interpretacion de datos de elisa y establecimiento del

INTERPRETACION DE DATOS DE ELISA Y ESTABLECIMIENTO
DEL RANGO POSITIVO Y NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO
DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS (VTC) EN
MUESTRAS COMPUESTAS.
ISAURA~OBLEDOCASTRO
ASESORES:
DR. DANIEL TELlZ ORTIZ
M. en C. MARTIN VALENCIA ACEVES
'25813
U
~
INTRODUCCION Y ANTECEDENTES
El desarrollo de las vías de comunicación y el aumento en la rapidez de los medios de
transporte, ha conducido a la facilitación del comercio nacional e internacional de
vegetales y sus productos, pero al mismo tiempo se han incrementado las oportunidades
para la diseminación de plagas.
Por otra parte, debido al cambio de la Política Económica Nacional en el marcodela
apertura comercial, estamos
sometidos
a una competencia intensa con sistemas
productivos, que buscan eficiencia y apertura de nuevos mercados.Asimismo,sedebe
considerar que los recursos disponibles requieren la participación de los sectores
interesados en la Industria, Universidades e Institutos de Investigación Agrícola, para
asumirsus responsabilidades fitosanitarias, creando una interacción positiva que le dé
independencia y autonomía en cada uno de los niveles operativos y que se integre bajo la
normatividad y supervisión de las áreas competentes.
Ante esta necesaria apertura comercial, el riesgo de diseminación de plagas es mayor, tal
es el caso del Virus Tristeza de los Cítricos (VTC);
el cual se encuentra distribuido en casi
todas las zonas citrícolas del mundo, por lo que existe un alto riesgo fitosanitario en el
intercambio de material vegetal de cítricos.
Importancia de la citricultura.
La industria cítricola de México además de proporcionar fruta para consumo local y para
exportación, representa un importante apoyo para la economía del país, proporcionando
fuente de divisas y de empleo para una gran parte de la población mexicana. Para 1992,
México contaba con una superficie total de más de 300 mil ha dedicadas al cultivo de los
cítricos, las cuales proporcionan una producción anual promedio estimada en 3.5 millones
de toneladas.
La naranja, toronja y mandarina se cultivan principalmente m los estados de Veracruz,
San Luis Potosí, Tamaulipas y NuevoLeón.Estas
especies representan alrededor del
80% de la producción total de cítricos del país.
Otros estados con áreas en incremento en el cultivo de los cítricos, principalmente naranja,
son: Sonora, Sinaloa, Jalisco, Quintana Roo, Yucatán, Tabasco, Oaxaca y Guerrero
(Rocha-Peña Mario A. y Peña del Río Ma. de los Angeles 1992).
Características del Virus Tristeza de los Cítricos (VTC).
EL VTC pertenece al grupo de los Closterovirus, posee partículas en forma de filamentos
flexibles que miden 11 X 2000 nanometros (nm), las partículas contienen un sólo cordón
de ácido ribonucleico (ARN)como material genético. Presenta agregadosde partículas,
llamados inclusiones, que a menudose encuentran en el parénquima o en la células
adyacentes a los haces vasculares del floema, ya que dicho virus sólo se encuentra en
estos tejidos
Transmisión.
Este virus se difunde naturalmente por insectos; el más importante de ellos es el áfido café
Toxopfera citricidus, que es considerado como el vector más eficiente del VTC. El áfido
probablemente es nativo deChina y actualmente se encuentra distribuido enuna gran
cantidad de regiones citrícolas del mundo.Aunque es considerado comouna especie
tropical, el áfido existe en los lugares fríos del Japón, en el sur del desierto del Sahara, en
la India, Ceylán, en las regiones áridas de Africa del sur, Australia, y Nueva Zelanda, así
como en todos los países del oriente; donde es también, considerado como una plaga de
consideración para el cultivo de los cítricos.
Otras especies asociadas a la transmisión del VTC son: Toxopfera auranfii, AphisgOSSYPk
A. spiracola, Myzuspersicae.
Fawel y Wallace 1946, fueron los que por primera vez descubrieron su naturaleza viral al
demostrar que era transmisible por injerto de corteza, con yemas o brotes y tejidos de
hojas. Lo cual es utilizado para realizar ensayos experimentales. Desde 1957, Mc cleam,
reporta que el VTC no se transmite por semilla.
Sintomatología.
La enfermedad llamada Tristeza de los cítricos, afecta prácticamente a todos los tipos de
cítricos, pero principalmente al naranjo dulce, toronja, naranjo agrio y mandarina. Este
virus produce efectos letales; al iniciarse la enfermedad, las hojas normalmente de color
verde intenso se torna cloróticas, coriáceas, con la nervadura central prominente. La
brotación se detiene, las raícillas de la periferia mueren y conforme avanza la muerte de
raíces, la brotación se detiene, el follaje se ralea y la planta toma un aspecto triste, seguido
de un decaimiento general, razón por la cual los autores brasileños la denominaron
"Tristeza". Enese estado las plantas florecen muy intensamente, pero seformanmuy
pocas frutas, que no alcanzan su tamaño normal. En estados más avanzados las hojas
caen, las ramas mueren y la parte aérea se va secando, sólo se produce alguna brotación
en las ramitas primarias en el tronco, hasta que finalmente la planta se seca. Esto ocurre
en un lapso de tres a cinco años; según la variedad o raza del virus, existen casosde
marchitamiento y muerte casi instantánea, entonces la planta queda con sus hojas y frutos
secos.
Por otra parte, se supone que la destrucción de las raíces del naranjo agrio se vincula con
la acción de toxinas elaboradas por las hojas del naranjo dulce en presencia del virus,
esas toxinas son letales para las raíces del naranjo agrio, esta enfermedad viral tiene gran
difusión en el mundo entero y a través de los tiempos ha recibido distintos nombres, los
mas importantes:
“Incompatibilidad” en Africa.
“Podredumbre de las raicillas” en Argentina.
“Podridao das raicelas” en Brasil.
“Tristeza” en Brasil y Florida.
La tristeza es una de las enfermedadesmás destructivas de los cítricos, y esde
distribución mundial; hasta ahora es considerada como una de las enfermedades de mayor
importancia económica en el cultivo de los cítricos (Bar-Joseph and Lee,1989; Bar-Joseph
et al, 1983,1989).
Distribución del VTC.
