Pruebas moleculares basadas en ADN en la

Pruebas moleculares basadas en ADN en la prác4ca clínica Luis M. Franco, M.D. Profesor Asistente Departamento de Gené4ca Molecular y Humana y Departamento de Medicina Interna Baylor College of Medicine Houston, TX, E.U.A. ¿Qué hace que seamos tan similares?
¿Qué hace que seamos únicos?
Dos miembros de la misma familia tienen la
misma enfermedad. Uno tiene un caso leve y
el otro un caso muy severo. ¿Por qué?
También somos únicos en el modo en el que
respondemos a las enfermedades y los
tratamientos
¿Puede esta información ser utilizada para
mejorar la prevención y el tratamiento de las
enfermedades?
Dos personas reciben el mismo
tratamiento. Una responde muy bien y la
otra no responde. ¿Por qué?
Una gran parte de la diversidad biológica humana está escrita en nuestro ADN La cara cambiante de la gené4ca médica Cada uno de estos individuos ;ene > 22,000 genes. ¿Qué información hay en esos genes que nos pueda ayudar a mejorar el cuidado médico que les ofrecemos? Muchas enfermedades dermatológicas, especialmente de la infancia, 4enen un componente hereditario ¿Qué es lo realmente nuevo? Muchas enfermedades gené4cas 4enen manifestaciones cutáneas Secuencia del genoma
humano, letra por letra
(2003)
Base molecular de
un número creciente
de enfermedades
Herramientas
bioinformáticas para
navegar y estudiar el
genoma
Impacto sobre la
práctica clínica
La base molecular de las enfermedades genéticas está siendo
descubierta a un paso acelerado
Prefijo Autosómico Ligado a X Ligado a Y Mitocondrial Total Descripción de gen 12885 632 48 35 13600 Gen y feno;po 209 10 0 2 221 Feno;po, base molecular conocida 2936 247 4 28 3215 Feno;po, base molecular desconocida 1631 135 5 0 1771 4986 35% Feno;pos con sospecha de herencia mendeliana 1815 129 2 0 1946 Totals 19476 1153 59 65 20753 Estadís;cas de OMIM a Agosto 7 de 2011 El número de enfermedades para las cuales existe una prueba diagnós4ca molecular ha aumentado dramá4camente en los úl4mos años Caso clínico •  Paciente femenina de 12 años, remi4da por el pediatra al dermatólogo por múl4ples lesiones de piel •  El dermatólogo encuentra múl4ples quistes epidermoides y fibromas •  Historia familiar: –  Abuelo materno con cáncer de colon a los 45 años –  Tío materno con cáncer de colon a los 35 años –  Madre de 33 años, siendo estudiada por sangrado rectal •  Dermatólogo sospecha poliposis adenomatosa familiar con manifestaciones extra-­‐colónicas (antes: Gardner) Caso clínico •  El dermatólogo quiere confirmar el diagnós4co y encuentra un laboratorio que realiza pruebas moleculares para poliposis adenomatosa familiar . Le ofrecen las siguientes opciones: – 
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Secuenciación del gen APC: $1,700,000 Prueba de proteína truncada: $500,000 Prueba de deleción/duplicación del gen APC: $500,000 Pánel completo (secuenciación y pruebas de deleción/duplicación): $1,900,000 •  La persona que contesta el teléfono en el laboratorio sugiere que el pánel completo es la mejor opción porque “incluye todo” •  ¿Cuál de las anteriores pruebas debe escoger el dermatólogo? Pruebas diagnós;cas basadas en ADN humano •  Usadas con frecuencia creciente •  Dos propósitos en la prác4ca clínica actual: –  Diagnós4co de enfermedades gené4cas –  Predicción de respuesta a medicamentos en pacientes sin enfermedades gené4cas •  Cada vez más disponibles (Colombia no es una excepción) •  Intrínsecamente diferentes a otros 4pos de pruebas diagnós4cas •  Su uso e interpretación adecuados requieren un buen entendimiento de varios conceptos básicos Es importante tener muy claros algunos conceptos básicos Genes Alelos Geno;po Autosómico Feno;po Variación en el número de copias Dominante VS recesivo Homozigoto VS heterozigoto Locus ¿Cómo se ve el ADN? •  El ADN humano está dividido en 46 piezas (cromosomas) •  Tenemos dos copias de cada cromosoma (23 pares) •  Un par de cromosomas sexuales (XX ó XY) y 22 pares de autosomas •  Recibimos una copia de cada cromosoma del padre y otra de la madre Entonces, ¿qué es un gen? Gen •  Un gen es un pedazo de ADN que cumple una función •  ADN ARN Proteina •  Cada cromosoma ;ene un gran número de genes •  Los humanos tenemos aproximadamente 22,000 genes Como tenemos dos copias de cada cromosoma, tenemos dos copias de cada gen Cromosoma heredado del padre Cromosoma heredado de la madre Feno;po: anifestación isica Un gen en Lsa u mlocus El alelo rojo de este gen El alelo azul de este gen Geno;po: Combinación específica de alelos en un locus (por ejemplo, rojo/
