Sección Química de Alimentos y Nutrición Fecha emisión: PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE 19-08-2005 ACIDOS GRASOS SATURADOS, Revisión: 1 MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Fecha revisión: Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID) 20-10-2008 Página 1 de 6 PRT-711.02-154 1. OBJETIVO Determinar el perfil de los ácidos grasos, incluidos los isómeros de ácidos grasos trans (AGTs) en grasas y aceites de origen vegetal y animal. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método está diseñado para evaluar el perfil de ácidos grasos en aceites y grasas vegetales y animales. 3. FUNDAMENTO Los ácidos grasos metilados de las muestras son separados y cuantificados por cromatografía gaseosa con detector FID en columna capilar de fase reversa. 4. REFERENCIAS ISO 15304 ”Animal and vegetable fats and oils – Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetable fats and oils – Gas chromatographic method. 5. TERMINOLOGÍA Ácidos grasos trans: isómeros de configuración trans de todos aquellos ácidos grasos que contienen dobles enlaces. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Y EQUIPOS 6.1.1 Cromatógrafo de gases equipado con detector FID, muestreador automático, helio como gas carrier 6.1.2 Balanza de precisión 0.001 g 6.1.3 Agitador mecánico de tubos 6.1.4 Micropipeta de 1000 µL 6.1.5 Viales con tapa de 2 mL para autosampler 6.1.6 Columna capilar DB-23 fase reversa, 60 m, 0.25 mm i.d., 0.25 µm de film 6.1.7 Tubo de vidrio tapa rosca de 10 mL 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 REACTIVOS Éter de petróleo p.a. Solución de hidróxido de potasio en metanol, 2 M Estándar mezcla de 37 ésteres metílicos de ácidos grasos. Sección Química de Alimentos y Nutrición Fecha emisión: PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE 19-08-2005 ACIDOS GRASOS SATURADOS, Revisión: 1 MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Fecha revisión: Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID) 20-10-2008 Página 2 de 6 PRT-711.02-154 7. DESARROLLO 7.1 Preparación de la muestra Antes de tomar la muestra, mezclar completamente. Fundir las muestras sólidas para asegurar una buena homogeneización, a no más de 60 °C. 7.1.1 Preparación de los ésteres metílicos: Pesar entre 100 y 250 mg de muestra en un tubo de vidrio con tapa rosca. 7.1.2 Agregar 500 µL de hidróxido de potasio en metanol, 2 M. 7.1.3 Agregar 5 mL de éter de petróleo. 7.1.4 Agitar 2 min en vortex, reposar 1 hora. 7.1.5 Trasvasijar a los viales del muestreador automático. 7.1.6 Inyectar. 7.2 Condiciones cromatográficas -T° detector: 250 °C -T° inyector: 250 °C -Flujo gas carrier: 33 psi -Split: 1:100 -Volumen de inyección: 1 µL -Programa de temperatura del horno: 120 °C por 5 min, Aumentar la temperatura a razón de 10 °C/min hasta 180 °C, mantener por 30 min. Aumentar nuevamente a razón de 10 °C/min hasta 210 °C y mantener por 21 min. (total 65 min). 7.3 Expresión de resultados 7.3.1 Identificación Para la identificación de los ácidos grasos, hacer la relación respecto al tiempo de retención del ácido graso C16:0 y comparar con los obtenidos para los estándares. Usar la siguiente formula: _____tr ácido graso____ tr ácido graso C16:0 donde : tr = Tiempo de retención Sección Química de Alimentos y Nutrición 7.3.2 Fecha emisión: PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE 19-08-2005 ACIDOS GRASOS SATURADOS, Revisión: 1 MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Fecha revisión: Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID) 20-10-2008 Página 3 de 6 PRT-711.02-154 Cuantificación Para cuantificación de los ácidos grasos trans, hacer zoom en la zona de los C18, entre los 24 a 34 min. La fracción de masa relativa de cada ácido graso se calcula determinando el área corregida del peak correspondiente dividiéndola por la suma de las áreas corregidas de todos los peaks. El área corregida por Peak se calcula obteniendo el factor de respuesta FID (FX) y el factor de corrección FID (fX) para cada ácido graso (ver anexo adjunto). Se informa el porcentaje de área > 0,01 del porcentaje total corregido para cada ácido graso. Para el cálculo de la fracción de masa relativa, considerar la siguiente formula : wx = Ax * fx *100 % _ At wx = masa relativa del componente x, en porcentaje por área del Peak. Ax = área del peak correspondiente al componente x, en unidades de área. fx = factor de corrección para el componente x At =suma de las áreas corregidas para todos los peaks, excluyendo el área del solvente, en unidades de área. (para el cálculo del factor de corrección y factor de respuesta de FID ver