Para 1992, la F A 0 reporta la presencia del VTC en Argentina, Brasil, Colombia,Perú,
Uruguay, Venezuela, Estados Unidos, Islas Hawai,Jamaica, Filipinas, Formosa, China,
Japón, India, Ceylán, LaCuenca del Mediterráneo (España, Italia, Israel, Egipto), Africa,
Cuba. Para el caso de México y Centro América y algunos países del Mediterráneo, donde
la enfermedad aun no se presenta, se encuentran amenazados, por la llegada deesta
plaga, ya sea a través de material propagativo o su vector (Toxopferacifricidus).Asimismo,
el VTC presenta alrededor de 18 variantes, las cuales producen diferentes síntomas en
sus hospederos, por lo que es considerada como una de las enfermedades víralesde
mayor importancia económica en el cultivo de los cítricos (Bar-Joseh, M. and Lee, RF.,
1989).
Métodos de Diagnóstico.
Para conocer si el VTCse encuentra presente en alguna planta, se pueden utilizar los
métodos convencionales de diagnóstico, tales como; plantas diferenciales, injerto y
microscopia electrónica. Sin embargo, dentro deestosmétodos, destaca el diagnóstico
serológico ELISA (Inmuno Absorbencia con Enzimas Conjugadas), que mediante el uso de
un antígeno, que se depositan en una placa, se puede identificar la presencia del VTC.
El nivel de absorbancia se obtiene en nanómetros, que se genera al conjuntar el antígeno
del virus con los anticuerpos de la planta y que se refleja por la presencia de una tonalidad
de color amarillo o verde, lo cual permite determinar visualmente la presencia del virus. Sin
embargo, no se tiene el grado de incidencia, este se obtiene al analizar estadísticamente
los resultados.
La aplicación estadística que se da a los resultados de absorbancia, que se obtienen al
conjuntar el antígeno y el anticuerpo, es la desviación estándar.
El grado en que los datos numéricos tienden a extenderse, alrededor de un valor medio, se
le llama variación, tales como: el rango, la media y la desviación estándar.
Si se requiere una expresión más formal de la estimación y su variación, se puede obtener
una estimación por intervalo, que es una estimación del parámetro por intervalo al azar,
llamado intervalo de confianza.
Para mayor claridad, supongamos que el parámetro a estimar por intervalo de confianza es
la media muestral; se conoce que la distribución muestral de la media es aproximadamente
normal por el teorema del límite central y que dice:
a) El 68% de los casos están comprendidos entre X-S y
la desviación estándar a ambos lados de la media).
X+S (es decir, el valor de
b) El 95.45% de los casos están comprendidos entre X-2s Y X+2S.(es decir, el
doble del valor de la desviación estándar a ambos lados de la media).
c) El 99.73% de los casos están comprendidos entre X-3s Y X+3S.(es decirel
triple del valor de la desviación estándar a ambos lados de la media).
Como se indica:
La desviación estándar se define como la raíz cuadrada positiva de la varianza. Asíla
desviación estándar viene dada por la varianza de un conjunto de datos, que se define
como el cuadrado de la desviación estándar (S).
El uso de histogramas, facilita visualizar los valores de la distribución de frecuencias en
ELISA, es el dibujo de número de observaciones, es la representación por unidades de
áreas sobre un eje,se elige un intervalo conveniente de unidades de absorbancia, se
cuentan los puntos que caen dentro decada intervalo y se gráfica la distribución de
frecuencias de la población de cítricos
Aunque se considera, al método serológico ELISA de uso común, existen diferencias con
respecto al análisis de los resultados estadísticamente. Bajo este esquema, se plantearon
los siguientes objetivos:
U
OBJETIVOS
1. Estandarizar un método estadístico para determinar el rango positivonegativo (plantas sanas-enferma), en virus Tristeza de los cítricos VTC
(muestras compuestas).
2. Estandarizar criterios en la determinación del rango positivo-negativo
válidos en cualquier laboratorio en donde se realice el diagnóstico del
virus tristeza de los cítricos (VTC),mediante la técnica ELISA
(muestras compuestas).
I
MATERIALES Y METODOS
Este trabajo se dividió en dos etapas:
1.- Muestre0 en campo:
Selección al azar de plantaciones de cítricos comerciales y viveros productores, en cuatro
estados de la República Mexicana, como se indica en el CUADRO 1 y FIGURA 1.
CUADRO 1. LUGARES MUESTREADOSY MUESTRA COLECTADA POR ESTADO
LUGARES MUESTREADOS(DEPLANTACIONES Y VIVEROS)
COLECTADAS
ESTADO
I
I
I
NUEVO LEON
TAMAULIIPAS
SONORA
COLIMA
3
37/
c.7
I
20
29
30
1
I
1
TOTAL
740
. .
400
580
480
110
Elmétodo estadístico de muestre0 fue el de tipo “ W , con tamañode
compuesta de 3 brotes tiernos, de 5 árboles diferentes para una hectárea.
2200
una
muestra
La toma de muestras fue de brotes tiernos, retirados del árbol mediante un corte con tijeras
de podar, la cual se limpiaba con hipoclorito de sodio, después de cada corte.
Las muestras se identificaron con región, vivero, propietario y árbol, y fueron trasladadas
en cajas refrigerantes, para mantenerlas frescas.
2.- Trabajo de laboratorio:
Eltrabajode
laboratorio se llevó a cabo en elCentro
Nacional de Referencia de
Diagnóstico Fitosanitario, área de virología, laboratorio de serología, de la Dirección
General de Sanidad Vegetal.
Procesado de muestras:
Las muestras de cítricos se analizaron mediante la técnica serológica ELISA, para esto se
requiere de la savia de los cítricos y cinco diferentes soluciones:
0
O
O
O
O
buffer de lavado, (buffer PBST).
buffer de extracción
buffer de solución del sustrato PNP
buffer de cubrimiento
buffer Reactivo [A]
Es importante durante el proceso respetar el tiempo, orden y cantidad de la aplicación de
los diferentes tipos de soluciones (buffer); asi mismo,al realizar la lectura medianteel
lector de (ELISA) calibrar a 405 nm, para tener un registro de una buena lectura.
Descripción de la técnica ELISA
La Técnica ELEA esta basada en la capacidad de los virus parásitos de vegetalesde
producir anticuerpos en animales de laboratorio y la especificidad de sus reacciones
antígeno-anticuerpo, hacen que esta técnica sea prácticamente obligatoria, con el objeto
de lograr la identificación de un determinado virus.
