Universidad Veracruzana “Manual de bioqulmica metabolica”

Universidad Veracruzana
Facultad de Bioanalisis
“Manual de bioqulmica metabolica”
Presenta
Lidia Paola Diaz Nieto
Director
Laura Cecilia Gonzalez
Xalapa, ver.
Noviembre 2010.
Resumen
Este manual es un material de apoyo para la materia de bioquimica metabolica,
que le brindara al alumno conocimientos vinculados teoria-laboratorio.
Para la elaboracion del manual se eligieron diferentes practices con base en las
secciones en la que este dividida como lo es:
•
Metabolismo de carbohidratos
•
Ciclo de krebs
•
Cadena transportadora de electrones
•
Metabolismo de lipidos
•
Metabolismo de aminoacidos y acidos nucleicos
Ademas de que cuenta con un apartado de preparacion de soluciones y las
reglas que se deben seguir eh el laboratorio
v
Manual de bioquimica metabolica 2010
Indice*
I. Introduccion
II. Justificacion
III. Objetivos
IV. Normas Generates del Laboratbrio.
V. Manejo de RPBI
VI. Manual de Praciicas del Laboratorio de Bioquimica Metabolica.
1. Metabolismo de CarbohidratOs
Practica Ne 1 Determinacion de azucares reductores
Practica N° 2: Fermentacion de la glucosa por levaduras
(Sacharomyces cerevisiae)
Practica N° 3: Fermentacion del vino.
2. Ciclo de Krebs
Practica N° 4: Determinacion de la actividad succinato
deshidrogenasa.
Practica N° 5: Respiracion aerobia
Practica N° 6: Respiracion en celulas vegetates
Practica N° 7: Respiracion celular bn plantas y animates
3 . Cadena Transportadora de Electrones
_____________ _____ Manual de bioquimica metabdlica j 2010
Practica N° 8: Estudio del bombeo de protones por
levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de
transpose de electrodes y de los desacoplantes.
5. Metabolismo de los Lipidos
Practica N° 9: Radicales libres (lipoperoxidacion).
Pr&ctica N°10: Conversidn de lipidos a carbohidratos.
6. Metabolismo de los Aminoacidos y Nucleotidos
Practica N°10: Determination de acido urico en suelo.
Pr&ctica N°11: Transaminacion.
VII. Preparation de Soluciones
Manual de bioqulmica metabolica 2010
INTRODUCCION
La Bioqulmica es ia Ciencia que estudia los constituyentes quimicos de los
seres vivos, sus funciones y transformaciones, es decir, estudia las bases
moleculares de la vida. Segun se ha avanzado en el conocimiento cientlfico, se
ha reconocido que gran parte de las enfermedades son consecuencia de
alteraciones moleculares y que se requieren solidos fundamentos bioqulmicos
para entender su fisiopatologla, para llegar al diagnostico y para desarrollar una
terapeutica adecuada. Todo ello ha contribuido a que la bioqulmica tenga un
papel trascendental en el campo de la salud y por tanto resulte imperativo
proporcionar ai alumno los conceptos teoricos adecuados en cuanto a las
principals rutas metabolicas de degradation y bioslntesis de biomoleculas, los
aspectos bioenergeticos, su regulacion e interrelation que existe entre ellas,
as! como complementar mediante la realization de experimentos que le
permitan desarrollar sus habilidades anallticas e integrar los conocimientos
adquiridos en sus cursos teoricos. Para lograr este objetivo es recomendable
que el estudiante haga una revision y ampliation de la parte introductoria que
acompana cada experimento y que sea capaz de aprender a aprender,
construir sus propios conocimientos y demostrar que la ensehanza estrategica
es integrada y aplicada a cada situation.
OBJETIVO.
Ser un material de apoyo para la experiencia educativa, que permita al alumno
Conocer a profundidad las rutas del metabolismo celular, con especial hincapie
en su regulacion y en las interdependencias metabolicas entre diferentes
organos, en situaciones de salud y enfermedad.
JUSTIFICACION
Las practicas de laboratorio en la ensehanza de la Bioqulmica, tienen un rol
importante en el proceso de aprendizaje, a traves del Cual se busca motivar al
estudiante en la investigation con el desarrollo de experimentos y lograr con
1
Manual de bioquimica metabolica I 2010
ello promover el desarrollo del analisis y razonamiento vinculando
teoria y
experimentacidn, siendo esto el motivo primordial que plantea la necesidad de
realizar un manual de practicas que cumpla con dichos requerimientos, en
virtud de que en la actualidad no se cuenta con ningun material de apoyo
educativo que se apegue al programa de estudios de la experiencia.
Desde esta
perspectiva,
consideramos
la
necesidad
de aplicar esta
herramienta de trabajo, con el compromiso de que se explote, investigue y
profundice los topicos considerados adecuados a la experiencia educativa.
2
Manual de bioqufmica metabolica I 2010
I. Normas Generales del
Laboratorio
i
3
Manual de bioquimica metabolica I 2010
Normas Generates del Laboratorio
Se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo cual
se le indicaran las normas generates de comportamiento en el mismo, las
reglas de seguridad que hay que observar, as! como las normas generates
para la realizacion de las practicas de Bioquimica II.
A) Normas generates de com portam iento:
1. El alumno tiene la obligation de leer y estudiar con anticipation las
experiencias a realizar en el laboratorio. El fundamento teorico, si no lo
conoce, debera buscarlo en los libros adecuados.
2. A la hora senalada para el comienzo de las practicas el alumno debera
estar en el lugar correspondiente y en su puesto. Sera obligatorio usar
una bata blanca. No disponer de la bata blanca implica no poder realizar
la practica de ese dia.
3. Todo alumno debera llevar cuaderno de practicas y una libreta donde
hacer las anotaciones que estime oportunas, asi como una calculadora.
4. Durante el horario de practicas no se podra salir del laboratorio sin pedir
permiso al profesor.
5. Esta PROHIBIDO realizar pruebas diferentes a las indicadas en este
cuaderno de practicas. El alumno se cenirb escrupulosamente al mismo.
6. Se valorara la actitud que cada persona adopte durante la realizacion de
las practicas, aspecto este determinante de la nota final.
B) Reglas de seguridad:
1. En el laboratorio esta PROHIBIDO comer, beber o fumar.
2. Se tomaran las precauciones necesarias al trabajar con acidos, bases o
sustancias peligrosas para evitar accidentes. Si precede trabajar en
campana de extraction, usar guantes y gafas de protection.
3. En caso de introduccibn de alguna sustancia o disolucion extrana en los
ojos, estos se lavaran con abundante agua utilizando un frasco lavador.
Posteriormente se aplicara un colirio neutro o suero salino fisiologico. Si
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Manual de bioquimica metabolica I 2010
accidentalmente se ingiriera un acido o base fuertes se administrara
abundante agua o leche y se acudira a un centre medico. Las
quemaduras
por
sustancias
corrosivas
se
trataran
lavandolas
adecuadamente y aplicando una pomada a tal fin. En todos los casos
es imprescindible el posterior examen en un centro medico. Ante
cualquier duda, incidencia o eventualidad se consultary y avisara al
profesor encargado del laboratorio.
4. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensaye a la llama,
se hara con el tubo algo inclinado, agitando suavemente y con la boca
del tubo dirigida hacia un lugar en que no haya ninguna persona.
5. Los residuos liquidos se vertiran a las pilas del fregadero, previa diluciOn
con abundante agua.
6. Si se produce algun accidente, avisar rapidamente al profesor.
C) Normas generales para la realizacion de las practicas:
1. Antes de comenzar la practica debera revisar que dispone de todo el
material y productos necesarios para la misma, y que se encuentra
todo limpio y en orden. Se notificara al profesor cualquier anomalia.
Al finalizar la practica entregara todo el material perfectamente
limpio v ordenado. avisando al profesor de haber terminado antes
de abandonar el laboratorio.
2. Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas.
Pipetear siempre con la propipeta o perilla adecuada. No pipetear
entre varias personas.
3. Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente
etiquetados y cerrados, evitando que se confundan los tapones. Los
recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben
marcar adecuadamente utilizando rotuladores, lapices de cera o
etiquetas. En cada caso se indicarS la sustancia de que se trata y su
concentracion, asi como la fecha de preparacion.
4. Se deben de anotar en el cuaderno de practicas las disoluciones
preparadas y su concentracidn, asi como el volumen preparado de
cada una.
5
Manual de bioquimica metabolica 2010
5. Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados
deberan situarse en el sitio indicado por el profesor o encargado del
laboratorio.
6. Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un
grupo
de
varias
personas)
debera
presentar
el
informe
correspondiente a cada practica el dia de su realization, al fmalizar la
misma.
7. Algunas de las preguntas de los cuestionarios se pueden responder
si se leen los metodos generates.
8. Ante cualquier duda preguntar al profesor de practicas.
NOTA: SE RECUERDA QUE PARA SUPERAR LA AS1GNATURA ES
NECESARIO APROBAR LAS PRACTICAS.26
RESIDUOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS (RPBI).
Podemos definir como
residuos peligrosos biologico infecciosos (RPBI) a
aquellos residuos que contienen agentes infecciosos en concentration
suficiente para causar un dano directo a la salud que puede ser de naturaleza
viral, bacteriana o micotica, entendiendo que estos agentes se definen como
cualquier organismo capaz de transmitir una enfermedad, dichos residuos
provienen de actividades asistenciales o experimentales de salud ya sea en
humanos o animates. Resulta de suma importancia en el laboratorio el manejo
adecuado de los RPBI para logar dicho objetivo podemos seguir los siguientes
pasos:
1. Identificacion de los residuos.
2. Envasado de los residuos.
3. Almacenamiento temporal.
4. Recoleccion y transporte externo.
5. Tratamiento
6. Disposition final.
El laboratorio de bioquimica metabolica sera generador de RPBI en algunas
practicas que se efectuaran, por lo que se
abarcaran los puntos de
identificacion y envasado de residuos se describe a continuation como se
6
Manual de bioquimica metabolica I 2010
deben cubrir estos procedimientos de manera adecuada para prevenir
cualquier tipo de accidente o mat manejo de dichos residuos. Se debe
identificar el desecho de forma inmediata una vez terminado el metodo de
donde se genera de su correcta identification se derivara su correcto
envasado, los identificaremos de acuerdo a su estado flsico ya sea liquido o
solido.
Ser£n considerados RPBI en el laboratorio de Bioquimica Metabolica los
siguientes:
•
Sangre y los componentes de esta, solo en su forma llquida, as! como
sus derivados incluyendo las fracciones celulares o a celulares de la
sangre resultante (hemoderivados). La cual sera inactivada antes de ser
desechada mediante la adicion de hipoclorito de sodio a partes iguales
con un periodo de tiempo de diez minutos.
•
Los residuos no anatomicos como
recipientes desechables que
contengan sangre llquida. Los materiales de curacion, empapados,
saturados, o goteando sangre o fluidos corporales.
•
Los objetos punzocortantes que han estado en contacto con humanos o
animates o sus muestras biologicas
lancetas, agujas de jeringas
desechables, agujas hipod6rmicas, bisturls.
Los RPBI se deben separar y envasar de conformidad con sus caracterlsticas
flsicas y biologicas observando lo establecido en la tabla No. 2
segun la
NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002 como a continuation se
indica.
Tabla No 2.
TIPO DE
ESTADO FISICO
ENVASADO
COLOR
RESIDUOS
Sangre
Llquidos
Recipientes
Rojo
hermeticos
Cultivos y cepas de
Solidos
Bolsas de
Rojo
7
Manual de bioquimica metabolica 2010
agentes
polietileno
infecciosos
Patologicos
Solidos
Bolsas de
Amarillo
polietileno
Liquidos
Recipientes
Amarillo
hermeticos
Residuos no
Solidos
anatomicos
Bolsas de
Rojo
polietileno
Liquidos
Recipientes
Rojo
hermeticos
Mo consideraremos como residuo peligroso biologico infeccioso los siguientes:
•
Torundas y gasas con sangre seca o manchada de sangre.
•
Material de vidrio utilizado en el laboratorio.
Muestras de orina y excremento utilizados en el laboratorio
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Manual de bioquimica metabdlica 2010
II. Practicas
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Manual de bioquimica metabblica I 2010
1. Metabolismo de Carbohidratos
Los carbohidratos pueden definirse como aldehidos y cetonas polihidroxilicos, y
sus derivados; reciben este nombre por la observation de que la formula
empirica de muchos integrantes de este grupo son: CnN2nOn , por lo tanto la
mayor parte de los carbohidratos consta de estos tres elementos. (1)
Todos los organismos obtienen energia de la degradation oxidativa de glucosa
y otros carbohidratos. Incluso para algunas celulas y organismos, como las
celulas del cerebro y muchas bacterias, esta es la principal o unica fuente de
energia. ()
El metabolismo de los carbohidratos complejos, empieza en la boca, cuando la
saliva descompone los almidones. Despues en el estomago, mediante la
action del acido clorhldrico, el metabolismo continua y termina en el intestino
delgado. All! la amilasa (enzima del jugo pancreatico), trasforma al almidon en
maltosa. La maltosa, pasa a ser trasformada en glucosa.
La glucosa pasa al torrente sangulneo, y es oxidada en las celulas
proporcionandonos 4 kilocalorias por cada gramo. La glucosa que no es
quemada se transforma en glucogeno, el cual se almacena en hlgado y en
musculos. (2)
Los niveles de glucosa tambien se pueden aumentar mediante slntesis
(gluconeogenesis) partiendo del piruvato o lactato. Ademas de su funcion tan
importante en el metabolismo energetico, la glucosa tambten es un precursor
en la sintesis de polisacaridos estructurales como celulosa, disacaridos como
sacarosa y lactosa y de otros monosacaridos como galactosa y fructosa. A
continuation se exponen los detalles dela ruta glucolitica.3 ()
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Manual de bioquimica metabolica 2010
La glucolisis es la via metabolica por la que se degrada la glucosa;
filogeneticamente, es la via mas antigua y consiste en una secuencia de
reacciones enzimaticas en las cuales se degrada la glucosa.
La glucolisis puede dividirse en dos fases: una de activacion y una oxidativa. La
fase de activacion consiste en la transferencia de fosfatos a la glucosa con
gasto de dos ATP y en su ruptura en dos moleculas de gliceraldehido 3 fosfato;
en la fase oxidativa, el gliceraldehido 3 fosfato es transformado en piruvato con
la obtencion de cuatro moleculas de ATP por fosforilacion a nivel de sustrato. ()
Las reacciones de la glucolisis ocurren en el citoplasma y no estan ligadas a
estructuras celulares. El producto de la via es el piruvato, el cual puede seguir
diversos destinos segun las condiciones de la celula.
Bibliografia:
Milton Toporek, bioquimica, editorial interamerican, segunda edicion, pag. 7
http://modelode.com/modelos/ld-metabolismo-de-los-carbohidratos.php
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Manual de bioqulmica metabolica I 2010
PRACTICA No. 1
Determinacion de azucares reductores
OBJETIVO:
Observar de forma cualitativa la existencia de los grupos aldehldos y cetonas.
