 min.
4°C, ∞
Preparar Mezcla.
Buffer FS
4.0 μL
DTT
2.0 μL
6.0 μL
- Se centrifugó brevemente.
- Se adicionó al tubo la mezcla preparada.
- Se adicionó 1.0 μL de enzima SSIIRT
- Se dejó a 45 °C el tiempo restante del programa.
- Determinación de la calidad de 1ra cadena de cDNA mediante el gel de electroforesis.
VII.2.2.4 Síntesis de 2da cadena
Al tubo con la reacción de 1ra cadena, adicionar lo siguiente:
18.5 μL de reacción de 1ra cadena
H2O DEPC Kit
92.0 μL
Buffer SS
30.0 μL
dNTPs
3.0 μL
E. coli, Ligasa (10u/µL)
1.0 μL
E. coli. DNA polimerasa 1 (10u/µL)
4.0 μL
RNA asa H (2u/µL)
1.0 μL
150.0 μL
41
- Se pipeteó para mezclar,
- Termociclador: 16°C, 2:30 hrs.
- Se adicionó T4 DNA polimerasa 2 μL
- 16°C 30 min. 4°C
- Se adicionó 10 μL de EDTA 0.5M para detener la reacción
- Determinación de la calidad de 2da cadena de DNA mediante el gel de electroforesis.
- Se midió la concentración de 2ª cadena DNA de las 6 etapas, en el Nanodrop.
VII.2.2.5 Extracción Fenol-Cloroformo
- A la reacción de 2ª cadena agregar 160 μL de fenol: cloroformo, isoamílico.
- Agitar en Vortex
- Centrifugar 5 min. a 14000 rpm
- Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo y desechar el fenol
- Al sobrenadante agregar:
1 μL de glicógeno
80 μL de acetato de amonio
600 μL de etanol 100%
- Poner a –80 °C.
- Centrifugar 25 min. a 14000 rpm
- Quitar sobrenadante
- Lavar la pastilla con etanol 70%
- Centrifugar 5 min. a 14000 rpm.
- Secar a 37 °C.
- Resuspender en H2O DEPC.
VII.2.3 cDNA/AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando
DNA complementario).
Se utilizó el Kit de AFLP
®
Expression Analysis (Li-Cor Biosciences).
ETAPAS
Concentración de 2ª cadena de cDNA
T0
50 ng/ μL
T1
70 ng/ μL
T2
100 ng/μL
T3
80 ng/μL
T4
70 ng/μL
T5
70 ng/μL
42
VII.2.3.1 Digestión Restricción del templado cDNA
Digestión Restricción Taq I
Poner lo siguiente en tubos eppendor en hielo
T0
T1
T2
T3
T4
T5
cDNA (250 ng)
5 μL
3.57 μL 2.5 μL
3.12 μL
3.57 μL
Buffer RL 10X
4 μL
4.0
μL 4
μL
4.0 μL
4
μL
4
μL
Taq I
1 μL
1.0
μL 1
μL
1.0 μL
1
μL
1
μL
30 μL
31.43 μL 32.5 μL
31.88 μL
31.42 μL
31.43 μL
40 μL
40 μL
40 μL
40 μL
40 μL
H2O dd
40 μL
3.57 μL
Mezclar y centrifugar
Incubar a 65 °C durante dos horas y poner el tubo en hielo o a 4 °C.
Digestión Tru
Adicionar lo siguiente a la digestión de Taq I en hielo.
T0
Mezcla de Digestion Taq I
T1
40 μL
40
T2
μL
40
T3
μL 40
T4
μL
40
T5
μL 40
μL
Buffer RL 10X
2 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.0 μL
2.0 μL
Tru
1 μL
1.0 μL
1.0 μL
1.0 μL
1.0 μL
1.0 μL
H2O dd
7 μL
7 μL
7
μL
7.0 μL
50 μL
50 μL
μL
50 μL
7
μL
50 μL
7
50 μL
50 μL
Mezclar y centrifugar
Incubar a 37 °C durante dos horas
Incubar 20 min. a 80 °C para inactivar las enzimas y poner el tubo en hielo o a 4 °C.
NOTA: Esta reacción se hizo al doble, para verificar en electroforesis en gel de agarosa que
los fragmentos hayan sido digeridos.