La técnica más utilizada en virología vegetal, es la reacción de precipitación. Esta se basa
en el hecho de que los antígenos víricos vegetales son polivalentes, o sea que cada
partícula puede combinarse con varias del anticuerpo según el tamaño de la partícula
antígena. De este modo se forman estructuras reticuladas que crecen hasta hacerse
visibles en forma de un precipitado.
El antisuero se obtiene preferentemente de conejos y ratones o caballos, según el volumen
que
se
necesite. La inyección del antígeno se efectúa según los casos, por vía
endovenosa, intramuscular o intraperitoneal. Este antígeno es conveniente que
sea
minuciosamente purificado, porque de emplearse el jugo vegetal como se extrae, se corre
el riesgo de incorporar una considerable cantidad de proteínas vegetales, como resto de
células, cloroplastos etc.Por
otra parte, con elvirus
purificado y por lo tantomás
concentrado se requiere de una inyección con una cantidad menor. La purificación parcial
del antígeno puede ser efectuada por diferentes medios.
Diagrama de flujo, para la Técnica Serológica ELISA (APENDICE 1)
1.
Adición del primer anticuerpo- policlonal.
La placa de poliestireno (Fase sólida) secubre con el antisuero, se prepara en
unadisolución de I:10,000 del antisuero (cabra anti VTC)en solución amortiguadora
(buffer) de cobertura de carbonatos a pH = 6.9
Incubar 4 hrs. a temperatura de 37OC, o durante toda la noche a 4OC
Lavar la placa *
2.
Preparación y adición de muestras a las placas.
Extraer la muestra (macerar) en buffer de extracción en una relación de (1:20)
peso/vol, a pH= 7.4 agregar 200 ul en cada pozo del extracto vegetal.
Incubar 16 hrs. a temperatura de 37OC
Lavar la placa *
3.
Adición de anticuerpo secundario monoclonal, ratón anti VTC en buffer reactivo [A]
en 1: 1O 0 0 agregar 200 ul a cada pozo.
Incubar 2 hrs. en cámara húmeda a temperara de 37°C.
Lavar la placa *
4.-
Adición del conjugado( antisuero-enzima).
Adición de enzima conjugada anti ratón IgG, diluir el conjugado del antisuero y la
enzima fosfatasa alcalina en el buffer reactivo [A], agregar 200 ul en cada pozo.
Incubar 1 hr. a temperatura de 37OC.
Lavar la placa *
5.-
Adición del sustrato.
Sustrato preparar el PNP (p-nitrofenil fosfato) en solución para disolver elDTA
(dietanolamina), en 1 mg/ml.
30-60 minutos en medio obscuro a temperatura de 37OC.
Evaluación visual (coloración amarilla)
Lectura fotométrica (405 nm por el lector de ELISA)
Losvalores de la placa registrada por el lector ELISA a 405nm, es debido a quese
obtiene una coloración amarilla en las muestras positivas, al efectuarse la reacción de la
fosfatasa alcalina con el sustrato.
* Proceso de lavado de placas:
Este proceso consiste en agregar buffer de lavado (PBS-T)a la placa, esperar
apróximadamente 5 segundos y voltear la caja mediante un movimiento brusco sobre un
papael secante, teniendo cuidado de que al levantar la placa esta no escurra líquido. Esta
acción se recomienda que se repita otras dos veces más, siendo en total tres lavados entre
cada fase de aplicación de los diferentes reactivos, de acuerdo al esquema señalado.
La evaluación se realizó en 148 muestras compuestas, provenientes del estado de Nuevo
León, 80 de Tamaulipas, 116 deSonora y 96 deColima.Lo
cual da un total de440
muestras compuestas.
En relación a la placa en base para llevar a cabo la técnica ELISA, se pueden analizar 45
muestras,yasea simples o compuestas con una repetición y sus tres testigos (buffer,
testigos positivo y negativo). En este estudio en cada pozo de la placa deELISAse
colocaron muestras compuestas de 5 árboles diferentes. De esta forma se analizaron 2250
muestras en total, bajo este esquema:
PARA UNA PLACA
45
No. de pozos por placa
En cada pozo se analizan 5 muestras
de cítricos
225 Muestras compuestas analizadas en total +
testigos
PARA 50 PLACAS
45
No,de pozos por placa
Placas de ELISA
2250 Muestras compuestas analizadas en
total + testigos
Estandarización del métodode (ELISA).
Mediante fórmulas estadísticas y gráficas, los datos reportados por el lector deELISA
calibrado a 405 nm., se obtuvo el criterio de evaluación, con respecto a muestras positivas
(Plantas enfermas) 0 muestras negativas (plantas sanas) en cítricos en la detección del
VTC.
ESQUEMA DE UNA PLACA ELISA
1
A
lB
..
I
1
71
I
2
2
81
~
3
4
3
4
91 101
I
I
5
5
111
I
lado izquierdo muetras (a)
7
6
1
121 8171
6
I
+
I
8
2
9
I
3
91
I
10
4
101
I
11
5
11I
12
a
lado derecho muestras (b)
6
12
I
+
t"""""""""""""""""""""""""""
t""""""""""""""""""""""
El lado izquierdo corresponde a las muestracompuestas del tipo "a" (pozo 145), más testigos (buffer, planta con W C y planta sana).
El lado derecho corresponde a las muestras compuestas del tipo "b"(repetición
de los pozos 1-45 ), más testigos (buffer, planta con VTC y planta sana).
RESULTADOS DEL ANALISISSEROLOGIC0 ELSA A PLANTAS DE ClTRlCOS
CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE: NUEVO LEON
LOCALIDAD
RANCHO
No. DE
MUESTRA
RESULTADO
DE ANALISIS
PLANTA SANA: 0.0255 nm.
PLANTA C M C : 0.1332 nm.
ANAL
ESTADI
-
X=
;Is
r tco
MEDIA
S=DESV.
EST.
ESTEBAN
GARCIA
al
a2
bl
b2
1
2
3
4
0.0018
0.0014
0.0018
0.0005
0.00137
0.00061
4LLENDE., N.L RAMON
CAVAZOS
al
a2
bl
b2
5
6
7
8
0.0015
0.0033
0.0006
0.0008
0.00155
0.00122
ROGELIO
SALAZAR
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
0.0007
0.0000
0.0001
0.0007
0.0006
O. 0003
0.0008
0.0004
0.0010
0.0007
0.0002
0.0007
0.0007
0.0001
O. 0007
0.001o
0.0009
0.0001
0.0029
0.0024
0.0002
0.0006
0.0013
0.0007
0.0016
0.0000
0.0006
0.0003
0.00037
0.00037
0.00052
0.00022
0.00065
0.00033
O. 00062
0.00037
0.00157
0.00129
0.0007
0.00045
O. 00062
0.00069
EL CERRITO
SAN
MIGUELITO
ZADEREYTA.
