EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN
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EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO CONDICIONES CONTROLADAS ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C. Junio de 2010 EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO CONDICIONES CONTROLADAS ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar por el título de MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C. Junio 2010 NOTA DE ADVERTENCIA Artículo de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas anhelo de buscar la verdad y la justicia”. EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO CONDICIONES CONTROLADAS ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ APROBADO ______________________________ Jorge Cuéllar-Anjel, D.V.M., M.Sc. Director ___________________________ Janeth del Carmen Arias, M.Sc. Jurado EFECTO DEL INMUNOMODULADOR COMERCIAL ERGOSAN® SOBRE LA SUPERVIVENCIA DE CAMARONES Litopenaeus vannamei INFECTADOS PER OS CON EL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA MANCHA BLANCA (WSSV) BAJO CONDICIONES CONTROLADAS ANA MILENA SUÁREZ GÓMEZ APROBADO ______________________________ Ingrid Schuler, Ph.D. Bióloga Decano Académico ___________________________ Janeth del Carmen Arias, M.Sc. Bacterióloga Directora de Carrera A Dios, por guiarme y llenarme de infinitas bendiciones. A mis padres, Orlando Suárez y Elina Gómez, por su amor incondicional, su esfuerzo y perseverancia para formarme como persona y profesional integral. A mi hermosa hermana, Carmen Suárez, por brindarme todo su cariño y valiosos consejos en momentos difíciles. A mi cuñado, Eduardo Jaimes, por su gran ayuda y colaboración. A mi sobrinita Isabella, quien con su simpatía y ternura alegró mis días. A ellos y a toda mi familia, por su respaldo y apoyo que hicieron posible el alcance de mis metas. AGRADECIMIENTOS Especialmente al Dr. Jorge Cuéllar-Anjel, por su meritorio compromiso como Director de Tesis, por su valioso aporte de conocimientos, por su inmensa colaboración, paciencia y perseverancia en situaciones de dificultad. Por todo el apoyo brindado con el cual hizo posible la conclusión satisfactoria de ésta investigación. Además, mis más sinceros agradecimientos por todos los consejos ofrecidos que ayudaron favorablemente en mi crecimiento como profesional integral. A CAMACO (Camaronera de Coclé S.A), por financiar y permitir el desarrollo de este trabajo. A su gerente el Ing. Roberto Chamorro, por su aprobación y su apoyo. A Mario Aguirre de la empresa Schering Plough – Salud Animal, por ratificar mi colaboración en la investigación y por su contribución a nuevos avances en Acuicultura. A mi compañero y amigo el Ing. Agrónomo Giancarlo Cerrud, por su calidad humana representada en su enorme ayuda y cooperación, además agradezco el aporte de ideas y conocimiento que hicieron posible a cabalidad el alcance de los objetivos propuestos. Al personal de la Sala de Bioensayos de CAMACO S.A., Luis Alfredo Quezada y Cristian Saenz quienes cooperaron arduamente en las actividades y trabajo técnico. A todos los integrantes de UNICAM (Unidad de Investigación del Camarón, CAMACO S.A.), por su ayuda en gran parte de la realización del presente estudio, en especial a su Director Darwin Zambrano y a la Licenciada Vielka Pacheco. vi A mis nuevos amigos Yuliana Christopher, Thelma Quintero, Edward Villanero quienes con su afecto se convirtieron en la mejor compañía. Agradezco de corazón a “Vilo” Ábrego por brindarme su cariño y enseñanzas que hicieron de mi estadía en Aguadulce, Panamá una valiosa experiencia de vida. A Janeth Arias, Bacterióloga M.Sc., Directora de las carreras de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana, por su respaldo a lo largo de mi carrera lo cual contribuyó significativamente en mi formación profesional. Fecha: Junio de 2010 vii TABLA DE CONTENIDO 1. Introducción………………………………………………………………... 19 2. Marco Teórico……………………………………………………………… 21 2.1 Generalidades de los camarones………………………………………… 21 2.1.1 Taxonomía………………………………………………………………. 21 2.1.2 Anatomía general………………………………………………………. 21 2.1.3 Ciclo de vida de los camarones………………………………………… 24 2.2 Sistema de respuesta inmune en camarones……………………………. 27 2.2.1 Inmunidad celular……………………………………………………… 27 2.2.1.1 Componentes de la hemolinfa del camarón………………………… 27 2.2.1.2 Funciones de los hemocitos…………………………………………... 30 2.2.1.3 Fagocitosis…………………………………………………………….. 31 2.2.1.4 Formación de nódulos………………………………………………... 32 2.2.1.5 Encapsulación………………………………………………………… 32 2.2.1.6 Coagulación…………………………………………………………… 32 2.2.1.7 Melanización………………………………………………………….. 33 2.2.2 Inmunidad humoral……………………………………………………. 33 2.2.2.1 Proteínas patrón de reconocimiento………………………………… 34 2.2.2.2 Sistema profenoloxidasa (proPO)…………………………………… 34 2.2.2.3 Fases iníciales del sistema proPO……………………………………. 35 2.3 Medición de parámetros inmunológicos en camarones………………... 36 2.4 Bioensayos………………………………………………………………… 37 2.4.1 Control de condiciones en Sala de Bioensayos………………………... 37 2.5 Principales enfermedades en camarones Penaeidos……………………. 38 2.5.1 Virus…………………………………………………………………….. 38 2.5.2 Bacterias………………………………………………………………… 39 viii 2.5.3 Hongos…………………………………………………………………... 40 2.5.4 Protozoarios…………………………………………………………….. 40 2.5.5 Toxinas………………………………………………………………….. 41 2.5.6 Factores Fisicoquímicos………………………………………………... 41 2.5.7 Etiología idiopática……………………………………………………... 41 2.6 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)…………………….. 41 2.7 Inmunoestimulantes……………………………………………………… 45 ® 2.7.1 Inmunomodulador Comercial (AquaVac. - Ergosan )…………….. 47 2.8 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)…………………………… 48 3. Formulación del problema y Justificación………………………………. 50 3.1 Formulación del problema………………………………………………. 50 3.2 Justificación………………………………………………………………. 50 4. Objetivos……………………………………………………………………. 53 4.1 General……………………………………………………………………. 53 4.2 Específicos………………………………………………………………… 53 5. Materiales y Métodos……………………………………………………… 55 5.1 Descripción del área de trabajo ………………………………………… 55 5.2 Población analizada……………………………………………………… 55 5.3 Fases experimentales……………………………………………………... 56 5.3.1 Preparación del Material de la Sala de Bioensayos (Fase 1)………… 57 5.3.1.1 Acuarios……………………………………………………………….. 57 5.3.1.2 Desinfección de acuarios y tuberías de la Sala……………………… 58 5.3.1.3 Tratamiento del agua………………………………………………… 58 5.3.1.4 Pruebas microbiológicas del agua…………………………………… 59 5.3.2 Transferencia y Siembra de Animales en los Acuarios (Fase 2)…….. 62 5.3.2.1 Control de peso de los camarones…………………………………… 63 5.3.2.2 Unidades experimentales…………………………………………….. 63 5.3.2.3 Mantenimiento de acuarios…………………………………………. 65 5.3.2.4 Condiciones físico – químicas del agua de los acuarios……………. 66 ix 5.3.3 Dieta experimental (Fase 3)……………………………………………. 66 5.3.3.1 Tratamientos experimentales (Diseño de la Investigación)………... 68 5.3.3.2 Alimentación experimental de los camarones………………………. 69 5.3.4 Infección experimental (Fase 4)……………………………………….. 71 5.3.4.1 Amplificación de cepas virales purificadas…………………………. 71 5.3.4.2 Preparación de la Papilla infectante………………………………… 72 5.3.4.3 Verificación de Papilla mediante nested – PCR……………………. 73 5.3.4.4 Prueba de Virulencia de la Papilla………………………………….. 75 5.3.4.5 Suministro de Papilla infectante…………………………………….. 76 5.3.5 Registro de Mortalidad (Fase 5)………………………………………. 77 5.3.5.1 Toma de muestras para pruebas confirmatorias de laboratorio…………………………………………………………………….. 77 5.4 Técnicas confirmatorias de la infección por el virus WSSV…………... 80 5.4.1 Prueba molecular………………………………………………………. 80 5.4.1.1 Extracción de ADN………………………………………………….. 80 5.4.1.2 Nested – PCR………………………………………………………… 82 5.4.1.3 Observación e interpretación de resultados (nested-PCR)…………………………………………………………………. 84 5.4.2 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)………………………. 86 5.4.3 Histopatología…………………………………………………………... 88 5.5 Extracción de Hemolinfa (prueba complementaria)…………………… 90 5.5.1 Conteo de Hemocitos (Hemograma)…………………………………... 92 5.6 Análisis de la información……………………………………………….. 94 6. Resultados y Discusión……………………………………………………. 95 6.1 Pruebas previas al experimento…………………………………………. 95 6.2 Manifestaciones clínicas de la enfermedad en camarones Infectados……………………………………………………………………… 96 6.3 Pruebas confirmatorias del virus WSSV………………………………... 98 6.3.1 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®)………………………. 98 x 6.3.2 Nested – PCR……………………………………………………………. 100 6.3.3 Histopatología…………………………………………………………... 101 6.4 Prueba de desafío mediante infección per os con el virus WSSV………………………………………………………………………….. 105 6.4.1 Relación de supervivencia entre los tratamientos infectados con los no infectados……………………………………….............................. 107 6.4.2 Relación de supervivencia entre el tratamiento con la dieta ERGOSAN® infectado y el Control infectado……………………………… 109 6.5 Efecto del Inmunomodulador comercial (ERGOSAN®) sobre el recuento de hemocitos………………………………………………. 113 6.5.1 Recuento luego de diez días de suministro de dieta ERGOSAN®………………………………………………………………….. 113 6.5.2 Recuento 20 días después de terminado el suministro de dieta ERGOSAN®………………………………………………………… 114 6.5.3 Recuento 30 días después del terminado el suministro de dieta ERGOSAN®………………………………………………………… 116 7. Conclusiones………………………………………………………………... 120 8. Recomendaciones………………………………………………………….. 122 9. Referencias bibliográficas…………………………………………………. 123 10. Anexos……………………………………………………………………... 131 xi LISTA DE TABLAS Tabla 1. Taxonomía de camarones penaeidos………………………………… 21 Tabla 2. Funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de los camarones penaeidos………………………………………………………. 23 Tabla 3. Estadios del ciclo de vida de camarones penaeidos………………… 24 Tabla 4. Funciones de los distintos tipos de células presentes en la hemolinfa de camarón…………………………………………………………. 30 Tabla 5. Proceso de fagocitosis – reacción de defensa celular………………... 31 Tabla 6. Características alimento CAMPENT – TOP………………………… 67 Tabla 7. Diseño experimental…………………………………………………. 68 Tabla 8. Diseño experimental – Hemograma…………………………………. 69 Tabla 9. Diseño del suministro de papilla infectante…………………………. 76 Tabla 10. Volúmenes necesarios para preparar Mix 1………………………... 82 Tabla 11. Programación del termociclador – WSSV…………………………. 83 Tabla 12. Hallazgos histopatológicos…………………………………………. 102 Tabla 13. Porcentaje de Mortalidad…………………………………………… 105 Tabla 14. Media de Supervivencia……………………………………………. 108 Tabla 15. Porcentaje de supervivencia por día………………………………... 109 Tabla 16. Porcentaje de supervivencia de cada acuario infectado……………. 111 Tabla 17. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos 10 días de tratamiento con ERGOSAN®……………………………………… 113 Tabla 18. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos 20 días sin ERGOSAN®……………………………………………………….. 114 Tabla 19. Promedio de hemocitos diferenciales y totales transcurridos 30 días sin ERGOSAN®………………………………………………………. 116 Tabla 20. Consolidado de hemogramas………………………………….......... 118 xii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Morfología externa de camarones penaeidos……………………... 22 Figura 2. Ciclo de vida más típico de Penaeidae tropical o subtropical……………………………………………………………………. 26 Figura 3. Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos asociados……………………………………………………………………… 28 Figura 4. Tipo de hemocitos…………………………………………………. 30 Figura 5. Respuesta inmunológica inducida en los hemocitos………………. 35 Figura 6. Signos clínicos - enfermedad IMNV……………………………… 39 Figura 7. Infección por bacterias en camarón peneido - manchas negras en la cutícula…………………………………………………………………. 39 Figura 8. Lesiones melanizadas causadas por Fusarium solani en camarón Penaeus sp……………………………………………………………………. 40 Figura 9. Caparazón de un juvenil de P. monodon con enfermedad de la mancha blanca (WSSV)……………………………………………….. 43 Figura 10. Cuatro juveniles de P. monodon mostrando signos de infección por Virus de la Mancha Blanca (WSSV)…………………………... 44 Figura 11. Presentación del producto comercial AquaVac. – ERGOSAN®…………………………………………………………………. 47 Figura 12. Vista frontal de la “Casa de Don Popo” – Sala de Bioensayos……………………………………………………………………. 55 Figura 13. Disposición de acuarios en Sala de Infección…………………… 57 Figura 14. Recepción de agua marina……………………………………….. 59 Figura 15. Microbiología de aguas………………………………………….. 60 Figura 16. Esquema descriptivo del proceso de dilución y siembra de muestras de agua marina………………………………………………….. 61 Figura 17. Proceso de transferencia de camarones a los acuarios………….. 62 Figura 18. Unidades experimentales………………………………………… 64 Figura 19. Acuarios con camarones para extracción de hemolinfa 64 xiii y conteo de hemocitos………………………………………………………... Figura 20. Mantenimiento de acuarios………………………………………. 65 Figura 21. pHmetro y medición de pH en el agua de los acuarios…………... 66 Figura 22. Dietas experimentales……………………………………………. 67 Figura 23. Alimentación de los camarones en cada uno de los acuarios……. 70 Figura 24. Inoculación del virus WSSV en camarones sanos……………….. 71 Figura 25. Preparación de papilla infectante………………………………… 73 Figura 26. Esquema descriptivo para evaluación semicuantitativa de la papilla infectante……………………………………………………….. 74 Figura 27. Suministro de papilla infectante a acuarios……………………… 76 Figura 28. Recolección y registro de animales moribundos………………… 77 Figura 29. Proceso de toma de muestras de camarones moribundos………... 79 Figura 30. Extracción de ADN viral………………………………………… 81 Figura 31. Técnica de Nested – PCR……………………………………….. 84 Figura 32. Observación e interpretación de resultados de la nested – PCR………………………………………………………………………….. 85 Figura 33. Shrimple® diagnostic test kit procedure diagram and potencial test results…………………………………………………………. 86 Figura 34. Procesamiento de muestras para técnica de histopatología……… 88 Figura 35. Observación de resultados de prueba Histopatologíca…………... 90 Figura 36. Proceso realizado para la extracción de hemolinfa en camarones…………………………………………………………………. 91 Figura 37. Comparación entre los signos clínicos presentados por un camarón infectado a diferencia de un camarón sano………………………. 97 Figura 38. Manchas blancas en cutícula de camarón L. vannamei………….. 98 Figura 39. Resultados positivos para el virus WSSV mediante la Prueba de Shrimple®…………………………………………………………. 99 Figura 40. Electroforesis en gel de agarosa con resultados positivos de la amplificación del ADN viral mediante nested-PCR……………………. xiv 101 Figura 41. Microfotografía de tejido conectivo afectado por la infección del virus WSSV………………………………………………………………. 103 Figura 42. Microfotografía de láminas histológicas observadas bajo el microscopio (600X)…………………………………………………... 104 Figura 43. Gráfico – Curva de mortalidad…………………………………... 106 Figura 44. Gráfico - diferencia entre el porcentaje de supervivencia de los tratamientos infectados con los no infectados…………………………. 108 Figura 45. Gráfico – Curva de supervivencia………………………………... 110 Figura 46. Gráfico - Tendencia de las poblaciones sobrevivientes por cada uno de los acuarios………………………………………………….. 112 Figura 47. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de diez días de suministro de la dieta a base de ERGOSAN ®…………………………………………………. 114 Figura 48. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de 20 días de haber culminado el suministro de la dieta a base de ERGOSAN®…………………………………………………………………… 115 Figura 49. Gráfico - Diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de 30 días de haber culminado el suministro de la dieta a base de ERGOSAN ®…………………………………. 117 Figura 50. Gráfico – Consolidado de hemogramas ERGOSAN® vs. Control………………………………………………………………………… 119 xv LISTA DE ANEXOS Anexo 1. PCR – WSSV, IHHNV, NHP……………………………………. 131 Anexo 2. Medios de cultivo………………………………………………… 131 Anexo 3. Etiqueta alimento “CAMPENT-TOP”…………………………… 134 ® Anexo 4. Etiqueta producto comercial ERGOSAN ………………………. 135 Anexo 5. PCR – Papilla infectante…………………………………………. 136 Anexo 6. Resultados para prueba de virulencia de la papilla infectante…………………………………………………………………… 137 Anexo 7. Registro de mortalidad…………………………………………… 138 Anexo 8. Registro de toma de muestras…………………………………….. 144 ® Anexo 9. Shrimple - Manual Kit EnBioTec………………………………. 145 Anexo 10. Recuento microbiológico del agua de las unidades experimentales……………………………………………………………… 151 Anexo 11. Registro de resultados para Pruebas de Shrimple ®……………… 152 Anexo 12. Registro de resultados para técnica Nested – PCR……………… 153 Anexo 13. Registro lectura de láminas histopatológicas……………………. 154 Anexo 14. ANOVA y Duncan entre los cuatro tratamientos……………….. 155 Anexo 15. ANOVA y Duncan para tratamientos infectados……………….. 156 Anexo 16. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos luego de 10 días con ERGOSAN®……………………………………………………………. 157 Anexo 17. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 20 días después de haber suspendido ERGOSAN®………………………………… 160 Anexo 18. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 30 días después de haber suspendido ERGOSAN®………………………………… xvi 163 Resumen Este estudio se llevo a cabo en la Sala de infecciones experimentales de la Camaronera de Coclé S.A. ubicada en la Hacienda La Estrella, Distrito de Natá, Provincia de Coclé, República de Panamá. Uno de los mayores problemas a los que se enfrenta la industria camaronera es a la creciente presencia de enfermedades infecciosas causadas principalmente por virus, generando altas tasas de mortalidad y graves pérdidas en el sector. Por lo antes postulado, el objeto de este experimento fue evaluar la capacidad del producto comercial ERGOSAN ® en el fortalecimiento de sistema natural de defensa y así mismo en la reducción del índice de mortalidad del camarón blanco (L. vannamei) frente a la infección per os del Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV). La fase experimental se desarrolló en 40 acuarios y el suministro de las dietas (dieta ERGOSAN® y dieta BASE – Control) se hizo dos veces diarias durante diez días continuos. El día 11 se llevo a cabo la infección vía oral con el virus WSSV, continuando del día 2 en adelante con la dieta control (sin ERGOSAN®) en todos los tratamientos. Posterior a la infección se realizó un registro de mortalidad y se tomaron muestras para la confirmación del virus mediante inmunocromatografía, Nested – PCR e histopatología. El grupo con ERGOSAN ® presento una supervivencia del 11% mientras que el Control obtuvo un 6%, sin que se presentaran diferencias significativas entre los tratamientos (P < 0.05). El hemograma presentó diferencias significativas (P < 0.06) luego de diez días con ERGOSAN®, en cuanto a las células semigranulares y totales a favor del Control. El recuento de hemocitos, tanto diferencial como el total, tuvo una tendencia positiva en favor de ERGOSAN® 20 días después de terminar el suministro del producto inmunomodulador. Luego de transcurridos 30 días de haber suspendido el producto, el hemograma retomo valores similares entre los valores obtenidos para el producto como para el Control. Se concluye que incorporar ERGOSAN® en el alimento para camarones y suministrarlo por 10 días antes de una infección con WSSV, podría ayudar a mejorar la supervivencia de las poblaciones expuestas al virus. No es clara la causa del incremento del hemograma tras 20 días de terminado el tratamiento con ERGOSAN®, pero se puede considerar como un efecto tardío favorable del producto, lo cual amerita un estudio dirigido más completo. Se recomienda realizar pruebas con concentraciones mayores de ERGOSAN®, con el fin de lograr un menor impacto del virus WSSV y por ende una mejor supervivencia de los camarones. Abstract This study was carried out in the experimental infections room of the Shrimp Factory Coclé Inc., located in the estate “La Estrella”, Natá District, Province of Coclé, in the Republic of Panama. One of the major problems facing for the shrimp industry is the growing presence of infectious diseases mainly caused by viruses, generating high mortality rates and huge losses in the sector. By the above, the object of this experiment was to assess the ability of the commercial product called ERGOSAN ® in the strengthening of natural defense system and also in the reduction of the mortality rate of white shrimp (L. vatmamei) compared to per os infection of the White Spot Syndrome Virus (WSSV). The pilot phase was developed in 40 aquariums and the supply of the diets (ERGOSAN® diet and BASIC diet - Control) was twice daily for 10 days consecutives. The 11th day was carried out the infection orally with the WSSV virus, continuing from the day 2 at forward with the control diet (without ERGOSAN®) in all treatments. After the infection it was carried out a record of mortality and samples were taken to the confirmation of the virus by immunochromatography, Nested - PCR and histopathology. The group with ERGOSAN®displayed a survival from 11 percent while the Control obtained a 6 percent, without significant differences were presented between the treatments (P < 0.05). The hemogram presented significant differences (P < 0.06) after 10 days with ERGOSAN®, with regard to both the semigranulated and total cells in favour of the control. The counting of haemocytes, both differential as total, had a positive trend in favour of ERGOSAN® 20 days after the end of the supply of the immunomodulating product. Thirty days after of suspending the product, the hemogram returns to similar values between the values obtained for the product as for the control. It concludes that incorporate ERGOSAN® in the shrimp feed and supply it by 10 days before an infection with WSSV, could help to improve the survival of the people exposed to the virus. It is not clear the cause of the increases of the hemogram 20 days after of ending the treatment with ERGOSAN®, but it can be considered as a positive late effect of the product, which warrants a guided study more comprehensive. It recommends make tests with higher concentrations of ERGOSAN ®, in order to achieve a lesser impact of the WSSV virus and hence a better survival of the shrimp. 