VII.2.3.2 Ligación de Adaptadores
Mezcla de Digestión Restricción
Taq I / Mse I
50 μL
Mezcla de Ligación
de Adaptadores
9 μL
T4 DNA ligasa
1 μL
60 μL
43
Mezcla de Ligación
de Adaptadores
x1
Adaptador Taq I (50 pmol)
0.3 μL
Adaptador Mse I (50 pmol)
0.3 μL
ATP (10 mM)
1.2 μL
Buffer RL (10X)
1.0 μL
H2O dd
6.2 μL
9.0 μL
Centrifugar brevemente la mezcla
Incubar a 20 °C por dos horas o toda la noche
NOTA: Hacer una dilución 1:10 de la mezcla de ligación.
La porción no usada guardarlo a -20 °C.
TABLA 1.
Secuencia de adaptadores.
Nombre
Secuencia
Adaptador MseI
5’GACGATGAGTCCTGAG-3’
3’TACTCAGGACTCAT-5’
5’GACGATGAGTCCTGAC-3’
Adaptador Taq I
3’TACTCAGGACTGGC-5’
VII.2.3.3 Pre-amplificación
Adicionar lo siguiente a un tubo de PCR.
A
B
Dilución 1:10
2.5 μL
Dilución 1:10
Oligo Taq I + 0 (50ng/ μL)
1.15 μL
Oligo Taq I + 0 (50ng/ μL)
1.15 μL
Oligo MseI + A (50ng/ μL)
1.15 μL
Oligo MseI + C (50ng/ μL)
1.15 μL
dNTPs (10 mM)
0.5 μL
dNTPs (10 mM)
H2O dd
17.2 μL
Buffer de Amplificacion
H2O dd
2.5 μL
0.5 μL
17.2 μL
Buffer de Amplificacion
PCR 10X
2.5 μL
PCR 10X
MgCl2
0.65 μL
MgCl2
0.65 μL
Taq DNA Pol (50ng/ μL)
0.5 μL
Taq DNA Pol (50ng/ μL)
0.5 μL
26.15 μL
2.5 μL
26.15 μL
44
Centrifugar mezcla brevemente
Termociclador 20 ciclos
94°C, 30 seg.
56°C, 1 min.
72°C, 1min.
4°C, ∞
Análisis de preamplificación en gel de agarosa por electroforesis
NOTA: Hacer diluciones 1:150 de la mezcla de preamplificación.
TABLA 2. Secuencias
de primers usados para Pre-amplificación.
Nombre
Secuencia
Oligonucleótido MseI + A
5’GACGATGAGTCCTGAGTAA/A-3’
Oligonucleótido MseI + C
5’GACGATGAGTCCTGAGTAA/C-3’
Oligonucleótido TaqI + 0
5’GACGATGAGTCCTGACCGA-3’
VII.2.3.4 Amplificación Selectiva
Preparar la siguiente mezcla para usarse en la amplificación selectiva.
Taq DNA polimerasa, mezcla de trabajo
5.2 μL
H2O dd
Buffer de Amplificación
PCR 10X
1.1 μL
MgCl2
0.3 μL
Taq DNA Polimerasa (50ng/ μL)
0.2 μL
6.8 μL
Continuación de la amplificación selectiva
ADN preamplificado y diluido 1:150
2.0 μL
Primer MseI + 2 (contiene dNTPs)
2.0 μL
Primer TaqI marcado a 700nm
0.5 μL
11.3 μL
Mezclar suavemente, centrifugar brevemente, colocar en hielo y cubrirlo de la luz con papel
aluminio.
Llevar a cabo un PCR con el siguiente programa: un ciclo a 94°C por 30 segundos, 30
segundos a 65°C, y un minuto a 72°C; 12 ciclos en donde subsecuentemente se disminuye la
45
temperatura de alineamiento (65°C) por 0.7°C por ciclo mientras se mantiene a 94°C por 30
segundos (desnaturalizar) y 1 minuto a 72°C (extensión); 23 ciclos de 94°C por 30 segundos,
30 segundos a 56°C y 1minuto a 72°C y mantener a 4°C.
NOTA: Los primers marcados con fluorescencia, son sensibles a la luz, se recomienda
minimizar la exposición a la luz de los primers marcados y las mezclas de reacción que los
contienen.