1.L.
LA
HACIENDITA
A
CADEREYTA
AGUIRRE
SAN PEDRO
EJIDO DE LA
HACIENDITA
B
LOCALIDAD
RANCHO
MUESTRA
No. DE
RESULTADO
DE ANALISIS
MUESTRA
TEODORO
RDZ.
PEDRO
VAQUERO
al
a2
bl
al
a2
bl
ELENA
GOMEZ
ANGELINA
WELSH
MONTE
MORELOS
EMILIO
LEON
JUAN
CARDENAS
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
VIVERO
JOSE
LUIS
DE LEON
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
VIVERO
MANUEL
MATA
al
a2
bl
HDTA.
LA
CARLOTA
VIVERO
MANUEL
MARROQUIN
PLANTA SANA:0.0255 nm
PLANTA C M C 0.1332 nm.
38
39
42
44
b2
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
1
b2
b2
-
0.0028
0.0028
0.0016
0.0016
0.0017
0.0030
0.0024
0.001 9
0.0025
0.0016
0.0030
0.0028
0.0033
0.0032
0.0012
0.0001
0.0021
0.0036
0.0031
0.0033
0.0006
0.0008
0.0006
0.0013
0.0033
O. 0024
0.0012
0.0009
0.001 9
0.0019
0.0009
0.0009
0.0028
0.0032
0.0027
0.0020
0.0260
0.0260
0.0280
0.0280
ANALISIS
ESTADI:
tic0
S=DESV.
X=
EST.
MEDIA
0.0022
0.00069
40 b2
41 0.00225
0.00058
37
43
45 0.00247
46
0.00061
0.00195
0.00156
0.00302
0.00065
0.00082
0.00033
0.00195
0.001 10
0.0014
0.00057
0.00267
O. 00049
0027
0.00115
LOCALIDAD
RESULTADO
DE ANALISIS
'CANTA SANA: 0.0255 nm.
'CANTA WVTC: 0.1 332 nm.
HUERTO
SOLEDAD
DE LA MATA
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
LA PURlSlMA
C
LA PURlSlMA
D
88
JESUS
MARIA
3ENERAL
TERAN
OSWALDO
VILLANUEVA
b2
al
I
E. HECTOR
GARCIA
DOLORES E.
PEÑA
QUINTANILL
106 A DOLORES
a2
R
84
85
86
I
b2
al
a2
bl
b2
al
b2
al
:E
b2
al
bl
b2
89
90
I
1
92
93
94
95
96
97
1O 0
1o1
~.
102
103
104
105
107
108
0.0015
0.0020
0.0021
0.0013
0.0001
0.0006
0.0003
0.0005
0.0003
0.0003
0.0001
O. 0004
0.0012
0.0005
0.0013
0.0008
0.0015
0.0005
0.0012
0.0019
0.0011
0.0021
0.0012
0.0015
0.0012
0.0011
0.0024
0.0014
0.0008
0.0005
0.0015
0.0005
ANALISIS
ESTADI
S=DESV.
EST.
MEDIA
x=
rlco
0.00172
0.00038
0.00037
0.00022
0.00027
0.00012
0.00095
0.00036
0.00127
0.00059
0.00147
98
O. 00045
0.00152
0.00059
0.00082
0.00047
LOCALIDAD
RANCHO
LA CONCHA
LAS VEGAS
LA PARRITA
LA
CHAPEÑA
LA PERLA
LINARES
MONTERREY
N.L.
JUAN
SAN
DE
DIOS
Y
LA CORONA
LA AMISTAD
LA CONTRA
LA GARZA
LA
CATARINA
MUESTRA
No. DE
MUESTRA
1o9
al
110
a2
bl
111
112
b2
al
113
114
a2
bl
115
0.0433
116
b2
117
al
a2
118
bl
0.0289
119
b2
0.0294
120
al
121
a2
122
bl
123
b2
0.0425
124
al
125
a2
126
bl
127
b2
0.0420
128
al
129
a2
130
bl
131
b2
132
al
133
a2
134
b2
135
b3
136
al
137
a2
138
bl
139
b2
0.0003
140
al
0.0012
141
a2
142
bl
143
b2
0.0003
144
al
8 0.001
145
a2
bl
b2
148
RESULTADO
DE ANALISIS
X=
r tco
MEDIA
S=DESV.
EST.
0.0436
O. 0440
O. 0466
0.0433
0.0439
0.0426
0.0438
0.04437
0.00151
O. 0434
0.00059
0.0263
0.0271
0.02792
0.00146
0.0426
O. 0426
O. 0421
0.04245
0.00023
O. 0421
0.0425
0.0430
0.0424
0.00045
0.0015
0.0016
0.0245
0.0006
0.0016
0.0020
0.0009
0.0005
0.0003
0.0007
0.0017
0.00705
0.01164
0.00125
0.00067
0.00075
0.00066
0.00077
0.00049
0.00137
0.00061
PLANTA SANA: 0.0255 nm
PLANTA CIVTC 0.1332 nm.
I
ESTADI!
-
0.0004
0.0012
0.0014
0.0018
0.0005
RESULTADOS DEL ANALISISSEROLOGIC0 ELSA A PLANTAS DE ClTRlCOS
CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE: TAMAULIPAS
r
ANALISIS ESTADISTICO
RESULTADO
DE ANALISIS
RANCHO
PLANTA SANA:0.0255 nm.
PLANTA CIWC. 0.1332 nm.
HUERTO
CARLOS I
SAN
HUERTO
CARLOS II
SAN
HUERTO
PRINCIPIO
LA Y
MAGNOLIA
EL
EJIDO PLAN
DE
AYALA
ClRlLO
CASTILLO
EJIDO
MARGARITA
GARCIA
HUERTO
HACIENDA
CARACOL.
SALAZAR
PROP.
ALANIS
LA
CRUZ
EXEL
J.
MARIO
HUERTA
HACIENSDA
CARACOL
ALANIS
HUERTO
REGISTRO
HACIENDA
CARACOL
HUERTO
PROVIDENCIA
EXEL
M.
