construcción de un vector bicistron

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA
FACULTAD DE BIOCIENCIAS
MÁSTER EN GENÉTICA AVANZADA
“CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR BICISTRONICO PARA LA
EVALUACIÓN DE ELEMENTOS IRES EN CÉLULAS
EUCARIOTAS”
2011 – 2012
JUAN PABLO FALCONI ESPINEL
1 LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA
HOSPITAL VALL D’HEBRON
Certifico que el trabajo para disertación de Máster en Genética Avanzada del candidato
Juan Pablo Falconi Espinel ha sido concluido de conformidad con las normas establecidas;
por lo tanto, puede ser presentado para la calificación correspondiente.
Dr. Trond Aasen
Director
Barcelona, 11 de Julio 2012
2 Contenido 1 RESUMEN ................................................................................................................................... 5 2 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 7 2.1 Vectores de expresión bicistrónicos ....................................................................................... 7 2.2 Mecanismos que actúan en la traducción ............................................................................... 8 2.3 Componentes estructurales del ARN mensajero (mARN) ..................................................... 8 2.4 Inicio de la traducción cap dependiente ................................................................................. 8 2.5 Inicio de la traducción IRES dependiente ............................................................................ 10 2.6 Características de los IRES .................................................................................................. 10 3 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 15 3.1 Objetivos generales .............................................................................................................. 15 3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................ 15 4 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 16 4.1 Diseño y construcción del Vector pMF ................................................................................ 16 4.2 Construcción del vector pMFR ............................................................................................ 16 4.2.1 Desarrollo de la expresión del vector bicistrónico pMFR ............................................. 16 4.3 Extracción y purificación de ADN plasmídico mediante Kits de minipreps y midipreps .... 17 4.4 Digestión con enzimas de restricción ................................................................................... 18 4.5 Desfosforilación del vector .................................................................................................. 18 4.6 Ligación de fragmentos obtenidos para la construcción del vector pMFR ........................... 18 4.7 Preparación de medios de cultivos agar Luria Bertani (LB) ................................................. 19 4.7.1 Preparación de medio de cultivo líquido Luria Bertani (LB) ........................................ 19 4.8 Transformación en Escherichia coli αDH5 .......................................................................... 20 4.9 Mutagénesis .......................................................................................................................... 20 4.10 Cultivo celular y transfección ............................................................................................... 21 4.10.1 Visualización de las células transfectadas ................................................................... 21 4.11 Lisado de las células para análisis de Western – blot ........................................................... 22 4.11.1 Concentración de Proteína .......................................................................................... 22 4.12 Western – Blot Gel de Poliacrilamida SDS-PAGE .............................................................. 23 4.12.1 Transferencia de Bandas del gel a la membrana de nitrocelulosa ............................... 23 4.12.2 Lavados de la membrana de transferencia .................................................................. 23 3 4.12.3 Relevado de la membrana de transferencia ................................................................. 24 5 RESULTADOS .......................................................................................................................... 25 5.1 Construcción del vector de expresión bicistrónico multi-fluorescente (pMF) ...................... 25 5.1.1 Clonación de dos proteínas fluorescentes mCherry y EGPF ......................................... 25 5.1.2 Introducción de His-tag (diana) en el vector pCH-G (CherryHis-EGFP) ..................... 25 5.2 Inserción de un Myg-tag en la secuencia de mCherry para distinguirlo de EGFP ............... 26 5.3 Mutagénesis .......................................................................................................................... 27 5.3.1 Mutación del primer codón de inicio (ATG) de mCherry ............................................. 27 5.3.2 Mutación del segundo codón de inicio en la secuencia Cherry ..................................... 29 5.3.3 Inserción de la secuencia IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) en el
constructo pMCH-GH2mut (pMyc-2mutCherryHis-tag-EGFPHis-tag). .................................. 31 5.4 Inserción de estructuras secundarias (horquilla) para detener defectos en el escaneo
ribosomal .............................................................................................................................. 32 5.4.1 Inserción de una horquilla después de mCherry para reducir la traducción no específica
de GFP debido a los defectos en el barrido del ribosoma .......................................................... 32 5.4.2 Inserción de una horquilla frente a la secuencia mCherry para reducir los altos niveles
de traducción cap-dependiente de mCherry .............................................................................. 33 6 DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 38 7 CONCLUSIONES Y FUTURO ................................................................................................. 41 8 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................ 43 4 1
RESUMEN
Desde el momento en que se identificaron los elementos IRES tanto de virus como en
mARNs celulares, se han empleado vectores bicistrónicos para poder analizar y
comprender mejor los mecanismos de iniciación de la traducción de proteínas tanto capdependientes como cap-independientes o IRES dependiente. La estrategia prevalente ha
sido la de utilizar la combinación de dos proteínas luminiscentes (renilla y luciferasa) para
medir la traducción cap-dependiente versus la independiente con la ayuda de un
luminómetro. El uso de vectores bicistrónicos que expresan proteínas fluorescentes permite
una mejor visualización a través tanto de miscrocopia como cuantificación por fluorímetro.