Visualizar la demostracion colorimetrica, que se basa en la variacion de color
de diferentes sustancias qulmicas por el poder reductor del grupo carbonilo.
FUNDAMENTO:
Una caracteristica fundamental de los aldehldos y de las cetonas, es la
existencia en su estructura del grupo funcional carbonilo (C = O). Cuando el
carbonilo esta asociado a un carbono primario forma los aldehldos, y cuando
est£ en un carbono secundario da lugar a las cetonas.
Los glucidos monosacaridos (azucares) segun tengan el grupo funcional
aldehldo o cetona, se dividen en aldosas o cetosas. Los aldehldos y las
cetonas de 6 o mas carbonos forman estructuras clclicas del tipo furanosa (5
vertices) o piranosa (6 vertices). La estructura abierta (no clclica) de estas
moleculas se caracteriza por que el carbono del grupo carbonilo no es
asimetrico (2 valencias ocupadas por el oxlgeno), pero cuando se forman los
ciclos, (estructura de Haworth) el carbono que forma parte del grupo carbonilo
se hace asimetrico (unido a cuatro grupos distintos), aumentando el numero de
isomeros opticos.
Las estructuras abiertas y cerradas son convertibles entre si y existe un
equilibrio entre ambas formas. Para que un azucar sea reductor debe tener el
grupo carbonilo libre, por lo que el carScter reductor esta presente en los
monosacaridos. En el caso de los disacaridos, poseen car£cter reductor
aquellas moleculas cuyo OH del carbono anomerico de la segunda molecula no
interviene en la reaccion acetal, como es el caso de la maltosa (glucosa +
glucosa, enlace 1-4), mientras que la sacarosa (glucosa + fructosa, enlace 1-2),
pierde esta funcion por desaparecer el OH del carbono anomerico de la
fructosa.
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Manual de bioquimica metabblica I 2010
Los monosacaridos mas comunes son la glucosa, la fmctosa, la galactosa y la
manosa. Un carbohidrato que puede ser hidrolizado en dos moldculas de
monosacaridos es llamado disacarido. Los mds importantes son la lactosa
(presente en la leche), la sacarosa (presente en el azucar comun) y la maltosa.
Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en varias
moleculas de monosacaridos son llamados polisacaridos. Los mas comunes
son el almidon y la celulosa, este ultimo es componente estructural de las
plantas.
6c h 2oh
HOCHo
H
|3
H
[2
j\
OH
HO
OH
H
Fructosa
Glucosa
Unidad de glucosa
Unidad de galactosa
H
dH
CH2-0H
LACTOSA
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Manual de bioquimica metabolica I 2010
Unidad de glucosa
Unidad de glucosa
Unidad de glucosa
Unidad de fructose
PRUEBA DE BENEDICT
Algunos azucares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes
oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta caracteristica radica en la
presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo
carboxilo. Por lo tanto, aquellos azucares con un grupo carbonilo libre son
llamados azucares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se
encuentra combinado en union glicosidica se conocen como azucares no
reductores. Existen varias reacciones quimicas que permiten determinar si se
esta en presencia de un azucar reductor o no. La prueba de Benedict es una de
ellas y se basa precisamente en la reaction o no de un azucar con el ion Cu2+
El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de
cobre, y citrato de sodio. El Na2CQ3 confiere a la solucion un pH alcalino
necesario para que la reaccidn pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio
mantiene al ion Cu2+ en solucion ya tiene la propiedad cje formar complejos
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Manual de bioquimica metabolica j 2010
coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre
produce un complejo de color azul.
Si se le agrega al reactivo una solucion de azucar reductor y se calienta hasta
llevar la mezcla a ebullicion, el azucar en solucion alcalina a elevadas
temperaturas se convertira en D-gluconato y su ene-diol, rompibndose luego en
dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos,
reaccionaran con el Cu++. Se obtiene entonces un azucar oxidado y dos iones
Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH" presentes
en la solucibn para formar el hidroxido de cobre. La aparicion de un precipitado
amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azucar
reductor.
MATERIALES Y REACTIVOS
-Reactivo de Benedict: consta de 3 soluciones:
Pesar 100 g de Na2C03 anhidro y disolver en 200 ml de agua destilada
hervida.
Pesar 173 g citrato de sodio y disolverlo en 200 ml de agua destilada hervida.
Pesar 17.3 g de CuS04.5H20 y disolverlo en 300 ml de agua destilada
hervida.
Mezclar las tres soluciones cuando esten frias. Aforar a 1 L con agua destilada
hervida.
-Soluciones de carbohidratos al 2%
Glucosa
Fructosa
Galactosa
Sacarosa
Maltosa
Lactosa
-1 gradilla o vaso de precipitado
-6 tubos de ensayo de 15 x 150
-6 pipetas de 5 ml. y 6 de 2 ml.
-1 Tripie
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_____________________________ Manual de bioquimica metabolica | 2010
-1 Tela de asbesto
-1 mechero
-1 vaso de precipitado de 500 ml
-Pinzas para tubo
-Perilla
PROCEDIMIENTO:
1. Depositar a cada tubo 2.5 ml del reactivo de Benedict
2. Adicionar a cada tubo 1 ml de un carbohidrato diferente procurando
marcar el tubo para identificarlo.
3. Observar el color que adopta.
4. Colocar los tubo en bano de agua hirviendo durante 5 minutos (uno por
uno)
5. Observar cualquier cambio de color durante el calentamiento (rojo,
anaranjado o verdoso)
6. Sacar el tubo y ponerlo en la gradilla y despubs de un corto tiempo
observar si se ha formado algun precipitado.
7. Anotar los resultados para cada tubo
RESULTADOS:
-Elaborar un cuadro con los carbohidratos que utilizo, si se form6 un precipitado
y de que color es el mismo.
PREGUNTAS:
-^Concuerdan sus resultados con lo esperado tebricamente sobre
carbohidratos reductores? Explique.
-^Que otro reactivo se puede utilizar para el analisis de azucares reductores?
-<j,Porque es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?
Bibliografia:
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Manual de bioqutmica metabolica 2010
- Chang Raymond. Quimica. Cuarta edicion. Me Graw Hill. Espana 1997.
- Lehninger Albert L. Bioqulmica. Ediciones Omega. Espana.2006
- Oficial methods of analysis of AOAC International. 1998. Editado por Patricia
Conniff.
Publicado por AOAC International, 16th edicion, volumen 1 y 2, U.S.A.
- Sanchez L; 1995, “Instrumentacion en Bioquimica” Concytec, Lima Peru.
Manual de bioquimica metabolica 2010
PRACTICA No. 2
Fermentacion de glucosa por levaduras
(Sacharomyces cereviceae)
OBJETIVO:
Comprobar la production de piruvato,
acetaldehldo y etanol durante la
fermentacion de la glucosa.
Fundamento:
La fermentacidn se define como un proceso de obtencion de energia mediante
el cual las moleculas org£nicas servir como donantes de electrones y
aceptadores de electrones. (3)
En la ferm entacion las moleculas de acido piruvico se convierten en algo de
"residuos" de productos, y un poco de energia (solo dos moleculas de ATP por
molecula de glucosa - en realidad cuatro son producidos en la glucolisis, pero
dos se utilizan) se produce. (4)
En muchos microorganismos que viven en condiciones anaerdbicas (sin
oxigeno), sirve como la principal via productora de energia por catabolismo de
carbohidratos, lo que da por resultado la formation de productos metabolicos
finales especificos, como etanol, acido lactico, glicerol y C 02. ()
El piruvato esta situado en una verdadera encrucijada metabolica, y su destino,
entre otros factores, depende de las condiciones aerobias o anaerobias
existentes, asi como de las caracteristicas de las cdlulas donde se produce o
Hega. (5)
De muchos tipos posibles de los procesos de fermentacion, dos de los tipos
mds comunes son la ferm entation acido lactica y la ferm entacion del
alcohol. (4)
2 ATP + glucosa + 4 ADP + 2 Pj + 2 NAD + --------------------- > 2 ADP + 2 piruvato + 4 ATP + 2 NADH
Manual de bioquimica metabolica I 2010
REACTIVOS:
. Solucion de glucosa al 1%
. Reactivo de benedict.
. Levadura de panadero seca activa.
PROCEDIMIENTO:
1. - En un vaso de precipitado de 25 ml. Pipetear 10 ml de la solucibn de
glucosa y anadir 0.3 g (la punta de una espatula) de levadura. Mezcle
perfectamente hasta que la mezcla sea homogenea. Incubar a 37 grados
centfgrados. Realizar una prueba de Benedict a esa mezcla a los 30 min., y a la
hora y media de incubation.
2. - Para verificar que la solucion de glucosa es un azucar reductor, realizar una
prueba de Benedict a la solucibn de glucosa.
3. - Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningun azucar
reductor realizar un bianco de la siguiente manera:
Mezcle 0.3 g (la punta de una espbtula) de levadura con 10 ml. de agua
destilada. Efectue una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solucibn de
levadura.
INTERPRETACION:
1. Muestra no fermentada: reaccion de Benedict positiva (rojo ladrillo)
2. Muestra fermentada: reaccion de Benedict negativa (azul).
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
Manual de bioquimica metabolica I 2010
PREGUNTAS:
1.-<j,Que es la glucblisis?
2. -<»,Cuales son los productos finales de la glucolisis en ausencia y presencia de
oxlgeno?
3. -<<,Cuantos ATP son sintetizados en la glucolisis?
4. -<i,En donde se lleva a cabo la glucolisis?
5. - <|,Qu6 es la fermentacion?
BIBLIOGRAFIA:
•
http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C11/C11Links/www.bact.wisc.edu/micro
textbook/metabolism/Fermentation.html
•
•
http://bioloqy.clc.uc.edu/courses/bio104/cellresp.htm
J.A.Lorenzo, J.D.Galindo, J.C.Garcia-Borron, J.H.Martinez Liarte, R.
Pena Fiel, F. Solano; bioquimica para ciencias de la salud; editorial:Mc
Graw-Hill interamericana; pp: 223,248
•
-Chumbe Gutierrez, Guillermo. Guia de Practicas de Bioquimica I.
Universidad Nacional Federico Villarreal. FIIS. EPIA. 2008
•
-Bautista Espinoza, Marleni. Manual de practicas bioquimica I.
Universidad
Nacional Federico Villarreal. FIIS. EPIA. 2008
•
-Lehninger Albert L. Bioquimica. Ediciones Omega. Espana.2006
•
-Sanchez L; 1995, “Instrumentacion en Bioquimica” Concytec, Lima
Peru.
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Manual de bioquimica metabolica 2010
PRACTICA No.3
Fermentacion del vino
OBJETIVO:
Estudiar el efecto de la concentracion de sacarosa en la fermentacion del vino.
FUNDAMENTO:
La fermentacion alcoholica del vino es muy antigua y ya en la Biblia se hacen
numerosas referencias al proceso. Los griegos atribulan el descubrimiento de
la fermentacion al dios Dionisio. (6)
El proceso principal mediante el cual se transforma el mosto de uva en vino, se
conoce con el nombre de ferm entacion alcohdlica. La fermentacion alcoholica
consiste en la transfomnacion de los azucares contenidos en la uva (glucosa y
fructosa) en alcohol etilico y anhidrido carbonico. (7)
Desde el punto de vista energetico la fermentacion alcohdlica es una reaction
exotermica, se libera una cierta cantidad de energia. La fermentacion
alcoholica produce gran cantidad de C02, que es la que provoca que algunos
vinos como el Champagne y el Cava tengan burbujas. (6)
El proceso de fermentacion lo realizan las levaduras adheridas al hollejo de la
uva (mediante una capa cerosa denominada pruina) las que, para cubrir sus
necesidades de crecimiento, ayudan al proceso. Son levaduras del genera
Sacharamyces las que suelen desempenar la parte mas importante de este
proceso. Son las verdaderas "obreras del vino.” (7)
El final del proceso de fermentacion es cuando ya se han "desdoblado" casi
todos los azucares y se detiene la ebullition. En bodegas esto se calcula
mediante los clasicos pesamostos o denslmetros. Es importante tambien
controlar la temperatura de fermentacion continuamente durante todo el
proceso, ya que cada vino requiere unos determinados margenes de
temperatura. (7)
21
Manual de bioquimica metabolica I 2010
MATERIAL DE LABORATORIO:
-1 Probeta graduada de 250 ml
- Tubos de ensaye de 13 X 100
-1 Matraz Erlenmeyer
- ITapon de goma para el matraz
-Tubo Tygon
MATERIAL BIOLOGICO:
- Levadura activa del vino seco
- Cepas de Saccharomyces ellipsoideus
REACTIVOS:
- Jugo de uva o de otra fruta
- Sacarosa
EQUIPO:
- Alcohollmetro (hidrometro).
- Balanza
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare el cultivo iniciador de levadura
•
Mezcle 1 g del cultivo de levadura de vino seco en 100 ml de jugo de
uva. Vea la Nota 1.
•
Deje la levadura crecer en un envase sin apretar a temperatura
ambiente por 24 horas.
2. Fermentacion primaria
•
Agregue bastante azucar al jugo de uva para preparar los 4 substratos
como se muestra en la tabla 1.3, un litro por cada uno:
22
Manual de bioquimica metabolica I 2010
Sustrato
Concentration de
Sacarosa
extra adicionada
A
0.0 g/l
B
100.0 g/l
C
200.0 g/l
D
300.0 g/l
Tabla 1.3 Concentration de sacarosa adicionada.
•
Mida la gravedad espetifica y el valor de PA para cada uno de los
substratos initiates con un alcohollmetro. Este es el valor inicial de PA
que sera utilizado mas adelante para estimar el contenido en alcohol.
•
Inocule cada botella con 20 ml del cultivo iniciador de levadura
preparado en el paso previo. Vea la nota 2.
•
Tape la botella del jugo con un tapon de goma. Una pieza de tubo Tygon
es extendida del tapdn para proporcionar un respiradero para el bidxido
de carbono desarrollado. El otro extremo del tubo se sumerge en agua
en un pequeho tubo de prueba tapado para la botella. El agua previene
la entrada del oxigeno, que altera el metabolismo de la levadura y
estropea el vino. Al mismo tiempo, el bioxido de carbono puede
escaparse de la botella.
•
Fermente a temperatura ambiente por una semana.
3. Fermentacidn secundaria
•
Al termino de una semana, decante el jugo de la botella para limpiar los
envases temporales individuates.
•
Mida los valores de PA para cada uno de los sobrenadantes con un
alcoholimetro. Estime el contenido en alcohol restando el valor final del
PA del valor inicial del PA.
•
Deseche el sedimento y lave cada botella con agua.
•
Vierta el jugo nuevamente dentro de la botella limpia. Ponga detras el
ensamblaje limpio del tapon de goma y del tubo Tygon.