Anexo N° 1). Cálculo de AGTs en aceites y grasas refinadas : Calcular los isómeros trans como la suma de las fracciones de masa relativa de los esteres metílicos de C18:1 trans, C18:2 trans y C18:3 trans, El máximo de peaks posibles de encontrar son C18:1 trans (1 peak), C18:2 trans (2 peak) y C18:3 trans (4 peak). Se expresa con 2 decimales. Cálculo de AGTs en Aceites y grasas parcialmente hidrogenadas: Calcular los isómeros trans como la suma de todas las fracciones de masa relativa de todos los esteres metílicos de los ácidos grasos que contienen dobles enlaces con configuración trans, relativo a la suma de los ésteres metílicos de todos los ácidos grasos. Se expresan con 2 decimales. Sección Química de Alimentos y Nutrición Fecha emisión: PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE 19-08-2005 ACIDOS GRASOS SATURADOS, Revisión: 1 MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Fecha revisión: Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID) 20-10-2008 Página 4 de 6 PRT-711.02-154 ANEXO N° 1 Cálculo de fracción de masa relativa de cada componente para la determinación de ácidos grasos saturados, monoinsaturados, poliinsaturados y ácidos grasos trans La fracción de masa relativa de cada componente se calcula a partir de la determinación del área corregida del peak relativo correspondiente, considerando la suma total de las áreas corregidas de todos los peaks. La corrección es necesaria para compensar la respuesta del FID para cada componente. Para eso, es necesario calcular el factor de respuesta de FID y el factor de corrección de FID. Cálculo del factor de respuesta del FID Calcular el factor de respuesta para cada componente según la ecuación: Donde: Fx =_ Mx___ (nx-1)Ac Fx = Factor de respuesta para el componente x Mx = masa molecular relativa del componente x nx = número de átomos de carbono del ácido graso metilado del componente x Ac = masa atómica relativa del carbono (12,01) Cálculo de factor de corrección FID Calcular el factor de corrección FID para cada componente según la ecuación: Donde: fx= _Fx_ Fr fx = es el factor de corrección para el componente x Fx = Factor de respuesta para el componente x Fr = es el factor de respuesta para el C16:0 (Fr = 1,407) Sección Química de Alimentos y Nutrición Fecha emisión: PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE 19-08-2005 ACIDOS GRASOS SATURADOS, Revisión: 1 MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Fecha revisión: Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID) 20-10-2008 Página 5 de 6 PRT-711.02-154 El factor de respuesta de FID para C16:0 (Fr = 1,407) es considerado como referencia (fx = 1,00). Todos los otros factores corregidos FID usados en los calculos son relativos a ese valor . Por ejemplo, el factor de corrección para C10:0 es 1,10. Cálculo de la fracción de masa relativa wx = Ax * fx *100 % _ At wx = masa relativa del componente x, en porcentaje por área del Peak. Ax = área del peak correspondiente al componente x, en unidades de área. fx = factor de corrección para el componente x At =suma de las áreas corregidas para todos los peaks, excluyendo el área del solvente, en unidades de área Tabla Resumen. Factores de Respuesta FID y Factores de Corrección FID Masa Molecular (Mx) C4:0 C6:0 C8:0 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C14:1 C15:0 C15:1 C16:0 C16:1 C17:0 C17:1 102,13 130,18 158,23 186,28 200,30 214,33 228,35 242,38 240,36 256,40 254,39 270,42 268,41 284,45 282,44 Número de átomos de carbono del ácido graso metilado (nx-1) 4 6 8 10 11 12 13 14 14 15 15 16 16 17 17 Factor de Respuesta FID (Fx) Factor de Correccion FID (fx) 2,13 1,81 1,65 1,55 1,52 1,49 1,46 1,44 1,43 1,42 1,41 1,41 1,40 1,39 1,38 1,51 1,28 1,17 1,10 1,08 1,06 1,04 1,02 1,02 1,01 1,00 1,00 0,99 0,99 0,98 Sección Química de Alimentos y Nutrición C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C18:4 C20:0 C20:1 C20:2 C20:3 C20:4 C21:0 C20:5 C22:0 C22:1 C22:2 C22:5 C22:6 C23:0 C24:0 C24:1 Fecha emisión: PROCEDIMIENTO DETERMINACIÓN DE 19-08-2005 ACIDOS GRASOS SATURADOS, Revisión: 1 MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Fecha revisión: Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID) 20-10-2008 Página 6 de 6 PRT-711.02-154 298,47 296,46 294,45 292,43 290,42 326,52 324,51 322,50 320,48 318,47 340,55 316,45 354,57 352,56 350,55 344,50 342,49 368,60 382,62 380,61 18 18 18 18 18 20 20 20 20 20 21 20 22 22 22 22 22 23 24 24 1,38 1,37 1,36 1,35 1,34 1,36 1,35 1,34 1,33 1,33 1,35 1,32 1,34 1,33 1,33 1,30 1,30 1,33 1,33 1,32 0,98 0,97 0,97 0,96 0,95 0,97 0,96 0,95 0,95 0,94 0,96 0,94 0,95 0,95 0,94 0,93 0,92 0,95 0,94 0,94