En el laboratorio de Anatomía patológica (grupo de patología molecular, VHIR) ha estado
probando la combinación del reportero rojo fluorescente Cherry y la proteína verde
fluorescente EGFP, una combinación fácil de visualizar por separado por la mayoría de
lectores fluorescentes incluyendo los microscopios estándares de fluorescencia. En este
proyecto, se ha avanzado en mejorar este vector, al que hemos denominado pMFR, que
contiene varias modificaciones con el fin de resolver varias limitaciones: poder detectar la
expresión de las proteínas por Western Blot y reducir la traducción residual de la proteína
EGFP, no mediada por la activación del correspondiente IRES.
Primeramente, para poder detectar la expresión tanto de la proteína Cherry como de
EGFP por Western Blot, se clonaron unas secuencias His-Tag (6 aminoácido Histidina) a cterminal de ambas proteínas. De esta forma, un anticuerpo anti-His marcado con HRP es
útil para detectar y comprara la expresión de ambas proteínas en una misma membrana. A
parte, se introdujo una secuencia tag Myc-tag en el N-terminal de Cherry, permitiendo la
separación mejor en el tamaño entre Cherry y EGFP por Western blot. Además, para Myctag hay anticuerpos específicos, los cuales permiten la detección de la proteína Cherry por
si fuera necesario. También
hay disponibles
excelentes anticuerpos específicos para
EGFP.
En segundo lugar, debido al escaneo defectuoso ribosomal, varias proteínas Cherry se
estaban traduciendo (adicionalmente de Myc-Cherry). Este problema fue resuelto
5 cambiando el codón de inicio original ATG de Cherry por mutagénesis dirigida. Sin
embargo otra proteína de Cherry sin Myc, de menor peso, estaba siendo detectada, por lo
que se procedió a mutar el segundo codón de iniciación putativo ATG de Cherry. La
eliminación correcta de los dos codones ATG impidió que siga la traducción de las
proteínas Cherry sin Myc-tag, evitando así expresión errónea de la proteína myc-Cherry.
También, con el fin de reducir la fuerte traducción de Cherry mediada por la vía capdependiente, y de prevenir cualquier defecto en el escaneo ribosomal que produciría falsa
expresión de EGFP, se decidió insertar dos horquillas cortas de RNA antes y después de la
secuancia myc-cherry. Así se consiguió reducir la fuerte traducción cap-dependiente de
Cherry producido por el optimo región 5’UTR, al codón de inicio ATG, como también al
fuerte promotor CMV.
La inserción de un elemento IRES del virus EMCV en el vector pMFR, permitió
comprobar cómo estaba funcionando el nuevo plásmido en cuanto a la traducción del EGFP
con la presencia y ausencia de este IRES conocido.
Finalmente, el diseño del vector en sí fue realizado de tal manera que tenga varios sitios de
restricción entre las secuencias Cherry y EGFP para así poder clonar diferentes secuencias
IRES de interés por ligación directa en el vector. Para ello se utilizó el sitio de clonaje
múltiple del vector comercial pEGFP. La conservación de un único sitio de restricción de
la enzima Bgl II en frente Cherry y otro sitio de restricción NotI a 3’ UTR de EGFP nos
facilitan la clonación directa de cualquier fragmento de Cherry-Ires-EGFP dentro de un
vector retroviral (pLPCX).
En resumen, estos cambios en el vector pMFR nos permitirán estudiar de forma más
precisa la activación de la traducción cap-independiente mediada por las diferentes
secuencias IRES de mRNAs celulares de nuestro interés.