TABLA 3. Secuencias
de primers para su uso en Amplificación Selectiva.
Nombre
Secuencia
Oligonucleótido MseI + A
5’GATGAGTCCTGAGTAAAN
Oligonucleótido MseI + C
5’GATGAGTCCTGAGTAACN
Oligonucleótido TaqI + 0
5’GATGAGTCCTGACCGANN
TABLA 4. Combinaciones
Combinación
de oligonucleótidos utilizados en la Amplificación Selectiva.
Oligonucleótido
marcar)
(sin
Oligonucleótidos marcados con
fluorescencia
(700nm)
1
MseI + AC
TaqI + AC
2
MseI + AG
TaqI + GA
3
MseI + AC
TaqI + TC
4
MseI + AC
TaqI + CA
5
MseI + AC
TaqI + GA
6
MseI + AG
TaqI + CA
7
MseI + AC
TaqI + AG
8
MseI + CA
TaqI + TC
9
MseI + CT
TaqI + AG
10
MseI + CA
TaqI + AC
11
MseI + CA
TaqI + CT
12
MseI + CT
TaqI + TC
46
VII.2.3.5 Desnaturalización
Antes de la electroforesis en gel de poliacrilamida, se desnaturalizó el cDNA de
amplificación selectiva para que pudiera entrar a la fina matriz que forma la poliacrilamida,
para esto se agrego a cada tubo PCR, 3µL de la muestra de amplificación selectiva con 2µL
de buffer de carga (Blue Stop Solution del Kit cDNA-AFLP de LI-COR). Se mezcló y
centrifugó y se puso por 3 minutos a 94 °C.
VII.2.3.6 Electroforesis en gel de poliacrilamida
Se preparó un gel de poliacrilamida al 6.5 %, con Urea 8 M y TBE 1X (Tris 1M, ácido
bórico 1M, EDTA 20 Mm, pH 7.0).
La separación de los fragmentos en el gel se hizo en la cámara de electroforesis del
Analizador de cDNA marca LI-COR. El gel se precorrió a 2000 V con amortiguador TBE 0.5
X hasta que se alcanzaron 30 mA o menos. Después se cargo de 0.8 a 1 μL de cada muestra
desnaturalizada en cada pozo, en los carriles de los extremos se cargo la misma cantidad de
marcador de peso molecular de 50 – 700 pares de bases.
Para obtener fragmentos de hasta 700 Pb, el cDNA se dejo correr aproximadamente 3 horas, a
1500 V, 40 W, y 40 mA.
Los datos de los cDNA- AFLP fueron captados automáticamente por el Analizador de cDNA
LI-COR durante electroforesis. La relación entre el tamaño de los fragmentos y su migración
en el gel es casi lineal.
47
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Se monitorearon y colectaron muestras de la formación de bulbilos en plantas de Agave
tequilana en seis diferentes etapas T0, T1, T2, T3, T4, T5, correspondientes a los 0, 14, 28, 30,
32 y 35 días respectivamente, en el periodo de Marzo a Julio del 2006, en la ciudad de
Irapuato, Guanajuato. A partir de estas muestras se empleo la técnica de cDNA-AFLP usando
un protocolo de AFLP genómico estándar sobre un templado de cDNA para obtener un
análisis diferencial.
VIII.1 Templado de cDNA
VIII.1.1 Extracción de RNA total.
En la extracción de RNAtotal, se obtuvieron de muy buena calidad, esto fue gracias a que la
técnica TRIZOL Reagent es eficiente, debido principalmente al tipo de tejido siendo este de
etapas en el desarrollo de los bulbilos, donde las células se reproducen muy rápidamente por
tanto el proceso transcripcional esta muy activo y la cantidad de RNA es mayor. La FIGURA
14
muestra al RNAtotal en sus tres formas: mRNA y tRNA en forma de barrido y rRNA (5S,
18S, 28S) en forma de bandas. Sus concentraciones fueron adecuadas para la extracción de
mRNA, ya que presentan una concentración promedio de 702 ng/μL, estas fueron medidas en
el espectrofotómetro y en el nanodrop obteniendo un promedio de las dos comparaciones, los
resultados obtenidos se aprecian en la TABLA 5.