1. INTRODUCCIÓN La Acuicultura en los últimos años ha tenido grandes avances y se ha convertido en una de las más importantes áreas comerciales. La contribución de la acuicultura al suministro mundial, con base en datos arrojados por la F.A.O, en los tres últimos decenios, la acuicultura ha crecido con rapidez a nivel global. En la década de 1970, suponía alrededor del 6 % del pescado disponible para el consumo humano; en 2006, esta cifra era del 47 %. En América Latina, la producción estimada en millones de toneladas fue de 0,07 en 1985, luego aumento a 0,41 en 1995 y en el 2005 alcanzó un total de 1,37. En cuanto a la camaronicultura, se estima que la producción mundial del camarón fue de 4,00 millones de toneladas en el año 2005. Donde la variación anual fue de un 13, 8 % entre los años 1995 al 2005. (F.A.O. – Estado Mundial de la Pesca y la Acuicultura, 2008) En la República de Panamá se cultivan especialmente dos especies de camarón Litopenaeus vannamei y L. strylirostris. La principal provincia de Panamá dedicada al cultivo de camarón es Coclé, seguida por Herrera, Panamá, Veraguas y Los Santos (Dirección de estadística y Censo de la Contraloría General de la República de Panamá, 2007) A partir de los esfuerzos que se han hecho en los últimos años, se ha logrado incrementar la producción en Panamá. Sin embargo, su desarrollo ha presentado una serie de problemas relacionados con el crecimiento y la supervivencia en condiciones de cultivo, generados a partir de la presencia de microorganismos patógenos para la especie, como virus, bacterias, Protozoos y Hongos. En la actualidad la principal amenaza para el desarrollo de la industria camaronera son las enfermedades infecciosas especialmente las causadas por virus. Dentro de los agentes etiológicos reconocidos en el cultivo del camarón, los virus han generado las mayores catástrofes económicas para las camaroneras en el ámbito 19 mundial. Durante los 90´s emergió una de las mayores panzootias en camarones, causada por el virus de síndrome de la mancha blanca (White Spot Syndrome Virus – WSSV) en áreas costeras del Sudeste y Norte de Asia, Centro y Sur América. El virus se ha vuelto endémico en América Central y del Sur, principalmente en Ecuador, Panamá, Colombia y Perú. En la actualidad impacta severamente la producción y ha contribuido a la disminución, en corto tiempo, de la producción de camarón en estos países. El virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) posee una presencia permanente en el medio ambiente de las zonas afectadas. Esto indica que la aparición o no de la enfermedad puede estar relacionada con el estado inmunitario de los camarones, la resistencia genética, las condiciones generales del medio ambiente y manejo que se le da al cultivo. Por tal razón, la mejor manera de prevenir brotes de la enfermedad es mantener el cultivo en condiciones ambientales estables, exponiéndolos al menor grado de estrés. Se ha descubierto que durante los brotes de mancha blanca, se da un descenso dramático en las defensas de los camarones y a la disminución en el conteo de hemocitos circulantes totales. Se estima que en el camarón las reacciones de resistencia a patógenos están basadas en el número de hemocitos circulantes en la hemolinfa. Por tal razón, en la actualidad la inmunoestimulación es una alternativa efectiva para manipular la respuesta inmune del camarón antes de que estos se enfrenten a desafíos de patógenos en el cultivo. A partir de lo anteriormente postulado este proyecto tendrá como fin evaluar la capacidad que tiene el producto comercial ERGOSAN ® en la proliferación de hemocitos y así mismo en la reducción del índice de mortalidad de camarones (L. vannamei) frente a la infección per os con el virus WSSV. 20 2. MARCO TEÓRICO 2.1 Generalidades de los camarones 2.1.1 Taxonomía La ubicación taxonómica de los camarones penaeidos es la siguiente: Tabla 1: Taxonomía de camarones penaeidos Phylum: Arthropoda Clase: Crustacea Subclase: Malacostraca Serie: Eumalacostraca Superorden: Eucarida Orden: Decápoda Suborden: Natantia Sección: Penaeidae Familia: Penaeidae Subfamilia: Penaeinae Género: Penaeus (Litopenaeus) Especie: vannamei Adaptado de Rodríguez, 1993. En: Gómez, D. y Fajardo, D. 2003 2.1.2 Anatomía general El camarón blanco Litopenaeus vannamei es un invertebrado marino. Posee un tronco compuesto por 14 segmentos más el telson, de los cuales los 8 primeros forman el tórax y los últimos 6 el abdomen. Los apéndices abdominales anteriores se llaman pleópodos y son utilizados para nadar, mientras que los apéndices del tórax, llamados periópodos son usados para caminar. 21 El cuerpo de los camarones presenta un abdomen y cefalotórax definido. El cefalotórax posee un rostro aserrado. Tienen un exoesqueleto conformado por quitina que suele ser delgado y flexible. Presenta una boca en posición ventral. (Figura 1) El aparato digestivo se ensancha a lo largo del dorso, para formar el hepatopáncreas o glándula digestiva que es un órgano vital involucrado en la digestión del alimento, absorción y almacenamiento de nutrientes. El cordón nervioso se extiende a lo largo del vientre. Sus órganos excretores son las glándulas antenales o verdes que lanzan al medio sustancias de desecho. El sistema circulatorio es abierto y compuesto por vasos sanguíneos que transportan la hemolinfa la cual posee cobre y acarrea el oxígeno, por lo que desarrolla un color azuloso. El oxígeno y el dióxido de carbono son transportados desde y hasta las branquias, que es donde se realiza el intercambio gaseoso (Ruppert, E. E. y Barnes, R. D. 1996) Figura 1: Morfología externa de camarones penaeidos. (En: Suárez, C. 2008) En la siguiente tabla se resume las funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de los camarones penaeidos: 22 Tabla 2: Funciones fisiológicas de los principales órganos y estructuras de los camarones penaeidos Órgano/Estructura Función principal Músculo estriado abdominal (cola Movimientos rápidos de huida hacia o abdomen del camarón) atrás contra predadores Antenas Sensores táctiles (detección de predadores) Complejo glándula antenal Excreción y balance osmótico Anténulas Quimiorrecepción Ciegos anterior y posterior Desconocida Exoesqueleto Soporte externo, barrera de defensa. Intestino anterior (boca, esófago, Captación, masticación y estómago) almacenamiento temporal de alimento Branquias Respiración, excreción, osmorregulación y fagocitosis. Hepatopáncreas Digestión del alimento, absorción posterior de nutrientes y almacenamiento de energía Órgano linfoide Posible reconocimiento de antígenos y fagocitosis 23 Mandíbulas, palpos mandibulares Sensores táctiles, captura de y paquetes branquiales partículas de alimento y movimiento de agua hacia las branquias Intestino medio Absorción y excreción Pereiópodos y pleópodos Locomoción y quimiorrecepción Adaptado de Brock y Main, 1994. En: Cuéllar-Anjel, J. et al. 1998 2.1.3 Ciclo de vida de los camarones Los camarones penaeidos desovan en mar abierto. Las larvas a medida que avanzan en su desarrollo se acercan a la costa, donde alcanzan la forma de postlarva. Éstas generalmente penetran en aguas estuarinas, donde continúan su desarrollo rápidamente a juveniles hasta llegar a veces al estado de subadulto y, finalmente, cuando son camarones adultos, (Figura 2) regresan al mar abierto a desovar (Mendoza, F. E. 2007). Tabla 3: Estadios del ciclo de vida de camarones penaeidos Huevo El desove de la hembra ocurre generalmente durante la noche y cada hembra produce aproximadamente 150.000 huevos cada 15 días, los cuales deben mantenerse en aireación constante y temperatura entre 26 y 28°C. La eclosión de los huevos sucede a las 12 a 15 horas post-cópula. 24 Larva Este estadio se divide en tres subestadios: nauplio (cuerpo piriforme con sólo tres pares de apéndices natatorios, se alimenta de reservas vitelinas propias), protozoea o zoea (se alimenta de algas y microencapsulados, tiene el cuerpo dividido en cefalotórax y abdomen) y mysis (comienza a ser carnívora, consume nauplios de artemia, desarrolla pereiópodos para su desplazamiento). Postlarva En este estadio el animal presenta hábitos nadadores y tendencia bentónica. A partir de postlarva 10, empieza a ser comercializada. Juvenil En su ambiente natural según las especies y regiones, llegan a juvenil luego de 4 o 5 meses con una longitud de entre 7 y 10 centímetros. Posteriormente, se alejan de las zonas de crianza e ingresan a mar abierto para reproducirse, en la región de aguas más profundas, donde habitan unos meses más. 25 Adulto Se da cuando el camarón logra un peso de 20 gramos alcanzando su madures sexual cuando tiene un peso promedio de 25 a 30 gramos. El apareamiento se da en aguas profundas, en esta misma zona la hembra desova durante la noche. Adaptado de Carvajal, A. M. 1999. El camarón blanco presenta los siguientes estadios en su ciclo de vida: Figura 2: Ciclo de vida más típico de Penaeidae tropical o subtropical (Boschi, E. E. 1980) 26 2.2 Sistema de respuesta inmune en camarones El mecanismo innato de defensa de los artrópodos está basado en la inmunidad humoral y celular (Muñoz, M. et al., 2000); éstos, juegan un papel importante en la detección y eliminación de microorganismos y parásitos potencialmente dañinos. Se puede dividir la respuesta inmune de los artrópodos en diferentes fases: - Reconocimiento de factores ajenos e inicio de actividad inmunológica - Actividad celular y síntesis de efectores inmunitarios - Actividad humoral del sistema inmune La capacidad que tienen los camarones para reconocer y destruir invasores, está basada en los componentes de la inmunidad celular y humoral del sistema circulatorio y son expresados en varias respuestas inmunes (Vergara, F. 1999). 2.2.1 Inmunidad celular Consiste en la activación de una gran cantidad de hemocitos, que tienen la capacidad especial de fijarse al agente extraño y destruirlo. 2.2.1.1 Componentes de la hemolinfa del camarón Para protegerse a sí mismos de la invasión por parte de agentes patógenos, los camarones no generan inmunoglobulinas, pero sí moléculas efectoras que están involucradas en la respuesta inmune. Teniendo un sistema circulatorio abierto con fluido hemolinfático (Figura 3), los camarones poseen un inmediato, mas no inducible, mecanismo de defensa y coagulación, para atrapar parásitos y prevenir la pérdida de hemolinfa por una herida (Vergara, F. 1999). Estas reacciones son realizadas por las células de la hemolinfa, las cuales son producidas por el tejido hematopoyético. 27 Figura 3. Sistema circulatorio abierto/semi-abierto de camarón y órganos asociados. C: corazón; HP: hepatopáncreas; OHA: órgano hematopoyético antenal; OHD: órgano hematopoyético dorsal; OHV: órgano hematopoyético ventral; VD: vaso dorsal (Adaptado de Bachere et al., 2004; En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008) En la hemolinfa son transportados continuamente nutrientes, excretas, oxígeno, hormonas y otras moléculas importantes para los diferentes órganos de esos animales. Debido a su fluidez y por la capacidad de llegar directamente a todos los tejidos de los crustáceos, la hemolinfa contiene además todos los componentes del sistema inmunológico. La hemolinfa está compuesta por una fracción celular, representada por las células circulantes o hemocitos y por una fracción líquida constituida por el plasma que contiene diferentes factores humorales. Las respuestas inmunocelulares e inmunohumorales actúan de forma integrada en los crustáceos, protegiéndolos contra la invasión de microorganismos y parásitos, garantizando así su integridad corporal y homeostática (Barraco, M. y Perazzolo L. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008) En la mayoría de los decápodos, se han usado criterios morfológicos asociados con ensayos bioquímicos para identificar y clasificar los diferentes tipos de hemocitos. En el camarón se han reportado tres tipos de hemocitos distintos (Johansson, M. et al. 2000): 28 a) Células hialinas (HC): 80% de la hemolinfa. Son pequeñas con un núcleo grande y muy poco citoplasma. b) Células semigranulares (SGC): 10-13% de la hemolinfa. Más grandes que las hialinas, con presencia de algunos gránulos, sus núcleos son proporcionalmente más pequeños. c) Células granulares (LGC): 4-10% de la hemolinfa. Son más grandes que las semigranulares y por su gran contenido de gránulos, son más refringentes bajo el microscopio (Le Moullac, G. et al. 1997). (Figura 4) Las células hialinas y las semigranulares son capaces de fagocitar sustancias extrañas, pero difieren por la presencia del sistema profenoloxidasa (proPO). Los hemocitos semigranulares y granulares son poseedores del sistema proPO, también pueden ser citotóxicos y causar lisis en células eucariotas, similar a la acción de las “natural killer” en mamíferos. Las células hialinas se mantienen listas para atacar y desplegarse extensamente para fagocitar. Las células semigranulares son inestables, están encargadas de reconocer y responder ante células invasoras para luego atacar desplegándose en la superficie del invasor. Se ha observado que estas células son las únicas que reaccionan ante los polisacáridos microbiales como los lipopolisacáridos (LPS) y β-1,3 glucanos, con una respuesta de degranulación. Las semigranulares son las principales células que intervienen en la reacción de encapsulación. Se ha observado que las células granulares son las responsables de la activación del sistema proPO (Johansson, M. et al. 2000). 29 Figura 4. Tipos de hemocitos (A – F) y reacciones celulares de defensa en curstaceos (G – J). A, D: hemocitos hialinos (HHs) de camarones observado al microscopio de contraste de fase y electrónico de transición, respectivamente; B, E: hemocitos con granulos pequeños (HGPs); C, F: hemocitos con granulos grandes (HGGs). G: fagocitosis de un levadura por un hemocito de L. vannamei; H: encapsulamiento in vitro de nematodo Panagrellus redivirus por hemocitos de Macrobrachium rosenbergii; I: encapsulamiento in vitro de hifas del hongo Ganoderma sp. por hemocitos de Farfantepenaeus pulensis, con fuerte reacción de melanización; J: nódulo hemocítico en el hepatopáncreas de L. vannamei con agregados bacterianos en el centro. (Reproducido de Covarrubias, 2004; En: Morales, V. y Cuéllar–Anjel, J. 2008) 2.2.1.2 Funciones de los hemocitos Tabla 4: Funciones de los distintos tipos de células presentes en la hemolinfa de camarón Tipo de hemocito Función en inmunidad Células hialinas Fagocitosis 30 Células Encapsulación semigranulares Fagocitosis (limitada) Almacenamiento y liberación del sistema proPO Citotoxicidad Células Almacenamiento y liberación del sistema proPO granulares Citotoxicidad Adaptado de Johansson, M. et al. 2000. 2.2.1.3 Fagocitosis Una vez que el parásito ha superado la barrera fisicoquímica de la cutícula, la fagocitosis constituye, junto con los componentes humorales, la primera línea de defensa, siendo la más común de las reacciones de defensa celular (Carvajal, A. M. 1999; Vergara, F. 1999) La quimiotaxis se considera comúnmente como el primero, entre varios eventos, que dirigen una partícula extraña a la fagocitosis. En los artrópodos, las células de la hemolinfa viajan por todo el cuerpo, proporcionando una amplia oportunidad para encontrarse con los invasores y contrarrestar eventos infecciosos (Carvajal, A. M. 1999) El proceso de la fagocitosis está dividido en las siguientes etapas: Tabla 5: Proceso de fagocitosis – reacción de defensa celular Aumento de la capacidad de Opsonización expresión de partículas foráneas. Identificación de la partícula por Reconocimiento receptores de membrana. 31 Fagocitosis Ingestión de la partícula. Formación de fagosomas El fagosoma es una vacuola y está compuesto por la partícula extraña rodeada de una envoltura, la cual es parte de la membrana celular del fagocito. La partícula extraña es destruida Destrucción y digestión por las enzimas del fagolisosoma y/o por un mecanismo bioquímico conocido como choque respiratorio. Adaptado de Vergara F. 1999. 2.2.1.4 Formación de nódulos Cuando la cavidad corporal es invadida por un número de microorganismos que no pueden ser fagocitados, se presenta un agrupamiento de hemocitos que los envuelve inmovilizándolos e impidiendo su diseminación. Se cree que los túbulos del hepatopáncreas y las branquias son los lugares de alojamiento de los agentes extraños eliminados (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992) 2.2.1.5 Encapsulación Tiene el mismo principio que la formación de nódulos. La diferencia se encuentra en que este proceso ocurre como respuesta a parásitos más grandes (Vergara, F. 1999). 2.2.1.6 Coagulación Debido a que los artrópodos poseen un sistema circulatorio abierto, las heridas deben ser cerradas rápidamente para prevenir la salida de grandes cantidades de hemolinfa y la entrada de agentes patógenos (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992). Al entrar una 32 bacteria a la cavidad corporal, induce la liberación exocitotóxica de la cascada de la coagulación dentro del plasma. Los LPS inducen, a la vez, la activación de la cascada de la coagulación, que comprende la cascada de serino proteasas y la proteína coagulable o cuagulógeno (Vergara, F. 1999). 2.2.1.7 Melanización Es iniciada por la lisis de los hemocitos cerca de la superficie del parásito, seguido por una deposición de sustancias melanoides en el área que sufrió la lisis y en la membrana del parásito. La melanina y la esclerotina son consideradas materiales de melanización en la respuesta inmune del camarón (Vergara, F. 1999). Durante la formación de la melanina, se liberan metabolitos tóxicos con actividad fungicida. La melanina y sus compuestos son altamente reactivos y están involucrados en la prevención del crecimiento de microorganismos, inhibiendo las proteasas y las quinasas extracelulares (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992). 2.2.2 Inmunidad humoral Es realizada por moléculas efectoras y no por células hemolinfáticas. Resulta de procesos generales, más que de procesos dirigidos contra organismos patógenos específicos. Este evento incluye: a) Resistencia de la cutícula a la invasión por parte de microorganismos. b) Presencia de moléculas efectoras en la hemolinfa que se unen a los microorganismos, como las proteínas de reconocimiento de microorganismos patógenos (BG-BP y LPS-BP) (Cuéllar-Anjel, J. 1998). La primera línea de defensa entre el camarón y el medio ambiente es la cutícula, dentro de la cual se presentan laceraciones e infecciones microbianas, que incluyen la inhibición de la degradación de la cutícula mediante inhibidores de proteinasas, melanización de la cutícula y síntesis de novo de moléculas antibacterianas en el integumento (Cuéllar-Anjel, J. 1998). 33 Cuando partículas extrañas penetran la cutícula del camarón hasta llegar a la cavidad corporal, se activa un eficiente y rápido proceso de defensa en el animal: El sistema de activación de la profenoloxidasa (sistema proPO). Lo que se puede observar durante este proceso, es la formación de melanina, un pigmento oscuro que se acumula alrededor de las heridas, o encapsulando e invadiendo los microorganismos para evitar su diseminación a otros tejidos del cuerpo (Cuéllar-Anjel, J. 1998). 2.2.2.1 Proteínas patrón de reconocimiento Los artrópodos no poseen una respuesta inmune adaptativa con inmunoglobulinas. Este mecanismo de defensa es iniciado por el reconocimiento de factores que son liberados o están presentes en la superficie de los microorganismos o parásitos. Las proteínas que reconocen estos factores son denominadas proteínas patrón de reconocimiento (PRP) (Cuéllar-Anjel, J. 1998). Las PRP son macromoléculas utilizadas para el reconocimiento de los determinantes microbianos que son liberados por el patógeno, o que se encuentran sobre su superficie para iniciar ciertas respuestas inmunes. Estas macromoléculas son de gran importancia para iniciar una respuesta en contra de la infección; pueden iniciar la actividad del sistema proPO que es el principal sistema de defensa en los artrópodos, o también pueden actuar directamente como opsoninas o aglutininas (Vergara, F. 1999). 2.2.2.2 Sistema profenoloxidasa (proPO) A través de heridas o alimentos contaminados, pueden ingresar microbios y parásitos al sistema del artrópodo y algunos hongos pueden penetrar la cutícula (quitina y Calcio) por medio del uso de quitinasas u otros mecanismos. La respuesta se puede observar como manchas oscuras en la cutícula de los animales afectados. La fenoloxidasa (PO) es el último componente de activación en el sistema proPO, siendo la responsable también de la reacción de melanización (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992). El sistema proPO puede ser activado por lipopolisacáridos y peptidoglicanos. 34 2.2.2.3 Fases iníciales del sistema proPO El sistema proPO puede activarse por acción de polisacáridos microbiales; las proteínas recubren en primer lugar los carbohidratos y luego inician la activación del sistema, pero los detalles bioquímicos de este proceso son poco conocidos (Söderhäll, K. y Cerenius, L. 1992). Figura 5. Respuesta inmunológica inducida en los hemocitos, después del reconocimiento del patógeno, vía PRPs plasmática o celulares y subsecuente activación (1) degranulación, con liberación de diferentes inmunoefectores e inmoreguladores; (2) inducción y/o represión de genes inmunológicos; (3) activación de respuestas celulares como fagocitosis y formación de nódulos y cápsulas. (Imagen tomada a partir de la publicación de Morales, V. y Cuéllar – Anjel, J. 2008) Cuando se hallan presentes los polisacáridos o β-1,3 glucanos, la degranulación o exocitosis de los hemocitos (granulares y semigranulares) produce la liberación del sistema proPO, que comienza aquí su activación (Carvajal, A. M. 1999). Las proteínas se unen primero a estos carbohidratos para luego comenzar la activación, provocando la formación de melanina en la superficie afectada por el patógeno (Vergara, F. 1999). En los gránulos secretores de los hemocitos granulares y semigranulares, se encuentran almacenadas la proPO y la ppA. Estos gránulos son liberados en el proceso de degranulación celular luego de una estimulación con antígenos. 35 Los mecanismos encargados de activar el sistema proPO son aquellos que estimulan las diferentes reacciones de defensa celular: a) fagocitosis, b) formación de nódulos, c) encapsulación y d) quimiotaxis de los hemocitos. 2.3 Medición de parámetros inmunológicos en camarones La medición de algunos parámetros inmunológicos en los camarones, permite evaluar y determinar en un momento dado, las condiciones sanitarias de un grupo de animales o de una población en un sistema comercial de cultivo. Estos parámetros están relacionados con la capacidad de respuesta inmune de los organismos, frente a la invasión de agentes bioagresores (virus, bacterias y hongos), o elementos inertes que entran en contacto con los animales. Los principales parámetros inmunes de los camarones que se pueden medir son: hemograma, concentración de proteínas plasmáticas, capacidad de hemoaglutinación, actividad de la fenoloxidasa, capacidad antibacteriana del plasma, entre otros. (Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). El hemograma consiste en realizar un conteo total o diferencial de los hemocitos de la hemolinfa, para establecer una relación entre los valores obtenidos y las condiciones de salud de los camarones examinados (o de sus poblaciones de origen). (Morales V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). En investigaciones realizadas se han tenido conteos totales de hemocitos que van desde 21.000/mm3 (con citómetro de flujo) a 23.300 (con hematocitómetro) en camarones sanos (Owens, L. y O’Neill, A. 1997). Para realizar el conteo de hemocitos generalmente se extrae hemolinfa, del seno ventral de los camarones con una jeringa de 1 mL, la cual contiene anticoagulante en igual volumen al de la hemolinfa extraída. El anticoagulante puede ser solución de Alsever modificada con 10% de formol, cuando se requiere hacer fijación y preservación de los hemocitos (Le Moullac, G. y Haffner, P. 2000) 36 2.4 Bioensayos Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones de una población determinada, utilizando como organismos “blanco” camarones sanos y susceptibles a dicha enfermedad. Éstos pueden ser “libres de patógenos específicos” (SPF por sus siglas en inglés) o simplemente libres de la enfermedad que se pretende reproducir. (Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). El objeto de los bioensayos es determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso (virus, bacterias, hongos, etc.) tóxico (toxinas químicas o biológicas), o descartando lo anterior, de origen ambiental o por manejo. También se utilizan los bioensayos para evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral a camarones libres de dichos agentes patógenos. (Morales, V y Cuéllar-Anjel, J. 2008). 