Informe inicial - Instituto de Ingeniería Eléctrica

Tratamiento de Imágenes por Computadora
Universidad de la República Oriental del Uruguay
Proyecto de Fin de Cursos
ELECTROFORESIS EN GEL DE MOLÉCULAS DE ADN
Noviembre de 2006
Carolina Etchart C.I. 3.757.708-8
Marcelo Lavagna C.I. 3.508.715-8
[email protected]
Electroforesis en gel de moléculas de ADN - Proyecto de Fin de Cursos
Tratamiento de Imágenes por Computadora
ELECTROFORESIS EN GEL DE MOLÉCULAS DE ADN
Introducción
La electroforesis en gel es un grupo de técnicas empleadas por los científicos para
separar moléculas basándose en propiedades como tamaño, forma o punto isoeléctrico.
La electroforesis en gel se utiliza generalmente con propósitos analíticos, pero puede ser
una técnica preparativa para purificar moléculas parcialmente antes de aplicar una
espectroscopia de masas, una PCR, una clonación o una secuenciación de ADN.
La segunda parte del nombre, gel, se refiere a la matriz usada para separar las
moléculas. En muchos casos un gel es un polímero entrelazado de porosidad
controlable. Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños, el
gel está compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida y un iniciador de la
polimerización, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaños. Para
separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada
es de agarosa purificada, un polisacárido extraído de algas marinas. En ambos casos, el
gel forma una matriz sólida pero porosa
La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es
empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel
y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes
velocidades, hacia el cátodo si están cargadas positivamente y hacia el ánodo si están
cargadas negativamente. En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del
electrodo negativo al positivo, y esto es debido a que poseen una carga negativa. En los
fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración
es proporcional a su tamaño. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN,
dichas moléculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma complicada,
según la estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que
puedan romper los enlaces de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la
formamida, son empleados para 'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la
velocidad de migración dependa únicamente del tamaño y no de la estructura formada
tras el plegamiento.
Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al
ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para
hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio o la plata.
Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el
gel. Si el reactivo es fluorescente bajo luz UV, se puede simplemente hacer una
fotografía de la placa bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos
radiactivos se puede efectuar un autoradiograma.
Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán
separaciones paralelas. Cada separación mostrará distintas bandas correspondientes a
cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dará un
solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o más componentes.
Electroforesis en gel de moléculas de ADN - Proyecto de Fin de Cursos
Tratamiento de Imágenes por Computadora
Las bandas en diferentes separaciones paralelas están a la misma distancia del principio
significa que contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad.
Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de moléculas de tamaño
conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida,
llamada patrón, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas a las
obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamaño. La distancia a la que se
encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al
logaritmo del tamaño de la molécula.
Descripción del proyecto
En nuestro caso trabajaremos con imágenes de electroforesis realizadas a cadenas de
ADN en las que el gel utilizado es la agarosa.
Por tanto, el objetivo del proyecto es la detección de los largos de las cadenas de ADN
pertenecientes a las moléculas que fueron colocadas en cada pista y compararlas con la
muestra patrón.
A su vez, se deberá detectar en qué pista se encuentra el patrón, lo cual puede ser
utilizado como dato, y según el valor de la concentración del gel, calcular la escala de
valores del mismo.
Con dichos datos podremos estimar qué valores toman los largos detectados, siendo esta
la salida del programa.
Para comprobar el funcionamiento de nuestro programa, contaremos con los resultados
obtenidos por los investigadores del tema.
Imágenes de muestra
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Procedimiento de análisis y técnicas a utilizar
Datos de entrada al programa:
- N: Cantidad de hendiduras
- n: Ubicación de pistas activas
- p: Posición de la muestra patrón
- : Porcentaje de concentración del gel de agarosa
- Im: La imagen a analizar hacia
Condiciones de la imagen de entrada:
-
Hendiduras “hacia arriba”
Hendiduras de igual tamaño
Procedimiento de análisis:
-
-
-
Pasaje a escala de grises de la imagen original y rotación en caso necesario.
Estimación de la distancia entre hendiduras (teniendo en cuenta el ancho de
la imagen y la cantidad de hendiduras (N))
Detección de hendiduras.
- Binarización de la imagen
- “Recorte” de la imagen en la zona de ubicación de las hendiduras (aprox.)
- Cálculo de la apertura de la imagen binarizada y “recortada”.
- Detección de zonas blancas y almacenamiento en un registro adicional de
la posición (dos valores: el píxel más a la izquierda y el más a la derecha)
de dichas zonas en la imagen (teniendo en cuenta la distancia entre
hendiduras).
- Almacenamiento en un registro adicional de la posición del centro
(promedio de los valores hallados en el paso anterior) de las zonas blancas
detectadas.
“Detección” del patrón y “asignación de valores” al mismo.
- Ubicar la hendidura número p (dato de entrada).
- “Recorte” de la imagen en la zona del patrón (teniendo en cuenta la
posición de los centros de las hendiduras adyacentes).
- Ecualización adecuada de la nueva imagen.
- Umbralización del gradiente de la ecualización anterior (filtro Sobel).
- Moviéndonos verticalmente en la posición del centro de la hendidura
correspondiente, detectaremos pixeles “negros” (inicio de una franja del
patrón) y el segundo pasaje por un cambio a “blanco” (fin de la misma
franja del patrón). El valor promedio se almacenará en un registro, al
mismo tiempo que el valor correspondiente en pb (pares de bases).
“Detección” de muestras y “asignación de valores” a las mismas.
- Ubicar la hendidura número n(i) (dato de entrada).
- “Recorte” de la imagen en la zona de la muestra i (teniendo en cuenta la
posición de los centros de las hendiduras adyacentes).
- Ecualización adecuada de la nueva imagen.
- Umbralización del gradiente de la ecualización anterior (filtro Sobel).
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Tratamiento de Imágenes por Computadora
-
-
Moviéndonos verticalmente en la posición del centro de la hendidura
correspondiente, detectaremos pixeles “negros” (inicio de una franja de la
muestra i) y el segundo pasaje por un cambio a “blanco” (fin de la misma
franja de dicha muestra). El valor promedio de cada franja detectada se
almacenará en un registro, y se interpolará con los datos obtenidos de las
franjas del patrón, almacenándose el valor correspondiente en pb (pares de
bases).
Visualización de resultados.
Plan de trabajo
Día
0 – Semana del
13 al 17
1 – Martes 21
2 – Viernes 24
3 – Martes 28
4 – Viernes 01
5 – Martes 05
6 – Viernes 08
7 – Martes 12
Tarea
Planteo y organización de las tareas –
Realización del presente informe
Recorte de imágenes
Detección de hendiduras
Detección de franjas
Detección de franjas
Interpolación de datos – Página Web
Página Web – Preparación de la presentación
Presentación oral
Nota: En caso de ser necesario se incluirán más reuniones.
Bibliografía
-
Gel Electrophoresis of DNA – Libro concedido por investigadores del Clemente
Estable.
Wikipedia : "http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel"
Internet
Agradecimientos
Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable – Extracción de las imágenes
utilizadas e información sobre el tema.
En especial, a Patricia Vaz y a Uriel Koziol.