MPM
T0
T1
T2
T3
T4
T5
4.0 Kb
3.0
2.0
1.6
1
0.5
FIGURA 13. RNA total de bulbilos. MPM) Marcador de peso molecular de 1 Kb;
T0) 0 días; T1) 14 días; T2) 28 días; T3) 30 días; T4) 32 días; T5) 35 días.
48
TABLA 5.
Concentraciones obtenidas de RNA total y volumen necesario para la extracción de
mRNA.
ETAPAS
T0
650 ng/μL
Volumen para la
Extracción de mRNA
230.76 μL
T1
880 ng/μL
170.45 μL
T2
820 ng/μL
182.92 μL
T3
476 ng/μL
315.12 μL
T4
704 ng/μL
213.06 μL
T5
684 ng/ μL
219.29 μL l
Concentración de RNA total
VIII.1.2 Extracción de RNA mensajero.
Esta extracción fué realizada a partir de RNA total de las etapas (T0,
T1, T2, T3, T4, T5),
se
obtuvieron mRNA de muy buena calidad, presentando un peso molecular mayor de 1Kb, esto
fue gracias a que la técnica Dynabeads Oligo (dT)25 es eficiente para este RNA total. Se
verificaron las concentraciones obtenidas para las 6 etapas comparándose con un RNA control
de 100 ng, observándose las diferentes etapas en concentraciones con un promedio arriba de
100 ng mRNA como se observa en la FIGURA 14. Sus concentraciones también fueron
medidas en el Nanodrop obteniendo un promedio de 126.91 ng/μL al conocer las
concentraciones, se calculo el volumen necesario para 500 ng, los cuales fueron requeridos
para la síntesis de 1ª cadena de cDNA, estos resultados se aprecian en la TABLA 5.
CONCENTRACION mRNA T0-T5
MPM C
MPM C
T0
T0
T1
T1
T2
T2
T3
T4
T5
T3 T4 T5
4.0 Kb
3.0
2.0
1.6
1.0
0.5
FIGURA 14. mRNA de bulbilos. MPM) Marcador de peso molecular de 1 Kb; C) RNA control de 100 ng;
T0) 0 días; T1) 14 días; T2) 28 días; T3) 30 días; T4) 32 días; T5) 35 días.
49
TABLA 5.
Concentraciones obtenidas de mRNA y volumen necesario para la síntesis de 1a
cadena.
ETAPAS
Concentración de mRNA Vol. mRNA para 500ng
T0
128.7 ng/ μL
3.885 μL
T1
103.1 ng/ μL
4.849 μL
T2
115.5 ng/μL
4.329 μL
T3
139.8 ng/μL
3.576 μL
T4
143.5 ng/μL
3.484 μL
T5
130.9 ng/μL
3.819 μL
Una alta calidad de RNA es crítico para obtener resultados de cDNA-AFLP reproducible.
Generalmente, 1 μg de mRNA por templado es suficiente para la producción de cDNA, sin
embargo, se uso 0.5 μg lográndose buenos resultados.
VIII.1.3 Síntesis de 1ra y 2da cadena.
La síntesis de 1ª y 2ª cadena de cDNA fué de muy buena calidad, observándose arriba de
1 Kb y expresándose en los geles en forma de barrido estas observaciones se muestran en las
FIGURAS 15 A)
y B). La síntesis fue buena, debido principalmente a la calidad del mRNA, Las
concentraciones, fueron medidas después de la síntesis de la 2ª cadena en el nanodrop,
obteniéndose en promedio 138.51 ng/ μL estos resultados se aprecian en la TABLA 6.
de 1a cadena
1a Cadena
Síntesis de 2a cadena
2a Cadena
FIGURAS 15 A). Síntesis
B).
1KbM C
1KbM T0
1Kb
T0
C T1
T1
1Kb
50
1a cadena
2a cadena
1KbM C
1KbM T2
C
T3
T3
1Kb
1Kb
1a cadena
1KbM T4
2a cadena
T5
1Kb
TABLA 6.
T2
1KbM
C
T4
1KbM
C
T4
C
C
T5
T5
1Kb
Concentraciones obtenidas de 2ª cadena de cDNA.