SIN
EXEL
a2
bl
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
al
a2
bl
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
6
7
8 b2
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24 b2
25
26
27
28 b2
29
30
31
32 33
34
35
36
37
38
39
40
0.0110
0.0091
0.01 02
0.0104
0.0096
0.0096
0.0095
0.0095
0.0085
0.0098
0.0102
0.0103
0.0099
0.0099
0.0093
0.0093
0.0090
0.0098
0.0101
0.0091
0.0099
0.0091
0.0098
0.0091
0.0095
0.0095
0.0105
0.0105
0.0106
0.0094
0.0106
0.0095
0.0096
0.0096
0.0094
0.0096
0.0098
0.0098
0.0140
0.0140
-
X=
MEDIA
S=DESV.
EST.
0.01O 17
0.00079
0.00955
0.00005
0.0097
0.00082
0.0096
0.00034
0.0095
0.00053
O. 00947
0.00043
0.01
0.00057
0.01002
O. 00066
0.00955
0.0001
0.0119
0.00242
-
al
a2
bl
0.0088b2
iUERTO
al
rAMOQUlCHE
0.0009 a2
0.0004b l
b2
iUERTO
0.0012a l
2OVADONGA
a2
bl
b2
iUERTO
LOS
al
iUMUS
0.0441a2
bl
0.0281b2
'ROP.
MARIANO
al
SANCHEZ L.
0.0441a2
0.0271b l
0.0267b2
iUERTO CAPORAL
al
ZD. SANTOS
0.0178a2
0.0208b l
0.0208 b2
LOS iUERTO
al
qARANJOS
0.0128a2
0.0185b l
0.0185b2
i U E R T 0 RANCHO0.0198a l
ZHAPULTEPEC
a2
bl
0.0192b2
iUERT0
SANTA
al
3ARBARA
0.0190a2
iUEHUETLAN
bl
0.0200b2
'ROP
JESUS0.0122a l
V.
AARQUEZ
a2
iUICHIHUAYAN
bl
b2
iUERTO
ZECILIA
SANTA
41
42
43
44
0.001 45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
0.01 73
74
75
76
77
80
0.0099
o.O099
O. 0088
5
X=
MEDIA
S=DESV.
EST.
0.00935
0.00063
0.00072
0.00061
0.00065
0.00041
0.03557
0.01044
0.03555
0.00998
0.0193
0.001 73
0.01565
0.00329
0.0001
o.0002
0.0006
0.0006
O. 0450
0.0251
O. 0443
0.0178
0.0128
~
0.0198
0.0192
90
0.0200
0.0000
0.0181
0.0000
~~
~~
0.0195
0.00034
0.0195
0.00057
0.00757
0.00907
RESULTADOS DEL ANALISISSEROLOGIC0 ELSA A PLANTAS DE ClTRlCOS
CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE: SONORA
ANALISIS ESTADISTICO
MUESTRA
RANCHO
No. DE
MUESTRA
HUERTO EMILIANO
ZAPATA
LA
HUERTO
LAURITA
HUERTO EL PARDO
HUERTO EL CAMPO
N EVO
U
HUERTO
ANTONIO
SAN
HUERTO SOCIEDAD
DE
PRODUCCION
RURAL STA. AMELIA
HUERTO ARMlDA
HUERTO
GRANJA
LA
HUERTO EL AGUILA
HUERTO EL LOCO
RAMOS
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
RESULTADO
DE ANALISIS
-
X=
'LANTA SANA: 0.0267 nm
'LANTA CIVTC 0.1194 nm.
0.0247
1
0.02472
0.0236
2
0.0258
3
4
0.0248
0.0256
5
0.0244
6
0.0257
7
0.0269
8
0.0274
9
0.0256
10
0.0258
11
0.0280
12
0.0253
13
14 0.02497 0.0256
O. 0249
15
0.0241
16
O. 0260
17
18
0.03945
O. 0443
19
0.0441
0.0434
20
0.0271
21
0.0257
22 0.02652
0.0259
23
0.0274
24
0.0245
25
0.0254
26 0.02457
0.0243
27
0.0241
28
0.0255
29
30 0.02497 0.0235
0.0256
31
0.0253
32
0.0256
33
34 0.02515 0.0252
0.0254
35
0.0244
36
0.0259
37
0.0250
380.0256
0.0261
39
0.0254
40
S=DESV.
EST.
MEDIA
0.00089
0.00102
0.02565
I
0.00118
0.00065
"
0.00897
0.00085
0.00057
0.00099
0.00052
0.00049
-
RODOLFO
RURAL
a2
SANTIAGO
VICENTE
GUERRERO
EL OLVIDO
al
SALSIPUEDES
MARIBEL
LA ESMERALDA
SAN JOAQliN
TEPIC
CHAMIZAL
CRISTOBAL C
bl
b2
al
0.0014a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
0.0006a2
bl
b2
0.0276a l
0.0254a2
0.0264b l
0.0255b2
al
a2
bl
0.0023b2
al
0.0253a2
I
bl
0.0273b2
0.0143a l
a2
bl
b2
0.0142
al
a2
bl
0.0008b2
al
1
I
b2
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
MEDIA
X=
S=DESV.
EST.
0.00675
0.00248
0.0105
0.01050
0.00047
0.00048
0.00075
0.00019
0.02622
0.00102
0.00162
0.00067
0.02585
0.00097
0.01425
0.00005
0.00097
0.00059
0.02495
0.00190
*
I
0.0089
0.0046
0.0196
0.0196
o.0002
0.0002
0.0003
0.0012
0.0010
0.0006
0.0008
8
0.0017
0.001
0.0007
0.0253
0.0255
I
I
0.0143
0.0142
0.0018
0.0009
0.0004
O. 0266
O. 0266
0,0233
0.0233
a2
S=DESV.
EST.
RITA
SANTA
SAN JOSE
:L TEPEYAC
SPR-1UERTA
-1ERMOSILLO
SONORA
SAN SEBASTIÁN
MEXICO
S.P.R.