6 2
INTRODUCCIÓN
2.1 Vectores de expresión bicistrónicos
Con el descubrimiento de las proteínas fluorescentes y el uso de las mismas como
proteínas reporteras puestas bajo el control de un mismo promotor ha permitido el
monitoreo de la expresión de otras secuencias distintas por medio de microscopia
fluorescente (Martin, et al., 2006). Esto ha provocado un gran interés en la biología
molecular para desarrollar nuevas herramientas para permitir entender la interacción RNAproteínas y sus efectos en procesos biológicos como localización, transporte, traducción,
etc., (Nie y Htun, 2006). En años recientes, el uso de expresión de vectores bicistrónicos en
el cual el primer gen es traducido de manera cap-dependiente y el segundo de forma IRESdependiente han sido aplicados en varios experimentos de cultivos celulares y para
animales transgénicos (Mountford y Smith, 1995). El uso de vectores de expresión
bicistrónicos ha mejorado la eficiencia de la selección durante la transgénesis asegurando
alrededor del 90% de las células expresen el marcador detectable con el gen de interés,
como una selección positiva indicando la eficiente transcripción y la traducción IRES
dependiente del segundo cistrón que no ha interferido por la iniciación de la traducción capdependiente del primer cistrón (Wagstaff, et al, 1998). En algunos casos la expresión
conducida por IRES se ha visto que ha sido disminuida en relación a la expresión de capdependiente del mismo reportero en una versión monocistrónica del mismo vector pero
todavía podía ser detectado con facilidad porque mantenía la expresión necesaria para
seleccionar eficazmente células transformadas. La presencia de un IRES en un vector de
expresión confiere una selectiva traducción no solo bajo condiciones normales para la
iniciación cap-dependiente si no también cuando este mecanismo ha sido cerrado; también
se ha visto que la traducción de un mARN por vía IRES-dependiente ocurre bajo
condiciones de estrés como infecciones virales, hipoxia o cuando la iniciación por la vía
cap-dependiente ha sido comprometido por tener cantidades muy bajas de los factores
funcionales de inicio eucarióticos como: eIF4F, eIF4G, eIF4A, eIF2 , eIF3 PTB, PCBP,
hnRNP-C. hnRNP-L, PABP (proteínas de unión a la poli-A) (Wagstaff, et al, 1998).
7 2.2 Mecanismos que actúan en la traducción
La traducción es el mecanismo mediante el cual un ARN mensajero (mARN) maduro
es traducido en proteínas; este consta de tres fases: a) inicio de la traducción, en la que el
ribosoma reconoce y se une al mARN; b) etapa de elongación de la cadena polipeptídica,
durante la cual la secuencia de ARN, es reconocida por los ribosomas y es traducida, por
cada tres nucleótidos de la cadena se forma un aminoácido específico que será integrado en
la cadena polipeptídica y c) terminación, etapa en la que el ribosoma se libera del mARN
tras haberse formado una proteína (Gutiérrez, 2006). 2.3 Componentes estructurales del ARN mensajero (mARN)
En los eucariotas, la mayor parte de mARNs son monocistrónicos, es decir que cada
mARN codifica una sola proteína. Este mARN, estructuralmente, está formado por un
extremo 5’-terminal, una guanina metilada trifosfato o estructura cap (caperuza) que es el
sitio de unión del ribosoma. La región del ARN que se encuentra entre el cap y el codón de
inicio, AUG, se denomina región no traducida UTR (por las siglas en ingles, Untraslated
Region) 5’, que por su composición nucleotídica, longitud, y estructura determina la
eficiencia con la cual se traduce cada mARN. El codón AUG señala el inicio del marco de
lectura abierta ORF (Open Reading Frame), que contiene la secuencia completa de la
proteína que codifica. Por otro lado, el codón de paro (UAA, UAG, o UGA) señala la
terminación del proceso. Después se encuentra la región no traducida, 3’UTR seguida de
una secuencia repetida de adeninas, conocida como cola de poli-A, que son residuos
añadidos por la polimerasa (A) (Hershey, 2000).
2.4 Inicio de la traducción cap dependiente
Los mARNs eucariotas poseen en el extremo 5’ la estructura cap, sitio en el cual se une
el complejo eIF4F, el mismo que a su vez se encuentra formado por tres factores: el eIF4E,
el cual interactúa directamente con el cap, el eIF4A, que tiene una función helicasa
dependiente de ATP, implicada en el desenrrollamiento de las estructuras secundarias del
mARN, y el eIF4G que se une al eIF4E y al eIF4A y funciona como una plataforma que
permite la interacción con el complejo de pre-iniciación, constituido a su vez por el
complejo ternario (eIF2-GTP-Met-tRNA), la subunidad ribosomal 40S y el eIF3. Este
8 último es el responsable de la interacción directa entre el complejo de pre-iniciación y el
eIF4G. Una vez que esto sucede, otros factores como el eIF1A operan sinérgicamente para
permitir el avance del complejo de pre-iniciación en dirección 5’à3’ desde el sitio de
unión inicial hasta el codón de inicio de la traducción; este movimiento requiere de la
hidrólisis de ATP. Los eIF1A, eIF2-GTP y el eIF5 participan en el reconocimiento del
codón de inicio, favoreciendo su apareamiento con el anticodón presente en el Met-tARN.