ETAPAS
Concentración de 2ª cadena de cDNA
T0
51.8 ng/ μL
T1
70.4 ng/ μL
T2
112.1 ng/μL
T3
83.6 ng/μL
T4
71.3ng/μL
T5
72.2ng/μL
51
VIII.1.4 Extracción Fenol-Cloroformo
Se llevo a cabo la purificación del templado de cDNA de las 6 etapas, mediante la técnica de
extracción Fenol-Cloroformo, el cual purificó el cDNA degradando
algunas proteínas
(enzimas que actuaron en la síntesis de 1ª y 2ª cadena).
VIII.2 cDNA/AFLP (Amplificación de Fragmentos de Longitud Polimórfica usando
DNA complementario).
En el análisis de cDNA-AFLP se utilizaron 12 combinaciones de primers conteniendo 2
nucleótidos selectivos (TABLA 4), cada combinación tiene un primer marcado con
fluorescencia (TaqI+0 NN) y otro sin marcar (MseI + NN). Los primers marcados con
fluoróforos permitieron un alto rango en la expresión de transcritos debido a que emiten luz a
700 nm. A continuación se muestran los resultados obtenidos detalladamente:
VIII.2.1 Digestión Restricción del templado cDNA
La digestión se realizó en dos etapas a diferentes temperaturas, usando dos enzimas de
restricción TaqI (con sitio de corte T/CGA) y MseI (con sitio de corte T/TAA), ambos de
corte frecuente, generando fragmentos dentro de un rango de tamaños variables.
Se realizo una verificación en geles de agarosa al 1% del cDNA digerido, los resultados
obtenidos se observan en la FIGURA 16 en forma de barrido. Los fragmentos digeridos, fueron
de tamaño notablemente menor que el cDNA sin digerir, por lo tanto fueron de buena calidad,
posteriormente a estos fragmentos digeridos se les ligaron en sus extremos los adaptadores
conocidos TaqI y MseI, de lo obtenido se hicieron diluciones 1:10 y se continuó con las preamplificaciones.
MPM T0
T1
T4
T5
T2 MPM
T3
1.6 Kb
1 Kb
0.5 Kpb
FIGURA 16. Digestión Restricción del templado cDNA. MPM) Marcador de peso molecular de 1 Kb; T0) 0
días; T1) 14 días; T2) 28 días; T3) 30 días; T4) 32 días; T5) 35 días.
52
VIII.2.2 Pre-amplificación
Se realizaron pre-amplificaciones con los primers TaqI+0 y MseI+A, y con los primers TaqI+0 y
MseI+C,
de los resultados obtenidos se llevo a cabo una verificación en geles de agarosa al 1%,
obteniéndose fragmentos de buena calidad en forma de barrido,
con tamaños
aproximadamente entre 0.3 a 0.7 Kpb, como se observa en la FIGURA 17 de a) y b). Con estas
pre-amplificaciones obtenidas se prepararon diluciones 1:150, para las amplificaciones
selectivas posteriores.
MPM T0
T1
T2
T3
T4
T5
MPM T0
T1
T2
T3
T4
T5
1.6 Kb
1 Kb
0.5 Kpb
a)
b)
FIGURA 17. Pre-amplificación del templado cDNA digerido, con combinaciones:
a) TaqI+0 y MseI+A;
b) TaqI+0 y MseI+C. MPM) Marcador de peso molecular de 1 Kb; T0) 0 días; T1) 14 días; T2) 28 días; T3) 30
días; T4) 32 días; T5) 35 días.
VIII.2.3 Amplificación Selectiva
Se realizaron 12 amplificaciones selectivas a partir de las preamplificaciones diluidas 1:150
para cada etapa, usando 12 combinaciones de primers conteniendo 2 nucleótidos selectivos
(TABLA 4). Cada combinación tuvo un primer marcado con fluorescencia (TaqI+0 NN) y otro
sin marcar (MseI + NN) de los cuales se utilizaron (MseI + AN y MseI + CN). Los
fragmentos amplificados fueron posteriormente separados en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante y la lectura de los geles fue visualizada en el software SAGAMX de AFLPR
Quantar en el sistema LI-COR, obteniéndose un buen perfil de patrones de bandeo desde 30 a
650 Pb, observándose en este rango un promedio de 116 bandas, para cada una de las
combinaciones. En estas 12 combinaciones se visualizan 912 patrones de expresión
diferencial y 440 patrones de expresión constitutiva. En estos patrones de expresión
diferencial se observaron varios transcritos de expresión muy notable, tal es el caso de
transcritos que se expresan solo en la etapa T0, solo en la etapa T3, solo en la etapa T4, solo
en la etapa T5 y patrones de expresión donde hay transcritos que se expresan en todas las
etapas excepto en una de ellas, todos estos resultados se muestran en la TABLA 7.