-1ERCULES
SAHUARIPA I
0.0233
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
1O 0
1o1
102
103
104
105
106
107
108
1o9
lo
111
112
113
114
115
116
1
0.0163
0.0163
0.0251
0.0251
0.0258
0.0258
0.0008
0.0008
0.0286
0.0267
0.0273
0.0250
0.0260
0.0252
0.0262
0.0256
0.0263
0.0254
0.0252
O. 0244
0.0258
0.0286
0.0260
0.0234
0.0248
0.0253
0.0250
0.0258
0.0265
0.0261
0.0255
0.0257
0.0250
0.0252
0.0198
0.00404
0.02545
O. 00040
0.01422
0.01552
0.02587
0.00104
0.02587
O. 00044
0.026
0.00182
0.02487
0.00109
I
0.00063
0.02535
0.00031
RESULTADOS DEL ANALISIS SEROLOGIC0 ELISA A PLANTAS DE ClTRlCOS
CONTRA EL VIRUS TRISTEZA DE LOS ClTRlCOS EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL
ESTADO DE : COLIMA
1
RANCHO
MUESTRA
CHORIZO
EL JARAL
PROPIEDAD
SERGIO VERDUSCO
LAS PRIMAVERAS
SAN
BUENAVENTURA
SANTA RITA
RANCHO
SANTANDER
RANCHO
POLLITO
EL
HUERTO
VIEJO
VALLE
HUERTO RANCHO
LOS CERRITOS
No. DE
MUESTRA
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
8
RESULTADO
DE ANALlSIS
5
7
8
9
11
12
13
15
l4
16
19
l8
20
21
23
22
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
0.001
I
I
I
0.0260
0.0269
0.0255
O. 0264
0.0254
0.0258
0.0259
0.0.249
0.0296
0.0277
0.0289
0.0273
0.001 1
0.0008
0.0001
0.0005
0.0003
0.0014
0.0017
0.0016
0.0005
0.0006
0.0003
0.0008
0.0004
0.0014
0.0010
0.0000
0.0004
0.0001
0.0003
0.0001
0.0009
0.0014
35
0.0018
36
37
0.0015
0.0120
0.0120
0.001 8
40
x=
MEDIA
S=DESV.
EST.
2
3
4
0.0262
0.00059
6
0.0255
0.00045
10
0.02837
0.00106
0.00062
0.00042
0.0125
O. 00064
0.00055
0.00020
0.0007
0.00062
0.00022
0.00015
0.0014
0.00037
0.0069
0.00588
PLANTA
SANA:
0.0264 nm.
PLANTA CNTC. 0.1056 nm.
1
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
ANALISIS ESTADISTICO
17
RESULTADO
DE ANALISIS
>LANTA SANA 0.0264 nm.
'LANTA CIVTC. 0.1056 nm
HUERTO LA ROSAL
44
HUERTA EL PILAR
46
LA
ERANO
HUERTA
PAROTITA
RANCHO
MANOLOS
LOS
PAPA ALEJO Ill
58
LIC.
LEONARD0
JARAMILLO
62
RANCHO
CIRUELOS Ill
LAS
68
HUERTA
SANTA
GERTRUDIZ
a2
IV
72
TECOMAN M.R. LUIS
76
EL
HUERTA
MICHELENA
80
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
bl
b2
41
42
43
45
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
59
60
61
63
64
65
66
67
69
70
71
73
74
75
77
78
79
O. 0007
O. 0003
0.0012
0.0012
0.0006
0.0013
O. 0007
0.001 5
0.0014
0.0001
0.0002
0.001 3
0.0000
0.0005
0.0003
0.0008
0.0007
0.0004
0.0011
0.0007
0.0008
0.0012
0.0008
0.0012
0.0010
0.001 7
0.0009
0.0030
0.001 1
0.0002
0.0005
0.0003
0.0245
0.0302
0.0440
0.0437
0.0438
O. 0440
O. 044 1
0.0443
-
X=
S=DESV.
MEDIA
EST.
0.00085
0.00043
0.00102
0.00044
0.00075
0.00069
O. 0004
0.00033
0.00072
0.00028
0.001
0.00023
0.0165
0.00096
0.00052
0.00040
0.0347
0.00890
0.04405
0.00020
ANALISIS ESTADISTICO
RESULTADO
DE ANALlSIS
PLANTA S A N A 0.0264 nm.
PLANTA CIVTC:0.1056 nm.
t
KM. 2 CAMINO
A
CHENCHOPA
RANCHO
FLORIDA
RANCHO
LORENZO
VILLA
SAN
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
b2
al
a2
bl
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
0.0015
0.0016
0.0023
O. 0006
0.0014
0.0008
0.0012
0.0004
0.0189
0.0189
0.0183
0.0183
O. 0446
0.0257
0.0258
0.0252
I
-
X=
MEDIA
I
I
S=DESV.
EST.
0.0015
0.00069
0.00009
0.00044
0.0186
0.00034
0.03032
0.00952
I
ANALISIS ESTADISTICO POR ESTADO
I
TAMAULIPAS
I
I
80
0.0132075
0.0096338
0.040991
SONORA
116
0.0204818
0.0103829
0.051630
COLIMA
96
0.0095697
0.0139929
0.051 548
I
440
I
I
0.0133942
ANALISIS ESTADISTICO DE TESTIGOS NEGATIVOS
BUFFER
-
X+3S DE VALORES NEGATIVOS =0.06639
PLANTASANA
-
X+3S DE VALORES NEGATIVOS= 0.05259
I
0.052592
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A CITRICOS DE
MUESTRAS COMPUESTAS DEL ESTADO N.L.
--
____
A
B
S
O
R
B
A
TESTIGO
120
+
i
133.2
I
a
x
VALOR ESTANDAR = 5 2 . 5
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e
I
r
a
n
C
40
20
I-
c
---------
I 1 I1
TESTIGO ( - )
25.5
RANGO NEGATIVO
I
I
I
I
h
O
- NUEVO LEON
T E S T I G - ( 2 5 . 5 ) VAL. E S T A N D ( 5 2 . 5 )
TEST+(133.2)
ESC 1:lOOO
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A ClTRlCOS DE
MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO. TAMAULIPAS
A
_____
140
+
TESTOGO
133.2
B
S
O
R
B
A
120
N
C
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A
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t
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VALOR
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.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
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1
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25.5
C
h
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5
10
15
20
25
30
NO. DE RANCHOS
-t" TAMAULIPAS
T E S T I G - ( 2 5 . 5 ) VAL. E S T A N D ( 5 2 . 5 )
TEST+(133.2)
ESC 1:lOOO
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A ClTRlCOS DE
MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO. SONORA
A
B
S
O
R
B
A
140
TESTIGO
+
119.4
120
N
C
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+
1525
+ I
I
20
I
35
NO. DE RANCHOS
SONORA
30
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A CITRICOS DE
MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO.COLIMA
A
B
120
TESTIGO
S
O
R
B
A
+
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,
I
1O 0
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C
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5
10
15
25
20
NO. DE RANCHOS
-6"-
COLIMA
TEST-(26.4)VALORSTAND(52.5)TEST+(lO5.6)
30
ANALISIS SEROLOGICO(VTC) A ClTRlCOS DE
MUESTRAS COMPUESTAS DE LOS ESTADOS
A
B
S
O
R
B
A
N
C
140
- TESTIGOS
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I
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I
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i
RANGO POSITIVO
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120
I
A
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4
POSITIVOS
133.2
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1
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VALOR
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X
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ESTANDAR
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10
20
30
40
NO. DE RANCHOS
d-
i
-
NUEVO LEON
"- TAMAULIPAS
SONORA
++ COLIMA
50
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS
COMPUESTAS DE ClTRlCOS DEL EDO.