•
Fermente lentamente por otras 4-6 semanas.
•
Mida los valores del PA como antes cuando este listo para consumir.
23
Manual de bioqulmica metabolica I 2010
4. Pruebe el vino.
5. Pruebe con otros jugos de fruta.
NOTA 1. Las uvas frescas pueden ser machacadas para obtener el jugo. La
mayorla de los lagares agregan el dioxido de sulfuro como gas o como sal
sdlida para prevenir el crecimiento de otras levaduras y bacterias que causen
los
desperdicios.
El
dioxido
de
sulfuro
tambien
es
producido
por
Saccharomyces durante la fermentacion. La fuente mas simple del jugo es el
estante del supermercado. Utilice “Todo Natural” la variedad sin preservatives o
azucar agregados.
NOTA 2. La levadura del vino seco se agrega directamente al jugo de uva en
un nivel de 1 g por 4 litros. Para mejores resultados, primero suspenda 1 g de
la levadura del vino seco en 10 ml del agua caliente cerca de 35 °C. Entonces
agregue el cultivo suspendido al jugo de uva
Hoja de resultados
1 Anota en la tabla el contenido de alcohol que mediste.
Sustrato
Contenido de alcohol en
Contenido de alcohol en
Fermentacidn primaria
Fermentacion
secundaria
A
B
C
D
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
24
Manual de bioqulmica metabolica j 2010
CONCLUSIONES
PREGUNTAS:
1 - <j,Que es el efecto Pasteur?
2. -Comente sobre las maneras de mejorar el experimento.
3. -En una fermentacion, <-,A una mayor concentracion de glucosa esperarla
encontrar una mayor concentracion de etanol?
4. - <j,Qu§ factores de experimentation deben controlarse durante el proceso de
fermentacion alcoholica?
BIBLIOGRAFIA:
•
•
•
http://www.articuloz.com/vino-articulos/la-fermentacion-del-vino-laquimica-entre-dos-964223.html
http://www.nuestrosvinos.com/proceso-elaboracion-vino/
-David N. Nelson; Michael M. Cox. Principios de bioqulmica. Tercera
edicibn.editorial Omega. Barcelona 2003.
•
-J.J. Bioqulmica. 1a.ed. Edit. McGraw-Hill. 2000. Mexico.
•
-Mathews, C. y K.E.Van Holde. 2a.ed. edit. McGraw-Hill
lnteramericana.1998. Mexico.
•
-Diaz Zagoya, Hicks Bioqulmica. Editorial Interamericana MC. Graw Hill.
2000
•
-Stryer. L. Bioqulmica. 3a. Edicion. Editorial Reverte. Espaha 2006
25
Manual de bioquimica metabolica j 2010
2. Ciclo de krebs
En los organismos aerobios como el hombre, la energla se obtiene mediante la
transformacion oxidativa de nutrientes y metabolitos hasta dibxido de carbono y
agua. En la matriz de la mitocondria se encuentran casi todas las enzimas que
participan en el ciclo de krebs. (5)
El ciclo toma su nombre en honor del cientlfico anglo-aleman Hans Adolf Krebs,
que propuso en 1937 los elementos clave de la ruta metabolica. Por este
descubrimiento recibio en 1953 el Premio Nobel de Medicina
El ciclo de Krebs (conocido tambien como ciclo de los acidos tricarboxllicos o
ciclo del acido citrico) es un ciclo metabolico de importancia fundamental en
todas las celulas que utilizan oxigeno durante el proceso de respiracibn celular.
El ciclo de Krebs es una ruta metabolica anfibolica, ya que participa tanto en
procesos catabolicos como anabblicos. Este ciclo proporciona muchos
precursores para la produccion de algunos aminoacidos, como por ejemplo el
cetoglutarato y el oxalacetato, asi como otras moleculas fundam entals para la
cblula. (8)
El ciclo de Krebs se Neva a cabo por enzimas solubles (a excepcion de la
succinato deshidrogenasa que es parte integral de la membrana interna) de la
matriz mitocondrial, figura 2.1.
Regulation del ciclo de Krebs. Por el hecho de que entrega NADH y FADH2 a
la cadena respiratoria y recibe de e|la las mismas coenzimas oxidadas, el ciclo
de Krebs funciona bajo el control de la cadena respiratoria y depende en ultima
instancia de la fosforilacion oxidativa. Sin embargo, el ciclo de Krebs responde
a moduladores alostericos generados en el propio ciclo y tambien en otras vias
del metabolismo; son moduladores negativos NADH, ATP, citrato, succinil-CoA
y oxaloacetato y modulador positivo ADP. ()
26
Manual de bioquimica metabolica I 2010
BIBLIOGRAFIA:
•
•
J A.Lorenzo, J.D.Galindo, J.C.Garcia-Borron, J.H.Martinez Liarte, R.
Pena Fiel, F. Solano; bioquimica para ciencias de la salud; editorial:Mc
Graw-Hill interamericana; pp: 223,248
http://www.ciclodekrebs.com/
27
Manual de bioqutmica metabolica 2010
PRACTICA No 4
Determinacion de la actividad succinato deshidrogenasa
OBJETIVO:
Comprobar el funcionamiento del Ciclo de Krebs por medio de la actividad de
una de las enzimas involucradas en dicho ciclo.
Fundamento:
La conversion de succinato a fumarato, la tercera oxidacion del ciclo del acido
citrico, es catalizada por la succinato deshidrogenasa, una flavoproteina y
oxidoreductasa que contiene FAD. ()
La parte final del ciclo consiste en la reorganizacion de moleculas a cuatro
atomos de carbono hasta la regeneration del oxalacetato. Para que eso sea
posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un
carbonilo. Estos tres pasos, ademas de regenerar oxalacetato, permiten la
extraccidn ulterior de energia mediante la formation de FADH2 y NADH. (11)
SUCCINATO DESHIDROGENASA
H
H
succinato
C
/ \
COO
1
fumarato
La enzima succinato deshidrogenasa es la unica enzima del ciclo de Krebs que
no se encuentra en la matriz mitocondrial, sino que en la membrana
mitocondrial interna, con el sitio de unibn del sustrato accesible desde la matriz.
Es ademas la unica en el ciclo asociada a un grupo prostetico flavlnico (FAD)
mediante el cual los equivalentes de reduction del succinato son transferidos a
la ubiquinona, componente de la cadena de transporte de electrones. En
general la funcidn bioquimica del FAD es oxidar alcanos a alquenos, mientras
que el NAD+ oxida alcoholes a aldehidos o cetonas. El malonato es un fuerte
inhibidor competitive de la enzima. (10)
28
Manual de bioquimica metabolica I 2010
MATERIAL DE LABORATORIO:
- Bano maria
-1 Mortero
-1 Gradilla
- 2 Tubos de ensaye
- 2 Pipetas de 5 ml
-1 Pipeta de 1 ml
-1 Termometro de 0 a 100°C
- Arena de vidrio.
MATERIAL BIOL6GICO:
- Aceite vegetal, 10 ml
- Musculo fresco de res o polio, 1g
REACTIVOS:
!
(Para su preparacion vease la preparacion de soluciones).
- Acido succlnico al 3% neutralizado con hidroxido de sodio al 10% hasta pH
7.4, 50 ml
- Azul de metileno al 0.001%, 25 ml
- Acido tricloroacetico al 20% , 10 ml
Proceditniento:
1. Triture cuidadosamente con arena de vidrio 1 g de musculo en un mortero,
anadiendo de 3 a 4 ml de la disolucion de £cido succinico y filtre a traves de
una gasa la mezcla.
2. El liquido homogeneizado se reparte en dos porciones iguales, las cuales se
pondr£n en tubos de ensaye.
3. En el tubo control se anade 1 ml de disolucion de acido tricloroacetico para
destruir la enzima.
4. Anada a ambos tubos de 1 a 2 gotas de azul de metileno y agltelos.
5. Sobre la superficie del liquido de cada tubo se vierten de 0.5 a 1 ml de aceite
con el fin de aislar el oxigeno del aire.
6. Los tubos se incuban en bano maria a 50° C durante 10 minutos.
7. Una vez transcurrido este tiempo, en el tubo de ensaye experimental se
observa la decoloration del azul de metileno
29
_______________________ _____ Manual de bioquimica metabolica | 2010
Hojas de resultados
1 Anota los cambios de color en los tubos.
2.- Explica ^Por qu6 el azul de metileno puede actuar como indicador cuando
la enzima esta presente y activa?
DISCUSION DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
PREGUNTAS:
1.-<j,Por que se utiliza musculo como material biologico de experimentation?
2. -Nombra las enzimas del ciclo de Krebs e indica el tipo de reaccion que
cataliza cada una. Indica ^cuales actuan como oxido-reductasas y cual es su
cofactor?
3. -En la
reaccion en la cual la succinil-CoA es convertida a succinato una
molecula de GTP es producida.
Es sabido que la production de GTP es
equivalente a la de ATP. ^Como puedes explicar esto considerando los
siguientes cambios de reaccion?
GTP+ADP = GDP+ATP
4. -i,Que es la succinato deshidrogenasa y en que via metabolica ejerce su
accion?
5. -^Cu^les son los productos de su actividad?
BIBLIOGRAFIA:
•
http://falcon.sbuniv.edu/~ggrav.wh.bol/tutorial/citric/step2.htm
•
http://www.geothesis.com/index.php?option=com content&view=article&id=675:elciclo-de-krebs&catid=21:artulos&ltemid=100
•
-Sarah Beyon. Cursos Crash de Mosby “Lo esencial en metabolismo y
•
nutricion” Editorial Harcourt Brace. 2000
30
_____________________
•
Manual de bioquimica metabolica | 2010
-Dra, Ana Maria Lopez Colome. Manuales Departamentales. Bioquimica
y
•
Biologia Molecular. Facultad de Medicina UNAM, Departamento de
Bioquimica.
•
Me Graw Hill. Mexico 2000
•
-Dra. Luz del Carmen Doez Garelli. Q:F:B: Concepcion Soler Carrion.
Atlas de
•
mapas Metabolicos de Bioquimica. Universidad Autonoma Veracruzana.
Facultad
•
de Medicina. Editores JGH. Segunda Edicion Mexico1998..
31
Manual de bioquimica metabolica 2010
PRACTICA No 5
RESPIRACION AEROBIA
OBJETIVO:
Que el alumno relaciones el proceso de respiracion aerobia con la actividad
fisica
FUNDAMENTO:
La respiracion celular incluye todas las vias metabolicas que degradan
carbohidratos y otros metabolitos para la obtencion de ATP. Cuando una
molecula de glucosa de seis carbonos se rompe, se transforma en moleculas
de acido piruvico de tres carbonos. Este proceso aerobio es denominado
glicolisis. La glicolisis se lleva a cabo en el citoplasma de las celulas y no
requiere de oxigeno; sin embargo, si hay oxigeno presente, el proceso de
liberation de energia continua, ocurriendo la respiracion aerobia que sucede en
la mitocondria.
En la respiracion aerobia existen dos pasos despues de la glicolisis. En el
primero se transforma el acido piruvico de tres carbonos en acetil coenzima A
de dos carbonos; el tercer carbono se ha transformado en CO2 . El segundo
paso de la respiracion aerobia es el ciclo del acido citrico que continua
liberando moleculas de CO2 durante el proceso y formando moleculas de ATP.
Si no hubiera oxigeno disponible en el proceso de la respiracion despues de la
transformation del acido piruvico, se presenta un proceso anaerobio llamado
fermentation.
MATERIAL Y EQUIPO
-3 vasos de precipitado de 100 ml
-3 pipetas Pasteur con bulbo
-Indicador azul de bromotimol
-Popotes
PROCEDIMIENTO
1. Rotula 3 vasos de precipitado de 100 ml y agregales agua a la mitad de
su capacidad de agua destilada. Adicionales unas 5 gotas de solution
32
____________ ________________ Manual de bioquimica metabolica j 2010
de azul de bromotimol y agita hasta obtener un color homogeneo en las
soluciones.
2. Toma la frecuencia cardiaca (pulso) de alguno de tus companeros de
equipo en reposo y anota tus resultados. Haz que exhale el aliento de
una respiracion en el vaso 1 ayudandose con un popote.
3. Pide a tu companero que camine durante un minuto y vuelve a medir su
frecuencia respiratoria. Anota tus resultados y haz que exhale el aliento
de una respiracion en el vaso de precipitado 2.
4. Pide ahora que realice ejercicio fuerte como correr o subir y bajar
escaleras durante 3 minutos, vuelve a tomar su frecuencia respiratoria y
haz que exhale el aliento de una respiracion en el vaso de precipitado 3.
5. Compara tus observaciones
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
PREGUNTAS:
1 £Que es la respiracion?
2. - <{,Bajo que condiciones se da la respiracion aerobia?
3. -Defina y explique el concepto de coeficiente respiratorio.
4.- ,j,Cual es su utilidad practica?
_____ _______________________Manual de bioquimica metabolica j 2010
BIBLIOGRAFIAS:
•
-Diaz Zagoya, Hicks Bioquimica. Editorial Interamericana MC. Graw Hill.
•
-Stryer. L. Bioquimica. 3a. Edicion. Editorial Reverte. Espana 1996.
•
-Lenhinger A.L. Bioquimica. Omega, Mexico 1998
•
-Dra, Ana Maria L6pez Colome. Manuales Departamentales. Bioquimica
y
•
Biologia Molecular. Facultad de Medicina UNAM, Departamento de
Bioquimica.
•
Me Graw Hill. Mexico 2000
34
______________ Manual de bioquimica metabolica | 2010
PRACTICA No 6
RESPIRACION EN CELULAS VEGETALES
OBJETIVO:
Comprobar el evento de la
respiracion a traves de la formacion de un
subproducto natural como es el bioxido de carbono.
FUNDAMENTO:
La respiracion, proceso metabolico mediante el cual los organismos aerobios
obtienen energia, consta de tres fases:
Ciclo de Krebs, Cadena respiratoria, Fosforilacion oxidativa.
Durante la misma se produce la formacion de dioxido de carbono, agua y parte
de la energia liberada se utiliza para la formacion de ATP. Este proceso se
alimenta de un importante metabolito, la Acetil-Coenzima A, compuesto que
puede proceder de la degradation de carbohidratos, llpidos y protemas. Dentro
de los glucidos se destaca el almidon por su abundancia.
El proceso respiratorio es continuo en todas las celulas aerobias y on los
vegetates se lleva a cabo tanto en raices como en tallos, hojas, flores y
semillas. Estas ultimas constituyen un importante reservorio de sustancias
oxidables entre las que se destacan el almidon y las grasas.
Cuando las semillas germinan, degradan una importante parte de estas
sustancias. El almidon se convierte por la action de la amilasa y las diastasas
en glucosa la cual se degrada por la combination de la glucolisis y la
respiracion hasta dioxido de carbono y agua.