2.4.1 Control de condiciones en Sala de Bioensayos El control de la calidad del agua (parámetros físico - químicos y nutrientes) del estanque y el conocimiento de los límites de tolerancia de las especies son requerimientos indispensables en todo el sistema de cultivo, e influyen decisivamente en el éxito o fracaso de ésta actividad productiva (Spotte, S. 1970; Kinne, O. 1976). Los factores físico-químicos directa o indirectamente afectan a los animales a través del impacto que tienen sobre el crecimiento y consumo de alimento. Es importante reconocer que estos factores están relacionados entre sí, y que cuando están bien balanceados, pueden contribuir significativamente a un ecosistema de componentes bióticos y abióticos con un buen funcionamiento. El monitoreo diario y cuidadoso de parámetros como la temperatura, pH, OD, entre otros permite anticipar problemas potenciales y evitar la aparición de condiciones estresantes que pueden afectar seriamente el rendimiento optimo. (S.A.D.P.A. 2006; Rodríguez, H. 1993) 37 Estudios previos realizados en el análisis de los parámetros que influyen en la infección del WSSV indican que la temperatura del agua (32 – 33°C) reduce la mortalidad de los camarones infectados por el virus. (Rahman, M. M. y Escobedo – Bonilla, C. M. 2006). En este contexto, la temperatura del agua está considerada como uno de los factores ambientales más importantes en el desarrollo de los camarones, ya que influye en el metabolismo, el consumo de oxigeno, tipo de alimentación, crecimiento, muda, la supervivencia y la tolerancia a los metabolitos tóxicos. (Rahman, M. M. y Escobedo – Bonilla, C. M. 2006) Además, en otras publicaciones se ha reportado la influencia marcada de la temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad. Camarones infectados con WSSV pueden permanecer asintomáticos a temperaturas arriba de 27ºC, pero la enfermedad se hace evidente si la temperatura del agua disminuye (Vidal, O.M. et al., 2001; Granja, C.B. et al., 2003 En: Morales, V. y Cuellar-Anjel, J. 2008). 2.5 Principales enfermedades en camarones Penaeidos Las enfermedades se consideran como una de las principales causas de pérdidas de poblaciones de camarones de cultivo y por ende económicas, debido a mortalidades masivas de curso agudo o crónico producidas por agentes bióticos o abióticos (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). Los camarones de cultivo con frecuencia se ven afectados por enfermedades que varían en cuanto a severidad, patogénesis, agente etiológico y manejo/tratamiento de la afección. Las principales causas de estas enfermedades son virus, microorganismos intracelulares, bacterias, hongos, protozoarios internos y externos, organismos epicomensales, toxinas, factores fisicoquímicos y causas de etiología idiopática (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). 2.5.1 Virus Los más frecuentes son: WSSV virus del síndrome de la mancha blanca, IHHNV virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética, TSV virus del 38 síndrome de Taura, BP Baculovirus penaei,HPV parvovirus hepatopancreatico y YHV virus de la cabeza amarilla. (Lightner, D.V. 1999; Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). Figura 6. Signos clínicos - enfermedad IMNV (Pantoja y Lightner. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al. 2008) 2.5.2 Bacterias Son causadas principalmente por especies de los géneros Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Flavobacterium, Plesiomonas y Serratia. Así como estas bacterias extracelulares causan enfermedad en camarones, también existen microorganismos intracelulares como rickettsias y una alfa Proteobacteria, esta ultima causante de la hepatopancreatitis necrosante (NHP) (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y CuéllarAnjel, J. 2008) Figura 7. Camarón peneido con manchas negras en la cutícula causadas por bacterias quitinolíticas (Covarrubias, M. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al. 2008) 39 2.5.3 Hongos Son de poca importancia en camarones de cultivo, debido a que no son muy frecuentes y además son poco severas. Los principales géneros de hongos patógenos se presentan en larvas y postlarvas produciendo la “micosis larval” y son especies de Lagebidium spp. y Sicolpidium spp. En reproductores se presenta la fusariosis que es causada por el género Fusarium, principalmente F. solani (Lightner, D. V. 1996; Cuéllar-Anjel, J. 1998; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). Figura 8. Lesiones melanizadas (negras) dentro de la cámara branquial de un camarón Penaeus sp. causadas por infestación con Fusarium solani (Pantoja, C. En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. et al. 2008) 2.5.4 Protozoarios En el contenido intestinal se pueden encontrar gregarias (Nematopsis sp.), las cuales compiten por el alimento, pudiendo causar obstrucción mecánica y lesiones en las paredes entéricas por deterioro del epitelio intestinal. También pueden observarse microsporidios dentro del músculo abdominal (Nosema sp.) que causa la enfermedad del camarón algodonoso. Externamente están los epicomensales que se adhieren a la cutícula del camarón principalmente en las branquias y compiten por el oxigeno con el camarón. Los principales géneros son: Zoothamnium, Epistylis, Vorticella y Acineta (Cuéllar-Anjel, J. 1998; Morales V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). 40 2.5.5 Toxinas Son poco frecuentes. En algunos casos estas se asocian con pesticidas o substancias químicas. Existen toxicosis causadas por algas verde-azules y afectan principalmente la pared del intestino medio de los camarones, produciéndose enteritis hemocítica en los animales (Cuéllar-Anjel, J. 1998). 2.5.6 Factores Fisicoquímicos Cambios súbitos o condiciones extremas de los factores físicos (oxigeno disuelto, temperatura, turbidez) y químicos (salinidad, amonio, nitritos, sulfuros) en un estanque de producción, alteran la calidad del agua y pueden ser causas de estrés, el cual dispara enfermedades que se encuentran latentes en los camarones. Adicionalmente, niveles bajos de oxigeno disuelto crean una condición de hipoxia critica para los camarones. (Cuéllar-Anjel, J. 2002; Le Moullac, G. 2000; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). 2.5.7 Etiología idiopática Existen pocas condiciones que afectan la salud de los camarones que sean desconocidas. La más frecuente, aun sin ser muy común en la naturaleza, es la necrosis muscular idiopática (NMI), que consiste en el deterioro de una zona de músculo abdominal, con inflamación e infiltración hemocítica abundante. (CuéllarAnjel, J. 1998; Cuéllar-Anjel, J. 2002; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). 2.6 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV – por sus siglas en inglés) En el año de 1999, la Enfermedad de la Mancha Blanca apareció en Centro y Sudamérica, golpeando fuertemente la industria acuícola de Panamá, la cual está centrada principalmente en el cultivo del camarón, y se lleva a cabo en fincas especialmente desarrolladas para esta actividad. En 1998, la industria camaronera panameña estaba constituida por más de 9000 hectáreas de estanques en producción. Generó más de 8.000 empleos directos y exportó un estimado de 10.300 toneladas de 41 camarón de cultivo por valor de 100 millones de dólares (Cuéllar-Anjel, J. 2000; Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). El agente causante de la enfermedad de la mancha blanca, es un virus DNA de doble cadena, que es considerado potencialmente letal para todas las especies cultivadas de camarones penaeidos. Los viriones son circulares a elípticos con una envoltura trilaminar y son grandes (80-129 x 250-380 nm), también poseen un apéndice único en forma de cola (Itami, T. 1998a; O.I.E. 2000). El Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) es un patógeno que causó y causa devastaciones en la industria de la cría de camarones en varios países (Lightner et al., 1998; Jiang et al., 2006; En: Esparza – Leal, H. M. 2009), actualmente es uno de los más graves patógenos virales en el mundo (Soto y Lotz, 2001; Flegel, 2006; Sánchez – Martínez .et al. 2007. En: Esparza – Leal, H. M. 2009). En México, el WSSV apareció por primera vez en 1999 y pronto causo graves pérdidas, en primer lugar afectó el cultivo de Penaeus (también llamado Litopenaeus) stilyrostris y más tarde a la especie de P. vannamei (Galaviz-Silva et al., 2004; Peinado-Guevara y LópezMeyer, 2006. En: Esparza – Leal, A .M. 2009). El virus tiene un período de incubación de 3 a 7 días dentro del organismo del camarón. La transmisión ocurre a través de diversos vectores que incluyen: materia fecal o tejidos en descomposición, canibalismo y fluidos de hembras afectadas (Maldonado, M. y Rodríguez, J. 2004). Se puede dar una transmisión indirecta a través de agua contaminada, comida contaminada, entre otros (Johnson, S. K. 1996). Éste se encuentra presente en el medio ambiente y es portado por los camarones en baja intensidad. Puede no desarrollarse la enfermedad por mucho tiempo en condiciones libres de estrés (Meng – Feng, T. 1999). La única alternativa para reducir el riesgo de entrada del WSSV a instalaciones de producción comercial de camarones es la aplicación de técnicas de bioseguridad o las medidas de exclusión, como la desinfección (Clifford, 1999; Lightner, 2005. En: Esparza – Leal, H. M. 2009). Es de vital importancia mantener restringido la entrada 42 de de estanques o aguas vertidas en el medio adyacente (lagunas costeras o estuarios) donde habitan otras especies de crustáceos que pueden servir como huésped del virus. Muchos crustáceos son potencialmente susceptibles a la infección por WSSV (Escobedo-Bonilla et al., 2008. En: Esparza – Leal, H. M. 2009). La enfermedad de la mancha blanca en los camarones penaeidos está caracterizada por una mortalidad rápida y alta, acompañada por la aparición de manchas blancas, inicialmente circulares en la cutícula, que vistas al microscopio tienen un centro oscuro (Itami, T. 1998). Algunas veces estas manchas se encuentran acompañadas de una coloración roja en toda la superficie del cuerpo. Los puntos blancos, son depósitos de calcio que también pueden ser provocados por causas ambientales relacionadas con la concentración de Ca++ y el pH del estanque. Para verlos más fácilmente, se arranca la cutícula de la cabeza y con la uña del pulgar se rasca hasta retirar la epidermis. (Alday, V. 1999) Figura 9. Caparazón de un juvenil de P. monodon con enfermedad de la mancha blanca (WSSV). Las manchas blancas son depósitos calcáreos localizados en la porción interna del exoesqueleto. Fotografía cortesía de P. Saibaba (S.K.B.R College, Amalapuram, India). En: Morales, V. y Cuéllar–Anjel, J. 2008). El progreso de la enfermedad está caracterizado por el cese del consumo de alimento, unos días después se presenta la aparición de camarones moribundos nadando cerca de la superficie, en el borde de los estanques de cultivo (O.I.E. 2000). 43 En la fase aguda, sufren un episodio de letargia caracterizado por pocos movimientos corporales y aislamiento, cambian su color a rojizo-café oscuro, pierden del reflejo de huida, suspenden el consumo de alimento. Además efectúan una evacuación total del tracto intestinal y mueren a las pocas horas, sin haber consumido significativamente sus reservas del hepatopáncreas. Las inclusiones cuticulares van desde pequeños puntos hasta manchas de varios milímetros de diámetro, que pueden llegar a unirse entre ellas y formar zonas blanquecinas de gran tamaño. Éstas son más fáciles de observar separando la cutícula de la región del cefalotórax del camarón, removiendo los tejidos que puedan estar adheridos a ella y luego colocándolas a contraluz (O.I.E. 2000). Figura 10. Cuatro juveniles de P. monodon mostrando signos de infección por Virus de la Mancha Blanca (WSSV). El camarón de la parte superior y el de la derecha casi no muestran manchas blancas, pero se puede distinguir una coloración rosada a café – rojiza causada por la expansión de los cromatóforos subcuticulares. Es posible que esta coloración sea más aparente durante la etapa aguda de la enfermedad. El camarón de la izquierda y de la parte inferior muestran las manchas blancas que característicamente aparecen en esta especie al pasar la etapa aguda de la infección. (Fotografía tomada a partir de la publicación de Morales, V. y Cuéllar – Anjel, J. 2008) Las poblaciones de camarones que muestran estos signos, tienen grandes tasas de mortalidad, que pueden llegar a ser de 100% entre los 3 y 10 días después de la aparición de los signos clínicos (Lightner, D. V. 1996). 44 2.7 Inmunoestimulantes La llegada al continente americano del virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV- por sus siglas en ingles) ha creado la necesidad de explorar todas las vías posibles para su control. En este sentido, la inmunomodulación del camarón se presenta como una alternativa. Un aspecto fundamental de la inmunomodulación concierne a la inmunoestimulación, entendiéndose como tal, a la excitación del sistema inmune en animales sin carencias nutricionales (Rodríguez, J. y Le Moullac, G. 2000). Sustancias inmunoestimulantes están siendo obtenidas a partir de varias fuentes naturales y también por síntesis química con base en la estructura molecular de los propios productos naturales. Entre estos compuestos, se encuentran muchos derivados de microorganismos o de algas, destacándose los componentes de la pared celular de diferentes bacterias, hongos, microalgas y macroalgas. Los principales principios activos de estos componentes capaces de generar una inmunoestimulación son: fragmentos de peptidoglucanos (PGs), lipopolisácaridos (LPS), lipopéptidos, polisácaridos sulfatados, β – glucanos, acil – oligopéptidos y péptidos bacterianos específicos (revisión de Song y Huang, 2000, En: Morales, V. y Cuéllar-Anjel, J. 2008). Los β-glucanos están involucrados en el incremento de la actividad fagocítica de los hemocitos (Sung et al., 1994; Cheng – Fang, C. 2000), adhesión celular y producción de aniónsuperóxido en reproductores (Cheng – Fang C. 2000). En la publicación realizada por Rodríguez, J. (2000) se evaluaron cuatro dosis de β – glucanos encontrándose las mejores dosis en 75 y 100 ppm. En cuanto a los animales que recibieron 75 ppm se observó menor carga del virus WSSV que en aquellos donde se suministró dieta control. Se concluye en este trabajo que una ligera excitación del sistema inmune acompañada de los requerimientos nutricionales necesarios, puede ser capaz de alertar el sistema inmune de los camarones sin desgastar a los animales, limitando la multiplicación del WSSV. 45 Además de la publicación mencionada anteriormente Cheng – Fang, C. (1999) realizó un ensayo donde se hizo una infección con WSSV en camarones que fueron inmunoestimulados con β-1,3-glucano por 20 días y obtuvieron supervivencias del 20% y 12% en juveniles y postlarvas respectivamente, al sexto día de infección a diferencia del control que llegó con supervivencia de 0% al cuarto día de infección. Los peptidoglucanos derivados de Bifidobacterium thermophilum, también mejoran la actividad fagocítica de los hemocitos granulosos en animales desafiados experimentalmente con WSSV, incrementando la resistencia y supervivencia de los animales al virus. (Itami, T, 1998a). En camarones desafiados con el Vibrio penaeicida, que es un patógeno altamente virulento en los camarones. La tasa de supervivencia fue significativamente mayor que los animales dispuestos para control. Confirmando el refuerzo sobre el mecanismo de defensa a través de la administración de peptidoglicanos, aumentando la actividad fagocítica de los granulocitos y aumenta la resistencia a las enfermedades. (Itami, T. 1998b) Una forma de evaluar la eficacia de inmunoestimulantes y otras moléculas inmunomoduladoras, además de la supervivencia, sería mediante la cuantificación de parámetros inmunitarios. Estudios sobre parámetros celulares y humorales, tales como generación de radicales de oxígeno, actividad fenoloxidasa, hemoaglutinación, etc. se están realizando como indicadores de salud. (Rodríguez, J. y Le Moullac, G. 2000). Igualmente en distintos trabajos se han hecho evaluaciones de la respuesta inmune de familias resistentes y sensibles al virus de la mancha blanca (WSSV), en el curso de una infección, donde se estudió el comportamiento de los hemocitos circulantes a partir de hemogramas e infiltrantes por histología. Igualmente, para obtener información relacionada al manejo de familias resistentes, se estudió también si esta resistencia puede ser incrementada adicionando inmunoestimulantes como los ya mencionados β-1,3 glucanos a la dieta de los camarones juveniles antes de ser desafiados con el patógeno. (Maldonado, M. 2003). 46 2.7.1 Inmunomodulador Comercial (AquaVac. - Ergosan®) Aqua Vac. Ergosan® es un inmunomodulador basado en alginatos extraídos de algas marinas. Los ingredientes, incluidos los alginatos y polisacáridos, fortalecen el sistema natural de defensa en camarones. Es un producto completamente natural y como tal es un ingrediente aceptado en los alimentos. Los inmunomoduladores o inmunoestimulantes pueden jugar un papel importante en la acuicultura, su uso incluye la mejora de la respuesta inmune ante un amplio rango de agentes patógenos y al mismo tiempo el fortalecimiento en animales con un sistema débil o en desarrollo (ejemplo: larvas de camarón). Los ingredientes activos del ERGOSAN ® son los alginatos – polisacáridos derivados de macroalgas y microalgas Laminaria digitata (99%) y Ascofillum nodosum (1%). (Schering – Plough Animal Health, Aquaculture) Figura 11. Presentación del producto comercial AquaVac. - ERGOSAN®. (Schering – Plough Animal Health, Aquaculture) Los alginatos, son polisacáridos de algas, que se utilizan ampliamente en la industria alimentaria como un estabilizador o agente emulsionante. Dicho polisacárido es no digerible y también puede ser visto como una fuente de fibra en la dieta, pueden 47 proteger contra el desarrollo de enfermedades. Existen investigaciones en la actualidad que tienen como objeto evaluar el uso potencial de alginatos, como un suplemento dietético para estabilizar la salud normal del animal, o el alivio de ciertas enfermedades. (Brownlee, I. A. 2005). Se ha demostrado que estos polisacáridos mejoran la transferencia de oxígeno a través de la membrana celular y aumenta la actividad metabólica de las mismas, lo que influye sobre la resistencia a la infección por patógenos y a una mejor reparación de tejidos dañados a causa de estas enfermedades. (Nüssler y Thompson, 1992). En el caso de los crustáceos en el estudio realizado por Cheng W. (2005) se evaluó el recuento de hemocitos, la actividad fagocítica, entre otros parámetros inmunitarios en camarón blanco Litopenaeus vannamei alimentados con una dieta a base de alginatos por cinco meses y su reacción frente a la infección con Vibrio alginolyticus. En esta investigación se obtuvo que la supervivencia de los camarones alimentados con la dieta que contenía alginatos aumentó significativamente, en comparación con la de camarones alimentados con la dieta control. Se concluyó que la administración de alginato de sodio en la dieta puede mejorar la capacidad inmune de L. vannamei y aumentar su resistencia a la infección por V. alginolyticus. 2.8 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés – polymerase chain reaction) Esta reacción es un método enzimático de amplificación de secuencias específicas de ADN, que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del proceso, se duplica el número de moléculas. De esta manera, se utiliza para la detección genómica de ciertos microorganismos patógenos como virus (ADN y ARN) y bacterias, en muestras de camarones o de organismos relacionados. El principio de la PCR consiste en determinar la secuencia de interés y seleccionar pequeños segmentos de nucleótidos llamados iniciadores o cebadores (“primers” en inglés), complementarios con la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de 48 las cadenas que flaquean a dicha secuencia, a partir de los cuales se inicia la elongación. En esta técnica se consideran importantes los siguientes parámetros: un suministro abundante de iniciadores y de deoxinucleótidos trifosfatados (dNTPs); una fuente renovada de ADN polimerasa (enzima encargada de la síntesis de las cadenas complementarias) y los ciclos periódicos de cambios de temperatura. La reacción tiene lugar en tres fases: 1) Desnaturalización: el fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90 a 95°C durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas. 2) Anillaje: la temperatura de la mezcla se baja hasta 55°C durante 20 segundos para que los cebadores se enlacen con el ADN escindido. 3) Polimerización: la temperatura de la mezcla se eleva hasta 75°C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. (Morales V. y CuéllarAnjel, J. 2008) A partir del manual de pruebas de diagnóstico de enfermedades para los animales acuáticos (O.I.E. 2006), se recomienda en primer lugar, el uso de esta técnica para la comprobación de casos sospechosos de la enfermedad. Actualmente esta técnica se encuentra reconocida por la O.I.E. (por sus siglas en ingles) y es utilizada por todos los laboratorios de referencia para la detección de WSSV. En algunos casos puede que el animal no presente signos externos de la enfermedad, lo cual no significa que no pueda estar infectado. Lo anterior indica que se deben detectar niveles muy bajos de la infección, por ello es que las técnicas de biología molecular son las indicadas para la detección y amplificación del ADN viral. 49 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1 Formulación del problema La Industria del cultivo de camarón en el mundo y en América Latina ha surgido como una de las fuentes de mayor generación de divisas, con lo que en el transcurso de los años ha generado altos niveles de producción y grandes ganancias. Sin embargo, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta esta industria es a la presencia de enfermedades infecciosas. En la década de los 90’, hubo una reducción dramática en la producción del camarón de cultivo debido principalmente a enfermedades de origen viral, causando altas tasas de mortalidad (hasta del 100%). El Síndrome de la Mancha Blanca provocado por el WSSV (White Spot Syndrome Virus, por sus siglas en inglés), luego de su aparición en los años 98 y 99, se ha convertido en una de las enfermedades virales más devastadoras para el camarón de cultivo, afectando la producción y dando como resultado el cierre de empresas y la pérdida de muchos empleos. Durante los brotes de la enfermedad se producen altos episodios de estrés en el camarón debilitando su mecanismo de defensa. Parte esencial de la inmunidad es el estado de alerta por el cual un organismo puede detectar moléculas extrañas; un buen sistema de reconocimiento es lo ideal para expulsión adecuada del virus. Cuando existen fallas en dichas funciones se afectan las actividades de diferenciación y eliminación de patógenos en el animal; comprometiéndose así su salud y estabilidad generando mortalidades en los camarones infectados y por ende grandes pérdidas a nivel económico. 3.2 Justificación Debido a las bajas producciones de camarón reportadas en los últimos años en América Latina, por la presencia del virus del Síndrome de la Mancha Blanca WSSV, la Industria camaronera con el objeto de frenar al máximo los brotes y disminuir las pérdidas; ha ensayado varias opciones para atenuar su impacto. En la actualidad las 50 estrategias para el control de la enfermedad han sido directamente enfocadas en la mejora de la salud animal con el fin de prevenir infecciones por el virus. Es importante resaltar que al momento de enfrentarnos con problemas virales hay escases en cuanto a la aplicación de tratamientos, como lo son los antibióticos cuando la infección es bacteriana, por tal razón en estos casos el interés está encaminado hacia una prevención antes de que se presenten brotes de la enfermedad. Una nueva alternativa para ello es la inmunoestimulación. En años recientes, los inmunoestimulantes han sido usados para aumentar la resistencia de camarones contra infecciones virales. Las sustancias inmunoestimulantes tienen la cualidad de alertar el sistema inmune no especifico, desarrollando así una mejor respuesta ante posibles microorganismos patógenos. Al mismo tiempo es de vital importancia para una prevención mantener el cultivo de camarón en condiciones ambientales que mejoren la estabilidad de los camarones, ya que está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en estos, depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, que incluyen buena calidad del agua, densidad poblacional, nutrición y control de factores ambientales potencialmente estresantes (variaciones bruscas de salinidad, temperatura y oxigeno) en este caso es relevante el manejo de la salinidad, la temperatura y el oxigeno, ya que la dinámica de ocurrencia de los patógenos en los sistemas acuáticos está probablemente modulada por los parámetros ya mencionados. Se ha reportado la influencia marcada de la temperatura del agua en la manifestación de la enfermedad. (Vidal, O.M. et al., 2001; Granja et al., 2003, En: Morales y Cuéllar–Anjel, 2008). Existen ocasiones en las que los organismos son portadores de diferentes agentes patógenos y no manifiestan características externas de la enfermedad, mientras las condiciones de cultivo sean las optimas para su desarrollo; si estas condiciones se tornan desfavorables, el sistema de defensa que los mantenía protegidos, se suprime y la multiplicación del patógeno se desarrolla de tal manera que sobrepasa los mecanismos de defensa, causando en la mayoría de las ocasiones mortalidad en el hospedero. (Morales-Covarrubias, 2008. En: Morales y Cuéllar-Anjel, 2008). 