N.L.
F 140
R
E
C . 120 "'*
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N
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I
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RANGO NEGATIVO
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O
20
40
60
80
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ABSORBANCIA(405nm)
-*-
T E S T + ( 1 3 3 . 2 ) V A L O RS T A N D A R ( 5 2 . 5 )
TEST-(25.5)
NUEVO LEON
ESC 1:lOOO
120
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) E N MUESTRAS
COMPUESTAS DE ClTRlCOS DEL EDO. SONORA
F
140
R
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RANGO POSITIVO
RANGO NEGATIVO
100 ;
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I
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ABSORBANCIA(405nm)
*
TEST-(26.7)VALORSTANDAR(52.5)
TEST+(119.4)
SONORA
ESC 1:lOOO
12.0
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS
COMPUESTAS DE ClTRlCOS DEL EDO. TAMAUL.
140
F
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C 120
U
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C 1O 0
I
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RANGO NEGATIVO
,
POSITIVO
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I
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A
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t
O
O
40
20
60
80
100
ABSORBANCIA(405nm)
+ TAMAULIPAS
TEST-(25.5)VALOR STANDAR(52.5)
TEST+(133.2)
ESC 1:lOOO
120
225813
INTERVALO DE ABSORB.EN ClTRICOS(VTC)
EN MUESTRAS COMPUESTAS DEL EDO.COLIMA
E
N
C
I
A
N
O
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I
80
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I
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A
20
O
20
40
60
80
100
ABSORBANCIA(405nm)
---E+ COLIMA
ESC 1:lOOO
120
INTERVALO DE ABSORB.(VTC) EN MUESTRAS
COMPUESTAS DE ClTRlCOS DE LOS ESTADOS
E
N
c
I
A
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100,
4
"
20
4080
60
100
ABSORBANCIA(405nm)
"
c
NUEVO
LEON
-t- TAMAULIPAS
COLIMA
-++ SONORA
TEST-(26.4)VALORSTANDAR(52.5)
T E S T + ( 1 0 5 . 6 )T E S T + ( 1 1 9 . 4 )T E S T + ( 1 3 3 . 2 )
TEST-(26.7)
ESC 1:lOOO
U
DISCUSION
La evaluación de las muestras colectadas para el diagnóstico del virus VTC, se efectúa en
el lector de E L S A calibrado a 405 nm, el valor de absorbancia reportado en cada pozo y
testigos fueron formando la base dedatos para realizar los cálculos estadísticos para
obtener un número, el cual sería el estándar para determinar el rango positivo-negativo
para plantas de cítricos enfermas (presencia del VTC) o plantas sanas (ausencia del VTC).
Para el análisis estadístico, se revisaron varias fórmulas como son:
2 x
3;x+2s
x+3s
Sin embargo, en base a la literatura revisada se tomó la decisión de aplicar el teorema de
Chebychev ( X + 3s), ya que se requiere una expresión más formal de la estimación y
precisión, con lo cual se puede obtener una estimación del parámetro por intervalo al azar,
llamado intervalo de confianza.
Es decir, supongamos que el parámetro a estimar por intervalo de confianza, sabiendo que
la distribución muestra1 de X es aproximadamente normal por el teorema del límite central
I queaproximadamentees
el 99.73 % de los valores de la media, mástresveces
la
+3S del total de las plantas sanasde los estadosde
desviación estándar, esto es:
Nuevo León, Tamaulipas, Sonora y Colima, nos da un total de 440 muestras compuestas
en total. Estas muestras presentaron valores en un rango de O a 0.0466 nm de
absobancia, las cuales se encuentra por abajo del testigo positivo. Las variaciones de las
muestras analizadas se puede observar mejor en las gráficas, donde está variación se
debe a:
x
1. Madurez de la planta (contenido de virus).
2. Variante del virus (En México es una variante débil, no es tan agresivo).
3. Tamaño de muestra (cantidad de savia para analizar).
4. Condiciones ambientales ( campo/ laboratorio).
5. Calidad del material serológico (sustancias químicas y equipo).
6. Procesamiento (recursos humanos).
7. Manejo cultural del cultivo (fertilización, riego, fecha de siembra, variedad de la planta).
Lasmuestras analizadas nos dieron valores negativos, por lo tanto el virus VTCesta
ausente, esto con base a el valor tomadocomoestándar, que esde 0.05259 nm.Por
debajo de este valor se consideran los resultados de las muestras como negativas y por
arriba se consideran positivas.
Lasmuestrasse
analizaron serologícamente con la técnica de inmunosorbenciacon
enzimas conjugadas ELISA; como lo indica Agdia para la detección de la tristeza de los
cítricos VTC, utilizando anticuerpos policlonales goat anti-CiTV (antisuero policlonal de
cabra anti VTC), para la detección del VTC. Así como, el anticuerpo monoclonal mouse
anti-CiTV (antisuero monoclonal ratón anti VTC), para evaluar las muestras analizadas.
Actualmente, la técnica es de gran utilidad en éI diagnóstico deenfermedades vírales,
como es el caso de la enfermedad de la tristeza de los cítricos VTC.
Ahora bien, debido a que en México se considera como una de las pocas áreas del mundo
donde aún no existe el VTC (Virus Tristeza de los cítricos), es necesario analizar las
muestrasde viveros y plantaciones comerciales de cítricos, de las principales zonas
productoras; con la finalidad de detectar cualquier indicio de presencia de este patógeno,
que pudiera poner en riesgo la citricultura mexicana. En base a lo anterior, en ocasiones
se requiere analizar un gran número de muestras en poco tiempo, considerando muestras
compuestas o simples, de acuerdo con las evidencias de presencia o ausencia del VTC.