verde) 2 copias de cada Homozigoto Heterozigoto cromosoma AACTGAGTCAACGT AACTGATTCAACGT Mutación puntual Las mutaciones puntuales, pero también los cambios en el número de copias, resultan en variación humana y, ocasionalmente, en enfermedad Deleción Duplicación (borramiento) Alelo verde:
Alelo amarillo:
normal
mutación
Cuando se necesita un solo alelo
mutado para producir la
enfermedad, hablamos de un
patrón de herencia dominante
Patrón de herencia dominante
Cuando se require que los dos
alelos tengan la mutación para que
haya enfermedad, hablamos de un
patrón de herencia recesivo
Alelo amarillo:
Alelo amarillo:
mutación
mutación
Portadores: un alelo con mutación y
un alelo normal
Afectados: dos alelos con
mutación
Patrón de herencia recesivo
Es importante tener muy claros algunos conceptos básicos Genes Alelos Geno;po Autosómico Feno;po Variación en el número de copias Dominante VS recesivo Homozigoto VS heterozigoto Locus El proceso diagnós;co en las enferemedades gené;cas El proceso diagnós;co en las enferemedades gené;cas El médico sospecha una enfermedad gené4ca (cuadro clínico, historia familiar, alteraciones metabólicas, imágenes diagnós4cas) Caso clínico: Quistes epidermoides, fibromas, historia familiar de cáncer Selección de una prueba molecular confirmatoria adecuada Interpretación de los resultados, en el contexto del paciente Las pruebas moleculares se pueden hacer a tres niveles DNA complementario (cDNA) Leer letra por letra el ADN (secuenciación) Secuenciación del cDNA RNA RNA mensajero (mRNA) Proteina Pruebas de estructura de proteínas DNA Pregunta 1: ¿La prueba que estoy pidiendo, a qué nivel busca confirmar el diagnós4co? Proteina RNA/cDNA DNA Pregunta 2: ¿Qué 4po de alteración gené4ca es más común en la enfermedad que estoy sospechando? AACTGAGTCAACGT AACTGATTCAACGT Mutación puntual Deleción Duplicación La secuenciación no detecta deleciones ni duplicaciones ¿Por qué no? La secuenciación es discon;nua y no es una prueba cuan;ta;va Deleción Duplicación Pregunta 3: ¿Hay mutaciones predominantes en este gen, en esta población? APC FGFR3 BRCA1/2 ¿A qué nivel estoy buscando confirmar el diagnós4co? Prueba de función/
estructura de proteínas Proteína DNA, DNAc ¿Qué 4po de alteración es más frecuente en esta enfermedad? FISH, Hibridación genómica compara4va Deleción/duplicación Mutación puntual ¿Existen mutaciones predominantes en este gen, en esta población? Si No Mutaciones específicas Secuenciación del gen Llega el resultado. ¿Cómo interpretarlo? •  Reportes de resultados gené4cos 4enden a incluir una descripción detallada •  ¿A qué nivel molecular se realizó la prueba? –  Qué se evaluó y qué no se evaluó •  ¿Cuál es el patrón de herencia de la enfermedad? –  Dominante: Necesitamos una sola mutación –  Recesivo: •  Ninguna mutación (no afectado) •  Una mutación y una copia normal (portador) •  Una o dos mutaciones, y ninguna copia normal (afectado) •  Si se detectaron una o más mutaciones, ¿se trata de mutaciones conocidas? •  ¿Es congruente el resultado con la presentación clínica del paciente? Dónde encontrar información confiable sobre enfermedades gené;cas y su diagnós;co www.geneclinics.org www.ncbi.nlm.nih.gov Ubicar e interactuar con gene4stas clínicos en su lugar de prác4ca Volviendo al caso clínico •  El dermatólogo usa la siguiente aproximación: – 
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Sospecha clínica: Poliposis adenomatosa familiar con manifestaciones cutáneas Gen: APC Nivel molecular al que se realizan las pruebas: ADNc Tipos de mutaciones más frecuentes: •  Mutaciones puntuales: 85 -­‐ 90% •  Deleciones: 10 -­‐ 15% –  Mutaciones predominantes: No •  El dermatólogo remite la paciente al gene4sta clínico, y se decide realizar secuenciación y pruebas de deleción del gen APC •  Resultado: Mutación c.4348 C>T en uno de los dos alelos (la paciente es heterozigota) •  Mutación descrita antes en pacientes con PAF: Si •  Conclusión: Esta prueba confirma el diagnós4co de PAF en esta familia •  Siguiente paso: Buscar la mutación en otros familiares, e iniciar tamizaje agresivo en aquellos que tengan la mutación (incluyendo los que no hayan desarrollado aún cáncer) El esquema está empezando a cambiar