51 La sostenibilidad de la producción del camarón radica en un buen control y manejo de las enfermedades que se presentan en los cultivos. Dentro de la búsqueda de programas de prevención y estrategias innovadoras, se han intensificado investigaciones en distintas ramas del conocimiento científico, la aplicación de conocimientos fundamentales en inmunología de crustáceos ha permitido elaborar medidas profilácticas inmunomodulatorias, (Rodríguez J. y Cedeño R., 2000) obteniendo resultados favorables que han ayudado a atenuar las consecuencias causadas por la infección del virus WSSV en camarones. A pesar de los avances que se han alcanzado en la industria camaronera, este sector cuenta con pocas herramientas para identificar y enfrentar los problemas epidemiológicos que lo afectan, recurriendo generalmente a soluciones de emergencia cuando la infección se hace presente, por tal motivo está investigación pretende evaluar nuevas alternativas, en este caso los inmunoestimulantes, como una herramienta útil en las practicas de manejo; con el fin de confirmar los particulares del producto en cuanto al fortalecimiento del sistema inmune de los camarones L. vannamei ante una infección con el virus del Síndrome de la Mancha Blanca y que este proyecto sea como herramienta útil para la mejora en lo referente al cultivo de estos animales y en el aumento de la producción. 52 4. OBJETIVOS 4.1 General Evaluar la capacidad del producto comercial ERGOSAN ® en el fortalecimiento de sistema natural de defensa y así mismo en la reducción del índice de mortalidad del camarón blanco (L. vannamei) frente a la infección per os del Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV). 4.2 Específicos 1. Determinar la tasa promedio de supervivencia en los camarones del tratamiento con Ergosan® y del Control luego de ser infectados con el virus WSSV y buscar diferencias significativas en estos resultados mediante las pruebas de ANOVA y Duncan. 2. Establecer a partir de un conteo diferencial de hemocitos, si existe un aumento en la proliferación de los mismos, en camarones alimentados con la dieta Ergosan® respecto a la dieta Control. 3. Identificar mediante un examen clínico los camarones infectados y moribundos por acuario (con el virus WSSV), seleccionados por presentar manifestaciones propias de la enfermedad. 4. Determinar el efecto citopático causado por el virus WSSV en las células blanco de camarones infectados y moribundos, a partir de cortes histológicos procesados mediante inclusión en parafina y teñidos con Hematoxilina y Eosina 5. Confirmar mediante la técnica de PCR, si los animales infectados y moribundos son positivos para el virus (WSSV), mediante la amplificación de secuencias especificas del DNA de este microorganismo patógeno (prueba de nested-PCR). 53 6. Valorar de forma semicuantitativa la presencia del virus (WSSV) por inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®) en muestras de camarones (L. vannamei) muertos luego de la infección. 7. Cumplir los postulados de Koch a partir del aislamiento e identificación molecular del virus WSSV en camarones sanos, infectados artificialmente con este virus y en los cuales se logre reproducir la enfermedad con todos sus signos clínicos característicos, aislando de nuevo en éstos al agente etiológico (WSSV). 8. Mantener los parámetros físicos–químicos (pH, salinidad, oxígeno disuelto y temperatura), estables durante el transcurso del bioensayo. 54 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Descripción del área de trabajo El proyecto se llevó a cabo en la sala de Infección Experimental de la empresa Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO), ubicada en la Hacienda La Estrella, Distrito de Natá, Provincia de Coclé, República de Panamá. La sala está distribuida en dos áreas: una Sala de No – infección y una Sala de infección. El montaje del experimento se distribuyó dependiendo del tipo de actividad realizada. Figura 12: Vista frontal de la “Casa de Don Popo” donde se encuentra la Sala de Bioensayos. 5.2 Población analizada Los animales utilizados en el experimento eran procedentes del Centro de Producción Larval “C.P.L. San Carlos” (CAMACO), los cuales llegaron a la sala de Bioensayos con un peso promedio de 0.6 g. Éstos se mantuvieron por 15 días en Tanques cilíndricos de fibra de vidrio, alcanzado un peso promedio aproximado de 1.2 g. Fueron luego recolectados para realizar el experimento pasando a los Tanques de la Sala de No – infección, donde se mantuvieron en aclimatación y crecimiento hasta alcanzar la talla experimenta, habiéndoseles hecho el respectivo mantenimiento diario. 55 De manera complementaria, se dispuso una población de camarones para la realización de hemogramas, con el objeto de determinar el posible efecto del producto comercial ERGOSAN® sobre el conteo total y diferencial de los hemocitos y su eventual relación con la supervivencia de los camarones luego de la infección con el virus WSSV. Se tomó una muestra al azar de los camarones que se utilizaron para el ensayo, esto con el fin de detectar WSSV, virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética (IHHNV) y la bacteria intracelular causante de la hepatopancreatitis necrotizante (NHP), todas mediante la prueba de nested-PCR. (ANEXO 1) Con lo anterior, se buscó descartar la presencia de estos patógenos y que en un futuro pudieran interferir en los resultados de la investigación. Los análisis moleculares se realizaron en UNICAM. Ninguno de los tres patógenos fue detectado en ninguna de las muestras examinadas para este estudio. 5.3 Fases experimentales Las actividades de este ensayo se realizaron básicamente en cinco fases. La primera estuvo determinada por la preparación de los distintos materiales y las pruebas de laboratorio previas al experimento. La segunda fase consistió en la transferencia y siembra de los camarones en los acuarios. Luego de ello se suministró por diez días una dieta experimental a base del producto (ERGOSAN®), correspondiente a la fase tres. En la fase cuatro se realizó la preparación de la papilla infectiva y posteriormente la infección per os de los camarones con el virus WSSV. Por último en la fase cinco se llevaron a cabo, el registro de las mortalidades en cada uno de los acuarios y las pruebas de laboratorio confirmatorias posteriores a la infección experimental. En el trascurso del experimento se realizó el muestreo de hemolinfa de los animales dispuestos para conteos de hemocitos, habiéndose realizado tres extracciones con sus respectivos recuentos durante 30 días. 56 5.3.1 Preparación del Material de la Sala de Bioensayos (Fase 1) 5.3.1.1 Acuarios Fueron utilizados acuarios de vidrio con capacidad para 30 L (30 cm de ancho por 60 cm de largo y 30 cm de alto). De los 30 litros que caben en cada unidad, se utilizó el 86% que equivalen a 26 litros por razones de operación hídrica del sistema. Estos acuarios estuvieron bajo condiciones controladas de temperatura, oxígeno y salinidad. Además, la entrada de luz a la sala se bloqueó con plástico negro y se manejó luz artificial las 24 h. A B . C Figura 13: A. Ubicación de acuarios en la sala B. Llenado de unidades experimentales. C. Control de salida de aire en cada uno de los acuarios. 57 5.3.1.2 Desinfección de acuarios y tuberías de la Sala Para la desinfección y limpieza de los acuarios se utilizó cloro granulado al 65%, diluyendo 2.2 g de cloro comercial en 30 litros de agua, obteniendo así una concentración de 7.4% p/v (concentración estándar – Sala de Bioensayos), durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se neutralizó el Cloro con 1.1 g Tiosulfato de Sodio Comercial (Na2SO3) en 30 litros de agua (3.7 % p/v). Se eliminó el Tiosulfato de Sodio de los acuarios lavándolos con agua dulce y se dejaron secar. Al igual que en los acuarios, se hicieron pases de Cloro por las tuberías, el cual fue neutralizado con Tiosulfato de Sodio lavando luego con agua dulce para eliminar el exceso, antes de dejar pasar el agua marina. Todo lo anterior se hizo con el fin de disminuir la posible población bacteriana en las tuberías, que pudiera interferir en la salud de los animales y por ende en los resultados del experimento. 5.3.1.3 Tratamiento del agua El agua marina que se utilizó para el llenado de los acuarios, fue procedente del canal reservorio en las instalaciones de la finca CAMACO. Cada viaje de agua en tanques, fue registrado y sometido a tratamiento de rutina para la sala de bioensayos. El tratamiento consistió en pasar el agua por una tubería a un Tanque de reserva (TQ 4); al momento de su utilización el agua se dirigió a Tanques de desinfección (TQ 3 y TQ 2), en donde se trató con Cloro granulado al 65%, a una concentración del 7.4 % p/v (400 g en un TQ de 5400 litros) por 24 h. Después de cumplir este tiempo, se transfirió a un Tanque de neutralización (TQ1), donde se trató con Tiosulfato de Sodio Comercial a una concentración de 3.7 % p/v (200 g en un TQ de 5400 litros) por 60 minutos en recirculación constante. Antes de ser utilizada el agua para recambio de los acuarios, constantemente se hizo comprobación de la neutralización del cloro residual con una solución OTO (ortotoloidina) para asegurarse que estuviera libre del mismo y apta para su uso con camarones vivos. 58 A B . . C . Figura 14: Recepción y tratamiento de agua marina. A. Toma de muestra de agua para microbiología antes del tratamiento químico. B. Conexión de manguera del agua de llegada hasta el complejo de desinfección. C. Tanques de reserva para tratamiento de agua marina. 5.3.1.4 Pruebas microbiológicas del agua Para evaluar el efecto del tratamiento sobre la acción microbiana presente en el agua marina, se realizaron distintos recuentos de bacterias (UFC/ml) que evidenciaron el efecto inhibitorio del Cloro sobre la población bacteriana. Para ello, se tomó una muestra de agua en tubos plásticos de 1.5 ml estériles, antes del tratamiento y luego del llenado de los acuarios; estas muestras se llevaron a UNICAM donde fueron procesadas. 59 En este ensayo los datos obtenidos para las pruebas microbiológicas del agua, sólo se realizaron a fin de obtener información complementaria con relación a la eficacia del tratamiento utilizado. Para el crecimiento de la población bacteriana se utilizó Agar Marino, medio no selectivo usado para el aislamiento de bacterias totales presentes en camarones y Agar TCBS (Tiosulfato Citrato Bilis Sal Sacarosa), el cual es un medio selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (ANEXO 2) A B . . C . Figura 15: Microbiología de aguas A. Laboratorio de Microbiología – UNICAM. B. Cabina para procesamiento de muestras microbiológicas. C. Siembra de diluciones en Agar Marino y TCBS. El procesamiento de las muestras en el laboratorio se hizo de la siguiente manera: 1. A partir del agua inicial (antes y después del tratamiento) se hicieron diluciones seriadas, para ello se tomaron 100 μl de la muestra y se transfirieron a un tubo de 1.5 ml estéril, que contenía 900 μl de Solución Salina al 2 % (SSN 2%), esto se realizó sucesivamente hasta obtener una dilución de 10-3. 60 2. Se sembraron 10 μl de la muestra inicial en una parte media de caja la caja de petri y 10 μl de la dilución 10 -1 en la otra mitad. Al igual que lo anterior se hicieron las siembras con las diluciones 10-2 y 10-3. Luego se esparció el inoculo de forma homogénea sobre el Agar. La siembra se hizo sobre Agar Marino y TCBS por duplicado. 3. Las cajas de petri inoculadas se incubaron a 28 - 30°C y se realizó el recuento a las 24 horas. A continuación se resume el proceso de siembra: 1) 100 μl 100 μl 10 1.5 ml agua marina 100 μl -1 900 μl de SSN (2%) 10 900 μl de SSN (2%) -2 10 -3 900 μl de SSN (2%) 2) Muestra inicial 10 Directo 10 -1 1 10 -2 10 10 μl 10 Siembra en Agar Marino y TCBS por duplicado 2 10 -3 3 Siembra en Agar Marino y TCBS por duplicado Figura 16: Esquema descriptivo del proceso de dilución y siembra de muestras de agua marina. 61 5.3.2 Transferencia y Siembra de Animales en los Acuarios (Fase 2) Los acuarios se ordenaron sobre mesones en la Sala de Infección, cada uno debidamente marcado. Para mantener las condiciones de aireación, se les colocó una manguera con su respectivo aireador y se conectó a una tubería de aire; todos los materiales utilizados se desinfectaron previamente. A partir de los animales dispuestos en los Tanques cilíndricos de la Sala de No – infección, se tomaron con la ayuda de un chayo desinfectado, 400 camarones. Al momento de chayar se bajó el nivel del agua para facilitar la recolección. En la selección de los camarones se tuvo en cuenta que estuvieran dentro de un rango de peso similar, con el fin de obtener una biomasa homogénea para cada uno de los acuarios. A B . . C . Figura 17: Proceso de transferencia de camarones a los acuarios. A. Recolección de animales. B. Selección de camarones para obtener biomasa homogénea. C. Pesaje sobre balanza. 62 5.3.2.1 Control de peso de los camarones Para el pesaje de los camarones se contó con una balanza electrónica Mettler Toledo Ref. B3001 – 5 (Monobloc inside – weidhing technology) con un mínimo de medida de 0,0 g y un máximo de 31,0 g. Durante cada labor de pesaje, se bajó el nivel del agua y se recolectaron los camarones de forma individual, luego fueron colocados en un recipiente plástico que contenía agua marina para evitar estrés en los animales. Del valor total registrado luego del pesaje, se calculó el peso promedio por camarón tanto por acuario como por tratamiento. En el desarrollo de este bioensayo se realizaron cuatro mediciones del peso de los camarones por acuario. La primera se hizo al momento de la siembra, el segundo pesaje se realizó el día en el que se comenzaron las dietas experimentales, recién culminó la aclimatación en los acuarios. Posteriormente se hizo una tercera medición del peso previa a la infección experimental y por último al momento del registro de las mortalidades. 5.3.2.2 Unidades experimentales Luego de pesados los 400 animales se transfirieron diez camarones por cada uno de los 40 acuarios utilizados para el experimento. Al momento de introducir los animales a los acuarios en la Sala de Infección, estos se aclimataron, comparando el agua de salida con la de entrada para evitar estrés en los animales, cabe resaltar que no hubo diferencias en cuanto a la salinidad o temperatura entre el agua de origen y la destino, al momento de la siembra los acuarios ya se encontraban con aireación desde 24 horas antes. En resumen, como unidades experimentales se utilizaron diez acuarios (réplicas) por cada tratamiento, con diez animales en cada uno de ellos. De los acuarios utilizados, 20 fueron dispuestos para evaluar ERGOSAN® y los otros 20 fueron utilizados como Control; diez positivos y diez negativos para cada caso. 63 A A B . . C . Figura 18: Unidades experimentales A. Disposición de acuarios en la sala de Infección. B. Acuario de vidrio con capacidad para 30 L (30 cm de ancho por 60 cm de largo y 30 cm de alto), con 10 camarones cada uno. C. Rotulación de acuarios por cada tratamiento. Además se utilizaron seis acuarios, que se mantuvieron en las mismas condiciones, con diez camarones en cada uno; para la extracción de hemolinfa y la evaluación de los hemocitos. En total se utilizaron 60 camarones para esta prueba complementaria. Figura 19: Acuarios con camarones para extracción de hemolinfa y conteo de hemocitos. Como medida de prevención y para posibles reposiciones de camarones muertos antes de la infección, se dispuso de dos acuarios con 15 camarones cada uno, uno alimentado con dieta ERGOSAN® y el otro con dieta control. 64 5.3.2.3 Mantenimiento de acuarios Luego de la transferencia y en todo el desarrollo del experimento, la limpieza de los acuarios se realizó tomando cuidadosamente del fondo los residuos y/o detritos orgánicos como mudas, heces fecales, residuos alimenticios entre otros, con la técnica de sifoneo a partir de una bomba eléctrica, la boca de la tubería estaba sellada con una malla para evitar la entrada de los camarones. A B C D Figura 20: Mantenimiento de acuarios. A. Reducción de nivel del agua con la motobomba. B. Recambio a razón del 90%. C. Bomba eléctrica. D. Manguera sellada con malla para evitar la entrada de animales. Se hizo recambio diario del agua a razón de 90%, sin haber suspendido la aireación. Los acuarios se llenaron nuevamente con agua salada previamente tratada. Además, se revisó el estado de los acuarios dos veces al día con el fin de evitar el deterioro de la calidad del agua. 65 5.3.2.4 Condiciones físico – químicas del agua de los acuarios Los parámetros físico – químicos se mantuvieron en todo el desarrollo del ensayo bajo condiciones controladas, se realizaron mediciones constantes del agua, donde la temperatura osciló entre 27ºC y 28.2ºC; el oxigeno disuelto estuvo en el rango de 4.6 a 5.5 mg/l y la salinidad fue de 30 a 32 ppt. Figura 21: pHmetro y medición de pH en el agua de los acuarios Asimismo, se tomaron muestras de agua antes del vaciado y luego del llenado de los acuarios, que fueron enviadas al Laboratorio de Química de aguas de la Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO). Como resultado del análisis de nitritos, nitratos y amonio, los datos obtenidos estuvieron bajo el rango permitido para la condición del agua en Salas de Bioensayos. 5.3.3 Dieta experimental (Fase 3) En el experimento se utilizó una dieta experimental (ERGOSAN ®) y una dieta control. Las dos dietas fueron preparadas usando el mismo núcleo del alimento “CAMPENT-TOP” de CAMACO, a base de pellets con 25% de proteína, dicho alimento es elaborado por LARRO – Industrias de Natá S.A. (INASA) en la República de Panamá. (ANEXO 3) 66 La siguiente tabla muestra las características específicas del alimento utilizado en este experimento: Tabla 6: Características alimento CAMPENT – TOP - LARRO Características Cantidad (%) Humedad (máx.) 11 Proteína cruda (min.) 25 Grasa cruda (máx.) 10 Fibra cruda (máx.) 3 Cenizas (máx.) 8 Proteína animal (min.) 65 La dieta en la que se incluyó el producto comercial ERGOSAN ®, fue formulada con base a las indicaciones sugeridas por el fabricante. Donde, la mezcla para este caso se realizó a razón de 5 kg/Ton. Fue fabricado un batch de 30 quintales (3,000 lb de 454 g cada una). Tomando un quintal al azar se obtuvieron 5 kg de alimento tratado con ERGOSAN®, los cuales fueron divididos en 5 bolsas plásticas con sello hermético, de 1 kg cada una y preservados en refrigeración a 5ºC. El tamaño de los pellets experimentales tanto para el tratamiento con ERGOSAN ® como para el tratamiento Control fue de 2 mm aproximadamente. (ANEXO 4) A B Figura 22: Dietas experimentales A. Pellets de dieta BASE. B. Pellets de dieta ERGOSAN® 67 En adelante, y para efectos prácticos, se hará referencia a dieta ERGOSAN ® (dieta base + ERGOSAN®) y dieta BASE (sin ERGOSAN®). 5.3.3.1 Tratamientos experimentales (Diseño de la Investigación) El experimento se hizo a partir de cuatro tratamientos. El tratamiento uno (T1) consistió en el suministro de la dieta ERGOSAN®, donde los camarones no fueron infectados. Los animales tratados con el tratamiento dos (T2) también se les suministró dieta ERGOSAN®, pero a diferencia del T1 estos se infectaron con el virus WSSV. Se utilizaron diez acuarios para el Control negativo y otros diez para el Control positivo. En el primer caso, los camarones fueron alimentados con la dieta BASE (sin ERGOSAN®) pero estos no fueron infectados, lo anterior correspondió al tratamiento tres (T3). En cuanto al Control positivo que corresponde al tratamiento cuatro (T4), los animales también fueron alimentados con la dieta BASE (sin ERGOSAN®) pero estos camarones a diferencia de lo anterior si se infectaron con el virus WSSV. La siguiente tabla presenta de forma resumida el diseño experimental utilizado en este ensayo: Tabla 7: Diseño experimental utilizado para el suministro de dieta ERGOSAN® y dieta Control (Base) Tratamiento 1 2 Tipo de Infección con Nombre Alimento WSSV No. De acuario ERGOSAN® no Dieta base + infectado ERGOSAN® No 21 - 30 ERGOSAN® Dieta base + infectado ERGOSAN® Sí 1 - 10 Dieta BASE No 31 - 40 Dieta BASE Sí 11 - 20 Control no 3 infectado Control 4 infectado 68 El control negativo tuvo como objeto verificar que la mortalidad fuera exclusivamente causada por el virus WSSV y no por otro agente biótico o abiótico externo al experimento. El Control positivo tuvo la finalidad de servir como referencia para establecer si la supervivencia de los tratamientos con dietas medicadas, era superior o no a la dieta sin aditivos. Para los animales a los cuales se les realizó extracción de hemolinfa, se utilizaron tres acuarios los cuales se alimentaron con dieta a partir de ERGOSAN ® y tres acuarios se alimentaron con dieta BASE. Cabe resaltar, que los animales para este estudio de hemocitos, no fueron infectados con el virus WSSV y sus valores de supervivencia no se incluyeron en el análisis del experimento. A continuación se describe el diseño que se llevó a cabo para esta prueba: Tabla 8: Diseño utilizado para la dieta experimental de animales dispuestos para extracción de hemolinfa y conteo de hemocitos Tratamiento 5 Tipo de Infección con Nombre alimento WSSV No. de acuario Hemocitos con Dieta base + ERGOSAN® ERGOSAN® No 41 - 43 Dieta BASE No 44 - 46 Hemocitos sin 6 ERGOSAN® 5.3.3.2 Alimentación experimental de los camarones El suministro de la dieta experimental se hizo luego de transcurridos ocho días desde de la transferencia de los animales a los distintos acuarios (fase de aclimatación y reposición). La dosis de alimento utilizada en el estudio fue ad libitum (consumo libre). Con el manejo del alimento se procuró que no sobraran demasiados pellets de un día para otro, esto con el fin de mantener buena calidad del agua de los acuarios. El alimento fue distribuido de forma manual sobre la superficie de cada uno de los acuarios, los cuales estaban numerados y caracterizados con colores que diferenciaba 69 el tipo de tratamiento al cual se sometían los camarones. Esto, con el objeto de evitar confusiones al momento de depositar el alimento. El suministro de las dietas se hizo dos veces al día: 8:30 a.m. y 4:30 p.m.; esta frecuencia permitió que todos los camarones se alimentaran completamente. Figura 23: Alimentación de los camarones en cada uno de los acuarios Las dietas se aplicaron con base en el 10% de la biomasa de cada acuario. Al momento de esta fase de dieta experimental, la biomasa por acuario se encontraba en 13 g aproximadamente, esto indica que el 10% de alimento suministrado fue de 1.3 g por día, los cuales se dividieron en dos dosis cada una de 0.65 g (1.3 g 2 dosis/día ≈ 0.65 g/dosis/acuario). Como el suministro del alimento se hizo por la misma persona durante todo el experimento, la dosis necesaria por acuario se ajustó dependiendo de la cantidad de residuos que se observaron al término de cada jornada diaria. La alimentación con la dieta experimental ERGOSAN® se realizó por diez días luego de la transferencia, culminando un día antes de la infección con WSSV. Durante este tiempo se asume que el producto fue completamente incorporado al organismo de los camarones, en concentraciones suficientes para actuar como coadyuvante contra la infección del virus WSSV. 70 5.3.4 Infección experimental (Fase 4) Al día siguiente de haber culminado las dietas experimentales se hizo la infección experimental vía oral (per os) con tejido infectante (“papilla positiva”) para el virus WSSV. 5.3.4.1 Amplificación de cepas virales purificadas La papilla se preparó en base a la cepa original del virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) presente en la República de Panamá, la cual fue asilada en el año 2000 por CAMACO S.A. Dicha cepa fue criopreservada pura desde entonces a – 196ºC en nitrógeno líquido. La concentración de cada μl de purificado establecida con PCR en tiempo real, es de aproximadamente 10 millones de viriones. Para la realización de la papilla se utilizaron aproximadamente tres criotubos de 1.8 ml, los cuales se descongelaron a temperatura ambiente durante un tiempo determinado antes de ser utilizados. Figura 24: Inoculación de camarón libre de patogenos con el virus de WSSV. (Inyección sobre el tercer segmento abdominal con jeringa de 1 ml) Con la ayuda de una micropipeta, se tomaron 10 μl de los criotubos; la cantidad de criopreservado utilizada para la infección está determinada bajo el protocolo de CAMACO S.A. para la amplificación de cepas virales purificadas, donde se utiliza 1 μl por gramos de peso vivo del camarón. Los 10 μl de la cepa viral (hemolinfa 71 infectada + buffer T.E.N.) se colocaron cuidadosamente sobre papel PARAFILM de manera organizada, con el fin de facilitar la extracción. Las agujas que se utilizaron fueron de 1 ml (insulina). A partir de una población de 300 camarones libres de patógenos, con un peso promedio de 10 g. dispuestos en un tanque cilíndrico de fibra de vidrio previamente desinfectado, se recolectaron de manera individual cada uno de ellos con la ayuda de un chayo. Por cada camarón, se ubicó el tercer segmento abdominal donde ser realizó la punción con los 10 μl de la cepa viral, de manera cuidadosa para evitar daños en el tejido. Posteriormente, se fueron colocando uno por uno los animales inoculados en un RW (raceway). 