La production de dioxido de carbono se puede cuantificar mediante su reaction
con hidroxido de bario segun la ecuacion:
Ba(OH) 2 + CO 2
BaCO 3 + H 2 O
35
___________________________
Manual de bioquimica metabolica j 2010
El exceso de hidroxido de bario se titula con acido oxalico y de esta forma se
puede calcular la intensidad respiratoria de las semillas.
MATERIAL Y EQUIPO
4 frascos de boca ancha con tapa
4 pipetas Pasteur con bulbo
Probeta graduada de 50 ml
Balanza granataria
1 Bureta
Soporte para Bureta
Gasas
Hilo
REACTIVOS:
Semillas germinadas de frijol o chlcharo
Solucion de Ba(OH)2 0.1 M
Solucion acido oxalico 0.1 M
Fenolftaleina
PROCEDIMIENTO:
I-
COMPROBACI6N
de
la
p r o d u c c iOn
de
co2
d urante
la
RESPIRAC16N.
1. En las gasas se colocan las semillas germinadas, 5 y 10 gr
respectivamente, posteriormente se cierra con el hilo y se cuelga de la
tapa del frasco.
36
Manual de bioqulmica metabolica 2010
2. Anote la masa de semilla pesadas en la balanza granataria y denotelo
como "c".
3. En dos de los frascos se introducen 25 ml de la disolucidn de Ba(OH)2 y
se tapa con el tapdn en que estan colocadas las semillas germinadas.
Se dejan en el puesto de trabajo durante una hora. Periodicamente se
agjta el mismo para facilitar la reaccion del C 02 desprendido.
4. Paralelamente se prepara otro frasco que contenga 25 ml de Ba(OH)2 y
se tapa, el cual se utilizara como testigo.
5. Despu6s de transcurrida la hora se valoran los 3 frascos con Acido
Oxalico previa adicion de 2 6 3 gotas de fenolftaleina.
6. Anote los volumenes de acido consumido en la valoracion de los frascos
que contenian las semillas (b) y en el frasco testigo (a).
REPORTE DE LABORATORIO
I- Realice el calculo de la intensidad respiratoria teniendo en cuenta los datos
obtenidos del experimento.
a = ml de acido oxalico consumidos en la valoracidn del frasco testigo (sin
semillas)
b = ml de acido oxalico consumidos en la valoracion del frasco con las semillas
c = masa de semillas (gramos)
X = Intensidad respiratoria. mg de dioxido de carbono desprendido por gramo
de semilla
2,2 (a - b)
37
Manual de bioquimica metabolica j 2010
c
2,2 = 1 ml de £cido ox£lico c(x/z*) 0,1 mol/l equivale a 2,2 mg de dioxido de
carbono desprendido
Explique en que etapas de la respiracion se forma el Didxido de carbono
desprendido.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
Preguntas:
1 mencione cuales son los productos finales en la respiracion en plantas
2.- <i,Cual es la diferencia en cuanto la respiracion en semillas y plantas?
BIBLLIOGRAFIAS:
•
-Sarah Beyon. Cursos Crash de Mosby “Lo esencial en metabolismo y
•
nutrition” Editorial Harcourt Brace. 2000
•
-Dra, Ana Maria L6pez Colome. Manuales Departamentales. Bioquimica
y
•
Biologia Molecular. Facultad de Medicina UNAM, Departamento de
Bioquimica.
38
Manual de bioquimica metabolica I 2010
•
Me Graw Hill. Mexico 2000
•
-Dra. Luz del Carmen Doez Garelli. Q:F:B: Concepcion Soler Carrion.
Atlas de
•
mapas Metabolicos de Bioquimica. Universidad Autonoma Veracruzana.
Facultad
•
de Medicina. Editores JGH. Segunda Edicion M§xico1998..
39
Manual de bioquimica metabolica 2010
PRACTICA No 7
RESPIRACION CELULAR EN PLANTAS Y ANIMALES
OBJETIVO:
Comprobar la diferencia en cuanto la respiracion aerobia para diferentes
organismos, en relacibn a su tamano y naturaleza
FUNDAMENTO:
En la siguiente actividad, se comparara el proceso de respiracion celular en
varios organismos que viven en agua dulce. El C 02 que producen estos
organismos durante la respiracion celular se convierte en un acido (acido
carbonico), cuya concentration se medira por medio de una titulacion2 usando
un indicador de pH (fenolftaleina). Con este indicador se observara el punto de
cambio en pH, donde se obtiene el equilibrio entre pH acido y basico. Este
cambio en pH sucede al anadirle una solution basica de NaOH a la muestra
acida, y se observa por un cambio en color; de esta forma se podra calcular la
produccion de C 02 para cada organismo. Se estudiara una planta acuatica
para determinar si lleva a cabo la respiracion celular en la oscuridad y en
presencia de luz.
MATERIAL Y REACTIVOS:
-5 vasos de precipitado de 150 ml
-5 vasos de precipitado de 100 ml
-5 pipetas graduadas de10 ml
-1 bureta para titular de 10 ml
-1 soporte para bureta
-1 pinzas para bureta
-1 probeta de 100 ml
-1 perilla
-Papel de aluminio
-Fenolftaleina
Manual de bioqutmica metabolica I 2010
-Solucion de NaOH 0.25 M (para diluir 1:100)
-Anticloro
-Lampara
MATERIALBIOLOG ICO
-Peces de agua dulce
-Caracoles de agua dulce
-Elodea fresca
PROCEDIMIENTO:
1. Determine el volumen que se anadio al producirse acido carbonico en el
agua para cada organismo a utilizarse ( pez, caracol, Elodea ) y anote la
information en la Tabla 1
Para determinar el volumen siga estos pasos:
a. Anada el organismo a un vaso de precipitado de 100 ml con 50 ml de agua
corriente
b. Haga una marca donde queda el menisco.
c. Remueva el organismo.
d. Con una pipeta llena anada agua hasta llegar a la marca.
e. La diferencia de lectura en la pipeta indicara el volumen del organismo.
f. Repita para cada organismo.
2. Rotule cinco vasos de precipitado (150 ml) del 1 al 5 y anadale a cada uno:
1: 100 ml de agua + 1 pez
2: 25 ml de agua + un caracol grande (o dos caracoles pequefios)
3: 100 ml de agua + 5 cm de Elodea fresca
4: 100 ml de agua + 5 cm de Elodea fresca
5: 100 ml de agua
RECUERDE
Manual de bioquimica metabolica 2010
13. Coloque los resultados en la Tabla 1
RESULTADOS:
Tabla 1. Respiracion celular aerobica en plantas y animales
Vaso de
Organismo
precipitado
1
Pez
2
Caracol
3
Elodea en luz
4
Elodea en
NaOH
Volumen del
Cantidad de
(ml)
Organismo(ml)
C02 (ml)
oscuridad
5
Agua (control)
PREGUNTAS:
1 i Que organismo tiene el metabolismo mas alto? <-,Por que?
2. - ^Que organismo tiene el metabolismo mas bajo? <j,Por que?
3. - <j,Por que la planta lleva a cabo fotosintesis y tambien respiracion celular?
4. - Compare los resultados de Elodea en la oscuridad y en la luz. ^Cual tiene
una mayor tasa de respiracion celular? ^Por que?
BIBLIOGRAFIAS:
_____________ _____________ Manual de bioquimica metabolica [ 2010
•
-Dra, Ana Maria Lopez Colome. Manuales Departamentales. Bioquimica
y
•
-Biologfa Molecular. Facultad de Medicina UNAM, Departamento de
Bioquimica.
•
Me Graw Hill. Mexico 2000
•
-Dra. Luz del Carmen Doez Garelli. Q:F:B: Concepcion Soler Carrion.
Atlas de
•
mapas Metabolicos de Bioquimica. Universidad Autonoma Veracruzana.
Facultad
•
de Medicina. Editores JGH. Segunda Edicion Mexico1998..
•
-Karp. Biologla Celular, 2a. Edicion. Interamericana, Mexico 1992.
•
-Rawn, D Bioquimica. Edit. McGraw- Hill. Mexico 1999.
Manual de bioqulmica metabolica I 2010
3.
Cadena Transportadora de Electrones
El flujo de electrones en las reacciones de oxido-reduccion es responsable,
directa o indirectamente de todo el trabajo realizado en los organismos
vivientes. El flujo de los electrones en el metabolismo es un proceso complejo,
los electrones se mueven a partir de varios metabolitos intermedios a
acarreadores de electrones especializados en las reacciones catalizadas por
enzimas. Las celulas contienen una variedad de transductores de energia, los
cuales convierten la energia del flujo de electrones en trabajo.
El transporte de electrones, es la fuente principal de energia para las
actividades celulares, libera grandes cantidades de energia libre, la mayor
parte de la cual se almacena en forma de ATP en la fosforilacion oxidativa. (15)
A partir de la membrana interna mitocondrial pueden ser aislados cinco
complejos enzimaticos denominados I,II, III, IV y V. Los complejos l-IV
contienen parte de la cadena de transporte de electrones, mientras que el
complejo V cataliza la sintesis de ATP por lo que no es propiamente un
componente de la cadena de transporte de electrones.
Reacciones de la cadena de transporte de electrones
Con la excepcion de la coenzima Q, todos los miembros de esta cadena son
proteinas. Estas proteinas pueden funcionar como enzimas como en el caso de
varias deshidrogenasas, pueden contener fierro como parte de su centra fierroazufre o pueden contener cobre, como en el caso de los citocromos a y a3 .
NAD+ es reducido a NADH por deshidrogenasas las cuales remueven dos
atomos de Hidrogeno de su substrata. Ambos electrones pero solo un proton
(ion hidruro: H ) son transferidos al NAD+, formando NADH mas un proton libre,
H+, el cual es liberado al medio. (14)
Estructura de la cadena de transporte de electrones.
La cadena se puede dividir en cuatro complejos: el complejo I o NADH
deshidrogenasa (que cede sus electrones a la coenzima Q); el complejo II o las
45
Manual de bioquimica metabolica I 2010
deshidrogenasas que ceden sus electrones al FADH2 (como la succinato
deshidrogenasa) y a traves de el a la misma coenzima Q; el complejo III o
citocromo c reductasa, y el complejo IV o citocromo c oxidasa, que transfiere
los electrones al oxlgeno, que es el aceptor final.
La energla liberada en el curso de la transferencia de hidrogeno y electrones a
traves de la cadena respiratoria se utiliza para la formacion de ATP por la
llamada fosforilacion oxidativa.
46
Manual de bioqulmica metabdlica 2010
PRACTICA No 8
ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES
POR LEVADURAS; EFECTO DE LOS INHIBIDORES
DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES Y DE LOS
DESACOPLANTES
OBJETIVOS:
> Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH
producidos por las levaduras.
> Que el alumno describa las vias por las cuales la glucosa genera los
cambios de pH.
> Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes
sobre la salida de protones.
Fundamento:
En los organismos aerobios es esencial que las enzimas del ciclo de Krebs
esten asociadas con las del sistema de transporte de electrones. Es a traves de
esta oxidacion que los nucleotidos de la piridina (NADP y NAD) y el FAD,
reducidos en el ciclo de Krebs, son devueltos a su forma oxidada.
La energia cedida en estas oxidaciones es utilizada en la sintesis de ATP.
El sistema transportador de electrones esta constituido por una serie
secuencial de enzimas del grupo de los citocromos, capaces de pasarse
electrones de uno a otro. Los electrones, tornados por aceptores de hidrogeno
(NADP, NAD, FAD) a partir de los pasos oxidativos de la respiracion, acaban
pasando al sistema trasportador de electrones, en donde van “descendiendo” a
lo largo de la cadena de los citocromos.
Es especialmente importante para la celula viva el hecho de que en cada paso
de este sistema, el nivel de energia del electron disminuye, de manera que
la diferencia de energia pueda ser trasformada en energia de enlace fosfato
por conversion de ADP en ATP.
47
Manual de bioquimica metabolica I 2010
Durante la reoxidacion de ubiquinona reducida (UQ) los iones hidrogeno pasan
al citoplasma; solo los electrones circulan a lo largo de una serie de las
enzimas citocromicas. Para cada par de electrones que pasan por este
sistema, se forman 3 moleculas de ATP. La slntesis de ATP tiene lugar en la
oxidacion del NADH, en la oxidacion de dos citocromos b y en la oxidacion de
dos citocromos a.
Cuando alcanzan su nivel de energla mas bajo, los electrones son pasados al
oxlgeno desde el citocromo
reducido, activando as! el oxlgeno. En este
estado, el oxlgeno puede aceptar iones libres de hidrogeno para formar agua.
MATERIAL DE LABORATORIO:
- 3 Vasos de precipitados de 100 ml
-Pipetas de 5 y 10 ml
- Piceta
MATERIAL BIOLOGICO:
-Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg ml"1
REACTIVOS:
(Para su preparacion vease la preparacion de soluciones).
-Solucion de glucosa para una concentration final de 1%
-Solucion de dinitrofenol 40 mMol/l en etanol
- Solucion de azida de sodio 400 mMol/l
- Agua destilada
EQUIPO:
- Potenciometro
METODO:
Experimento 1 (control)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Determinar el pH de la solucibn y repetir la medicion dos veces mas con
intervalos de 3 minutos para obtener la llnea basal.
48
Manual de bioquimica metabolica I 2010
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10%, agitar y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solucion cada 5 minutos cuatro veces, y luego cada
10 minutos dos veces mas.
Experimento 2 (dinitrofenol)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2; Anadir por decantacion (no pipetear) 0.2 ml de la solucion de dinitrofenol 40
mMol/l, concentracion final de 200 mol/l.
3. Determinar el pH de la solucion y repetir la medicion dos veces mas con
intervalos de 3 minutos para obtener la linea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
Experimento 3 (azida)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Anadir por decantacion (no pipetear) 0.5 ml de la solucion de azida de sodio
400 mol/l, concentracion final de 5 mMol/l. Agitar con cuidado.
3. Determinar el pH de la solucion y repetir la medicibn dos veces mas con
intervalos de 3 minutos para obtener la linea basal.
4. Esperar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.19
Figura 3.3 Vias que siguen los protones en la levadura.
49
Manual de bioquimica metabolica | 2010
Hoja de resultados
1 Haga una grafica de cada uno de ios experimentos; utilizar los valores de
las lecturas de pH contra tiempo.
2. - Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control con
dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio.
3. - Hacer una relacion de las vias que producen estos cambios; tomar en
cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana
mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de
protones en la membrana plasmatica cuya funcion es similar a la bomba de
Na+/K+en las celulas de los mamiferos.
DISCUSION DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
PREGUNTAS:
1 <j,Cual es el efecto de cada uno de las siguientes sustancias en el transporte
de electrones y production de ATP? Se especifico acerca de cual reaction es
afectada.
a) Azida
b) AntimicinaA
Manual de bioquimica metabolica [ 2010
c) Amital
d) Rotenona
e) Dinitrofenol
f) Gramicidina A
g) Monoxido de carbono
2. - <j,Por que se puede usar el dinitrofenol como un medicamento de dieta?