53
Los transcritos que se expresan solo en las etapas T3 y T4, podrían ser de mayor interés, ya
que debido a lo observado en el estereo-microscopio FIGURA 18, en la etapa T3 se presenta
hinchamiento debajo de los bractéolos y en la etapa T4 el hinchamiento es más visible y
empiezan a sobresalir los bulbilos.
T3: 30 días
T4: 32 días
FIGURA 18. Etapas T3 y T4 de formación de bulbilos.
Algunos de los transcritos mas notables para la etapa T3, se observan en la FIGURA 19 en las
combinaciones: T-AG, M-AC localizando el transcrito a) a 123.9 Pb; T-AG, M-CT
localizando el transcrito b) a 400.3 Pb; T-CA, M-AG localizándose dos transcritos c) a 159.1
Pb y d) a 206.3 Pb
T-AG, M-AC
I.
C
T0
T1
T2
T3
T4
T-AG, M-CT
II.
T5
C
C
T0
T1
T2
T3
T4
T-CA, M-AG
III.
T5
C
C
T0
T1
T2
T3
T4
T5
C
d)
a)
b)
c)
FIGURA 19. Ejemplo del gel cDNA-AFLP, donde transcritos mas notables para la etapa T3 se muestran
expresados en tres diferentes combinaciones mostradas en los cuadros I, II y III. Cada cuadro representa las seis
etapas de la formación de bulbilos T0, T1, T2, T3, T4, T5, correspondientes a los 0, 14, 28, 30, 32 y 35 días
respectivamente.
54
También el transcrito que se expresa solo en la etapa T4, su expresión es demasiado notable,
observándose esto en 11 de las 12 combinaciones. En la FIGURA 20 se observan tres
combinaciones: T-GA, M-AC localizándose dos transcritos T4 a) a 327.4 y b) a 339.9 pb; en
T-GA, M-AG localizándose el transcrito c) a 451.5 pb; y en T-AC, M-AC localizándose el
transcrito d) a 596.1, en estas combinaciones los transcritos se encuentran con posibilidad de
extraerlos, debido a que se encuentra muy separados de los demás.
T-GA, M-AC
I.
C
T0
T1
T2
T3
T4
T-GA, M-AG
II.
T5
b)
a)
C
C
T0
T1
T2
T3
c)
T4
T-AC, M-AC
III.
T5
C
C
T0
T1
T2
T3
T4
T5
C
d)
FIGURA 20. Ejemplo del gel cDNA-AFLP, donde transcritos mas notables para la etapa T4 se muestran
expresados en tres diferentes combinaciones mostradas en los cuadros I, II y III. Cada cuadro representa las seis
etapas de la formación de bulbilos T0, T1, T2, T3, T4, T5, correspondientes a los 0, 14, 28, 30, 32 y 35 días
respectivamente.
Se observaron también patrones de expresión diferencial de manera ascendente, lo que nos
permite suponer que podrían ser transcritos involucrados en la iniciación y desarrollo de
meristemos vegetativos; y patrones de expresión diferencial de manera descendente de los
cuales podría suponerse que son transcritos de identidad de meristemo floral u otros que se
que se reprimen por la acción de genes de identidad de meristemos vegetativos. En la FIGURA
20
se observan tres combinaciones donde se muestran patrones de expresión de manera
ascendente, constitutiva y descendente: en la combinación T-AG, M-AC se localizan algunos
patrones de manera ascendente a) a 173.8, b) a 241.3 y c) a 270.6 Pb; en la combinación TTC, M-CA se obtuvieron 56 patrones de expresión constitutiva, en el CUADRO II solo se
observan 8 y en la combinación T-TC, M-CA se localiza un patrón diferencial de manera
descendente d) a 503.0 Pb.