5.3.4.2 Preparación de la Papilla infectante Los animales inoculados se mantuvieron bajo observación constante, con el fin de determinar las primeras mortalidades. Transcurridas 24 horas se presentó una mortalidad del 21%, para confirmar que las muertes estaban causadas por la infección del virus WSSV, se tomo una muestra de cinco camarones a los cuales se les realizó la técnica de inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®), se obtuvieron resultados negativos para la presencia del virus, lo que indica que la mortalidad para esta población fue causada por el manejo y estrés de los camarones debido a la punción. Luego de pasadas cuatro horas (28 h después de la infección) la mortalidad aumento de forma significativa y la mayoría de la población presentó signos de infección por el virus de WSSV. Por tal razón, se tomo una muestra de los camarones muertos y se les realizó la Prueba de Shrimple®, todos los animales analizados fueron positivos para el virus WSSV. De allí en adelante se recolectaron los camarones, se colocaron en bolsas plásticas selladas debidamente rotuladas y se llevaron a refrigerar a -10°C. La mortalidad cesó a las 36 horas luego de la infección. 72 Los camarones refrigerados se picaron completamente con la ayuda de bisturís estériles, en pedazos pequeños. Se mezclaron homogéneamente y se colocaron en un recipiente debidamente rotulado. Está papilla se mantuvo en refrigeración hasta el momento de su utilización. A B C Figura 25: Preparación de papilla infectante. A. camarones congelados positivos para WSSV. B. Cortes pequeños de camarón infectado. C. mezcla homogénea y envasado en recipiente para refrigeración 5.3.4.3 Verificación de Papilla mediante nested – PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) La evaluación de la papilla se hizo de manera semicuantitativa, realizando diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-7. A partir de la papilla congelada se tomo muestra la cual fue llevada a la Unidad de Investigación del Camarón (UNICAM) de CAMACO S.A. para ser analizada. El siguiente esquema muestra de manera resumida el procedimiento que se siguió para la evaluación de la papilla infectante: 73 Extracción de ADN 50 mg papilla Pellet de ADN + TE 5 μl Pellet de ADN + TE 5 μl 45 μl -1 TE 10 5 μl 45 μl -2 TE 10 5 μl 45 μl -3 TE 10 5μl 45 μl -4 TE 10 5μl 5 μl 45 μl -5 TE 10 45 μl -6 TE 10 45 μl -7 TE 10 103 102 101 nested – PRC 108 107 106 105 104 Figura 26: Esquema descriptivo para evaluación semicuantitativa de la papilla infectante (PCR con diluciones) En el laboratorio se pesaron 50 mg de la papilla, a los cuales se les realizó extracción de ADN. Posterior a la extracción se tomaron 5 μl del ADN resuspendido (ADN + TE) y se realizaron diluciones seriadas, es decir, de la dilución base (10 -1) se tomaron 5 μl que se pasaron a otro microtubo con 45 μl de solución TE, obteniendo la dilución 10-2 y así sucesivamente hasta alcanzar la dilución 10-7. Luego de tener cada microtubo con su respectiva dilución se les realizó nested – PCR con el fin de amplificar el ADN y observar hasta cual de las diluciones puede haber presencia de partículas virales. 74 Posterior a la verificación de la papilla infectante, se obtuvo como resultado que todas las diluciones fueron positivas para el virus WSSV (ANEXO 5). Si la sensibilidad del protocolo de nested-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la detección viral es de por lo menos 10 partículas virales (positivo), se sugiere que cada 50 mg de papilla tiene por lo menos 100 millones (108) de viriones infectantes, que pasarán a los tejidos de los camarones experimentales por vía oral. 5.3.4.4 Prueba de Virulencia de la Papilla Con el fin de analizar la capacidad infectiva y de virulencia de la papilla preparada en camarones sanos, se realizó una prueba previa a la infección experimental. Para el montaje se utilizaron dos acuarios antes desinfectados, donde se colocaron diez camarones por cada uno de ellos. Uno de los acuarios se utilizó para infección y el otro como Control negativo. La papilla se suministró al 10% de la biomasa, la cual se encontraba para cada acuario en 15 g aproximadamente, es decir, que los camarones a infectar se alimentaron con 1.5 g de la papilla vía oral. Los camarones del acuario Control se alimentaron con una dieta BASE. Las primeras muertes de los camarones se dieron transcurridas las 40 horas posteriores a la infección, alcanzando una mortalidad del 90% en menos de 14 horas después de la primera mortalidad (54 horas). Se tomo muestra de un camarón al cual se le realizó la Prueba de Shrimple®, para determinar que las muertes se dieron por la infección del virus WSSV, el resultado que se obtuvo fue positivo. (ANEXO 6) Debido a que la cepa viral utilizada en este experimento es altamente virulenta, no se ha establecido la DL-50 ya que muere entre el 90 y 100% antes de 7 días postinoculación (vía oral). Utilizar una concentración baja del virus para inocular camarones sanos, hará que la incubación sea más lenta y la mortalidad tome más tiempo, pero finalmente los camarones susceptibles morirán. Por consiguiente, el uso de concentraciones altas o bajas del virus solamente cambiará el tiempo de mortalidad total de la población expuesta y no la proporción de camarones muertos 75 5.3.4.5 Suministro de Papilla infectante Antes de la infección se realizó un pesaje de los camarones, con lo cual se obtuvo una biomasa de 20 g por acuario, dando un peso promedio de 2 g por camarón. El suministro de la papilla se hizo a razón de 4 g por acuario; es decir, la cantidad de papilla suministrada por acuario fue el 20% de la biomasa de cada uno. Tabla 9 : Diseño del suministro de papilla infectante Cantidad Tratamiento Nombre Suministro No. De por acuario Cantidad por de Papilla acuario (g) tratamiento (g) Sí 1 - 10 4 40 Sí 11 - 20 4 40 Total 80 gramos ERGOSAN® 2 infectado Control 4 infectado A B . . C D . . Figura 27: Suministro de papilla infectante a acuarios destinados para este fin. A. Corte de papilla congelada. B. Pesaje de la cantidad necesaria por acuario. C. Suministro a cada uno de los acuarios. D. Esparcimiento de la papilla por todo el àrea de superficie Un día después de la infección (día 12), se hizo sifoneo de todos los acuarios para extraer los residuos de la papilla y se reinició nuevamente el suministro de los pellets, 76 utilizando de aquí en adelante y en todos los tratamientos la dieta BASE (sin ERGOSAN®), hasta terminar el experimento. 5.3.5 Registro de Mortalidad (Fase 5) Esta fase consistió en el control y registro diario de las mortalidades que se presentaron luego de la infección con el virus WSSV, mediante observación diaria sin descuidar el estado de los animales infectados. La evaluación fue de manera detallada, minuciosa y frecuente, para evitar el deterioro de la calidad del agua y la sobreinfección por canibalismo de los animales sobrevivientes. Los camarones que iban muriendo se retiraron de los acuarios, registrando luego las bajas diarias en un formato diseñado para este fin. Se procuró hacer la recolección de los animales muertos de forma cuidadosa y con instrumentos específicos para cada tratamiento, esto con el fin de evitar contaminación cruzada entre los acuarios infectados y los no infectados (ANEXO 7) A B . . Figura 28: A. Recolección de animales moribundos. B. Registro de mortalidades en formato (No. de acuario, hora y fecha de recolección) 5.3.5.1 Toma de muestras para pruebas confirmatorias de laboratorio Durante esta fase de mortalidad, se tomaron 20 muestras de camarones moribundos, es decir, un camarón por cada acuario infectado (10 camarones ERGOSAN® + 77 infección y 10 camarones Control + infección); para luego ser procesadas por tres técnicas específicas. Lo anterior se hizo con el objeto de comprobar la infección de los camarones por el virus WSSV. Los animales sintomáticos para estas pruebas, fueron capturados entre las 36 h y las 62 h post-infección (ANEXO 8) Las pruebas realizadas en cada uno de los 20 camarones infectados y moribundos de los 2 tratamientos, fueron las siguientes: 1. Prueba Molecular: nested-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) 2. Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®) 3. Histopatología A continuación se describen los métodos que se utilizaron para cada técnica en cuanto a la recolección y toma de muestras: Para la recolección de animales se trato en lo posible de escoger camarones sintomáticos, además que presentaran letargia y pérdida del reflejo de huida, lo último hace referencia a la ausencia de respuesta al momento de la captura. Luego de capturado el camarón se le realizó un pesaje rápido, el cual fue registrado en el formato de mortalidad. Posteriormente, se extrajeron asépticamente dos pleópodos (primer par), los cuales se colocaron con la ayuda de una pinza desinfectada en un microtubo que contenía 95% de etanol con el fin de fijar los tejidos. Los tubos sellados se colocaron en bolsas plásticas debidamente rotuladas y enviadas al laboratorio para realizarle la prueba de nested – PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Inmediatamente, se tomó el segundo par de pleópodos los cuales se utilizaron para la prueba de inmunocromatografía. Esta técnica se realizó de manera inmediata con el kit comercial Shrimple® (Fujikura Kasei Co., Ltd, Japón) en la Sala de Bioensayos. Seguidamente y con los camarones aún vivos, se realizó fijación de los tejidos del camarón con solución de Davidson (AFA) mediante inyección, estos se colocaron en 78 recipientes plásticos con tapa rosca que contenían este fijador. La muestra se dejo sumergida por 48 horas en estos tarros y luego fueron transferidos a Etanol al 70%. Las muestras fueron llevadas al laboratorio para su procesamiento histológico mediante inclusión en parafina y tinción de Hematoxilina y Eosina de Harris (modificada). El procedimiento anterior se realizó para cada una de las muestras recolectadas (20); cada vez que se inició el proceso, el material para la toma de muestras fue esterilizado y/o desinfectado pasándolo por alcohol industrial, cloro y por último agua destilada. Las muestras para nested – PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) e histopatología se procesaron en UNICAM. A C B D Figura 29: Proceso de toma de muestras de camarones moribundos infectados con WSSV. A. Desinfección de material. B. Extracción aséptica de pleópodos para prueba molecular y de inmunocromatogafía. C. Rotulacion de frascos tapa rosca con solución Davidson (AFA). D. Fijación mediante inyección 79 5.4 Técnicas confirmatorias de la infección por el virus WSSV Como se mencionó anteriormente, estas pruebas se realizaron con el fin de confirmar que las muertes que se presentaron luego de la infección per os corresponden exclusivamente al virus WSSV y no estuvieron determinadas por otro agente patógeno ajeno al estudio. 5.4.1 Prueba molecular para la amplificación y detección del ADN viral (WSSV) 5.4.1.1 Extracción de ADN Para esta técnica se siguió el protocolo utilizado por el laboratorio de UNICAM (Unidad de investigación del Camarón, CAMACO S.A. Panamá), dicha extracción se llevó a cabo por medio un método sencillo que se basa en el uso de un buffer de lisis ( SDS-detergente no iónico), seguido de un choque mecánico y térmico. Como las muestras para esta técnica se encontraban fijadas en etanol al 95% se pasó la muestra a nuevos microtubos de 1.5 ml estériles. Luego se agregó por cada tubo 500 µl de solución salina estéril (NaCl 2%), y se invirtió el microtubo varias veces. Este lavado se hizo por triplicado, lo que permitió eliminar el exceso de etanol de las muestras de los tejidos. De aquí se tomaron 50 mg y se colocaron en microtubos de 1,5 ml. Luego se agregaron 400 µl del reactivo R1 (SDS 1% + NaOH 0,2 N – buffer de lisis) y con la ayuda de un macerador se maceraron cuidadosamente los tejidos. Para cada muestra se utilizaron maceradores distintos, previamente esterilizados. Los microtubos se llevaron a incubar en baño seco a 95ºC por diez minutos, sobre estos se colocaron seguros o cabaliers sobre la tapa, con el fin de prevenir que estas se destaparan por causa de la presión. Finalizado este tiempo, se retiraron los microtubos y se centrifugaron por diez minutos a 13000 rpm. separando de este modo la impurezas. 80 Se transfirieron 200 µl del sobrenadante, donde se encontraba el ADN extraído, a un nuevo microtubo de 1,5 ml. A este se le agregaron 400 µl de R2a (etanol al 99%) y se homogenizó invirtiendo el tubo varias veces. Seguidamente se centrifugó por 5 minutos a 13000 rpm. logrando así precipitar el ADN al fondo del microtubo. Luego se eliminó el sobrenadante cuidadosamente, para evitar la salida del pellet de DNA y se agregaron 150 µl de R2b (etanol al 70%), el cual se homogenizó y se llevo posteriormente a centrifugar por cinco minutos a 13000 rpm. lo anterior con el objeto de purificar el DNA y lavar los residuos químicos. Se sacaron los microtubos de la centrifuga y se eliminó en su totalidad el sobrenadante, se dejó secar el microtubo en posición invertida por 15 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se resuspendió el pellet de DNA con 50 µl de R3 (TE = Tris 10 mM + EDTA 1 mM), previamente calentado a 65ºC. Los tubos se llevaron a refrigeración (4ºC). A B . . C D . . Figura 30: Extracción de ADN. A. Lavado de muestras con solución salina estéril. B. Maceración de tejidos. C. Incubación en baño seco. D. Precipitación de ADN en el fondo del microtubo 81 5.4.1.2 Nested – PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) Para la preparación tanto de la primera como de la segunda reacción, el manejo de las muestras se realizó sobre un recipiente congelado. Se utilizaron puntas con filtro nuevas y guantes libres de RNasas. En esta prueba se incluyó un control positivo C (+) que sirvió como testigo del buen funcionamiento de la reacción y un control negativo C (-) que permitió confirmar que los reactivos utilizados no estaban contaminados. - Preparación de la primera reacción de PCR (Mix1) Para la preparación del Mix de PCR se tomo en cuenta el número de muestras a analizar más el control positivo C (+) y el negativo C (-) y una reacción adicional. Para ello se remplazó la siguiente ecuación: N= No. de muestras + C (+) + C (-) + 1 N = 20 + 1 C (+) + 1 C (-) +1 N= 23 La siguiente tabla indica el volumen de solución necesario para un tubo de la primera reacción de PCR (Mix1), estos datos se usaron como base para hallar el volumen total requerido para el análisis de las 23 muestras: Tabla 10: Volúmenes necesarios para preparar Mix 1 Mix 1 Volumen (µl) Premix 46,8 PWF1 1 PWR1 1 Taq DNA polimerasa 0,2 Volumen final 82 49 µl/ tubos Donde, el Premix estaba constituido por una mezcla de 10 µL de Buffer 5X Colorless (Promega cat. M792A), 3 mM de Cloruro de Magnesio MgCl2, 1 µL de Desoxinucleotidos trifosfatados dNTPs (Promega cat. U151B), 32.8 µL de agua destilada ultrapura (GIBCO cat. 10977-015) y los PWF1 – PWR1 (Concepto Azul, Ecuador) corresponden a los primers o iniciadores específicos para el virus WSSV. Luego de obtener el Mix1 se colocaron 49,0 µl en cada uno los 23 microtubos de 0.2 ml y se les adicionó 1 µl del ADN extraído. Se homogenizaron cuidadosamente y se colocaron en el termociclador (MWC-Biotech Primus 96 plus), para así comenzar la amplificación de secuencias especificas de ADN viral. A continuación se resume el programa del termociclador y la actividad que se ejecuta dependiendo de los cambios de temperatura: Tabla 11: Programación del termociclador para la amplificación de secuencias especificas del genoma viral (WSSV) Ciclos Temperatura (°C) Tiempo (seg.) Acción Denaturación del 1 ciclo (inicial) 94 180 (3min.) DNA Denaturación del 30 ciclos 1 ciclo (final) 94 30 DNA 47 45 Anillaje 72 45 Extensión inicial 72 300 (5 min.) Polimerización 4 indefinido Conservación - Preparación de la segunda reacción de PCR (Mix 2) Para la segunda reacción se siguió el mismo procedimiento utilizado para la preparación Mix1 (Tabla 10), a diferencia de este se hizo variación en los primers 83 (PWF2 y PWR2 - Concepto Azul, Ecuador). En este caso se tomo 1 µl de cada microtubo de la primera reacción y se adicionaron a nuevos microtubos debidamente marcados con el número de cada muestra, estos contenían 49,0 µl del Mix 2 previamente realizado. Las microtubos de 0.2 ml se colocaron en el termociclador programado de igual forma que en la primera reacción (Tabla 11) A B . . C D . . Figura 31: Técnica de nested-PCR A. Laboratorio de Biología Molecular – UNICAM. B. Preparación de reactivos para PCR C. Adición de 1 µl de ADN extraído en microtubos. D. Termociclador 5.4.1.3 Observación e interpretación de resultados (nested-PCR) La observación e interpretación de los resultados se hizo mediante Electroforesis en gel de agarosa al 1.5%. 84 Para la preparación del gel se pesaron 1.5 g de agarosa, se colocaron en un erlenmeyer con 240 ml de solución buffer (TAE = Tri Base + Acido acético + EDTA), se mezclo bien y se puso a calentar por cinco minutos o hasta punto de ebullición. Posteriormente se le adicionaron 12 µl de Bromuro de Etidio, se homogenizó y se sirvió sobre la caja de pozos. Se dejó enfriar hasta gelificar, aproximadamente durante un tiempo de 15 minutos. Listo el gel se colocó sobre la cámara de electroforesis, para el llenado de los pozos se depositaron 10 µl del producto de nested – PCR más 4 µl de azul de bromofenol aproximadamente. Para la migración electroforética se programó el sistema con 90 v. 50 mA por 15 minutos. Luego de transcurrido el tiempo de migración se observaron los resultados en el transiluminador (luz U.V.). A B . . C D . . Figura 32: Observación e interpretación de resultados de la nested – PCR. A. Cámara para migración electroforética y transiluminador. B. Mezcla del producto de la nested – PCR más azul de bromofenol. C. Siembra sobre gel de agarosa. D. Observación de resultados en el transiluminador (Luz U.V.) 85 Para la interpretación se tubo en cuenta que: toda muestra que presente una banda al mismo nivel de la banda observada para el control positivo C (+) se consideraron como positivas. Y para el control negativa (-) debe estar ausente la banda. 5.4.2 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®) A partir del segundo par de pleópodos extraído de cada camarón, se realizó la técnica de inmunocromatografía en la sala de Bioensayos. Para ello, se llevó a cabo la Prueba de Shrimple® con el kit comercial. A continuación se muestra un esquema que describe el procedimiento que se utilizó para el procesamiento de los pleópodos de animales moribundos: Figura 33: Shrimple® diagnostic test kit procedure diagram and potencial test results. Reprinted whith permission from EnBioTec Laboratories Co., Ltd. Shrimple® Product Gruide, En Bio Shrimple virus detection kit manual. (Figura tomada de: Powel James, 2006). 