3. - Indica las especies moleculares en el interior de la membrana de la
mitocondria las cuales sirven como bombas de protones o canales.
4 - Escribe la primer reaccion en la ruta de transporte de electrones la cual
envuelve NADH y CoQ. Indica los agentes de oxidation y reduction de la
reaccion.
5. - ^Por que la production de ATP requiere una membrana mitocondrial
intacta?
6. - ^Cuales son las fuentes de carbono que usa la levadura?
7. - ^Cuales son las vias metabolicas que catabolizan a los carbohidratos?
8. - <i,En que consisten la glucolisis y la fosforilacion oxidativa?
BIBLIOGRAFIAS:
•
-Mathews, C. y K.E.Van Holde. 2a.ed. edit. McGraw-Hill
nteramericana. 1998,Mexico.
•
-Robert Roskosky J.R Bioquimica. 2a. Edicion Interamericana Me Graw
- Hill,
•
Edit. Interamericana 1995.
•
-Dra, Ana Maria Lopez Colome. Manuales Departamentales. Bioquimica
y
•
Biologia Molecular. Facultad de Medicina UNAM, Departamento de
Bioquimica.
•
Me Graw Hill. Mexico 2000
51
Manual de bioquimica metabolica
•
2010
-Dra. Luz del Carmen Doez Garelli. Q:F:B: Concepcion Soler Carrion.
Atlas de
•
mapas Metabolicos de Bioquimica. Universidad Autonoma Veracruzana.
Facultad
•
de Medicina. Editores JGH. Segunda Edicion Mexico1998
Manual de bioquimica metabolica j 2010
4. Metabolismo de los Llpidos
Los llpidos biologicos constituyen un grupo quimicamente diversos de
compuestos, cuya caracteristica comun y definitoria es su insolubilidad en
agua. Las funciones biologicas de los llpidos son igualmente diversas. En
muchos organismos las grasas y los aceites son las formas principales de
almacenamiento energetico, mientras que los fosfollpidos y los esteroles
constituyen la mitad de la masa de las membranas biologicas.
Las grasas y aceites, utilizados casi universalmente como formas de
almacenamiento de energia en los organismos vivos, son compuestos muy
reducidos derivados de los acidos grasos. Se describen 2 tipos de compuestos
que contienen acidos grasos, los triacigliceroles y las ceras.
Las celulas obtienen energia a partir de los acidos grasos, los cuales pueden
proceder de diversas fuentes: grasas de la dieta, grasas almacenadas en las
celulas en forma de gotitas de lipidos y grasas sintetizadas en un organo y que
se exportan a otro. (16)
La degradacion de los acidos grasos es la degradacion de los trigliceridos
porque es asi como se almacenan. Implica 3 pasos diferentes:
•
Movilizacion de trigliceridos.
•
Introduction de los acidos grasos en el organulo donde se degradaran
(solo en la mitocondria).
•
Degradacion de la molecula de acidos grasos (D-oxidacion de los acidos
grasos). (17)
Los acidos grasos almacenados en los tejidos son utilizados por la celula para
la production de energia en magnitudes que varian de tejido a tejido, asi como
del nivel metabolico del organismo. Son los musculos, principalmente el
cardiaco y el esquetetico, los que mas dependen de los acidos grasos como
fuente de energia.
La mayoria de los acidos grasos que se oxidan en los tejidos provienen de los
triacilgliceridos del tejido adiposo desde donde son liberados por la accion de la
enzima triacilglicerido lipasa sensible a hormonas y transportados en la
circulacion como complejos albumina-acidos grasos. A| llegar al higado, el
Manual de bioquimica metabolica 2010
acido graso es activado en el citosol del hepatocito mediante la accion de la acil
coenzima A sintetasa (tiocinasa) con gasto de ATP; en esta reaccion se
produce un acil coenzima A (acil CoA) y AMP. El proceso de oxidacidn del
acido graso se realiza dentro de la mitocondria; sin embargo, su membrana es
impermeable a los £cidos grasos y derivados del acil CoA, por lo que se
requiere de un transportador: la molecula de carnitina es la encargada de llevar
al acido graso al interior de la mitocondria. Una vez dentro de la mitocondria, el
acil CoA sufre una serie de cambios que permiten obtener un fragmento de dos
carbonos, la acetil CoA.
Los cambios preparan al acilo para quedar nuevamente activado y estos
son realizados por: a) una deshidrogenasa que trabaja con FAD y transforma al
grupo acilo en uno enoilo (molecula con un doble enlace entre el carbono alfa y
beta); b) una hidratasa que elimina la doble ligadura y deja un hidroxilo en el
carbono beta.
Esta molecula se llama beta-hidroxiacil CoA;
c) otra
deshidrogenasa especifica, cuya coenzima es el NAD+, la cual transforma el
grupo hidroxilo de la position beta en un grupo ceto; d) una tiolasa que toma
una coenzima A (HSCoA) para unirla al carbono que tiene la nueva funcion
cetona y romper entre el carbono beta y alfa y dejar una molecula de acetil
CoA.
Estas cuatro enzimas siguen trabajando con el acil CoA que en cada
vuelta pierde dos carbonos como acetil CoA. Al mismo tiempo, el FADH2 y el
NADH obtenido en cada vuelta de la (3-oxidacion generan 5 ATP en la cadena
respiratoria y las acetil CoA entran al ciclo de Krebs para ser totalmente
oxidadas con
la ganancia de 12 ATP netos por cada acetil CoA que entra al ciclo. Asi
tenemos que, por ejemplo, un palmitato (16 C)
genera al oxidarse hasta C 02 y H20 , 131 ATP. Si consideramos el gasto de la
fase de activation del acido graso, obtenemos una ganancia neta de 129 ATP,
figura5.1.
54
Manual de bioquimica metabolica 2010
Sintesis de acidos grasos.
Cuando el requerimiento de energla en la celula ha sido satisfecho y existen
suficientes sustratos oxidables, procede su almacenamiento bajo la forma de
triacilgliceridos que constituyen la reserva de energla a largo plazo mas
importante de las celulas y del organismo. El primer paso de este proceso es la
bioslntesis de los acidos grasos, la cual se realiza en el citoplasma celular a
partir de la acetil coenzima A, el ATP y el NADPH proveniente del ciclo de las
pentosas y de otros sistemas generadores de poder reductor.
La biosintesis de los acidos grasos se inicia con la salida de la acetil CoA
desde la mitocondria en forma de citrato y su transformacion en malonil
coenzima A mediante la fijacion del CO2 por una sintetasa dependiente de
biotina que utiliza ATP. Tanto la acetil CoA como la malonil CoA se unen a un
complejo multienzimatico llamado sintetasa de los acidos grasos. Este
complejo esta formado por un conjunto de protelnas enzimaticas dispuestas
alrededor de la proteina transportadora de acilos (PTA). En pasossucesivos
ocurre la condensation de la acetil y la malonil CoA con desprendimiento de
C 02 y el resto del acetoacetilo de cuatro carbonos es llevado por el brazo
central de la PTA a los sitios activos de las enzimas del complejo para
Manual de bioqulmica metabolica | 2010
transformarlo, sucesivamente, en hidroxiacilo, enoilo y acilo saturado, mediante
el gasto de dos NADPH. El ciclo se repite al incorporar dos carbonos del
malonil CoA en cada vuelta, hasta que se completa el acido palmltico, un acido
graso saturado de 16 C
El citrato desempena un papel muy importante en la slntesis de los acidos
grasos ya que al salir al citoplasma se convierte en acetil coenzima A y
oxaloacetato. Este proceso alimenta con carbonos a la slntesis de los acidos
grasos y aporta NADPH por la accion de la enzima malica sobre el sistema
oxaloacetato-malato-piruvato. Por otra parte, el citrato es un modulador positivo
de la malonil coenzima A sintetasa (tambien llamada acetil CoA carboxilasa),
que es la principal enzima reguladora de la slntesis de los acidos grasos, figura
5.3
56
Manual de bioquimica metabolica
2010
Sintesis y degradacion de triacilgliceroles.
Una vez formados los acidos grasos procede la lipogenesis o sintesis de
los triacilgliceridos: dos acidos grasos activados como acil coenzima A
reaccionan con una molecula del glicerol fosfato para formar el acido
fosfatldico.
Esta ultima molecula es precursora de los triacilgliceridos y de los
fosfolipidos. Para sintetizar los primeros se hidroliza el fosfato, con production
del diacilglicerol, el cual recibe enseguida otra molecula de acil coenzima A,
con la cual se completa el triacilglicerido. La mayoria de las enzimas
participantes en este proceso son aciltransferasas y tiocinasas.
En el organismo humano la accion de la insulina estimula todo el proceso de la
lipogenesis al favorecer la entrada de la glucosa a los adipocitos, el ciclo de las
pentosas, la descarboxilacion del piruvato, la biosintesis de los acidos grasos y
la acumulacion de los triacilgliceridos.
La hidrolisis de los triacilgliceridos en el tejido adiposo, llamada tambien
lipolisis, es estimulada a nivel de la triacilglicerido lipasa en una accion mediada
a traves de AMPticlico, por numerosas hormonas entre las cuales se cuentan:
la epinefrina, el glucagon, los glucocorticoides, la tiroxina y el ACTH; mientras
que es inhibida por la insulina y por la concentration de acidos grasos libres.
La hidrolisis se completa por la accion de la diacilglicerido lipasa y la
monoacilglicerido lipasa que en conjunto liberan un glicerol y tres acidos grasos
de cada triacilglicerido, figura 5.3
BIBLIOGRAFIA:
•
http://acemucsc.galeon.com/articulos/Bioquimica/metabolismo de lipidos.htm
•
http://canal-h.net/w ebs/sgonzalez002/Bioquim ic/M ETLIPID .htm
57
Manual de bioquimica metabolica 2010
Practica # 9
Radicales libres (lipoperoxidacion)
OBJETIVOS:
> Mediante la determination de malondialdehldo el alumno constatara el
efecto de los radicales libres en la peroxidation de los lipidos
(lipoperoxidacion).
> El alumno revisara algunos de los mecanismos protectores contra los
radicales libres.
> El alumno destacara la importancia de los antioxidantes naturales del
organismo para protegerse de los radicales libres.
Fundamento.
Los radicales libres son atomos o grupos de atomos que tienen un electron(e-)
desapareado en capacidad de aparearse, por lo que son muy reactivos,
Una vez que el radical libre ha conseguido robar el electron que necesita para
aparear su electron libre, la molecula estable que se lo cede se convierte a su
vez en un radical libre, por quedar con un electron desapareado, iniciandose
asi una verdadera reaccion en cadena que destruye nuestras celulas.(18)
Las reacciones quimicas de los radicales libres se dan constantemente en las
celulas de nuestro cuerpo y son necesarias para la salud, pero el proceso debe
ser controlado con una adecuada protection antioxidante.
Todas las celulas estan rodeadas por una membrana celular que las separa del
medio
extracelular.
La membrana
celular contiene
enzimas,
canales,
receptores y antigenos que juegan papeles vitales en la interaccibn de la celula
con otras celulas, hormonas y otros agentes reguladores del liquido
extracelular. (19)
El proceso de oxidacion de los acidos grasos se denomina lipoperoxidacion. Se
trata de una reaccion en cadena o autocatalitica, es decir que, una vez
58
Manual de bioquimica metabolica I 2010
comenzada, continua desarrollandose por si misma. Por lo tanto el proceso
consta de tres etapas: iniciacion, propagacion y termination.
La etapa de iniciacion se produce cuando la uni6n C-H de los PUFA
polyunsaturated fatty acid)
(PU FA -
sufre la abstraction del hidrogeno de la doble
ligadura (hidrogeno alilico) susceptible de ser abstraido por los radicales libres,
fundamentalmente el HO, lo que genera un radical lipidico. El inicio se expresa
en la siguiente reaccion:
RH+ H O ____ »
donde
RH
R + H20
=
PUFA
y
R
=
radical
de
acido
graso.
La fase siguiente, de propagacion, comprende una etapa en la que el R se
combina con el oxigeno formando un lipoperoxido (ROO)
R +
02
ROO
Este peroxido puede retirar un nuevo hidrogeno de otro carbono molecular. De
esta manera, persiste el proceso autocatalitico que convierte el carbono del
acido graso de los fosfolipidos de membrana en hidroperoxidos.
ROO+ RH_____*
ROOH+ R
La lipoperoxidacion sigue propagandose de esta manera y llega a su termino
cuando dos ROOH reaccionan entre si dando un tetroxido o cuando son
neutralizados por los antioxidantes.
La gran mayoria de los metodos de laboratorio determinan el dano por RL o
cuantifican el estres oxidativo, dosando los productos oxidados de los PUFA.
Estos metodos incluyen el dosaje de malondialdehido, el estudio de dienes
conjugados y la medicion de la energia luminica (fotoemision) que producen
las mol§culas terminates de la lipoperoxidacibn. (20)
La peroxidacion lipidica es una reaccion en cadena que produce un suministro
continuo de radicales libres que inician la peroxidacion posterior.
59
Manual de bioquimica metabolica I 2010
La peroxidacion de los lipidos expuestos al oxigeno es la causa, no solo del
deterioro de los alimentos (rancidez), sino que tambien ocasiona en tejidos in
vivo
importantes
consecuencias
fisiologicas
y/o
patologicas
(cancer,
enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, envejecimiento, etcetera).
Estos efectos deletereos son iniciados por los radicales libres. Un radical libre
es cualquier especie quimica, molecula o atomo, portadora de uno o mas
electrones desapareados (la nomenclatura quimica indica el caracter de radical
libre de una molecula con la colocacion de un punto al final de la formula
quimica: R*).
Un electron desapareado es aquel que ocupa un orbital atomico o molecular
por el mismo (solo el esta en ese orbital), en lugar de los dos electrones que
habitualmente ocupan un orbital. El electron no apareado confiere una alta
reactividad quimica a los radicales libres que buscan con avidez completar su
par electronico.
En la materia viva, los radicales libres se originan generalmente en la captura
de atomos de hidrogeno (electron mas proton) a expensas de moleculas
organicas proximas.
Los acidos grasos poliinsaturados de los sistemas vivos son muy vulnerables
a la peroxidacion. La base de este proceso es que el doble enlace carbonocarbono debilita la union carbono-hidrogeno del atomo de carbono vecino y lo
vuelve susceptible a la abstraccion de hidrogeno por radicales libres y crea un
nuevo radical organico:
H H H H H H H
I
I
I
I
I
I
I
-C-C=C-C-C=C-C1
1
1
H
H
H
__ .
1
H H H H H H H
I
I
I
I
I
I
1
-C-C=C-C-C=C-CI
H
H
- HRadical organico
Una vez producida la abstraccion, las reacciones pueden tener lugar en
cualquier secuencia y muchos de los productos de degradacion reactivos
pueden contribuir a una mayor oxidacion.