55
T-AG, M-AC
I.
C
T0
T1
T2
T3
T4
T-TC, M-CA
II.
T5
C
C
T0
T1
T2
T3
T4
T-TC, M-CA
III.
T5
C
C
T0
T1
T2
T3
T4
T5
C
c)
d)
b)
a)
FIGURA 21. Ejemplo del gel cDNA-AFLP, donde se observan patrones de expresión de manera ascendente,
constitutiva y descendente se muestran expresados en dos diferentes combinaciones mostradas en los cuadros I,
II y III. Cada cuadro representa las seis etapas de la formación de bulbilos T0, T1, T2, T3, T4, T5,
correspondientes a los 0, 14, 28, 30, 32 y 35 días respectivamente.
En los resultados obtenidos en electroforesis de las 12 combinaciones (TABLA 4), no
debemos descartar transcritos de expresión notable para otras etapas; se debe tener en cuenta
que es el primer estudio que reporta un análisis de expresión diferencial de genes, en la
formación de bulbilos en A. tequilana.
Se comprobó que la técnica de cDNA-AFLP, es rápida y eficiente, además de que no
requiere información previa de secuencia del genoma, es reproducible permitiendo estudiar
una fracción muy grande de todos los genes expresados, y muy sensible permitiendo la
detección de transcritos de baja abundancia, además permite la identificación de genes
novedosos y proporciona perfiles de expresión semicuantitativa.
Aun cuando existen otras técnicas de expresión diferencial tal como: Hibridación de
Microarreglos (microarrays), Despliegue Diferencial, Hibridación sustractiva, Huella
Genética de ARN con PCR usando iniciadores arbitrarios (RAP-PCR), Análisis de
Diferencias Representativas y Análisis Seriales de la Expresión Diferencial (SAGE), entre
56
otros. Se utilizo esta técnica, debido a que es confiable y aplicable para identificar genes
regulados en el desarrollo.
Su aplicación en plantas se describió por primera vez por Bachem et al (1996), quien
utilizo esta técnica para el análisis de expresión de genes involucrados en el desarrollo del
tubérculo de papa. Ellos analizaron la expresión de dos genes conocidos Patatina y ADPGlucosa Pirofosforilasa, involucrados en el proceso de formación del tubérculo, demostrando
que los fragmentos derivados de transcritos generados mediante cDNA-AFLP revelan
patrones de expresión estrechamente correlacionados con los datos obtenidos usando otros
métodos. Además, obtuvieron en el análisis de expresión dos genes novedosos lox altamente
homólogos, los cuales son expresados diferencialmente durante la formación del tubérculo.
La técnica de cDNA-AFLP se ha aplicado en varios estudios moleculares en papa:
Brugmans et al. (2002) publicaron un nuevo método para obtener mapas completos del
transcriptoma basados en cDNA-AFLP. Las variantes alélicas de genes que se expresan
constitutivamente segregan al igual que otros marcadores en una progenie y se pueden utilizar,
por lo tanto, para generar mapas genéticos, cuyos marcadores, en este caso, tienen un
significado biológico concreto.
Tian et al. (2003) utilizaron cDNA-AFLP en combinación con la técnica SSH (subtractive
suppression hybridization) para identificar genes relacionados con la resistencia a P. infestans.
De esta forma, se identificaron cDNAs con expresión diferencial que presentan homologías
con proteínas del tipo kinasas, lipoxigenasas y proteínas ricas en glutamato, elementos típicos
generados en reacciones de defensa en plantas.
Siguiendo este reporte inicial por Bachem et al (1996) en sistemas de plantas, el uso de
cDNA-AFLP es una alternativa valida y de acuerdo con los resultados obtenidos en este, nos
permite suponer que en el presente estudio de la expresión diferencial de genes involucrados
en el formación de los bulbilos, los transcritos localizados en una sola etapa, así como
también los que se encuentran en forma ascendente y los que se encuentran en forma
descendente, pudieran ser transcritos de interés que son regulados por otros genes y así como
también no debemos descartar la posibilidad de encontrar genes novedosos, debido a que son
los primeros estudios realizados en el desarrollo de estos bulbilos. Estos transcritos se pueden
secuenciar y al conocer su secuencia identificar la identidad del transcrito con bases de datos
de plantas que producen bulbilos o meristemos vegetativos y otras bases de datos ya
existentes como las de Arroz, Maíz, Arabidopsis. Los genes que no se localizan en ninguna
base de datos diferente a la de Agave, pudieran ser transcritos novedosos y para analizar estos
se pueden realizar análisis de expresión en tiempo y espacio específicos tipo Northem o RTPCR.