86 Al momento de colocar la muestra sobre el pozo, la membrana contiene en primera instancia anticuerpos conjugados (gold labeled anti-WSSV) los cuales reconocen los antígenos específicos de WSSV. Luego la membrana se divide en dos zonas, una recubierta con anticuerpos monoclonales anti – WSSV (zona T) y anticuerpos inmunoglobulinas G (IgG) (zona C). Los anticuerpos conjugados movilizan los antígenos hasta la zona T, aquí son inmovilizados por los anti-WSSV produciéndose una reacción colorimétrica sobre dicha zona. Los anticuerpos conjugados corren por capilaridad y bloquean los anti – IgG, donde se produce una segunda reacción que corresponde a la zona control. Si al final de la prueba aparecen dos bandas rosas tanto en la zona T como en la zona C, está es considerada positiva para la presencia del virus de la mancha blanca (WSSV), a diferencia de esto si la banda solo aparece en la zona control esta es considerada como negativa. (ANEXO 9) Las herramientas de diagnóstico molecular han hecho más precisa la detección del virus WSSV, sin embargo, estas técnicas a menudo no son accesibles o no están disponibles para el diagnóstico rápido en campo o en instalaciones de producción de camarones. Por ello, es que esta técnica de inmunocromatografía esta diseñada específicamente para el uso donde se necesitan resultados rápidos, ya que en ocasiones el proceso para el análisis de muestras mediante biología molecular puede tardar días. Esencialmente, esta prueba de inmunoensayo está basada en fundamento de ELISA (sándwich). Donde, se da una reacción de anticuerpos monoclonales con proteínas estructurales del virus sobre una membrana de flujo lateral (Poulos et al., 2001; y. Takahashi et al., 2003. En: Morales, V. y Cuéllar Anjel, J. 2008). En la prueba de Shrimple® se utilizan anticuerpos específicos para antígenos específicos del virus WSSV, que al unirse producen una reacción colorimétrica observándose así las bandas de color rosa. 87 5.4.3 Histopatología A partir de las muestras recibidas en frascos con etanol al 70%, se extrajeron los camarones fijados y se sometieron a cortes longitudinales y transversales de cefalotórax, branquias y abdomen (3er segmento). Las muestras fueron codificadas y colocadas en un cassette histológico. A B C E D F Figura 34: Procesamiento de muestras para técnica de histopatología. A. tejido conservado en etanol al 70%. B. Corte de cefalotórax. C. Ubicación de cortes de tejidos en el cassette. D. Procesador de tejidos. F. Colocación de casset en el primer envase. E. Inclusión de tejido en parafina Para el procesamiento de las muestras se colocaron en una canastilla de metal, dentro de un procesador de tejidos. Posteriormente se pasaron por recipientes que contenían: etanol al 70% (dos envases), etanol al 80% (dos envases), etanol al 95% (dos envases), etanol al 100% (dos envases), Hemo De (o Xilol) (dos envases) y Parafina 88 derretida termostatada (dos envases). El procesador fue programado para que cada muestra permaneciera por una hora en cada uno de los envases en un tiempo de 12 h y durante este proceso ocurrió la correspondiente deshidratación y aclaración de los tejidos. Una vez procesadas las muestras se llevo a cabo la inclusión o penetración de la parafina en el tejido, de esta forma se produjo el endurecimiento por congelación, formando bloques sólidos denominados “tacos” y esos pasaron a ser cortados en el micrótomo. Se realizaron cortes a los bloques con un espesor de 3 µm. El ángulo del micrótomo estaba ajustado a 5º y 6º. Para montar el tejido en el portaobjetos se utilizó el flotador de tejido, que tiene como función extender el corte y eliminar pliegues. Este contenía una mezcla de agua destilada, albúmina y gelatina para la adhesión del tejido a la lámina portaobjetos y se encontraba a una temperatura de 60°C. Con el fin de desparafinar las láminas estas se colocaron en un incubador a una temperatura de 65ºC – 70ºC por media hora. Para la teñir las láminas se utilizó la Tinción con Hematoxilina y Eosina de Harris (modificada). Al momento de la tinción se suspendieron las láminas en la siguiente secuencia sobre los distintos reactivos: 1: Hemo De (5 min.), 2: Hemo De (5 min.), 3: Etanol 100% (2min.), 4: Etanol 100% (2 min.) 5: Etanol 95% (10 inmenrsiones), 6: Etanol 95% (10 inmersiones), 7: Etanol 80% (10 inmersiones), 9: Agua destilada ( 2 – 3 inmersiones, con cambio de H2O por cada baño), 10: Hematoxilina (4 – 6 min.) 11: Agua corriente (2- 3 min.), 12: Eosina ( 1 inmersión), 13: Etanol 95% (10 inmersiones), 14: Etanol 95% (10 inmersiones), 15: Etanol 100% ( 10 inmersiones), 16: Etanol 100% (10 inmersiones), 17: Hemo De (10 inmersiones), 18: Hemo De (10 inmersiones), 19: Hemo De (10 inmersiones), 20: Hemo De (10 inmersiones) 89 Una vez realizada la tinción, las muestras se pasaron a una cámara de extracción donde se limpiaron y se colocó sobre ellas un cubreobjetos con una gota de permount (medio de montaje), de forma cuidadosa y evitando la formación de burbujas. Luego se rotularon cada una de las láminas con el código correspondiente. Las láminas histológicas fueron examinadas bajo el microscopio por el Dr. Jorge Cuéllar-Anjel, Director de la Tesis y se registró el resultado obtenido por cada una de las muestras. A B . . C . Figura 35: Observación de resultados de prueba Histopatologíca. A. Lámina portaobjetos con cortes histológicos teñidos. B. Caja de 20 láminas histológicas debidamente rotuladas. C. Observación bajo el microscopio de cada lámina analizada por el Dr. J. Cuéllar-Anjel. 5.5 Extracción de Hemolinfa (prueba complementaria) En el ensayo se realizaron tres extracciones de hemolinfa en total, las muestras se tomaron al cabo de 10 días de estar suministrando el producto comercial 90 ERGOSAN®, así como los días 20 y 30 luego de haberlo terminado de usar (Tabla 8). Luego de cada extracción, se hizo conteo de hemocitos en cada muestra. Para la extracción de hemolinfa se colocó el camarón en posición ventro-dorsal (“boca arriba”) dejando expuesta la zona de unión entre cefalotórax y abdomen (seno hemolinfático ventral), luego se desinfectó la superficie con alcohol al 90% y mediante una jeringa de insulina estéril nueva con aguja hipodérmica (1 mL) y cargada con 100 L de anticoagulante (solución Alsever + formol 10%) se extrajeron 100 L de hemolinfa (relación hemolinfa anticoagulante de 1:1). A B C Figura 36: Proceso realizado para la extracción de hemolinfa en camarones. A. Ubicación del seno hemolinfático ventral e introducción de aguja con bisel boca arriba. B. Extracción de hemolinfa. C. Colocación de hemolinfa coagulada en cada uno de los microtubos de 1.5 ml, debidamente rotulados. Se introdujo con cuidado el bisel de la aguja hacia arriba y al mismo tiempo se succionó, extrayendo aproximadamente 100 µL de hemolinfa por cada camarón; inmediatamente se homogenizó para evitar la coagulación de la hemolinfa. La 91 relación entre anticoagulante y hemolinfa fue de 1:1. (Cuéllar-Anjel, 2008. En: Morales y Cuéllar-Anjel, 2008). La muestra extraída en cada jeringa se colocó en microtubos estériles de 1.5 mL, debidamente rotulados con cada número de camarón, estos se colocaron en bolsas plásticas selladas marcadas con el rango de los números de los camarones analizados por cada tratamiento. 5.5.1 Conteo de Hemocitos (Hemograma) A cada una de las 60 muestras extraídas se les realizó conteo total y diferencial de hemocitos, que corresponden a 30 camarones alimentados con dieta ERGOSAN ® y 30 camarones con dieta BASE. Como el volumen de hemolinfa que contenían los microtubos no era exacto y homogéneo, se tuvo en cuenta el factor de dilución al momento de hacer el conteo y registrar los resultados. Para determinar el factor de dilución y partiendo de 100 L de anticoagulante en todos los microtubos, se extrajo y registró la cantidad total de hemolinfa anticoagulada con la ayuda de jeringas de 1 mL nuevas. (hemolinfa + solución de Alsever). Para hallar el factor de dilución se realizó un cálculo entre el volumen de hemolinfa coagulada entre el volumen de hemolinfa total. Los datos obtenidos se registraron en un formato diseñado para tal fin. FD= Vol. Ha (µL) /Vol. H (µL) Donde, FD = Factor de dilución Vol. Ha = volumen de hemolinfa anticoagulada (extracción inicial de hemolinfa más solución de Alsever) Vol. H= volumen de hemolinfa extraído (Vol. Ha – 100) 92 5.5.1.1 Montaje en Cámara de Neubauer (Hematocitómetro) Para el montaje de la cámara primero se hizo una limpieza con la ayuda de toallas de papel humedecidas en agua destilada, se trató en lo posible de eliminar todos los residuos tanto de la superficie de la cámara como de la laminilla de cuarzo. Posteriormente, se colocó con mucho cuidado la laminilla sobre la cámara cubriendo las cuadriculas. Con la ayuda de una micropipeta (1-200 µL) se tomaron 20 µL del contenido de hemolinfa anticoagulada y se depositaron sobre el pozo de la cámara, dejando que se esparciera lentamente el contenido por capilaridad. Para el análisis de cada muestra se utilizaron puntas estériles diferentes y se llenaron los dos pozos (inferior y superior) simultáneamente con muestras de hemolinfa diferentes. De manera inmediata, se colocó la cámara de Neubauer en un microscopio de contraste de fase y se observó con el objetivo 40X (y oculares 10X= 400X). Se ubicaron los 5 cuadrantes pequeños de la cámara y el recuento se hizo con base en los 4 cuadros de las equinas y el central. Para llevar la cuenta de los hemocitos totales y diferencial se utilizó un contador celular mecánico rotulado. Para determinar el recuento total de hemocitos para cada muestra analizada se realizó la siguiente ecuación: THC: HC x 400 x 10 x 2/80 Donde, THC = conteo de hemocitos totales HC = número de hemocitos contados en los 5 cuadrantes 400 = cuadrículas pequeñas contenidas en la cámara (16 x 25 cuadrantes) 10 = ajuste por profundidad de la cámara (0.1 mm x 10 = 1 mm) 2 = factor de dilución del anticoagulante (1:1) 80 = total de cuadriculas por los 5 cuadrantes contados (16 x 5) 93 5.6 Análisis de la información Los resultados de supervivencia obtenidos para cada tratamiento luego de la infección con el virus WSSV, fueron registrados y analizados estadísticamente en formato Excel®. Debido a que los resultados obtenidos estaban determinados en porcentaje y hubo datos con valores desde “0” hasta “100”, los valores se sometieron a transformaciones con raíz cuadrada de (X + 1), siendo en este caso “X” cada uno de los resultados de supervivencia por acuario. Los resultados de las transformaciones fueron sometidos a las pruebas estadísticas de ANOVA y Duncan, mediante el programa estadístico SAS; con el objeto de hallar diferencias significativas entre los tratamientos. En cuanto a la variable de supervivencia, las diferencias se consideraron significativas cuando P ≤ 0.05. En cuanto a los valores obtenidos para el recuento total y diferencial de hemocitos (hemograma), estos también fueron sometidos a transformación pero en este caso se utilizó logaritmo de (X + 1), siendo “X” el número de hemocitos por mm3 para cada caso. De igual forma se les corrió análisis estadístico para buscar diferencias significativas con el programa SAS y mediante ANOVA y Duncan, considerando significativas las diferencias cuando P ≤ 0.06. 94 6. RESUTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Pruebas previas al experimento Con relación a la población de camarones utilizada para el experimento, todos los resultados fueron negativos mediante la técnica de nested – PCR para el virus WSSV, la alfa Proteobacteria causante de la Hepatopancreatitis necrotizante (NHP) y el virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoiética (por sus siglas en ingles IHHNV). Esto indica que los animales se encontraban libres de estos patógenos específicos para camarones. En cuanto a las condiciones del agua de las unidades experimentales y de la sala de bioensayos, la temperatura del agua osciló entre 27ºC y 28.2 ºC, el oxígeno disuelto estuvo en el rango de 4.6 a 5.5 mg/L y la salinidad estuvo entre 30 y 32 ppt (partes por mil). Es de vital importancia mantener estas condiciones bajo control, ya que su cambio drástico puede causar variaciones en la replicación del virus en los camarones, obteniendo así resultados distintos a los esperados. Con referencia al estado microbiológico del agua, se obtuvieron resultados satisfactorios luego del tratamiento realizado con cloro. De todas las muestras analizadas se realizó un promedio tanto del recuento total en Agar Marino como en TCBS, antes y después del tratamiento. Las muestras sembradas en Agar marino tuvieron como resultado antes del tratamiento, 2.7 x 10 6 UFC/mL y en Agar TCBS 2.3 x 103 UFC/mL. Posterior al tratamiento desinfectante, en Agar Marino se obtuvo un crecimiento de 8.6 x 105 UFC/mL y no hubo crecimiento en Agar TCBS. Aunque en Agar marino no hubo una reducción de crecimiento microbiano considerable luego del tratamiento, este medio se usó para el aislamiento de bacterias totales en el agua marina, siendo este no selectivo para las bacterias patógenas de camarones. Como resultado favorable para las condiciones del agua de las unidades experimentales, no se presentó crecimiento en Agar TCBS, el cual es un medio selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae, muchas de las cuales son patógenas para camarones. Lo anterior se considera importante dentro del desarrollo 95 del experimento, ya que hubo una reducción de la población patógena para los animales, lo cual podría haber interferido con la salud de los camarones y por ende con los resultados del estudio. (ANEXO 10) En cuanto a las características morfológicas evidenciadas en el crecimiento sobre Agar Marino, predominaron las colonias de un tamaño aproximado menor de 2mm, borde liso y color crema. Como este medio proporciona a las bacterias condiciones óptimas y ofrece nutrimentos similares al ambiente marino permitió el crecimiento elevado y con colonias variadas. Las siembras en placa sobre TCBS, mostraron que las colonias predominantes fueron sucrosa positiva (colonias amarillas) con relación a las sucrosa negativa (colonias verdes). La bibliografía reporta que las colonias verdes son las mas relacionadas con patogenicidad en camarones, mas aún si son luminiscentes (Gómez-Gil, 1998). Las bacterias principalmente las del género Vibrio, son consideradas como patógenos oportunistas, ya que en presencia de otros factores estresantes, pueden desencadenar el desarrollo de infecciones en los organismos (Gómez B., 2000). Este tipo de bacterias causa infecciones letales al interactuar con factores nutricionales, bióticos, abióticos, genéticos e inmunológicos. Las especies causantes de altas mortalidades en las granjas camaronícolas son: Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi, y Photobacterium daunselae y las especies que tienen cepas patógenas reportadas en los laboratorios causantes de mortalidades en larvas y postlarvas son: V. harveyi, V. splendidus y Vibrio sp. Aunque también son reportadas pero de manera ocasional en laboratorios y granjas de camarón Photobacterium damsela, V. fuvialis y Vibrio sp. (Morales V., y Cuéllar – Anjel J., 2008) 6.2 Manifestaciones clínicas de la enfermedad en camarones infectados La prueba de desafío realizada mediante infección experimental, permitió observar las manifestaciones clínicas que presentan los camarones al ser infectados por el virus WSSV. Los principales signos clínicos que se observaron en la población infectada 96 fueron principalmente tracto intestinal vacío, dado la disminución del consumo de alimento o al cese completo del mismo (OIE, 2000). Además, el exoesqueleto de los camarones presentó una textura blanda, cromatóforos expandidos y una coloración pálida generalizada, en algunos casos los animales tomaron una coloración rojiza muy leve (OIE, 2000). Al momento de la captura de los animales moribundos, estos se observaron letárgicos y con pérdida del reflejo de huída. También se visualizó en los camarones ausencia de respuesta ante el ataque de otros camarones. Estos son los signos clínicos característicos de la enfermedad de la mancha blanca en fase aguda, que se observan en poblaciones de cultivo de camarón blanco en Centroamérica y Sudamérica (Cuéllar-Anjel, com. pers.). Como las mortalidades se dieron prácticamente en una fase muy aguda de la infección, las manchas blancas bajo la cutícula fueron difíciles de discernir, solo en algunos casos se observaron las inclusiones pero muy pequeñas. (OIE, 2000). A B Figura 37: Comparación entre los signos clínicos presentados por un camarón infectado a diferencia de un camarón sano. A. camarón con signos de la enfermedad por WSSV, coloración pálida y levemente rojiza hacia los uropodos y pleópodos, cutícula flacida. B. cloración normal (animal transparente) con cutícula rigida. 97 A B Figura 38: (A – B) Fotografías donde se puede observar a simple vista a partir de la separación cuidadosa de la cutícula de los tejidos y sostenida hacia la luz, los pequeños puntos blancos que trata de disposiciones anormales de sales de calcio. Foto “B” cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel. Los signos externos pueden ser de gran ayuda como indicativos de una anomalía, en cuanto al diagnóstico del virus WSSV (Alday, V. 1999), pero en este caso la evaluación de signos clínicos solo se realizó para la obtención de resultados presuntivos ya que estos no se pueden utilizar como único medio de diagnóstico, por este motivo como se mencionó previamente, se decidió realizar las distintas pruebas de análisis de mayor sensibilidad que nos permitieron confirmar la presencia del virus en cada una de las muestras analizadas. 6.3 Pruebas confirmatorias del virus WSSV Para corroborar que la alta mortalidad presentada en los acuarios infectados corresponde a la infección por el virus WSSV, se realizaron tres tipos de análisis que ratificaron la presencia del mismo y su efecto sobre los tejidos del camarón. Para los tres casos se obtuvieron los resultados esperados, cada una de estas técnicas mostró como positiva la presencia del virus. 6.3.1 Inmunocromatografía (Prueba de Shrimple®) De forma inmediata, al momento de la recolección de muestras para la confirmación de la presencia del virus en los camarones moribundos que presentaron uno o más signos de esta enfermedad, se les realizó una prueba de inmunocromatografía en la 98 sala de bioensayos. Esta técnica logró corroborar en primera instancia el diagnóstico presuntivo de la enfermedad causada por el virus WSSV. Luego de procesadas las 20 muestras estas arrojaron como resultado positivo a WSSV en todos los casos sometidos a confirmación. (ANEXO 11) A B Figura 39: (A) Fotografía que indica resultados positivos para el virus WSSV mediante la Prueba de Shrimple®. (B) Zona C y Zona T con bandas color rosa. La muestra corresponde a un camarón recolectado de un acuario sometido al tratamiento de la dieta BASE más infección con el virus WSSV (Acu. 16 - CONTINF). Para las 20 muestras analizadas mediante inmunocromatografía, todos los resultados arrojados fueron positivos. Como la toma de muestras se realizó dentro de las 36 h y las 62 h post-infección, esto favoreció la eficacia del kit (Shrimple®) en cuanto a la detección del virus. Para la interpretación de los resultados se tuvo en cuenta lo descrito por Powel James (2006) y el manual para el uso del kit comercial (EnBioTec Laboratories Co., Ltd.) donde se debe considerar positivo para el virus WSSV cuando 99 la prueba da lugar a dos bandas de color rosa en la zona T y C, como se observa en la Figura 39. En la investigación realizada por Powel, J. (2006), donde se infectaron camarones con el virus WSSV, se determinó el rango de sensibilidad en la que el kit de diagnóstico es capaz de detectar el virus y el rendimiento del mismo en comparación con las técnicas de PCR convencional y Real Time – PCR. Dentro de los resultados se obtuvo que los resultados del test de Shrimple ® se correlacionan con los arrojados por PCR convencional, en cuanto a los obtenidos por Real Time- PCR está técnica posee una mayor especificidad y sensibilidad en comparación con las otras dos. Aunque mucho menos sensible que la Real Time -PCR, los kits de la prueba de Shrimple® proporcionan una herramienta útil para la detección de la infección causada por el virus WSSV antes el desarrollo de signos graves de la enfermedad aguda (12 horas post – infección) (Powel, J. 2006) 6.3.2 Nested – PCR (Reacción en cadena de la polimerasa anidada) La Figura 40 revela los resultados obtenidos, luego de procesar las 20 muestras tomadas al momento del registro de mortalidad. Como se observa en la fotografía del gel de agarosa, todas las muestras son positivas, es decir, que el ADN del virus WSSV fue amplificado satisfactoriamente, obteniendo así la debida confirmación. Para la interpretación de los resultados se debe tener en cuenta que todas las muestras que se encuentran en los carriles del 1 al 20 son consideradas como positivas ya que presentan una banda al mismo nivel de la banda observada para el control positivo (C +). En cuanto al control negativo (C-), no se observa ninguna banda lo que indica que no hubo contaminación cruzada entre las muestras y tampoco hubo contaminación de ADN en ninguno de los reactivos utilizados para la PCR. (Morales, M. 2009) (ANEXO 12) 100 Figura40: Electroforesis en gel de agarosa que permite la observación de los resultados de la amplificación del ADN viral mediante nested-PCR para cada una de las muestras procesadas. Los controles están definidos de la siguiente forma: CP, control sin DNA (control negativo de PCR); CE, control sin DNA (control negativo de extracción); Carriles del 1 al 20 son los productos de PCR. C (-), control negativo y C (+) control positivo. Estudios realizados por Hossain (2001) y Esparza–Leal (2009) demuestran que para el análisis experimental de la inefectividad del virus sobre el camarón L. vannamei y otras especies de crustáceos, se obtuvieron resultados de mayor sensibilidad utilizando nested–PCR que PCR convencional. A pesar de que está técnica tiene un alto grado de sensibilidad, existen inconvenientes dentro de los cuales puede estar un elevado costo, requiere de personal y equipos altamente especializados y, en ocasiones pueden existir inhibiciones y contaminaciones que pueden dar resultados falsos positivos. Por lo anterior, se debe tener conocimiento de la existencia de otras pruebas que nos permitan detectar la presencia del virus. 6.3.3 Histopatología Está técnica a parte de que nos confirmó la presencia del virus en las 20 muestras analizadas, también nos permitió observar el daño que genera la infección del 101 patógeno viral sobre los tejidos del camarón. Las láminas con los cortes histológicos fueron observadas y analizadas bajo en microscopio (400X y 600X) por el director de la Tesis, Dr. Jorge Cuéllar–Anjel, Patólogo Veterinario especialista en organismos acuáticos. Para esta prueba todos los resultados fueron positivos, donde se encontraron hallazgos relacionados con el virus WSSV, clasificados dependiendo el grado de severidad 0 – 4, siendo el 4 el más severo. (ANEXO 13) Tabla 12: Hallazgos relacionados con la infección del virus WSSV en láminas histológicas No. muestra No. Acu Tratamiento VAC WSSV 1 5 ERGINF 1 4 2 2 ERGINF 1 3 3 14 CONTINF 2 3 4 9 ERGINF 3 4 5 7 ERGINF 3 4 6 11 CONTINF 3 3 7 1 ERGINF 4 4 8 8 ERGINF 1 4 9 18 CONTINF 3 4 10 12 CONTINF 1 4 11 13 CONTINF 3 4 12 10 ERGINF 0 4 13 15 CONTINF 2 4 14 20 CONTINF 3 4 15 4 ERGINF 2 3 16 6 ERGINF 3 4 17 3 ERGINF 1 4 18 17 CONTINF 2 4 19 16 CONTINF 2 3 20 19 CONTINF 2 1 VAC= nivel de vacuolas lipidícas en HP WSSV= Lesiones causadas por el virus WSSV HP= hepatopáncreas 0 - 4 = clasificación de grados de severidad siendo el 4 lo más severo Como se observa en la Tabla 12 no hubo diferencias relevantes en la prevalencia de hallazgos causados por el virus WSSV sobre los tejidos de camarones pertenecientes tanto al tratamiento de la dieta con ERGOSAN® como la dieta BASE (control). En general, los organismos infectados por WSSV presentaron cuerpos de inclusión bastante prominentes, de tinción principalmente basofílica, los cuales son 102 aproximadamente 2-3 veces más grandes que el tamaño normal del núcleo (forma variable de circular a irregular) y muy numerosos. (Morales V., y Cuellar– Anjel J., 2008) Figura 41: Microfotografía de tejido conectivo afectado por la infección del virus WSSV en una de las muestras analizadas, donde se observa los núcleos hipertrofiados y con cuerpos de inclusión basofílicos (600X). Foto cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel. En todas las muestras analizadas se evidenció lo publicado por la OIE (2000), donde los principales tejidos afectados son de origen ectodermal y mesodermal, en particular el epitelio cuticular y tejidos subcuticulares del estómago, del cefalotórax y de las branquias. Como se mencionó con anterioridad, estos presentan células con núcleos hipertrofiados con inclusiones basofílicas centrales rodeadas de cromatina. 103 Figura 42: Microfotografía de láminas histológicas observadas bajo el microscopio (600X). A. Epitelio cuticular que presenta células con núcleos hipertrofiados con inclusiones basofílicas. B. Epitelio subcuticular de las branquias, donde se observan los cuerpos de inclusión característicos para la enfermedad por WSSV. Fotos cortesía del Dr. Jorge Cuéllar-Anjel. Estudios realizados por Yoganandhan (2003) donde se evaluó detección temprana en tejidos afectados por WSSV en camarones L. linicus mediante los métodos de diagnóstico histopatología y PCR, permitieron determinar su sensibilidad para la detección temprana de este virus y al igual que el bioensayo del que es objeto el presente trabajo, las observaciones histopatológicas revelaron la presencia de cuerpos de inclusión intracelulares en branquias, tejido blando, apéndice y tejido conectivo después de 36 horas post – infección. El análisis mediante PCR en dicho estudio reveló que el virus pudo ser detectado a las 6 horas post – infección en muestras de hemolinfa y a las 12 horas post- infección en el resto de los órganos analizados. Lo anterior, indica que la técnica molecular es de mayor sensibilidad pero cabe resaltar que las dos técnicas utilizadas permiten la detección temprana del virus, sirviendo como herramienta útil antes de que se alcancen mortalidades significativas en los estanques de cultivo. La ventaja de la histopatología es que nos permite observar detalladamente los cambios a nivel celular que puede producir la infección del virus WSSV, es decir, que esta técnica puede ser de tipo cualitativa. 