El oxigeno se puede unir a los acidos de los que se ha abstraido el hidrogeno,
formando radicales libres que pueden reaccionar entonces con otra molecula
de lipido, lo que conduce a la abstraccion de hidrogeno de la segunda
60
Manual de bioquimica metabolica I 2010
molecula. Los productos de esta reaccion son un hidroxiperoxido de lipido en la
primera molecula y un nuevo radical libre en la segunda molecula atacada:
HHHHHHH
HHHHHHH
I I II
II I
.
I II I I I I
-C-C-C=C-C=C-C- ■+• -C-C=C-C-C=C-CI
I
I
I
HO
H
H
H
I
0
I
H
Las moleculas de hidroperoxido de lipido se rompen y forman dialdehidos, el
mas prominente de los cuales es el malondialdehido (MDA). Este producto
puede
formar enlaces
que conducen a
cruzados
entre varios tipos de moleculas, enlaces
toxicidad, mutagenicidad, ruptura de membranas y
modificacion de enzimas. El MDA tambien se polimeriza consigo misrno y con
otros productos de degradation tisulares formando un pigmento insoluble, la
lipofuscina, que se acumula en algunos tejidos envejecidos.
Por otra parte, se ha comprobado que la hepatotoxicidad producida por el
tetracloruro de carbono, por el halotano, la isoniacida y la bleomicina tiene,
como uno de sus factores importantes, la lipoperoxidacion.
La presente pr£ctica tiene como objeto medir el nivel de MDA (uno de los
productos de los lipoperoxidos), el cual ha sido considerado desde hace varios
decenios como un marcador de |a presencia de la lipoperoxidacion en los
tejidos. Para ello se utilizara el peroXido de hidrogeno, el cual se descompone
facilmente en dos radicales libres llamados hidroxilos que son altamente
l
reactivos:
H20 2 => 2 *OH
Los radicales hidroxilo pueden atacar a las moleculas de su alrededor y, en el
caso de las c€lulas, su bianco preferencial seran los ^cidos grasos de la
membrana y produciran en ellos una peroxidacion. El MDA puede ser
detectado mediante su conjuncion con dos moleculas de acido tiobarbiturico
(TBA) el cual da una coloracion rosada al medio de reaccion.
61
Manual de bioqufmica metabolica { 2010
CHO
CH2 --- ►
CHO
V
OH ;
HOv
^j N
SH
: CH~CH=CH
OH
OH
Producto color rosado
El binomio MDA-TBA es soluble en solventes org£nicos y puede detectarse
mediante un espectrofotometro a 532 nm
Para controlar los efectos potencialmente devastadores de la peroxidacion
lipldica, tanto en los seres humanos como en la naturaleza, se usan los
antioxidantes. El galato de propilo, el butilato de hidroxianisol (BHA) y el butilato
de hidroxitolueno (BHT) son ejemplos de antioxidantes utilizados como aditivos
en los alimentos. La fdrmula quimica del BHT y el mecanismo antioxidante de
este compuesto es el siguiente:
BHT-OH+R02. => BHT - 0 + R02H
62
Manual de bioqulmica metabolica j 2010
El BHT cede un 3tomo de hidrogeno al radical peroxilo (o dioxilo) e interfiere
con la propagation de la lipoperoxidacion. El BHT-0 es un radical estable poco
reactivo.
Los antioxidantes naturales (medios de defensa en el organismo humano)
pueden incluirse en uno de los grupos siguientes:
1. Constituyentes presentes en la dieta, como los carotenos y retinoides
(vitamina A), el acido ascorbico (vitamina C), los alfa-tocoferoles (vitamina E) y
algunos minerales, entre los que destacan el selenio, el cine, el cobre y el
manganeso.
2. Proteinas y peptidos, como el giutation (GSH), la ceruloplasmina, la ferritina
y la transferrina.
3. Enzimas, como la superoxido dismutasa, la giutation peroxidasa, la giutation
reductasa y la catalasa.
4. Acido urico.
MATERIAL Y REACTIVOS:
-
8
tubos de ensayo de 13 x
100
marca pirex o kimax
- 4 Pipetas graduadas de 1 ml
- 4 Pipetas graduadas de 5 ml
-1 Pipeta Pasteur con bulbo
- 8 tapones de hule
-1
mortero con pistilo
-1
tripie
-1
tela de asbesto
-1 mechero Bunsen
-1 vaso de precipitado de 250 ml
-1
vaso de precipitado de
100
ml
BIOL6GICO:
- Homogeneizado de hlgado de polio
REACTIVOS:
- Acido tiobarbiturico a 0.8% (TBA)
- Cloruro de potasio al 2 %
63
______________________ ______ Manual de bioquimica metabolica | 2010
- Acido acetico al 2 0 %, pH 3.5
- Amortiguador tris 150 mM pH 7.4
- Butanol
- Butilato de hidroxitolueno BHT (antioxidante)
88
mg/ 10 ml de etanol
- Gotero con H2O2
EQUIPO:
- Centrifuga clinica
- Fotocolorlmetro con filtro verde
PROCEDIMIENTO:
1. Homogeneizar aproximadamente 1 gr. de higado de polio en 9 ml de agua
destilada.
2. Filtrar el homogeneizado con una gasa.
3. Preparar la serie de tubos, como se indica en la tabla
Tubo
1
2
3
4
Homogeneizado
0 .0
0.5
0.5
0.5
Amortiguador
2
1.5
1.4
1.3
Antioxidante
--
—
—
H2O2
—
--
2
gotas
2
gotas
2
gotas
Preparation de los tubos (volumenen ml). Agitar y esperar 10 minutos.
4. Detener la reaction con 1.5 ml de acido acetico en cada uno de los tubos.
Agitar y agregar 1.5 ml de acido tiobarbiturico.
5. Tapar los tubos con canicas e incubar en bano Maria a ebullition durante 30
minutos.
6
. Sacar los tubos y enfriar en el chorro de agua. Agregar 1 ml de KGI a 2% y
agitar. Observar la coloracion y determinar cualitativamente la production de
MDA.
7. En caso de que la coloracion de la solution en los tubos no sea
suficientemente evidente para apreciar la diferente cantidad de MDA en cada
uno de ellos, continuar con el paso siguiente, el cual consiste en solubilizar en
64
Manual de bioquimica metabolica j 2010
butanol
el
binomio
MDA-TBA
(color
rosado)
para
detectarlo
fotocolorimetricamente
8.
Anadir 5 ml de butanol a cada uno de los tubos, tapar y agitar fuertemente;
por lo menos, durante un minuto.
9. Centrifugar 5 minutos a 3 000 rpm. Pasar a otro tubo la fase superior (color
rosa) con la ayuda de una pipeta Pasteur.
10. Leer la fase superior en el fotocolorimetro con filtro verde.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
CONCLUCIONES:
PREGUNTAS:
1.
- ^Que es la lipoperoxidacion?
2. - <5,Que es un radical libre?
3. - <i,En donde pueden encontrarse los antioxidantes naturales?
4. - La oxidacion de acidos grasos insaturados requiere exactamente el mismo
grupo de enzimas que la oxidacion de acidos grasos saturados. i Es esta
declaration es falsa o verdadera, porque?
5. - <j,Que otras biomoleculas son afectadas por la formation de radicates libres
a nivel intracelular?
6
. - i,Cual es la importancia de la lipoperoxidacion en los sistemas biologicos?
BIBLIQGRAFIA:
•
http://www.lukor.com/ciencia/radicales libres.htm
•
http://www.ciencia-ahora.cl/Revista17/03RadicalesLibres.pdf
•
http://www.antioxidantes.com.ar/FrArt004.htm
65
Manual de bioquimica metabolica 2010
•
-Mathews, C. y K.E.Van Holde. 2a.ed. edit. McGraw-Hill
•
lnteramericana.1998.Mexico
•
-Oficial methods of analysis of AOAC International. 1998. Editado por
Patricia Conniff.
•
Publicado por AOAC International, 16th edicion, volumen 1 y 2, U.S.A.
•
-Chang Raymond. Quimica. Cuarta edicion. Me Graw Hill. Esparto 1997.
•
-Lehninger Albert L. Bioquimica. Ediciones Omega. Espana.2006
•
-Chumbe Gutierrez, Guillermo. Guia de Practicas de Bioquimica I.
Universidad Nacional Federico Villarreal. FIIS. EPIA. 2008
66
Manual de bioqulmica metabolica I 2010
PRACTICA No. 10
CONVERSION DE LIPIDOS A CARBOHIDRATOS
OBJETIVO:
Demostrar que en los vegetales se puede dar la conversion de llpidos a
carbohidratos.
FUNDAMENTO:
Las plantas y algunas bacterias
pueden usar la Acetil-ScoA derivada del
catabolismo de los llpidos (o de cualquiera otra sustancia) no solo como fuente
de energla, sino tambien como fuente de carbono para la formacion de casi
todas las otras clases de compuestos.
Los animales tienen casi la misma versatilidad, aunque son particularmente
ineficaces al usar el carbono lipldico para la formacion de carbohidratos. Esto
se debe a que las plantas y las bacterias sintetizan dos enzimas auxiliares,
isocitritasa (o liasa del isocitrato) y cintaza del malato, pero ninguna de ellas se
forma en los animales. Junto con otras enzimas del ciclo de £cido. En las
semillas oleaginosas, el ciclo del glioxilato ocurre en un organelo aparte, el
glioxisoma. El resultado del ciclo del glioxilato es:
2 acetil-ScoA + fp + 2 NAD+ + 3 H20 — > oxaloacetato + 2 CoASH + fpH2 + 2 NADH
La via del glioxilato facilita el consumo de dos moleculas de acetil-ScoA; una
por condensacidn con oxaloacetato y otra por condensation con glioxilato. Esta
entrada no solo genera
intermediarios utilizables en la bioslntesis de
aminoacidos, sino que ademas da por resultado la production neta de
oxaloacetato (OAA). De este mode, si se elimina uno de los intermediarios
previos al OAA, el ciclo del glioxilato tiene una reaction anapletorica intrlnseca.
Ademas, el propio OAA puede convertirse ya sea en aminoacidos o en
carbohidratos.
67
Manual de bioquimica metabolica
2010
MATERIAL DE LABORATORIO:
- 2 Pipetas de 10 ml
- 2 Pipetas de 5 ml
-1 Pipeta de 1 ml
- 2 Vasos de precipitados de 50 ml
-1 0 T ubos de ensaye
- 4 Frascos de boca ancha
-1 Bandeja
- Papel filtro
- Papel aluminio
- Gasa
MATERIAL BIOLOGICO:
- Semillas de ajonjoli y de soya
REACTIVOS:
(Para su preparacion vease la preparacion de soluciones).
- Mezcla cloroformo-metanol 2:1
- Fenol al 5%
- H2SO4 concentrado
- Solucion amortiguadora de fosfatos 0.1 M, pH 7.5, 3 mM de MgCh
- Reactivo de Biuret
- Solucion patron de glucosa 100 pg /ml
- Solucion patron de caseina 20 rng/ml
- Solucion de NaCI al 1%
- Sol. de hipoclorito de sodio al 1%
- Sulfato de sodio anhidro
EQUIPO:
- Estufa a temperatura constante 30° C y 28° C
PROCEDIMIENTO:
I.- Germinacion de las Semillas.
Soya:
1. Pesar 3 lotes de semillas de soya de 2.5 g cada uno.
68
Manual de bioquimica metabolica J 2010
2. Lavar las semillas con 25 ml de solucion de hipoclorito de sodio al 1% y
enjuagarlas con agua hervida y fria hasta que ya no huelan a cloro.
3. Colocar cada lote de semillas en un frasco de boca ancha y taparlo con gasa
detenida por una liga.
4. En una bandeja con un poco de agua colocar los dos frascos boca abajo a
manera de que las semillas esten en contacto con el agua.
5. Tapar los frascos con papel aluminio y guardar los lotes sobre la charola
durante 4 dias a 30° C.
6
. El dia que se realizara la sesion experimental pesar otros 3 lotes de semillas
de 2.5 g cada uno, estos seran los controles (semillas sin germinar).
Aionjoli:
1. Pesar 3 lotes de semillas de ajonjoli de 0.5 g cada uno.
2. Lavar las semillas con 25 ml de solucion de hipoclorito de sodio y
enjuagarlas con agua previamente hervida y fria hasta que ya no huelan a
cloro.
3. Colocar cada lote de semillas en un frasco esteril de boca ancha cubierto
con papel aluminio, que contiene un disco de papel filtro humedecido.
4. Ponerlos en la estufa a 28° C durante 4 dias
5. El dia que se realizara la sesion experimental pesar otros 3 lotes de semillas
de 0.5 g cada uno, estos ser£n los controles (semillas sin germinar) . 8
Il.-Preparacion de los Extractos y Determinacion de Biomoleculas
Antes de preparar los extractos secar con papel absorbente cada uno de los
lotes germinados de semillas, que se vayan a utilizar.
a) Proteinas
1. Homogenizar en un mortero, por separado y en frio, 2 lotes de semillas (1
lote sin germinar y
1
lote germinado) con
10
ml de solucion amortiguadora de
fosfatos pH 7.5, MgCb 3mM.
2. Centrifugar a 15000 rpm durante 15 minutos. Si es necesario, filtrar los
sobrenadantes a trav6 s de varias capas de papel filtro, a que los filtrados
salgan claros. Guardar los extractos en frio mientras se utilizan.
69
Manual de bioquimica metabolica 1 2010
Determination de Proteinas
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.25
0.5
0.75
1.0
—
—
—
—
—
—
—
—
—
1.0
—
—
—
—
—
—
—
—
—
1.0
—
—
--- :
—
—
—
—
—
—
1.0
—
—
—
—
—
—
—
—
—
1.0
—
5.75
5.5
5.25
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
6.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
(ml)
Soluci6n
Patr6n de
caseina
Extracto
enzimdtico
sin
germinar
Extracto
enzim£tico
germinado
Extracto
enzimStico
sin
germinar
diluido
1:10
Extracto
enzimdtico
germinado
diluido
1:10
Cloruro de
sodio 1%
Reactivo
de Biuret
El tubo Numero 9 corresponde al bianco. Despues de 30 minutos leer a 540
nm.
NOTA: Se recomienda centrifugar el tubo numero
6
en caso de que se note
turbia la solution .16
b) Carbohidratos
1. Homogenizar en un mortero, por separado y en frlo, 2 lotes de semillas (1
lote sin germinar y 1 lote germinado) con 10 ml de etanol al 75% frio.
2. Filtrar los homogenizados, centrifugar a 15000 rpm durante 15 min.
Manual de bioquimica metabolica 2010
Si es necesario, filtrar los sobrenadantes para que queden claros.