57
En un artículo reportado por Tooke et al (2005), se estableció que existe un balance
entre la expresión de genes que dan lugar a la formación de meristemos florales y genes que
dan lugar a la formación de meristemos vegetativos, por lo tanto la identidad del meristemo
en formación dependerá del tipo de genes expresados y la principal característica de la
reversión de la inflorescencia es su fuerte asociación con factores ambientales.
Esto nos permite suponer que patrones de expresión diferencial en la formación de los
bulbilos de manera ascendente, podrían ser transcritos involucrados en el crecimiento de
meristemos vegetativos; y los patrones de expresión diferencial de manera descendente,
probablemente transcritos de identidad de meristemo floral que se reprimen por la acción de
genes de meristemos vegetativos.
Algunas investigaciones también han mostrado la existencia de mutantes en
Arabidopsis thaliana, Titanotrichum oldhamii y en Zea mays, en las que se esta alterando el
equilibrio entre las características vegetativas y florales de la planta (Tooke, 2005; Colasanti,
1998; Desmond Bradley, 1996). Estos genes mutados en estas plantas, pueden ser comparados
con las secuencias obtenidas de los transcritos de expresión diferencial de la formación de
bulbilos y si estos presentan características similares, podrían ser los mismos genes que están
alterando el equilibrio entre las características vegetativas y florales de la planta o por lo
menos podrían estar involucrados.
En general, el presente estudio generó información básica de la expresión diferencial
de genes en la formación de bulbilos en Agave tequilana, la cual podría servir para identificar
genes responsables en el desarrollo y reproducción de estas plantas, que en algún futuro se
puedan manipular para obtener una mejor propagación de plantas, así como una mayor
calidad en estas, brindando beneficios a los productores de Tequila.
58
IX. CONCLUSIONES
Se obtuvo un RNA total de buena calidad y cantidad mediante la técnica “TRIZOL
Reagent” con una concentración promedio de 702 ng/μL para ser usado en la extracción de
mRNA.
Se obtuvo mRNA a partir de RNAtotal mediante Dynabeads Oligo (dT)25
obteniéndose también de muy buena calidad, con concentraciones arriba de 100 ng/μL.
Se obtuvo el templado cDNA de buena calidad a partir de 0.5 μg de mRNA mediante
la técnica de SuperScript II Reverse Transcriptase con una concentración promedio de 138.51
ng/ μL, siendo buena cantidad para ser usado en los cDNA-AFLP.
Se usaron 12 combinaciones de primers (conteniendo 2 nucleótidos selectivos),
obteniéndose un buen perfil de patrones de bandeo desde 30 a 650 Pb, observándose en este
rango un promedio de 116 bandas, para cada una de las combinaciones. En estas 12
combinaciones se visualizan 912 patrones de expresión diferencial y 440 patrones de
expresión constitutiva. Se observaron varios transcritos de expresión muy notable, tal es el
caso de transcritos que se expresan solo en la etapa T4 (cuando los bulbilos empiezan a salir).
En general los resultados indican que la técnica cDNA-AFLP es rápida, reproducible y
muy sensible, permitiendo la detección de transcritos de expresión diferencial en las distintas
etapas de formación de bulbilos en Agave tequilana.
59
X. PERSPECTIVAS
Extraer los transcritos de interés, clonarlos y secuenciarlos, puede ayudar a determinar
su identidad mediante un Blast en la base de datos de Agave y otras bases de datos ya
existentes como las de Arroz, Maíz, Arabidopsis o con bases de datos de plantas que producen
bulbilos o meristemos vegetativos. Los genes que no se localizan en ninguna base de datos
diferente a la de Agave, pudieran ser transcritos novedosos, los cuales se podrían caracterizar
por medio de análisis de expresión en tiempo y espacio específicos.
60
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