104 6.4 Prueba de desafío mediante infección per os con el virus WSSV Luego de la prueba de desafío mediante la infección per os con papilla positiva para el virus WSSV, se produjo una mortalidad masiva de la población de los acuarios infectados. (T2= dieta ERGOSAN ® + infección y T4= dieta BASE + infección). En cuanto a los acuarios sometidos a los tratamientos T1 y T3 donde no hubo infección (dieta ERGOSAN® sin infección y dieta BASE sin infección, respectivamente) no se presentaron mortalidades. Los 20 acuarios de estos dos tratamientos a los cuales no se les administró papilla infectante, se encontraban en cercanías a los acuarios infectados y bajo las mismas condiciones. Lo anterior demuestra que durante la infección y toma de muestras se realizó una buena manipulación que evitó la contaminación cruzada durante el experimento. La infección de los camarones se realizó el día 10/12/09 a las 10:00 a.m., las mortalidades se empezaron a presentar luego de transcurridas 28 horas post – infección y este período culminó a las 192 horas post – infección. La primera mortalidad se dio el día 11/12/09 a la 1:45 p.m. y la última muerte se registró el día 18/12/09 a las 11:20 a.m., es decir, siete días después. El registro de la mortalidad acabó cuando se observó el cese de las mismas luego de transcurridas 48 horas posteriores a la última mortalidad registrada. (ANEXO 7) Tabla 13: Animales muertos y mortalidad (%) que se presentó en los acuarios infectados No. acuario Tratamiento No. CAM muertos Mortalidad (%) 1 ERGINF 10 100 2 ERGINF 5 50 3 ERGINF 9 90 4 ERGINF 7 70 5 ERGINF 10 100 6 ERGINF 10 100 7 ERGINF 10 100 8 ERGINF 10 100 9 ERGINF 10 100 10 ERGINF 8 80 11 CONTINF 10 100 12 CONTINF 9 90 13 CONTINF 9 90 14 CONTINF 10 100 105 15 CONTINF 7 70 16 CONTINF 10 100 17 CONTINF 10 100 18 CONTINF 9 90 19 CONTINF 10 100 20 CONTINF 10 100 Como indica la Tabla 13 tanto en los acuarios tratados con la dieta BASE (T4) y la dieta con ERGOSAN® (T2) se obtuvieron mortalidades del 100% transcurridos los 8 días post – infección. Esto demuestra la gran susceptibilidad de la especie Litopenaeus vannamei (OIE, 2006) utilizada en el bioensayo, ante la infección del virus de la mancha blanca WSSV. Este alto porcentaje de mortalidad se relaciona por lo descrito en la publicación de Morales y Cuéllar–Anjel (2008) donde se afirma que los animales que presentan signos clínicos característicos de la enfermedad pueden exhibir altas tasas de mortalidad, alcanzando hasta el 100% de tres a diez días luego de la infección. Figura 43: Curva de mortalidad que se presentó luego de la infección per os con el virus WSSV a los dos tratamientos infectados (T2 y T4). (D1 – D8 días de mortalidad post-infección) 106 Se puede observar en la gráfica anterior (Figura 43), que al finalizar la prueba de desafío los animales sometidos a inmunoestimulación presentaron un porcentaje menor de mortalidad, 89% dieta ERGOSAN ® contra un 94% para la dieta control. Estos datos fueron analizados estadísticamente y no presentaron diferencias significativas, sin embargo, esta diferencia puede ser de interés si el producto se emplea como tratamiento preventivo, en condiciones de cultivo y en periodos de tiempo prolongados. El alto porcentaje de mortalidad obtenido para los dos tratamientos que se sometieron a la infección con el virus WSSV, puede estar directamente relacionado con el efecto causado por el la papilla infectante suministrada vía oral (per os). En este caso la acción de la misma está determinada por la alta carga viral presente en la papilla (10 8 partículas virales en 50 mg), dicha virulencia de la papilla fue capaz de producir mortalidades masivas según lo previsto para está prueba de desafío. 6.4.1 Relación de supervivencia entre los tratamientos infectados (T2 y T4) con los no infectados (T1 y T3) Con relación a la transformación de los resultados obtenidos para la supervivencia de cada tratamiento, se obtuvo mediante la prueba de ANOVA y Duncan (P < 0.001) que la supervivencia de los acuarios infectados es significativamente inferior a la supervivencia obtenida para los acuarios no infectados. Como se mencionó con anterioridad esto evidencia la capacidad infectante del virus sobre la supervivencia de los camarones y el buen manejo de las fases en el bioensayo que evitó la contaminación cruzada entre los acuarios. (ANEXO 14) A partir de los datos transformados se realizó estadística descriptiva entre los cuatro tratamientos. Donde, el coeficiente de variación fue de 22.8% y la desviación estándar fue de 1.42. 107 Tabla 14: Camarones supervivientes y medias de supervivencia para cada uno de los cuatro tratamientos n final Media de Tratamiento n inicial (sobrevivientes) supervivencia (%) ERGOSAN® infectado (T2) 100 11 11a Control Infectado (T4) 100 6 6a ERGOSAN® no infectado (T1) 100 100 100b Control no infectado (T3) 100 100 100b La Tabla 14 presenta las medias de supervivencia por tratamiento, así como las diferencias que se presentaron entre ellos. Las medias con igual letra, no presentan diferencias significativas. Dicha significancia fue obtenida a partir del análisis estadístico con valores transformados. Figura 44: Gráfico de barras que muestra la diferencia entre el porcentaje de supervivencia de los tratamientos infectados con los no infectados. 108 6.4.2 Relación de supervivencia entre el tratamiento con la dieta ERGOSAN ® (T2) y el Control (T4) luego de la infección con el virus WSSV. Con base en las transformaciones de los resultados obtenidos para la supervivencia de los acuarios infectados, mediante la prueba de ANOVA y Duncan no se presentaron diferencias significativas (Tabla 14) entre T2 y T4 (dieta ERGOSAN ® + infección y dieta BASE + infección) P < 0.5786. (ANEXO 15) En la práctica, el tratamiento con ERGOSAN ® infectado (T2) tuvo una supervivencia promedio de 11% mientras que el Control (T4) obtuvo una supervivencia de 6%. A pesar de que no se obtuvieron variaciones significativas a partir de la estadística realizada, ésta diferencia podría considerarse interesante en condiciones de cultivo en estanques o a gran escala, si se presenta de manera consistente en todas las unidades de producción de una camaronera y a lo largo de los dos ciclos de cultivo del año (estación seca, estación lluviosa y las respectivas fases de transición entre las dos estaciones). Más aún, considerando que la carga viral utilizada para las infecciones en este estudio, fueron por lo menos 1000 veces mayores a las que suceden en el medio natural (105 viriones/50 mg en un estanque de cultivo contra 10 8 viriones/50 mg en este estudio). Tabla 15: Porcentaje de supervivencia por cada uno de los tratamientos infectados durante 8 días luego de la infección per os con el virus WSSV. Supervivencia (%) Dia Post-infección ERGOSAN CONTROL Día 1 81 80 Día 2 38 47 Día 3 32 37 Día 4 22 20 Día 5 15 13 Día 6 12 9 Día 7 11 7 Día 8 11 6 El coeficiente de variación (CV) de las medias de supervivencia transformadas para los dos tratamientos infectados fue de 83.6% y una desviación estándar de 2.01. El 109 CV se considera elevado y fue debido a la amplia distancia entre los datos transformados (1 a 10), estando esto relacionado con el control del error experimental. Figura 45: Curva de supervivencia obtenida para los dos tratamientos infectados con el virus WSSV. Como se observa en el gráfico anterior (Figura 45) durante los primeros seis días, la supervivencia de los camarones disminuye prácticamente al mismo ritmo, tanto para el tratamiento con ERGOSAN® y el control. La diferencia, no tan notoria se da al séptimo día en la cual se observa una estabilidad en el porcentaje de supervivencia en los animales tratados con el inmuestimulante, mientras que en el control continúa decreciendo hasta el día ocho, luego de esto la supervivencia se estabiliza, cuando la supervivencia no es superior al 11%. Es importante resaltar que a pesar de que las diferencias no fueron significativas en el análisis de los dos tratamientos, se sugiere que al finalizar la prueba los resultados a favor del producto inmunoestimulante pueden estar determinados a que una parte de la población responde positivamente al producto o a un efecto tardío del mismo, lo que estabilizó la pendiente de supervivencia en los últimos días del experimento. 110 Tabla 16: Sobrevivencia de cada uno de los acuarios por cada tratamiento infectado con WSSV Tratamiento/ Acu. Sobrevivencia por acuario (%) ERGINF - 1 ERGINF - 2 ERGINF - 3 ERGINF - 4 ERGINF - 5 ERGINF - 6 ERGINF - 7 ERGINF - 8 ERGINF - 9 ERGINF - 10 Media CONTINF - 11 CONTINF - 12 CONTINF - 13 CONTINF - 14 CONTINF - 15 CONTINF - 16 CONTINF - 17 CONTINF - 18 CONTINF - 19 CONTINF - 20 Media 0 50 10 30 0 0 0 0 0 20 11 0 10 10 0 30 0 0 10 0 0 6 El siguiente gráfico (Figura 46) demuestra el pocentaje de supervivencia alcanzado por cada uno de los acuarios de los dos tratamientos analizados. Como se puede observar el acuario que alcanzó la mayor supervivencia corresponde a animales tratados con el producto inmunoestimulador, con un 50% de supervivencia. A pesar de que luego de la infección per os con el virus se observó similaridad en el comportamiento de los animales y en la frecuencia de las muertes, los acuarios tratados con ERGOSAN® quedaron con mayoría de animales sobrevivientes a diferencia de los acuarios tratados con dieta BASE. 111 Figura 46: Gráfico que muestra la tendencia de las poblaciones sobreviventes por cada uno de los acuarios. No obstante, haber obtenido datos que no mostraron resultados con diferencias significativas, no se debe dejar a un lado la idea de la búsqueda de nuevas estrategias y alternativas, que se conviertan en medidas preventivas cuando los camarones se enfrenten a infecciones severas como la del virus WSSV. La inmunoestimulación en la actualidad pese a que todavía es un tema controversial, se ha convertido en fuente de estudio por muchos investigadores que pretenden aumentar la resistencia natural de estos animales, dado la imposibilidad de ser vacunados. Está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en los cultivos de camarones, depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, (buena calidad del agua, adecuada densidad poblacional, buena nutrición y reducción de los factores ambientales potencialmente estresantes. El uso de sustancias capaces de aumentar la inmunocompetencia de los camarones, en paralelo a un buen manejo del cultivo, apunta ciertamente como una herramienta promisoria en la búsqueda de una mayor protección inmunológica contra el desarrollo de infecciones. 112 Existen en nuestros días muchas sustancias que son utilizadas como inmunoestimulantes, Entre los compuestos más utilizados en los cultivos se destacan los β-1,3/1,6-glucanos de hongos o algas, PGs de bacterias Gram-positivas, LPS de bacterias Gram-negativas, polisacáridos sulfatados de algas y algunas proteínas virales. Entre estos inmunoestimulantes, los β-glucanos son tal vez los más ampliamente utilizados para camarones y los presumiblemente más inmuno efectivos y compatibles con la práctica de la camarinocultura (revisión de Smith et al., 2003 En: Morales V., y Cuéllar Anjel J., 2008) 6.5 Efecto del Inmunomodulador comercial (ERGOSAN®) sobre el recuento de hemocitos 6.5.1 Recuento luego de diez días de suministro de dieta ERGOSAN ® Luego del hemograma realizado después de haber suministrado el producto por 10 días, se observaron diferencias significativas en los hemocitos semigranulares (P<0.01) y en los hemocitos totales (P<0.02), a favor del tratamiento Control. No se presentaron diferencias significativas en el recuento de hemocitos granulares y los hialinos entre el tratamiento ERGOSAN® y el tratamiento Control. (ANEXO 16) Tabla 17: Datos promedio de los conteos de hemocitos diferenciales y totales luego de transcurridos 10 días de tratamiento con ERGOSAN® Granulares Semi. Hialinos Totales ERGOSAN 1018a 7557a 1274a 9849a Control 1453a 12848b 1130a 15431b Diferencia -29,90% -41,20% +12,70% -36,20% ® 113 Figura 47: Gráfico que demuestra las diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de diez días de suministro de la dieta a base del producto comercial ERGOSAN® 6.5.2 Recuento 20 días después de terminado el suministro de dieta ERGOSAN ® El conteo de hemocitos hecho 20 días después de terminado el suministro de dieta con ERGOSAN®, arrojó valores muy distintos a los obtenidos en el recuento luego de diez días con el producto. En este último caso se observó una tendencia positiva en favor del producto. A partir del análisis estadístico de los datos, se obtuvieron diferencias significativas en los hemocitos hialinos (P<0.006) y en los totales (P<0.06). En el recuento de los hemocitos granulares y semigranulares aunque no se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos, se observó una ganancia del 56.5% y 58.8% respectivamente, favorable para el tratamiento donde se utilizó la dieta ERGOSAN®. (ANEXO 17) Tabla 18: Datos promedio de los conteos de hemocitos diferenciales y totales luego de transcurridos 20 luego del tratamiento con ERGOSAN® Granulares Semi. Hialinos Totales Control 3621a 2313a 20804a 13097a 4486a 1727b 28912a 17137b Diferencia +56,50% +58,80% +159,80% +68,70% ® ERGOSAN 114 Figura 48: Gráfico que demuestra las diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de 20 días de haber culminado el suministro de la dieta a base del producto comercial ERGOSAN® Como se observa en la gráfica (Figura 48) luego del recuento de los hemocitos totales se nota una diferencia marcada entre el tratamiento con ERGOSAN® y el control. Aunque no es clara la causa del incremento del hemograma tras 20 días de terminado el tratamiento con el inmunoestimulante, esto se podría considerar como un efecto favorable tardío del producto, lo cual amerita estudios específicos y dirigidos en especial a los mecanismos de acción directa de los alginatos extraídos de microalgas y macroalgas marinas, de los cuales está compuesto este inmunoestimulante. Con base en la publicación de Cheng–Fang C. (2000), donde se analizó el efecto de una dieta a base de β-1,3 glucanos sobre la supervivencia de camarones Penaeus monodon y parámetros inmunológicos (actividad fagocítica de los hemocitos y la producción de aniones superóxido). Los resultados que se obtuvieron demostraron que los animales alimentados con la dieta a base de β-1,3 glucanos presentaron mayor supervivencia (P<0.001) con respecto al grupo control. Los camarones inmunoestimulados revelaron además un aumento en la actividad fagocítica de los hemocitos y la producción de anión superóxido. Los resultados a favor del 115 inmunoestimulante se alcanzaron 24 días después de iniciar la exposición alimentaria. Lo anterior, confirma la hipótesis de que el aumento de los hemocitos pudo darse por un efecto tardío del producto diez días después de haber finalizado la dieta experimental. Posiblemente si se realizan experimentos con dosis más elevadas de ERGOSAN® y en tiempos más prolongados, se pueden obtener mejores resultados en cuanto al fortalecimiento del sistema inmunitario, reflejándose en una mayor supervivencia de los camarones al momento de enfrentarse a infecciones del virus (WSSV), minimizando así el impacto causado por la enfermedad. 6.5.3 Recuento 30 días después del suministro de dieta ERGOSAN ® Treinta días después de terminado el suministro de la dieta con ERGOSAN®, se realizó el último recuento de hemocitos en el experimento. El conteo a los 30 días disminuyó retomando a valores similares con respecto a los obtenidos para el tratamiento control. En este caso no se registraron diferencias significativas en ninguno de los dos tratamientos entre las células hemáticas. Sin embargo, se mantuvo una leve tendencia en el recuento de los hemocitos totales en favor del producto comercial ERGOSAN®. (ANEXO 18) Tabla 19: Datos promedio de los conteos de hemocitos diferenciales y totales luego de transcurridos 30 días de haber culminado el tratamiento con ERGOSAN® Granulares Semi. Hialinos Totales ® 1919a 15435a 1650a 19003a ERGOSAN 1965a 14366a 1395a 17726a Control -2,30% +7,40% +18,30% +7,20% Diferencia 116 Figura 49: Gráfico que demuestra las diferencias establecidas estadísticamente para el recuento de hemocitos luego de 30 días de haber culminado el suministro de la dieta a base del producto comercial ERGOSAN® ERGOSAN® es un producto que contiene alginatos provenientes de algas, se usa en acuicultura ya que al parecer posee actividad inmunoestimulante. En la publicación de Montero–Rocha (2000) se evaluó este producto a partir del suministro vía oral en camarones L. vannamei durante 15 días. Para determinar la actividad del producto se realizó un examen de las proteínas de la hemolinfa, las cuales no revelaron ninguna diferencia entre el control y los camarones tratados con ERGOSAN®. Del mismo modo, el total de los recuentos de hemocitos resultó ser más o menos equivalente tanto para el control como para las muestras experimentales. Sin embargo, el análisis diferencial de hemocitos revelaron cambios marcados en términos de conteo de hemocitos granulares, hialinos y semigranulares. Donde, los hemocitos granulares fueron más altos en los animales control con respecto a los tratados. En cuanto a los hemocitos hialinos y semigranulares el recuento fue significativamente mayor a diferencia del recuento para los animales control. En este estudio se determinó que los niveles bajos de hemocitos granulares en los animales con la dieta ERGOSAN® pudo haber surgido por la degranulación de dichos hemocitos como respuesta a la 117 acción del inmunoestimulante, lo que tiene como resultado la liberación de sustancias antimicrobianas en la hemolinfa. A continuación en la Tabla 20, se muestra un consolidado en cuanto al promedio de los tres recuentos realizados transcurridos 30 días luego del suministro del producto ERGOSAN® y su respectivo control negativo. Tabla 20: Consolidado de hemogramas en cada uno de los recuentos realizados durante el experimento con el producto comercial ERGOSAN® HEMOCITOS ERGOSAN CONTROL Gra10con 1018 1453 Gra20sin 3621 2313 Gra30sin 1919 1965 Semi10con 7557 12848 Semi20sin 20804 13097 Semi30sin 15435 14366 Hial10con 1274 1130 Hial20sin 4486 1727 Hial30sin 1650 1395 Total10con 9849 15431 Total20sin 28912 17137 Total30sin 19003 17726 Donde, Gra = granulares, Semi= semigranulares, Hial= hialinas, Total= totales, 10con= 10 días con ERGOSAN®, 20sin= 20 días después de terminar el tratamiento con ERGOSAN®, 30sin= 30 días después de terminar el tratamiento con ERGOSAN®. 118 Figura 50: Gráfico que muestra consolidado de hemogramas realizado para el recuento de hemocitos a camarones tratados con ERGOSAN® con respecto a los dispuestos para Control (dieta BASE) En la gráfica anterior (Figura 50), se observa que para el recuento diferencial y total (granulares, semigranulares, hialinos y totales) de los hemocitos, existe una marcada diferencia en el conteo luego de 20 días sin el tratamiento con el inmunoestimulante (ERGOSAN®), las barras indican claramente que existe un aumento significativo a favor del tratamiento ERGOSAN®, como se mencionó anteriormente esto puede estar determinado por un efecto tardío del producto. Es necesario realizar estudios más detallados y encaminados específicamente al efecto que pueden estar produciendo los alginatos y polisacáridos de micro y macroalgas (compuestos inmunoestimulantes del producto ERGOSAN®) sobre la viabilidad y proliferación de los hemocitos de camarones. 119 7. CONCLUSIONES 1. La mortalidad fue inferior en los animales inmunoestimulados (89%) que en el Control (94%). 2. La virulencia del virus WSSV presente en la papilla fue capaz de producir mortalidades masivas según se esperaba para esta prueba de desafío. 3. El comportamiento de los Controles negativos (dieta ERGOSAN ® y dieta BASE, sin infección con WSSV) fue el esperado, con una supervivencia de 100% en ambos casos; esto demuestra adecuada manipulación durante el estudio y ausencia de contaminación cruzada entre los acuarios infectados y los no infectados. 4. La supervivencia de los camarones tratados con ERGOSAN ® (11%) fue superior a la de los animales Control (6%), aunque no se presentaron diferencias significativas (P<0.05). 5. Los conteos de hemocitos no fueron superiores con el producto ERGOSAN ® luego de diez días con respecto al Control, pero sí aumentaron significativamente (P<0.06) 20 días después de terminada la aplicación del producto, retornando a los niveles originales 10 días más tarde. 6. Se cumplieron los postulados de Koch en este estudio, al aislar e identificar molecularmente el virus WSSV, infectando artificialmente camarones sanos y logrando así reproducir la enfermedad con manifestación de signos clínicos característicos de la enfermedad y aislando de éstos nuevamente el agente etiológico (WSSV). 7. Las tres técnicas de diagnóstico utilizadas para detectar presencia del virus WSSV en 20 camarones moribundos de los 20 acuarios sometidos a infección experimental (histopatología, inmunocromatografía y nested–PCR) permitieron 120 detectar en los 20 organismos el agente patógeno (WSSV), así como las lesiones celulares producidas por este tras la infección vía oral. 8. Mediante la técnica histopatológica se identificaron las lesiones celulares severas en los tejidos susceptibles al virus (branquias, tejido conectivo, epitelio cuticular, entre otros), donde en todos los casos se observaron los cuerpos de inclusión intracelulares característicos de la infección por WSSV. 9. No fueron detectados histopatológicamente, lesiones o agentes patógenos distintos a WSSV, capaces de causar enfermedad y mortalidad en camarones penaeidos (ej.: otros virus como TSV, bacterias extracelulares, bacterias intracelulares, hongos o protozoarios). 10. Se mantuvieron las condiciones bajo control en la Sala de Infecciones Experimentales durante todo el desarrollo del ensayo, lo que evitó que causas ajenas al experimento pudieran intervenir en los resultados del estudio. 121 8. RECOMENDACIONES 1. Realizar pruebas del desafío con el virus WSSV en salas experimentales, donde se evalúen nuevos productos inmunoestimulantes, probióticos, bloqueadores virales entre otros, que sirvan en un futuro como herramientas preventivas contra la infección causada por el virus de la mancha blanca (WSSV) en camarones Litopenaeus vannamei . 2. Con base en los resultados obtenidos en este estudio, se recomienda realizar pruebas con dosis más elevadas de ERGOSAN ® y un suministro más prolongado en el tiempo, con el objeto de buscar mejores resultados de supervivencia en función de minimizar el impacto del virus WSSV sobre camarones infectados de forma experimental. 3. Para que lo anterior se cumpla, es necesario realizar estudios más detallados y encaminados específicamente al efecto que pueden estar produciendo los alginatos y polisacáridos de micro y macroalgas (compuestos inmunoestimulantes del producto ERGOSAN®) sobre la viabilidad y proliferación de los hemocitos de camarones. 4. Realizar pruebas de campo tendientes a obtener supervivencias más altas en estanques tratados con ERGOSAN® respecto a estanques Control, tanto en la estación seca como en la estación lluviosa de CAMACO, a partir de las dosis utilizadas en el presente bioensayo y esperando una separación importante de los resultados de supervivencia en favor del ERGOSAN ® bajo condiciones de cultivo. 122 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alday, V. 1999. Diagnóstico y prevención de la enfermedad del punto blanco. Unidad de Diagnóstico. Unión CENAIM – Espol. Mundo Acuícola. Vol 5 No. 1: 3 – 8 pp. Brownlee, I. A., Allen, A., Pearson, J. P., Dettmar, P. W., Havler, M. E., Atherton, M.R. 2005. 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Nested - PCR para WSSV, IHHNV, NHP Anexo. 2 Medios de cultivo Agar Marino Agar Difco™ Marine (BD, ref. 212185, lot. 5333528): Medio para aislamiento, cultivo y enumeración de bacterias heterótrofas marinas. 