3. Guardar los extractos en frio mientras se utilizan.
4. Preparar tubos con los reactivos que se indican en la siguiente tabla:
Tubos (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
—
—
—
—
—
0.95
0.9
0.8
0.7
0.6
0.9
0.9
0.9
0.9
1.0
—
—
—
—
—
0.1
—
—
—
—
—
——
—
—
—
—
0.1
—
—
—-
—
—
—
—
—
—
—
0.1
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
0.1
—
Sol. Patron
de glucosa
Agua
destilada
Ext.Enz.
sin
germinarl :20
Ext.Enz. germinadol :20
Ext.Enz.
sin
germinar
diluido 1:50
Ext.Enz.
germinado
diluido 1:50
5. Agitar todos los tubos en el vortex. Los siguientes pasos se realizan en la
campana de extraction.
6
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Fenol 5%(ml)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
. Agitar todos los tubos en el vortex.
Tubos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Ac. sulfurico cone.
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
7. Agitar los tubos en el vortex con cuidado pues la reaction es exotermica y la
temperatura puede aumentar hasta 110°C.
71
Manual de bioquimica metabolica
8
2010
. Colocar los tubos en un bano de hielo y dejar hasta que se enfrien. Leer a
485 nm en el colorlmetro. El tubo 10 corresponde al bianco.8
c) Lipidos
1. Lavar y secar perfectamente dos vasos de precipitado de 50 ml, pesarlos y
rotularlos.
- Vaso 1:Lipidos de semillas germinadas.
- Vaso 2:Llpidos de semillas sin germinar.
2. Tomar los dos lotes de semillas restantes (uno sin germinar y otro
germinado) y pasar cada grupo de semillas por separado a un mortero para
macerarlas con 10 ml de solucion de cloroformo-metanol fria. (Evitar que las
semillas germinadas lleven agua).
3. Separar el sobrenadante pasandolo a un tubo para centrifuga y rotulelo.
4. Volver a homogenizar las semillas con 5 ml de cloroformo-metanol y pasar el
sobrenadante a su respectivo tubo de centrifuga.
5. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.
6
. Si se observa agua en el sobrenadante, agregar una cantidad conocida de
sulfato de sodio anhidro.
7. Pasar los sobrenadantes a sus respectivos vasos y eliminar los solventes
mediante calentamiento en bano maria y pesar los vasos.
8.
Por diferencia de pesos entre los vasos vacios y los vasos con los lipidos
despues de eliminar los solventes, calcular la cantidad de lipidos en cada lote
de semillas (si uso sulfato de sodio, descuente su peso del peso final de su
vaso).
Manual de bioqulmica metabolica J 2010
Hoja de trabajo
1.-Observe los resultados obtenidos y compare los lotes de semillas
germinadas contra los obtenidos en los lotes de semillas sin germinar.
Lotes de
Proteinas Carbohidratos Lipidos
sem illas
(% p/p)
(% p/p)
(% p/p)
Germinadas
Sin germinar
2. - Compare los resultados con los obtenidos por sus companeros.
3. Utilizando los resultados obtenidos y los datos siguientes proporcionados en
la tabla, identifique el tipo de vlas metabolicas activas durante la germinacion
de las semillas utilizadas en esta pr&cticas.
Tiempo de germinacidn
(dias)
0
Condicidn de germinacion
Enzima
4
- Oxalato
+ Oxalato
pg de producto/min/mg de proteina
a-cetoglut-deshidrogenasa 25
25
60
Malato sintasa
10
120
18
Malico deshidrogenasa
25
50
50
Trans GP*
35
60
150
PEPcinasa*
8
75
75
* Transaminasa glutamico piruvica
DISCUSION DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
** Fosfoenolpiruvato cinasa
Manual de bioqulmica metabolica
2010
PREGUNTAS:
1.-^Es posible cx)nvertir acidos grasos a otros lipidos sin intermediaries de acilCoA?
2.-<j,C6mo se regula el ciclo del glioxilato?
S.-^Como los animates pueden obtener carbohidratos a partir de compuestos
que no son carbohidratos?
4. -Explica como una dieta baja en carbohidratos y grasas ayuda a reducir la
grasa del cuerpo
5. - <j,En que organismos se lleva a cabo el ciclo del glioxilato?
6
. - ^Que permite utilizar a las plantas y a los microorganismos dicho ciclo?
7. - ^Cuales son las dos enzimas caracteristicaS del ciclo del glioxilato?
BIBLIOGRAFIAS:
•
-Bautista Espinoza, Marleni. Manual de practicas bioquimica I.
Universidad Nacional Federico Villarreal. FIIS. EPIA. 2008
•
-Sanchez L; 1995, “Instrumentacion en Bioquimica” Concytec, Lima
Peru.
•
-J.J. Bioquimica. 1a.ed. Edit. McGraw-Hill. 2000. Mexico.
•
-Mathews, C. y K.E.Van Holde. 2a.ed. edit. McGraw-Hill
•
Interamericana. 1998.Mexico.
•
-Dra. Luz del Carmen Doez Garelli. Q:F:B: Concepcion Soler Carrion.
Atlas de
•
mapas Metabolicos de Bioquimica. Universidad Autonoma Veracruzana.
Facultad
•
de Medicina. Editores JGH. Segunda Edicion Mexico1998..
•
-Herrera. E. Bioquimica, 2a. Edicidn Interamericana. Mexico 1996.
Manual de bioquimica metabolica
2010
5. metabolismo de Aminoacidos y Acidos Nucleicos
Los aminoacidos (aa) son moleculas organicas pequefias con un grupo amino
(NH2) y un grupo carboxilo (COOH). La gran cantidad de proteinas que se
conocen estan formadas unicamente pot 20 aa diferentes. Se conocen otros
150 que no forman parte de las proteinas, (2 1 )
Son importantes para el organismo, pues constituyen el Sustrato para la
sfntesis proteica, e igualmente para la slntesis de neurotransmisores en el
sistema nervioso central. (22) Todos los aminoacidos tiene la misma formula
general: (2 1 )
Grupo a c id b te rm in a l
Grupo
amino
H3+N T
'— C —
te rm in a l
Cadena l a t e r a l
Los aminoacidos participan en la liberation de insulina, hormona del
crecimiento, glucagon y de colecistoquinina. Esta ultima hormona favorece la
contraction de la vesicula biliar, y a nivel cerebral interviene en el control de la
ingesta de alimentos (hormona de la saciedad). Igualmente, Ids aminoacidos
favorecen la reduccion del colesterol plasmatico, y tienen funciones anabolicas
en tejidos perifdricos. (2 2 )
LoS nucledtidos purlnicos y pirimidlnicos son metabolites extremadamente
importantes que participan en muchaS funciones pelulares. Estas funciones
comprenden su actuacidn como precursores de los acidos nucleicos, como
almacenes de energia, afectores, agentes de transferencia de grupos, as!
como mediadores de la accidn hormonal y neurotransmisora, Sus principales
funciones son:
1. Pape! en el metabolismo ertergetico: El ATP $e genera en la$ celulas
mediante la fosfdri|acj6 n oxidativa y la fosforilacidn a nivel de sustrato.
Manual de bioquimica metabolica
2010
2. Unidades monomgricas de los &cidos nucleicos: los &cidos nucleicos, DNA y
RNA, estdn compuestos por unidades monomericas de los nucledtidos.
Mediadores fisioldgicos: otras funciones de los nucledtidos son aquellas en las
que actuan como mediadores de procesos metabolicos clave.
3. Componentes de coenzimas: Coenzimas tales como el NAD, FAD y
coenzima A son constituyentes metabolicos importantes de las celulas que
estan implicados en muchas rutas metabolicas.
4.
6
. Efectores alostericos: Muchos de los pasos regulados en las vias
metabolicas estan controlados por las concentraciones intracelulares de
nucleotidos. (23)
BIBLIOGRAFIA:
•
•
•
http://www.bioloqia.edu.ar/macromoleculas/aminoaci.htm
http://www.clinicamedicainternacional.com/aminoacidos.html
http://www.biopsicoloqia.net/fichas/paae 413.html
Manual de bioquimica metabolica I 2010
PRACTICA No. 11
DETERMINACION DE ACIDO URICO EN SUELO
OBJETIVO:
Conocer un metodo para la identification de acido urico.
FUNDAMENTO
El acido nifrico oxida al acido urico con formation de ctcido dialurico y aloxano,
que se condensan formando aloxantina, la cual, en presencia de hidroxido de
amonio produce acido purpurico y posteriormente purpurato de amonio o
murexida de color purpura.
El acido urico es muy poco soluble en agua o en soluciones acidas. Se
combina con el nitrato de plata amoniacal dando un pretipitado de urato de
plata. Esta es una reaction general de las purinas como grupo. En presencia
del i6 n amonio forma su sal correspondiente que precipita por ser poco soluble.
MATERIAL DE LABORATORIO:
-
8
Tubos de ensaye 13 X 100
- 5 Pipetas de 5 ml
-1 Embudo Buchner
-1 Matraz Kitasato
-1 Embudo de filtration rapida
- Papel filtro
- Agitadbr de vidrio
- Ccipsula de porcelana
MATERIAL BIOLOGICO:
- 2 0 0 g de muestra de suelo rico en materia organica
REACTIVOS:
(Para su preparation vease la preparation de soluciones).
- 25 mg de acido urico sdlido
- Carbonato de sodio al 1 0%
'i
77
_____________________________Manual de bioquimica metabolica j 2010
- Acido clorhldrico concentrado
- Hidroxido de amonio al 10%
- Nitrato de plata al 2%
- Solution saturada de cloruro de amonio
- Reactivo de acido urico de Folin
- Acido nitrico concentrado
PROCEDIMIENTO:
1. A 200 g de suelo rico en materia orgbnica agregue 200 ml de agua
aproximadamente, mezcle y deje reposar durante
2
dias a temperatura
ambiente.
2. Filtre a vacio y separe el liquido.
3. Prepare una solucion de acido urico por adicion a 10 ml de agua puestos en
un tubo de ensaye con 25 mg de acido urico sblido, esta solucion se tomara
como control. Vease su poca solubilidad agitando vigorosamente el tubo y
observando como continua el acido sin disolverse a pesar de que hay una
proportion. Para lograr su disolucion alcalinicese el contenido del tubo por
adicion de 5 ml de solucibn de carbonato de sodio al 10% y agite.
4. Observe como se disuelve (a veces en forma incompleta). Filtrese la
solucion si no estb perfectamente transparente y dividase el filtrado en 5
partes, poniendo las cuatro primeras en tubos de ensaye y la quinta en una
capsula. A partir de 10 ml de filtrado haga lo mismo con el filtrado de la muestra
de suelo.
5. A la primera portion agregar unas gotas de acido clorhldrico concentrado,
para acidificar, mezcle y observe. Deje reposar y vuelva a observar. Vease
como se precipitara el acido urico cristalino despues de algun tiempo.
6
. Al segundo tubo con solucibn de acido urico se le agregan algunas gotas de
solucion amoniacal de nitrato de plata. Observese la aparicion inmediata de
precipitado.
7. Al tercer tubo, agregar algunas gotas de solucion acuosa al 10% de
hidroxido de amonio y unos
12
ml de una solucion saturada de Cloruro ambnico
que se haya filtrado previamente para que no tenga ningun precipitado que
impida apreciar la aparicibn de uno nuevo. Observese como se enturbia,
produciendose una precipitacibn posterior.
Manual de bioqulmica metabolica I 2010
8
. Alcalinice el cuarto tubo con 10 ml de solucion al 10% de carbonato de sodio
y agregar 1 ml de reactivo de
6 cido
urico de Folin. Notese la inmediata
production de un color azul intenso.
9. Agregar 3 gotas de acido nltrico concentrado a la quinta porcion de acido
urico que se encuentra en la capsula, con objeto de oxidarlo. Evapore a
sequedad sobre una llama muy pequena para evitar quemar el producto.
Observe el color del residuo.
10. Deje enfriar la capsula y tome el residuo con un agitador que se acabe de
sacar de un frasco o tubo de ensaye con solucion de hidroxido de amonio al
1%, para que aun lleve esta sustancia. Observe como el color anaranjado del
residuo cambia a violeta al contacto con el amoniaco. Calentar la capsula
nuevamente en presencia de mas amoniaco.15
HOJA DE TRABAJO
1. - Anota y compara detalladamente todos los cambios observados en los
cuatro tubos preparados, tanto los tubos control como los tubos de suelo.
2. - Describe el color y los cambios que percibiste en la porcion que colocaste
en la capsula de porceiana, para ambos casos.
Tubo
Cambios observados
1 control
1 suelo
2 control
2 suelo
3 control
3 suelo
4 control
\
4 suelo
DISCUSION DE RESULTADOS
79
Manual de bioquimica metabolica I 2010
CONCLUSIONES
PREGUNTAS:
1.-^Cual es el origen metabolico del acido urico?
2. -^Cuales son los productos finales de su completa degradation en el suelo?
3. -^Cual es el coste energetico, en ATPs, al sintetizar el resto de hipoxantina
del IMP a partir de C 0 2 y NH4+?
4. -(j,Por que es toxica la desoxiadenosina para las celulas de los mamlferos?
5.
-lndica cuales de las sustancias siguientes son inhibidores basados en el
mecanismo y explica la razon.
a) Tosil-L-feniialanina clorometilcetona con la quimotripsina.
b) Trimetroprim con la dihidrofolato reductasa bacteriana.
c) El analogo 5-lactona del (NAG)4 con la lisozima.
d) Alopurinol con la xantina oxidasa.
6
. -Las celulas normales mueren en un medio nutriente que contiene timidina y
metotrexato, el cual mantiene el crecimiento de las celulas mutantes diferentes
de timidilato sintasa. Explique.
7.
-lngerir gran cantidad de glucosa antes de comer el maraton parece una
buena manera de aumentar las reservas de combustible. Sin embargo, los
corredores expertos no toman glucosa antes de la prueba. ^Cual es la razon
bioquimica por la que evitan este combustible potencial?. Sugiere considerar el
efecto de la ingestion de glucosa sobre el nivel de insulina.
BIBLLIOGRAFIAS:
•
-Herrera. E. Bioquimica, 2a. Edicion Interamericana. Mexico 1996.
•
-Karp. Biologia Celular, 2a. Edicion. Interamericana, Mexico 1992.
•
-Rawn, D Bioquimica. Edit. McGraw- Hill. Mexico 1999.
80
__________________________ Manual de bioquimica metabolica J 2010
•
-Ora, Ana Marla L6 pez Colome. Manuales Departamentales. Bioquimica
y
•
Biologla Molecular. Facultad de Medicina UNAM, Departamento de
Bioquimica.
•
Me Graw Hill. Mexico 2000
Manual de bioquimica metabolica J 2010
PRACTICA No. 12
TRANSAMINACION
OBJETIVO:
Obtener un extracto crudo de piruvicotransaminasa a partir de un producto
vegetal para medir la actividad de transaminacion de la enzima por colorimetrla
y determinar sus parametros cin§ticos.