En relación al tamaño de muestra compuesta, que se manejó en este ensayo, se conformó
de cinco muestras diferentes, cada unacompuestade
tres brotes tiernos para una
hectárea, en estas muestras es importante identificar la región, vivero, propietario y árbol.
Encasode
que se obtengan resultados positivos, serecomienda procesar muestras
simples, obteniéndose una mayor precisión del diagnóstico, ya que por trabajarcon
muestras compuestas no podemos determinar cuantosárboles están afectados por éI VTC.
Con la técnica ELISA para VTCpodemosconfirmar
la presencia 0 ausencia delvirus
tristeza de los cítricos, ya que como se ha mencionado esta técnica presenta las siguientes
ventajas:
0
0
0
0
Precisa
Sensible
Usa cantidades mínimas de antisuero
La reacción es rápida.
VENTAJAS DE PROCESAR MUESTRAS COMPUESTAS DE CITRICOS:
1. Se puede detectar la presencia del virus VTC en un muestreo grande.
2. En un período corto de tiempo pueden ser analizadas muchas muestras.
3. Utilizando mínimas cantidades desustanciasquímicaspodemos
analizar un mayor
número de muestras.
4. En cuanto al costo, resulta económico para un muestreo grande.
DESVENTAJAS DE PROCESAR MUESTRAS COMPUESTAS EN CITRICOS:
1. Si el resultado de una muestra compuesta sale positiva; es decir, está presente el VTC,
no se tiene la certeza de que 1,2,3,46 los 5 árboles sean positivos.
2. En el análisis de muestras compuestas, no es posible cuantificar la concentración del
virus por árbol (la intensidad de coloración es directamente proporcional a la
concentración del virus).
3. Si el resultado es positivo, esto implicaría analizar muestras simples, requiriendo de
mayor tiempoy dinero.
1
CONCLUSION
I
1. La implantación de medidas, que requiere de un análisis confiable estadísticamente, se
puede expresar como la media más tres veces la desviación estándar (
+ 3s);lo que
nos permite determinar el rango apropiado positivo-negativo en éI diagnóstico del virus
tristeza de los cítricos mediante la técnica ELISA.
x
2. Con base al uso de la técnica ELISA para diagnosticar y determinar la presencia o
ausencia del VTC en zona citricolas, sepudodeterminar
que en este muestre0 los
valores obtenidos se encuentran en un rango de O - 0.0466 nm, estos sonvalores
negativos, lo cual nos indica la ausencia del VTC.
3. Mediante el uso de la técnica ELISA, se evaluaron muestras compuestas de cítricos, lo
que permitió determinar que para 1993 no se encontró presente el virus tristeza de los
cítricos en las zonas muestreadas de los estados de Nuevo León, Tamaulipas, Sonora y
Colima.
*
RECOMENDACIONES
225813
I
1. Establecimiento de los valores del rango positivo y negativo a usar
2. Analizar suficientes plantas para familiarizarse con el rango de valores involucrados de
muestras positivas y negativas.
3. Incluir controles negativos conocidos en cada ensayo para asegurar la representación
del rango negativo previamente establecido. Asimismo, considerar un testigo positivo
(con presencia de VTC), con el mismo fin.
4. Incluir un control sano (positivo) confiable en cada placa.
5. Considerar un mínimo de dos repeticiones de las muestras.
APENDICE 1
REACTIVOS PARA LAS SOLUCIONES(BUFFER)
Buffer de lavado (buffer PBST).
REACTIVOS
CANTIDAD
FORMULAS
Cloruro de sodio
Fosfato dibásico de sodio (hidratado)
PO,
Fosfato monobásico de potasio
Cloruro de potasio
Tween-20 (surfactante)
En 1000 ml de agua destilada disolver.
Ajustar el pH = 7.4
Temperatura = 4 "C (almacenar)
NaCl
Na, HPO .12H20
KHz
KCI
8.0 g
2.99
0.29
0.29
0.5ml
Buffer de extracción
Disolver en 1000 ml de buffer de lavado (PBST).
FORMULAS
REACTIVOS
Sulfito de sodio(anhidro)
Polyvinylpyrrolidona
Azida de sodio
Polvo de albúmina de pollo
Tween 20 (surfactante)
Ajustar a pH = 7.4
Temperatura = 4 "C (almacenar)
Na, SO,
PM=24-40,000
(PVP)
NaN,
1.3g
20.09
0.2g
2.09
0.5ml
Buffer de solución del sustrato PNP(P-nitrofenil fosfato).
FORMULAS
REACTIVOS
Diethanolamina (DTA)
Agua
Azida
Ajustar el volumen final a 1000 ml con agua
destilada
Ajustar a pH = 9.8
Temperatura = 4 "C. (almacenar).
(HOCH, CH,) NH
NaN,
97.0 ml
800.0 ml
0.29
Buffer de cubrimiento
En 1000 ml de agua destilada disolver.
REACTIVOS
Carbonato de sodio
Bicarbonato de sodio
Azida de sodio
Ajustar a pH = 9.6
Temperatura = 4°C (almacenar).
FORMULAS
Na, CO,
Na HCO,
Na N,
CANTI DAD
1 .59g
2.939
0.29
Buffer Reactivo [A]
En 1000 ml de (PBST) agregar:
REACTIVOS
Suero de albúmina de bovino (BSA)
Polyvinilpyrrolidona
Azida de sodio
Temperatura = 4°C (almacenar)
CANTIDAD
FORMULAS
(PVP) PM = 24 - 40,000
NaN,
2.09
20.og
0.29
APENDICE 2
ESQUEMA
FOTOGRAFICO
DEL
EQUIPO
Y MATERIAL
PARA
DESARROLLAR LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.
LABORATORIO DIAGNOSTICO DE VIRUS, DE LA DlRECClON GENERAL
DE SANIDAD VEGETAL. SAGAR.
LECTOR ELISA
SUSTANCIAS Y REACTIVOS
HOMOGENiZADOR DE MUESTRAS (MACERADOR)
REFRlGERAClON DE MUESTRAS PARA CONSERVAClON Y PROCESAMIENTO
POSTERIOR
rl
BlBLlOGRAFlA
Agrios, N. G. 1991. Fitopatología. 5ta. reimpresión. Ed. Limusa. pp. 648-651
0
0
0
0
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Center, Wooster. Wooster.