131 Composición (g/L): Peptona 5.0 g Extracto de levadura 1.0 g Citrato ferrico 0.1 g Cloruro de sodio 19.45 g Cloruro de Magnesio 8.8 g Sulfato de Sodio 3.24 g Cloruro de Clacio 1.8 g Cloruro de Potasio 0.55 g Bicarbonato de sodio 0.16 g Bromide Potasio 0.08 g Chloruro Strontium 34.0 mg Acido bórico 22.0 mg Silicado sódico 4.0 mg Floruro de sodio 2.4 mg Nitrato de Amonio 1.6 mg Fosfato disodio 8.0 mg Agar 15.0 g Preparación: 1.Suspender 55.1 g de polvo en 1 L de agua. 2. Agitar frecuentemente durante 1 minuto hasta dislover completo el polvo 3. Autoclave a121°C po 15 minutos. Modo de Acción: la Peptona y el extracto de levadura proporcionan el nitrógeno, vitaminas y minerales. El volumen de sal alto ayuda simular el agua del mar. Numerosos minerales también son incluidos para simular lo mayor posible la composición de agua del mar. El Agar es el agente solidificante. 132 Agar TCBS (Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa) Difco™ TCBS Agar (BD, ref. 265020, lot. 8021353): Medio selectivo para vibrio sp. Composición (g/L): Extracto de levadura 5.0 g Peptona Proteosa No. 3 10.0 g Citrato de Sodio 10.0 g Thiosulfato de Sodio 10.0 g Oxgall 8.0 g Sacarosa 20.0 g Cloruro de Sodio 10.0 g Citrato de Amonio Ferrico 1.0 g Azul de Bromotimol 0.04 g Azul de timol 0.04 g Agar 15.0 g Preparación: 1. Suspender 89 g del polvo en 1 L de agua purificada. Mezclar fuertemente 2. Calentar con frecuente agitacion hasta disolver el polvo. 3. Enfriar a 45-50 ºC y servir inmediatamente. No autoclavar. Modo de acción: Las concentraciones altas de tiosulfato y citrato y la fuerte alcalinidad de este medio inhiben ampliamente el crecimiento de Enterobacterias. La bilis de buey y el colato suprimen enterococos principalmente. Cualquier bacteria del coliforme que puede crecer no puede metabolizar la sucrosa. Sólo unas cepas de Proteus sucrosa-positivas pueden crecer y formar color amarillo. El timol e indicador mixto azul-bromothymol produce el cambio a color amarillo cuando el ácido se forma, incluso en este medio fuertemente alcalino. 133 Anexo 3. Etiqueta alimento “CAMPENT-TOP” 134 Anexo. 4 Etiqueta producto comercial ERGOSAN® 135 Anexo 5. PCR – Papilla infectante 136 Anexo 6. Resultados para prueba de virulencia de la papilla infectante Sala de Infección experimental - Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO) Bioensayo - Efecto del producto ERGOSAN sobre la sobrevivencia de camarones Litopenaeus vannamei PRUEBA DE VIRULENCIA - PAPILLA INFECTANTE (10E+8 viriones/50 mg) Tratamiento Total CAM. Exp. Fecha DPI Hora Peso (g) CAMINF 1 09/12/2009 2 07:00 a.m. 1,3 CAMINF 2 09/12/2009 2 07:15 a.m. 1,3 CAMINF 3 09/12/2009 2 11:00 a.m. 1,2 CAMINF 4 09/12/2009 2 11:15 a.m. 1,2 CAMINF 5 09/12/2009 2 11:30 a.m. 1,6 CAMINF 6 09/12/2009 2 04:00 p.m. 1,1 CAMINF 7 09/12/2009 2 04:45 p.m. 1,1 CAMINF 8 10/12/2009 3 07:00 a.m. 1,1 CAMINF 9 10/12/2009 3 01:00 p.m. 1,6 CAMINF 10 SOBRE. ND ND ND Día de infección 07/12/09 6:00 p.m. DPI= Día post - infección, CAMINF= Camarones infectados con papilla - WSSV Primera mortalidad (37 horas post - infección) Última mortalidad (66 horas post - infección) SOBRE.= Animal sobreviviente ND= no hay datos de mortalidad 137 Anexo 7. Registro de Mortalidad No. Acuario No. CAM Total CAM INF. Tratamiento Fecha DPI Hora Peso (g) 1 1 1 ERGINF 11/12/2009 1 03:30 p.m. 2.3 1 2 2 ERGINF 12/12/2009 2 02:26 a.m. 1.6 1 3 3 ERGINF 12/12/2009 2 01:30 p.m. 1.5 1 4 4 ERGINF 12/12/2009 2 02:35 p.m. 1.7 1 5 5 ERGINF 12/12/2009 2 04:45 p.m. 1.4 1 6 6 ERGINF 12/12/2009 2 04:45 p.m. 1.0 1 7 7 ERGINF 12/12/2009 2 08:30 p.m. 1.5 1 8 8 ERGINF 14/12/2009 4 05:00 a.m. 2.4 1 9 9 ERGINF 14/12/2009 4 09:35 a.m. 1.6 1 10 10 ERGINF 14/12/2009 4 01:30 p.m. 2.9 2 1 11 ERGINF 11/12/2009 1 11:15 p.m. 1.3 2 2 12 ERGINF 12/12/2009 2 07:07 a.m. 2.0 2 3 13 ERGINF 12/12/2009 2 11:30 a.m. 1.5 2 4 14 ERGINF 12/12/2009 2 12:12 p.m. 2.5 2 5 15 ERGINF 14/12/2009 4 10:50 a.m. 1.2 2 6 16 ERGINF SOBREV. ND ND ND 2 7 17 ERGINF SOBREV. ND ND ND 2 8 18 ERGINF SOBREV. ND ND ND 2 9 19 ERGINF SOBREV. ND ND ND 2 10 20 ERGINF SOBREV. ND ND ND 138 3 1 21 ERGINF 11/12/2009 1 01:45 p.m. 1.5 3 2 22 ERGINF 11/12/2009 1 08:00 p.m. 1.5 3 3 23 ERGINF 11/12/2009 1 09:40 p.m. 1.5 3 4 24 ERGINF 12/12/2009 2 06:15 a.m. 1.4 3 5 25 ERGINF 12/12/2009 2 06:42 a.m. 1.6 3 6 26 ERGINF 12/12/2009 2 09:57 p.m. 1.7 3 7 27 ERGINF 13/12/2009 3 07:25 p.m. 1.6 3 8 28 ERGINF 14/12/2009 4 09:08 a.m. 2.1 3 9 29 ERGINF 15/12/2009 5 07:20 a.m. 1.5 3 10 30 ERGINF SOBREV. ND ND ND 4 1 31 ERGINF 11/12/2009 1 01:45 p.m. 1.5 4 2 32 ERGINF 11/12/2009 1 11:57 p.m. 2.7 4 3 33 ERGINF 12/12/2009 2 06:16 a.m. 1.8 4 4 34 ERGINF 12/12/2009 2 06:36 a.m. 2.7 4 5 35 ERGINF 12/12/2009 2 12:45 p.m. 1.8 4 6 36 ERGINF 14/12/2009 4 06:10 a.m. 2.8 4 7 37 ERGINF 15/12/2009 5 01:34 p.m. 1.7 4 8 38 ERGINF SOBREV. ND ND ND 4 9 39 ERGINF SOBREV. ND ND ND 4 10 40 ERGINF SOBREV. ND ND ND 5 1 41 ERGINF 11/12/2009 1 04:42 p.m. 1.1 5 2 42 ERGINF 11/12/2009 1 09:50 p.m. 1.6 5 3 43 ERGINF 11/12/2009 1 09:50 p.m. 1.3 5 4 44 ERGINF 12/12/2009 2 02:45 a.m. 1.6 5 5 45 ERGINF 12/12/2009 2 07:57 a.m. 2.7 5 6 46 ERGINF 12/12/2009 2 08:35 p.m. 2.7 5 7 47 ERGINF 12/12/2009 2 08:40 p.m. 1.9 5 8 48 ERGINF 14/12/2009 4 07:25 p.m. 2.1 5 9 49 ERGINF 15/12/2009 5 01:35 p.m. 2.2 5 10 50 ERGINF 17/12/2009 7 02:00 p.m. 2.6 6 1 51 ERGINF 11/12/2009 1 10:00 p.m. 1.9 6 2 52 ERGINF 11/12/2009 1 11:30 p.m. 1.4 6 3 53 ERGINF 12/12/2009 2 12:05 a.m. 1.6 6 4 54 ERGINF 12/12/2009 2 12:08a.m. 1.8 6 5 55 ERGINF 12/12/2009 2 06:18 a.m. 1.4 6 6 56 ERGINF 12/12/2009 2 02:35 p.m. 1.7 6 7 57 ERGINF 12/12/2009 2 5:16p.m. 1.6 6 8 58 ERGINF 14/12/2009 4 07:31 a.m. 1.3 6 9 59 ERGINF 15/12/2009 5 12:10 a.m. 1.7 6 10 60 ERGINF 15/12/2009 5 01:30 a.m. 2.2 139 7 1 61 ERGINF 11/12/2009 1 04:40 p.m. 1.6 7 2 62 ERGINF 11/12/2009 1 04:40 p.m. 2.5 7 3 63 ERGINF 11/12/2009 1 10:15 p.m. 1.9 7 4 64 ERGINF 11/12/2009 1 11:57 p.m. 2.0 7 5 65 ERGINF 12/12/2009 2 12:53 a.m. 1.7 7 6 66 ERGINF 12/12/2009 2 02:47 a.m. 1.8 7 7 67 ERGINF 12/12/2009 2 03:00 p.m. 1.7 7 8 68 ERGINF 13/12/2009 3 09:10 p.m. 3.0 7 9 69 ERGINF 15/12/2009 5 01:38 p.m. 2.2 7 10 70 ERGINF 16/12/2009 6 07:30 a.m. 2.2 8 1 71 ERGINF 11/12/2009 1 04:50 p.m. 3.0 8 2 72 ERGINF 12/12/2009 2 02:30 a.m. 1.6 8 3 73 ERGINF 12/12/2009 2 06:19 a.m. 2.1 8 4 74 ERGINF 12/12/2009 2 06:20 a.m. 1.5 8 5 75 ERGINF 12/12/2009 2 6:19a.m. 2.1 8 6 76 ERGINF 12/12/2009 2 06:22 a.m. 1.5 8 7 77 ERGINF 12/12/2009 2 03:20 p.m. 1.7 8 8 78 ERGINF 12/12/2009 2 10:27 p.m. 1.8 8 9 79 ERGINF 13/12/2009 3 09:55 a.m. 1.8 8 10 80 ERGINF 13/12/2009 3 10:20p.m. 1.9 9 1 81 ERGINF 11/12/2009 1 10:10 p.m. 2.1 9 2 82 ERGINF 12/12/2009 2 12:47 a.m. 1.5 9 3 83 ERGINF 12/12/2009 2 12:49 a.m. 1.0 9 4 84 ERGINF 12/12/2009 2 02:40 p.m. 1.6 9 5 85 ERGINF 12/12/2009 2 04:38 p.m. 1.9 9 6 86 ERGINF 12/12/2009 2 05:00 p.m. 1.3 9 7 87 ERGINF 13/12/2009 3 12:00 a.m. 1.4 9 8 88 ERGINF 13/12/2009 3 12:40 p.m. 2.2 9 9 89 ERGINF 14/12/2009 4 12:00 a.m. 3.2 9 10 90 ERGINF 16/12/2009 6 06:00 a.m. 2.1 10 1 91 ERGINF 11/12/2009 1 11:33 p.m. 1.5 10 2 92 ERGINF 12/12/2009 2 12:40 p.m. 2.5 10 3 93 ERGINF 12/12/2009 2 01:02 a.m. 1.7 10 4 94 ERGINF 12/12/2009 2 07:43 a.m. 2.9 10 5 95 ERGINF 12/12/2009 2 10:22 a.m. 1.1 10 6 96 ERGINF 14/12/2009 4 08:45 a.m. 2.5 10 7 97 ERGINF 15/12/2009 5 07:15 a.m. 1.1 10 8 98 ERGINF 16/12/2009 6 07:45 a.m. 2.0 10 9 99 ERGINF SOBREV. ND ND ND 10 10 100 ERGINF SOBREV. ND ND ND 140 11 1 101 CONTINF 11/12/2009 1 04:00 p.m. 1.7 11 2 102 CONTINF 12/12/2009 2 08:00 p.m. 2.4 11 3 103 CONTINF 12/12/2009 2 01:03 a.m. 1.3 11 4 104 CONTINF 12/12/2009 2 04:40 p.m. 1.4 11 5 105 CONTINF 12/12/2009 2 04:40 p.m. 1.6 11 6 106 CONTINF 12/12/2009 2 07:30 p.m. 1.4 11 7 107 CONTINF 12/12/2009 2 09:15 p.m. 2.9 11 8 108 CONTINF 14/12/2009 4 01:15 a.m. 1.3 11 9 109 CONTINF 14/12/2009 4 04:30 a.m. 1.9 11 10 110 CONTINF 18/12/2009 8 11:20 a.m. 2.0 12 1 111 CONTINF 11/12/2009 1 08:00 p.m. 1.5 12 2 112 CONTINF 12/12/2009 2 06:14 a.m. 1.7 12 3 113 CONTINF 12/12/2009 2 06:54 a.m. 2.1 12 4 114 CONTINF 12/12/2009 2 10:19 a.m. 1.7 12 5 115 CONTINF 14/12/2009 4 03:20 a.m. 1.3 12 6 116 CONTINF 14/12/2009 4 10:52 a.m. 2.5 12 7 117 CONTINF 14/12/2009 4 01:30 p.m. 2.4 12 8 118 CONTINF 15/12/2009 5 05:40 a.m. 2.4 12 9 119 CONTINF 15/12/2009 5 06:15 a.m. 2.4 12 10 120 CONTINF SOBREV. ND ND ND 13 1 121 CONTINF 11/12/2009 1 05:00 p.m. 2.6 13 2 122 CONTINF 12/12/2009 2 08:30 p.m. 1.5 13 3 123 CONTINF 12/12/2009 2 12:31 a.m. 1.7 13 4 124 CONTINF 12/12/2009 2 12:31 a.m. 1.8 13 5 125 CONTINF 12/12/2009 2 12:48 a.m. 1.5 13 6 126 CONTINF 12/12/2009 2 06:56 a.m. 2.2 13 7 127 CONTINF 12/12/2009 2 07:16 a.m. 1.8 13 8 128 CONTINF 13/12/2009 3 12:25 p.m. 2.1 13 9 129 CONTINF 13/12/2009 3 05:25 p.m. 3.0 13 10 130 CONTINF SOBREV. ND ND ND 14 1 131 CONTINF 11/12/2009 1 11:40 p.m. 1.8 14 2 132 CONTINF 12/12/2009 2 10:15 a.m. 1.2 14 3 133 CONTINF 12/12/2009 2 12:33 p.m. 1.7 14 4 134 CONTINF 12/12/2009 2 12:33 p.m. 1.6 14 5 135 CONTINF 14/12/2009 4 07:26 a.m. 1.9 14 6 136 CONTINF 14/12/2009 4 07:26 a.m. 2.7 14 7 137 CONTINF 14/12/2009 4 08:50 a.m. 1.3 14 8 138 CONTINF 14/12/2009 4 09:00 a.m. 2.1 14 9 139 CONTINF 16/12/2009 6 09:45 a.m. 1.2 14 10 140 CONTINF 17/12/2009 7 06:00 a.m. 2.6 141 15 1 141 CONTINF 11/12/2009 1 11:53 p.m. 1.6 15 2 142 CONTINF 12/12/2009 2 06:00 a.m. 1.1 15 3 143 CONTINF 12/12/2009 2 08:20 a.m. 1.8 15 4 144 CONTINF 13/12/2009 3 12:10 p.m. 1.4 15 5 145 CONTINF 13/12/2009 3 05:25 p.m. 3.0 15 6 146 CONTINF 15/12/2009 5 04:20 a.m. 1.8 15 7 147 CONTINF 15/12/2009 5 01:34 p.m. 1.9 15 8 148 CONTINF SOBREV. ND ND ND 15 9 149 CONTINF SOBREV. ND ND ND 15 10 150 CONTINF SOBREV. ND ND ND 16 1 151 CONTINF 11/12/2009 1 05:50 p.m. 1.7 16 2 152 CONTINF 11/12/2009 1 08:00 p.m. 1.4 16 3 153 CONTINF 11/12/2009 1 10:35 p.m. 1.3 16 4 154 CONTINF 12/12/2009 2 12:30 a.m. 1.2 16 5 155 CONTINF 12/12/2009 2 06:00 a.m. 1.1 16 6 156 CONTINF 12/12/2009 2 10:43 p.m. 1.3 16 7 157 CONTINF 13/12/2009 3 01:15 a.m. 1.4 16 8 158 CONTINF 14/12/2009 4 01:40 p.m. 2.4 16 9 159 CONTINF 14/12/2009 4 02:05 p.m. 1.8 16 10 160 CONTINF 17/12/2009 7 10:00 a.m. 2.2 17 1 161 CONTINF 11/12/2009 1 08:30 p.m. 2.3 17 2 162 CONTINF 11/12/2009 1 08:30 p.m. 2.3 17 3 163 CONTINF 11/12/2009 1 10:40 p.m. 1.3 17 4 164 CONTINF 12/12/2009 2 04:15 a.m. 1.5 17 5 165 CONTINF 12/12/2009 2 04:15 a.m. 1.6 17 6 166 CONTINF 12/12/2009 2 10:16 p.m. 1.8 17 7 167 CONTINF 14/12/2009 4 07:20 a.m. 1.7 17 8 168 CONTINF 15/12/2009 5 04:40 p.m. 2.3 17 9 169 CONTINF 16/12/2009 6 05:20 a.m. 2.2 17 10 170 CONTINF 16/12/2009 6 07:31 a.m. 1.9 18 1 171 CONTINF 11/12/2009 1 06:20 p.m. 1.2 18 2 172 CONTINF 11/12/2009 1 08:00 p.m. 1.3 18 3 173 CONTINF 11/12/2009 1 10:45 p.m. 1.8 18 4 174 CONTINF 12/12/2009 2 06:40 a.m. 2.0 18 5 175 CONTINF 12/12/2009 2 12:05 p.m. 1.3 18 6 176 CONTINF 12/12/2009 2 02:20 p.m. 2.0 18 7 177 CONTINF 12/12/2009 2 05:10 a.m. 2.0 18 8 178 CONTINF 14/12/2009 4 06:20 p.m. 2.3 18 9 179 CONTINF 16/12/2009 6 02:40 a.m. 2.4 18 10 180 CONTINF SOBREV. ND ND ND 142 19 1 181 CONTINF 11/12/2009 1 10:47 p.m. 1.7 19 2 182 CONTINF 11/12/2009 1 10:47p.m. 1.2 19 3 183 CONTINF 12/12/2009 2 01:19 a.m. 1.9 19 4 184 CONTINF 12/12/2009 2 10:55p.m. 1.5 19 5 185 CONTINF 13/12/2009 3 10:30 a.m. 1.4 19 6 186 CONTINF 13/12/2009 3 05:10 p.m. 1.3 19 7 187 CONTINF 14/12/2009 4 07:15 a.m. 1.7 19 8 188 CONTINF 14/12/2009 4 09:05 a.m. 2.1 19 9 189 CONTINF 14/12/2009 4 03:35 p.m. 2.8 19 10 190 CONTINF 15/12/2009 5 09:30 a.m. 2.3 20 1 191 CONTINF 11/12/2009 1 06:20 p.m. 2.2 20 2 192 CONTINF 11/12/2009 1 06:20 p.m. 1.7 20 3 193 CONTINF 11/12/2009 1 10:50 p.m. 1.7 20 4 194 CONTINF 11/12/2009 1 10:50 p.m. 1.5 20 5 195 CONTINF 12/12/2009 2 11:47 a.m. 2.2 20 6 196 CONTINF 13/12/2009 3 06:00 a.m. 2.7 20 7 197 CONTINF 13/12/2009 3 06:20 a.m. 2.4 20 8 198 CONTINF 13/12/2009 3 12:50 p.m. 2.1 20 9 199 CONTINF 14/12/2009 4 07:15 a.m. 1.5 10 200 CONTINF 15/12/2009 5 12:45 a.m. 1.0 20 Día de infección Fecha: 10/12/09 Hora: 10:00 a.m. Animales sobrevivientes Primera mortalidad de camarones infectados (28 horas post - infección) Última mortalidad de camarones infectados (192 horas - 8 días post - infección) No. Número DPI Día post - infección SOBRE. Sobreviviente ND. No hay dato de mortalidad 143 Anexo 8. Registro de toma de muestras No. muestras No. Acuario Tratamiento DPI Peso (g) 1 5 ERGINF 11/12/2009 09:50 p.m. 1 1,3 2 2 ERGINF 11/12/2009 11:15 p.m. 1 1,3 3 14 CONTINF 11/12/2009 11:40 p.m. 1 1,8 4 9 ERGINF 12/12/2009 12:47 a.m. 2 1,3 5 7 ERGINF 12/12/2009 12:53 a.m. 2 1,8 6 11 CONTINF 12/12/2009 01:03 a.m. 2 1,3 7 1 ERGINF 12/12/2009 02:26 a.m. 2 1,6 8 8 ERGINF 12/12/2009 06:22 a.m. 2 1,5 9 18 CONTINF 12/12/2009 06:40 a.m. 2 2 10 12 CONTINF 12/12/2009 06:54 a.m. 2 2,1 11 13 CONTINF 12/12/2009 06:56 a.m. 2 2,2 12 10 ERGINF 12/12/2009 07:43 a.m. 2 2,9 13 15 CONTINF 12/12/2009 08:20 a.m. 2 1,8 14 20 CONTINF 12/12/2009 11:47 a.m. 2 2,2 15 4 ERGINF 12/12/2009 12:45 p.m. 2 1,8 16 6 ERGINF 12/12/2009 05:16 p.m. 2 1,6 17 3 ERGINF 12/12/2009 09:57 p.m. 2 1,7 18 17 CONTINF 12/12/2009 10:17 p.m. 2 1,8 19 16 CONTINF 12/12/2009 10:43 p.m. 2 1,5 20 19 CONTINF 12/12/2009 11:30 p.m. 2 1,5 Fecha 144 Hora Anexo 9. Shrimple® - Manual Kit EnBioTec 145 Anexo 10. Recuento microbiológico de agua marina 151 Anexo 11. Registro de resultados para Pruebas de Shrimple® 152 Anexo 12. Registro de resultados para técnica Nested – PCR 153 Anexo 13. Registro lectura de láminas histopatológicas 154 Anexo 14. ANOVA y Duncan entre los cuatro tratamientos ANOVA Y DUNCAN DE SUPERVIVENCIA TRANSFORMADA CON RAÍZ DE (X+1) The SAS System 10:39 Wednesday, January 14, 1998 1 Analysis of Variance Procedure Class Level Information Class Levels TRATAM Values 4 CONTINF CONTNOIN ERGINF ERGNOINF Number of observations in data set = 40 Analysis of Variance Procedure Dependent Variable: SUP Source F DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > Model 0.0001 3 585.53802701 195.17934234 96.39 Error 36 72.89846306 Corrected Total 39 658.43649007 R-Square C.V. 0.889286 22.84826 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F TRATAM 3 585.53802701 195.17934234 96.39 0.0001 2.02495731 Root MSE SUP Mean 1.42300995 6.22808861 Duncan's Multiple Range Test for variable: SUP NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 36 MSE= 2.024957 Number of Means 2 3 4 Critical Range 1.291 1.357 1.400 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N A A A 10.0499 10 CONTNOIN 10.0499 10 ERGNOINF B B B 2.6608 10 ERGINF 2.1518 10 CONTINF 155 TRATAM Anexo 15. ANOVA y Duncan para tratamientos infectados ANOVA y Duncan para supervivencia de INFECTADOS transformada con raíz (X+1) Bioensayo con ERGOSAN – Noviembre y Diciembre de 2009 The SAS System 10:59 Wednesday, January 14, 1998 1 Analysis of Variance Procedure Class Level Information Class Levels TRATAM Values 2 CONTINF ERGINF Number of observations in data set = 20 Analysis of Variance Procedure Dependent Variable: SUPINF Source F DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 0.5786 1 1.29578909 1.29578909 0.32 Error 18 72.89846306 4.04991461 Corrected Total 19 74.19425215 R-Square C.V. 0.017465 83.63208 Source DF TRATAM 1 Root MSE SUPINF Mean 2.01243997 Anova SS Mean Square 1.29578909 2.40630160 F Value Pr > F 0.32 0.5786 1.29578909 Duncan's Multiple Range Test for variable: SUPINF NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 18 MSE= 4.049915 Number of Means 2 Critical Range 1.891 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 2.6608 10 ERGINF 2.1518 10 CONTINF 156 Pr > Anexo 16. ANOVA y Duncan para recuento luego de 10 días con ERGOSAN® Experimento ERGOSAN -BIOENSAYO-2009 Hemograma tras 10 d con el producto Analysis of Variance Procedure Class Level Information Class TRATAM Levels Values 2 Control ERGOSAN Number of observations in data set = 60 Dependent Variable: GRA Source F DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 0.0717 1 0.52029223 0.52029223 3.37 Error 58 8.96693820 0.15460238 Corrected Total 59 9.48723043 R-Square C.V. 0.054841 Source TRATAM Pr > Root MSE GRA Mean 13.52834 0.39319510 2.90645524 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 1 0.52029223 0.52029223 3.37 0.0717 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.80995592 0.80995592 Error 58 7.10609279 0.12251884 Corrected Total 59 7.91604871 R-Square C.V. Root MSE SEMI Mean 0.102318 9.098185 0.35002691 3.84721704 Source DF Anova SS Mean Square F Value TRATAM 1 0.80995592 0.80995592 6.61 Dependent Variable: SEMI 157 6.61 0.0127 Pr > F 0.0127 Dependent Variable: HIAL Source DF Sum of Squares Model 1 Error 58 9.61953923 Corrected Total 59 9.64510284 R-Square C.V. Root MSE HIAL Mean 0.002650 14.02139 0.40725192 2.90450438 Source DF Anova SS TRATAM 1 0.02556361 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.60497350 0.60497350 5.55 0.0219 Error 58 6.31975850 0.10896135 Corrected Total 59 6.92473199 R-Square C.V. 0.087364 Source TRATAM 0.02556361 Mean Square F Value 0.02556361 0.15 Pr > F 0.6961 0.16585412 Mean Square F Value 0.02556361 0.15 Pr > F 0.6961 Dependent Variable: TOT Root MSE TOT Mean 8.338134 0.33009295 3.95883465 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.60497350 0.60497350 5.55 Pr > F 0.0219 Duncan's Multiple Range Test for variable: GRA NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 58 MSE= 0.154602 Number of Means 2 Critical Range .2032 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 2.9996 30 Control 2.8133 30 ERGOSAN 158 Duncan's Multiple Range Test for variable: SEMI NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 58 MSE= 0.122519 Number of Means 2 Critical Range .1809 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A 3.96340 30 Control B 3.73103 30 ERGOSAN Duncan's Multiple Range Test for variable: HIAL NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 58 MSE= 0.165854 Number of Means 2 Critical Range .2105 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 2.9251 30 Control 2.8839 30 ERGOSAN Duncan's Multiple Range Test for variable: TOT NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 58 MSE= 0.108961 Number of Means 2 Critical Range .1706 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A 4.05925 30 Control B 3.85842 30 ERGOSAN 159 Anexo 17. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 20 días de haber suspendido ERGOSAN® Experimento ERGOSAN -BIOENSAYO-2009 Hemograma tras 20 d sin el producto Analysis of Variance Procedure Class Level Information Class Levels TRATAM Values 2 Control ERGOSAN Number of observations in data set = 59 Dependent Variable: GRA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 1 0.28872705 0.28872705 2.11 Error 57 7.78186476 0.13652394 Corrected Total 58 8.07059182 R-Square C.V. 0.035775 Source TRATAM Pr > F 0.1514 Root MSE GRA Mean 11.09255 0.36949147 3.33098893 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.28872705 0.28872705 2.11 Source DF Sum of Squares Model 1 0.25747537 0.25747537 Error 57 5.75165067 0.10090615 Corrected Total 58 6.00912604 R-Square C.V. 0.042847 Source TRATAM Pr > F 0.1514 Dependent Variable: SEMI Mean Square F Value 2.55 Pr > F 0.1157 Root MSE SEMI Mean 7.709845 0.31765729 4.12015142 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.25747537 0.25747537 2.55 160 Pr > F 0.1157 Dependent Variable: HIAL Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 1 Error Corrected Total Pr > F 1.19081774 1.19081774 7.91 57 8.57933043 0.15051457 58 9.77014818 R-Square C.V. 0.121883 11.82068 0.38796207 Source DF Anova SS Mean Square F Value TRATAM 1 1.19081774 1.19081774 7.91 0.0067 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.33887137 0.33887137 3.60 Error 57 5.35834781 0.09400610 Corrected Total 58 5.69721918 R-Square C.V. 0.059480 Source TRATAM 0.0067 Root MSE HIAL Mean 3.28206179 Pr > F Dependent Variable: TOT 0.0627 Root MSE TOT Mean 7.207116 0.30660415 4.25418649 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.33887137 0.33887137 3.60 Pr > F 0.0627 Duncan's Multiple Range Test for variable: GRA NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.136524 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153 Number of Means 2 Critical Range .1927 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 3.39977 30 ERGOSAN 3.25984 29 Control Duncan's Multiple Range Test for variable: SEMI NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.100906 WARNING: Cell sizes are not equal. 161 Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153 Number of Means 2 Critical Range .1656 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 4.18510 30 ERGOSAN 4.05296 29 Control Duncan's Multiple Range Test for variable: HIAL NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.150515 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153 Number of Means 2 Critical Range .2023 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A 3.4217 30 ERGOSAN B 3.1376 29 Control Duncan's Multiple Range Test for variable: TOT NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 57 MSE= 0.094006 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 29.49153 Number of Means 2 Critical Range .1599 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 4.32870 30 ERGOSAN 4.17710 29 Control 162 Anexo 18. ANOVA y Duncan para recuento de hemocitos 30 días de haber suspendido ERGOSAN® Experimento ERGOSAN -BIOENSAYO-2009 Hemograma tras 30 d sin el producto Analysis of Variance Procedure Class Level Information Class TRATAM Levels Values 2 Control ERGOSAN Number of observations in data set = 55 Dependent Variable: GRA Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 1 0.00228230 0.00228230 0.02 Error 53 6.28409114 0.11856776 Corrected Total 54 6.28637344 R-Square C.V. 0.000363 Source TRATAM Pr > F 0.8902 Root MSE GRA Mean 10.87269 0.34433669 3.16698609 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.00228230 0.00228230 0.02 0.8902 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.00037849 0.00037849 0.00 0.9535 Error 53 5.84790691 0.11033787 Corrected Total 54 5.84828540 R-Square C.V. 0.000065 Source TRATAM Pr > F Dependent Variable: SEMI Root MSE SEMI Mean 8.181038 0.33217144 4.06026056 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.00037849 0.00037849 0.00 0.9535 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 1 0.04094603 0.04094603 Error 53 5.72037309 0.10793157 Pr > F Dependent Variable: HIAL 163 0.38 0.5406 Corrected Total 54 5.76131912 R-Square C.V. 0.007107 Source TRATAM Root MSE HIAL Mean 10.71991 0.32852940 3.06466558 DF Anova SS Mean Square F Value 1 0.04094603 0.04094603 0.38 Source DF Sum of Squares Model 1 Error Corrected Total Pr > F 0.5406 Dependent Variable: TOT Mean Square F Value Pr > F 0.00030473 0.00030473 0.00 53 5.09533158 0.09613833 54 5.09563631 R-Square C.V. Root MSE TOT Mean 0.000060 7.450564 0.31006182 4.16158856 Source DF Anova SS Mean Square F Value TRATAM 1 0.00030473 0.00030473 0.00 0.9553 Pr > F 0.9553 Duncan's Multiple Range Test for variable: GRA NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.118568 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091 Number of Means 2 Critical Range .1863 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A 3.17331 28 ERGOSAN A A 3.16043 27 Control Duncan's Multiple Range Test for variable: SEMI NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.110338 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091 Number of Means 2 Critical Range .1797 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean 164 N TRATAM A A A 4.06293 27 Control 4.05768 28 ERGOSAN Duncan's Multiple Range Test for variable: HIAL NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.107932 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091 Number of Means 2 Critical Range .1777 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 3.09146 28 ERGOSAN 3.03688 27 Control Duncan's Multiple Range Test for variable: TOT NOTE: This test controls the type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha= 0.05 df= 53 MSE= 0.096138 WARNING: Cell sizes are not equal. Harmonic Mean of cell sizes= 27.49091 Number of Means 2 Critical Range .1677 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N TRATAM A A A 4.16399 27 Control 4.15928 28 ERGOSAN 165