Fundamento:
Una reaccidn de transaminacion es la primera etapa de la desasimilacion de los
aminoacidos, y sirve para encauzar los grupos amino hacia el a-cetoglutarato,
para transformarlo en glutamato que posteriormente ser£ sometido a una
reaccion
de
desaminacion
oxidativa,
catalizada
por
la
glutamato
deshidrogenasa, form&ndose un ion amonio que sera utilizado para generar
urea.
aminoacido ( 1 ) + a-cetoacido ( 1 ) <==> a-cetoacido (2 ) + aminoacido (2 ) (24)
La primera es la reaccion entre un aminoacido y un alfa-cetoacido, en la que el
grupo amino es transferido de aquel a este, con la consiguiente conversion del
aminoacido en su correspondiente alfa-cetoacido.
Despues de la formacion de glutamato, este transfiere su grupo amino
directamente a una variedad de alfa-cetoacidos por varias reacciones
reversibles de transaminacion: donacion libremente reversible de un grupo
amino alfa de un aminoacido al grupo ceto alfa de un alfa-cetoacido,
_____________________________ Manual de bioquimica metabolica j 2010
acompanado de la formacion de un nuevo aminoacido y un nuevo alfacetoacido. (25)
Todas las transaminasas utilizan el mismo grupo prostetico, el piridoxal fosfato
(una forma coenzimatica de la vitamina B6 ), que es transportador temporal del
grupo amino. El piridoxal fosfato se enlaza covalentemente con el grupo amino
£ de un residuo de lisina, en ausencia de sustrato (el aminoacido). (24)
MATERIAL DE LABORATORIO:
-1 Anillo de hierro
-1 Bisturi
-1 Pipeta Pasteur
- 2 Cristalizadores
- 2 Pipetas de 1 ml
- 2 Pipetas de 5 ml
-1 Pipeta de 10 ml
-1 Probeta graduada de 50 ml
-1 Termometro -10 a 200° C
-1 0 Tubos de ensaye
- 2 Vasos de precipitados de 250 ml
- Tela de asbesto
- Soporte universal
i
- Botella lavadora de 500 ml
- Bulbo 1 ml para pipeta Pasteur
- Embudo de vidrio de talle largo
- Gasa 4 cuadros de 10 x 10 cm
- Gradilla
- Hielo
- Mechero Bunsen
- Mortero con pistilo
MATERIAL BIOLOGICO:
- Chicharos frescos 10 g
____ _______ ____________
Manual de bioquimica metabolica | 2010
REACTIVOS:
(Para su preparacion vease la preparacion de soluciones).
- Solucion acida de 2,4-dinitrofenilhidrazina 1.5 mM
- Solucion amortiguadora de TRIS-HCI40 mM, EDTA 0.25 mM pH 7.5
- Solucion de NaOH 1 N
- Solucion patron de acido piruvico 2 mM
-Substrato: L-alanina 0.1 mM alfa-cetoglutarato 0.1 mM, Tris - HCI 0.1 M, pH
7.5
EQUIPO:
- Colorimetro
- Celdas de 1 cm
- Parrilla de agitacion
PROCEDIMIENTO:
A) Obtencion de extracto crudo de enzima
1.
Coloque el tubo para homogeneizado o el mortero en una cama de hielo.
Coloque dos tubos de ensaye en la cama de hielo.
2. Con el bisturi pique finamente los chicharos y coloque el picado en el tubo
para homogeneizado o en el mortero.
3. Agregue 20 ml de la solucion TRIS-HCI 40 mM pH 7.5. Homogenice el
picado manteniendo el tubo dentro del bafto de hielo.
4. Coloque el embudo dentro de un tubo de ensayo de la cama de hielo,
coloque 4 capas de gasa sobre el embudo y filtre el homogeneizado a traves
de las 4 capas de gasa.
5. Vierta el filtrado en un tubo de centrifuga y centrifugue a 3500 rpm durante 5
minutos.
6
. Vierta el sobrenadante en un tubo de ensayo frio, mantenga el tubo de
ensayo en un bafto de hielo.
B) Cinetica de la transaminacion
1. En un vaso de precipitados de 250 ml prepare un bafto a 37° C.
2. Arme el soporte universal con el anillo de hierro y la rejilla de asbesto, ponga
a hervir agua destilada en un vaso de precipitados de 250 ml.
Manual de bioqulmica metabolica
3. Tome
8
tubos de ensayo, etiquete los tubos del 1 al
agregue
1
ml de substrato,
0 .2
8
2010
, en el tubo No.
8
ml de extracto y hierva el tubo a bano maria
durante 5 min.
4. En los tubos del 1 al 7 agregue los reactivos en el orden de la siguiente
tabla.
Volumen ml
Tubo Sustrato Tris-HCI
E xtracto
5. Incube los
8
1
0 .0 0
1 .0 0
0 .2
2
0.05
0.95
0 .2
3
0 .1 0
0.90
0 .2
4
0 .2 0
0.80
0 .2
5
0.40
0.60
0 .2
6
0.80
0 .2 0
0 .2
7
1 .0 0
0 .0 0
0 .2
tubos 30 minutos a 37° C. Detenga la reaccion colocando los
tubos en un bano de hielo
C) Curva de calibracion y medicion de actividad enzimatica
1. Tome 6 tubos de ensayo y etiquete los tubos del 1 al 6 .
2. En los tubos del 1 al 6 agregue los readtivos en el orden de la siguiente tabla
(Curva de calibracion).
Volum en m l
Tubo Agua Patron Sustrato
1
0 .2
0 .0
1 .0
2
0 .2
0 .1
0.9
3
0 .2
0 .2
0 .8
4
0 .2
0.4
0 .6
5
0 .2
0 .8
0 .2
6
0 .2
1 .0
0 .0
Manual de bioquimica metabolica 1 2010
3. Adicione a los 14 tubos 1 ml de 2,4 dinitrofenilhidrazina 1.5 mM .
4. Agite vigorosamente los tubos para obtener una mezcla homogenea e
incube a temperatura ambiente durante
20
minutos.
5. Agregue a cada tubo 5 ml de solucion de hidroxido de sodio 1 N, agite
vigorosamente cada tubo.
6
. Incube a temperatura ambiente durante 5 min.
7. Calibre a 505 nm el colorlmetro a 0 de absorbancia con el tubo 1 de la curva
de calibracion. Lea la absorbancia a 505 nm de cada tubo.
HOJA DE TRABAJO
1. - Grafique la curva de calibracion de A vs [ac. Piruvico].
2. - Calcule la concentracion de acido piruvico obtenido con cada concentracion
de sustrato.
3. - Calcule la velocidad inicial de la reaccion enzimatica:
v = micromoles de acido piruvico/min y las unidades internacionales por
mililitro:
u.i. = micromoles/ml min
4. - Elabore la grafica
de Michaelis de [substrate] vs [ac.
(micromoles/min).
5. - Calcule la Km y la Vmax de la enzima.
6.
- Interprete el significado de los valores de Km y de Vm&x.
7. - Explique el resultado obtenido en el tubo No.
DISCUSION DE RESULTADOS
CONCLUSIONES
8
de la cinetica.
Piruvico]
_______________________
Manual de bioquimica metabolica j 2010
PREGUNTAS:
1
.-£Q u6 es la transaminaci6 n?
2. -<j,Cual es su importancia?
3. - Nombra los a-cetoacidos que se forman por transamination de cada uno de
los siguientes aminoacidos:
a) Alanina
d) Leucina
b) Aspartato
c) Glutamato
e)Fenilalanina
f) Tirosina
4. - Escriba la ecuacion equilibrada para la conversidn de aspartato en glucosa,
via oxalacetato. Citar los coenzimas que participan en estas etapas.
5. - Escribir la ecuacion equilibrada para la conversion de aspartato en
oxalacetato, via fumarato.
6
!- Proponga una funcion para el nitrogeno guanidinico, cargado positivamente,
durante la escision del arginino-succinato en arginina y fumarato.
BIBLIOGRAFIA
® http://www.transaminasas.com/reacciones de transaminacin
• http://es.wikipedia.org/wiki/Transaminaci%C3%B3n
"vianuai a e Dioquimica metaDOirca ! 2010
Preparacion de
Soluciones
Manual de bioqulmica metabolica I 2010
PRACTICA No. 1
DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES
1. Soluciones de carbohidratos al 2 %, pesar 2 gr. del carbohidrato y aforar a
100
2
ml con agua destilada.
. Reactive de Benedict, Pesar 100 g de Na2C03 anhidro y disolver en 200 ml
de agua destilada
hervida. Pesar 17.3 g citrato de sodio y disolverlo en 200
ml de agua destilada hervida. Pesar 17.3 g de CuS04.5H20 y disolverlo en
300 ml de agua destilada hervida. Mezclar las tres soluciones cuando esten
frias. Aforar a 1 L con agua destilada hervida.
PRACTICA No. 2
FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR LEVADURAS
(Sacharomyces cereviciae)
1. Solucion de Glucosa al 1 %, pesar
1
gr. del carbohidrato y aforar a
100
ml
con agua destilada.
PRACTICA No. 4
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD SUCCINATO DESHIDROGENASA
1.
- Acido succinico al 3% neutralizado con hidroxido de sodio al
10%
hasta pH
7.4: Mida 3 ml de acido succinico y disuelvalos en agua destilada hasta un
volumen final de 100 ml. Con ayuda de un potenciometro agregue gota a gota
el hidroxido de sodio al
10%
(pese
10
g de hidroxido y disuelvalos con agua
destilada hervida y fria hasta un volumen final de 100 ml) hasta obtener el pH
7.4.
2. - Azul de metileno al 0.001%: Pese 0.001 g de azul de metileno y disuelvalos
con alcohol hasta obtener un volumen final de
100
ml.
89
Manual de bioquimica metabolica 2010
3.- Acido tricloroacetico al 20%: Mida 20 ml de cicido tricloroaoetico y mezcle
con agua destilada hasta un volumen de 100 ml.
PRACTICA
No . 6
RESPIRACI6 N EN CELULAS VEGETALES
1.
Solucion de Ba(OH)2 0.1 M, pesar 17.1 gr. del hidroxido y aforar a 1000
ml con agua destilada.
2. Solucion de acido oxalico 0.1 M, pesar 90.04 gr. del acido y aforar a 1000
ml con agua
destilada.
PRACTICA No. 7
RESPIRACION CELULAR EN PLANTAS Y ANIMALES
1. Solucion de Hidroxido de sodio NaOH 0.25 M, pesar 2 gr. y aforar a 200
ml con agua
destilada. Posteriormente diluir
1 :1 0 0
PRACTICA No. 9
RADICALES LIBRES (LIPOPEROXIDACI6N)
1 - Acido tiobarbiturico al 0.8% (TBA): Pese 0.8 g de acido tiobarbiturico y
disuelvalos en agua destilada hasta un volumen final de
100
ml.
2 - Cloruro de potasio al 2%: Pese 2 g de cloruro de potasio y disuelvalos hasta
un volumen de
100
ml con agua destilada.
3. - Acido acdtico al
2 0 %,
pH 3.5: Mida
20
ml de acido acetico concentrado y
diluya con agua destilada hasta un volumen final de 100 ml. Con ayuda de un
potenciometro agregue gota a gota acetato de sodio hasta obtener el pH 3.5.
4. - Amortiguador tris 150 mMol/l, pH 7.4: Disuelva 18.165 g de Tris en agua
destilada y afore a 1 litro. Con ayuda de un potenciometro agregue poco a poco
HCI 0.1 N hasta el pH de 7.4.
__________ __________________ Manual de bioquimica metabolica | 2010
5.- Butilato de hidroxitolueno BHT (antioxidante)
88
mg/10 ml de etanol: Pese
0.88 g de BHT y disuelvalos en 100 ml de etanol.
PRACTICA No. 10
CONVERSION DE LIPIDOS A CARBOHIDRATOS
1. - Mezcla cloroformo-metanol 2:1: En un vaso de precipitado agregue 2 ml de
cloroformo y
1
ml de metanol, mezcle y tape.
2. - SDS (lauril sulfato de sodio) al 10 %: Pese 10 g de lauril sulfato de sodio y
disuelvalos con agua destilada hasta un volumen final de
3. - Acido tricloroacetico al
10
%: Mida
10
100
ml.
ml de acido tricloroacetico
concentrado y diluya con agua destilada hasta un volumen final de
100
ml.
4. - Fenol al 5 %: Mida 5 ml de fenol y llevelos a un volumen final de 100 ml con
agua destilada.
5. - Hidroxido de sodio 0.8 N: Pese 32 g de hidroxido de sodio y afore a 1000 ml
de agua destilada hervida y fria.
6.
- Solucion amortiguadora de fosfatos 0.1 M, pH 7.5, 3 mM de MgCI2:
7. - Reacfivo de Biuret: Disoiver 1.5 g de CUSO4.5 H2O y
6
g de tartrato doble de
sodio y potasio tetrahidratados en unos 500 ml de agua destilada, adicionar
300 ml de NaOH al 10 % libre de carbonates y aforar a 1000 ml con agua
destilada. Almacenar en botella de polietileno.
8.
- Solucion patron de glucosa 100 pg /ml: Pese 0.01 g de glucosa y disuelva
en
100
ml de agua destilada.
9. - Solucion patron de caseina 20 mg/ml: Pese 2 g de caseina y disuelvalos en
100
ml de agua destilada.
10. - Solucion de NaCI al 1%: Pese 1 g de cloruro de sodio y disuelvalos en
agua destilada hasta un volumen de
100
ml.
11. - Solucion de hipoclorito de sodio al 1%: Pese 1 g de hipodorito de sodio y
disuelvalos en agua destilada hasta un volumen final de
100
ml.
91
Manual de bioquimica metabolica I 2010
PRACTICA No. 11
DETERMIN ACION DE ACIDO URICO EN SUELO
1. - Carbonato de sodio a! 10%: Pese 10 g de carbonato de sodio y disuelva en
agua destilada hasta un volumen final de
100
ml.
2. - Hidroxido de amonio al 10%: Mida 10 ml de hidroxido de amonio y diluya
hasta un volumen de
100
ml con agua destilada.
3 - Nitrate de plata ai 2%: Pese 2 g de nitrate de plata y disuelva en agua
destilada hasta obtener un volumen de
100
ml.
4.- Solucion saturada de Cloruro de amonio: En un vaso de precipitado agregue
50 ml de agua destilada aproximadamente y despues agregue pequenas
cantidades de cloruro de amonio y agite siga agregando el cloruro hasta que el
soivente deje de disolver.
PRACTICA No. 12
TRANSAMINACION
1. - Solucion acida de 2,4 dinitrofenilhidrazina 1.5 mM:
2. - Solucion amortiguadora de TRIS-HCI40 mM, EDTA 0.25 mM pH 7.5:
3 - Solucion de NaOH 1 N: Pese 40 g de hidroxido de sodio y afore con agua
destilada hervida y fria a un volumen de
1
litro.
4. - Solucion patron de £cido piruvico 2 mM:
5. -Substrato: L-alanina 0.1 mM, alfa-eetoglutarato 0.1 mM, Tris - HCI 0.1 M,
pH7.5:
92