Manual de usuario - Instituto de Ingeniería Eléctrica

Universidad de la República Oriental del Uruguay
Facultad de Ingeniería
Instituto de Ingeniería Eléctrica
MANUAL DE USUARIO
ELECTROFORESIS
DICIEMBRE 2006
Tratamiento de Imágenes por Computadora
Proyecto de Fin de Cursos
Marcelo Lavagna – Carolina Etchart
[email protected]
INTRODUCCIÓN:
La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos
para separar moléculas basándose en propiedades como tamaño, forma o
punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con
propósitos analíticos, pero puede ser una técnica preparativa para purificar
moléculas parcialmente antes de aplicar una espectroscopia de masas, una
PCR, una clonación o una secuenciación de ADN.
La segunda parte del nombre, gel, se refiere a la matriz usada para separar las
moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad
controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos
pequeños, el gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida
y un iniciador de la polimerización, para producir redes de poliacrilamida de
diferentes tamaños. Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos
centenares de bases), la matriz empleada es de agarosa purificada, un
polisacárido extraído de algas marinas. En ambos casos, el gel forma una
matriz sólida pero porosa
La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz
que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las
moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las
moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo si están
cargadas positivamente y hacia el ánodo si están cargadas negativamente. En
los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al
positivo, y esto es debido a que poseen una carga negativa. En los fragmentos
de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración es
proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y
ARN, dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de
forma complicada, según la estructura terciaria formada tras el plegamiento.
Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de
hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para
'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración
dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada tras el
plegamiento.
Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han
llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un
colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el
bromuro de etidio o la plata. Asimismo se emplean otros métodos para
visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente
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bajo luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa bajo dicha
luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar
un autoradiograma.
Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán
separaciones
paralelas.
Cada
separación
mostrará
distintas
bandas
correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son
incompletas, se dará un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles
dos o más componentes.
Las bandas en diferentes separaciones paralelas están a la misma distancia del
principio significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la
misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de
moléculas de tamaño conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador
con una mezcla desconocida, llamada patrón, las bandas observadas en el
marcador pueden ser comparadas a las obtenidas en la mezcla desconocida
para determinar su tamaño. La distancia a la que se encuentra la banda del
principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del
tamaño de la molécula.
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1. CAPÍTULO I: INSTALACIÓN DEL SOFTWARE
I. Requisitos del sistema
i. Matlab R14 o superior
ii. Imágenes a tratar
2. CAPÍTULO II: FUNCIONAMIENTO
I. Requisitos de la entrada al programa (imagen)
i. Debe presentar hendiduras (al menos una)
ii. Hendiduras del mismo tamaño (aproximadamente)
iii. Hendiduras “hacia arriba”
3. CAPÍTULO III: EJEMPLO
EJEMPLO DE APLICACIÓN
Realizamos la electroforesis de ciertas muestras de ADN, y nos interesa
determinar con cierta exactitud el largo de las cadenas presentes en dichas
muestras. Para ello, sacamos una fotografía al gel de la “corrida” a evaluar, con
una cámara digital, y la guardamos en la PC, en alguna carpeta definida por el
usuario.
A continuación, ejecutamos electroforesis.m. Esta acción provocará la siguiente
cadena de interacciones PC-usuario.
I. Selección de la imagen a procesar
Para ello haga clic
en el botón
Examinar… y se le
desplegará la
ventana que le
permitirá
seleccionar la
imagen deseada
desde archivo.
Formato jpg.
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II. Selección de las características de la imagen
La imagen
seleccionada es
mostrada en
pantalla, y a
continuación se le
pedirá que indique
las características
de la imagen.
Presionar botón
Guardar datos.
Luego, se
mostrará en
pantalla la imagen
con las
hendiduras
detectadas
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III. Valores en pb de algunos puntos del patrón
A continuación
presione el botón
Presione para
valorar la primera
marca, con lo que
se mostrará la
imagen del patrón
y una cruz que le
permitirá cliquear
sobre el patrón.
Haga
usted
clic
donde
considere
que se encuentra la primera marca necesaria para la detección de las marcas
de las muestras.
Luego de haber
cliqueado, rellene
la casilla a la
derecha indicando
el valor en pb de
la marca elegida.
Continúe este
procedimiento
hasta completar
las cuatro marcas,
siempre en orden
descendente.
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IV. Selección de la planilla excel donde serán guardados los resultados
Habiendo
rellenado las 4
casillas
anteriores, haga
clic en el boton
Procesar datos,
que dara inicio al
programa.
A su vez, le
abrirá una
ventana para
seleccionar la
planilla Excel
donde se
guardarán los
resultados.
Esta operación
puede tardar
unos minutos.
Luego se irán mostrando imágenes de las marcas detectadas en cada muestra,
hasta que finalmente el programa llega a su fin, indicándole que debe apretar
cualquier tecla para continuar. Esta acción borra todas las imágenes abiertas.
Aclaración:
Los
botones
Ver planilla Excel y Salir no pudieron ser
implementados.
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V. Visualización de resultados en una planilla Excel
Observación: Los campos a la derecha de Muestra Activa: i – en posición j son
los valores generados por el programa electroforesis.m descrito anteriormente.
Los campos consecuentes hacia abajo, Valor real de la muestra activa i, son
destinados para la escritura manual de los valores esperados por el usuario, a
modo de comparación.
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