Posteriormente, el eIF5 induce la hidrólisis de GTP unido al IF2 (primera hidrólisis de
GTP), dando como resultado la formación de un eIF2 unido a GDP, inactivo hasta que es
reciclado en la forma activa eIF2-GTP mediante la actividad de el eIF2B, un factor de
intercambio de guaninas. Finalmente, por la hidrólisis de GTP unido al eIF2 y con la
participación eIF5 se regula la liberación de los factores del complejo de pre-iniciación.
Posteriormente la unión de la subunidad 60S con la 40S se cataliza mediante la hidrólisis de
otro GTP (segunda hidrólisis de GTP) unido al eIF5B. Esta serie de eventos trae como
consecuencia la formación del complejo de inicio de la traducción 80S para permitir la
síntesis de proteínas como se indica la figura 1 (Lee et al, 2002).
Figura 1. Representación de la traducción cap-dependiente.
En eucariontes, la traducción cap-dependiente se realiza en cuatro pasos. 1) Iniciación, el
mRNA se une al complejo de factores eIF4F (eIF4E, eIF4G, eIF4A) por la interacción
CAP-eIF4E. El complejo 43S (eIF2, tRNAMet, GTP, 40S, eIF3, eIF1A) se une al
9 mensajero mediante la interacción entre eIF4G y eIF3 y forman el complejo de inicio 48S.
Este complejo recorre el mRNA hasta encontrar el codón de inicio AUG, y entonces, se
une la subunidad ribosomal 60S y se liberan los factores de inicio. 2) Elongación,
comienza con la formación de la cadena polipeptídica, eIF1A lleva los tARNs al ribosoma,
mientras que eIF2 promueve la traslocación. Al encontrarse un codón de paro, eIF1 se une
al ribosoma y estimula la hidrólisis de la cadena peptídica. La posterior unión de eIF3 e
hidrólisis de GTP permiten el desensamble del ribosoma, tARN y factores. En el
reciclamiento eIF3 promueve la disociación del complejo post-terminación, permitiendo la
futura unión de la subunidad 40S con los factores de inicio para que pueda comenzar otra
vuelta de traducción (Tomado de Martínez, 2010).
2.5 Inicio de la traducción IRES dependiente
Las secuencias IRES no sólo han sido identificadas en algunos genomas virales de
ARN de cadena positiva, sino también en las regiones 5’UTR de un gran número de
mARNs celulares, por lo que tienen importancia en la traducción, con funciones críticas en
la regulación de muchos procesos celulares (Gutiérrez, 2006).
En virus como el de la polio (PV) y en el virus de la encefalomiocarditis (EMCV) se
describió la existencia de las secuencias IRES que son necesarias para el mecanismo de la
traducción alternativa, en las que el ribosoma interactúa con el ARN sin la participación de
la estructura cap (Pelletier, 1988). Esta región funciona de manera análoga al cap,
permitiendo que el ribosoma sea reclutado para la síntesis de proteínas. Pero a diferencia
del cap, las secuencies IRES permiten la unión del ribosoma en una secuencia interna del
mARN, localizado comúnmente en la región 5’UTR y en ciertas ocasiones dentro de los
primeros nucleótidos dentro de la región codificante y no en el extremo 5’-terminal (Kozak,
1989).
2.6 Características de los IRES
Los elementos IRES presentes en mARNs celulares presentan estructuras secundarias y
terciarias, conocidas como tallo y burbuja, respectivamente, las mismas que son secuencias
ricas de G-C y se encuentran localizadas en las regiones 5’-UTRs que se caracterizan por
10 tener varios tripletes AUG, no conservados, en ARNs en familias relacionadas (Macewjak,
1991).
Estos elementos presentan una secuencia con alrededor de 450 nucleótidos, formado
por varios dominios. El dominio 5 es el que interacciona directamente con el ribosoma, en
el proceso de traducción. El dominio 3, tiene una forma particular como un trébol, y está
involucrado en funciones como la de infección en los virus. El dominio C (rico en
secuencias de citosina) interacciona con la PCBP (unión de proteína poli C), que funciona
como activador de la infección en virus; los dominios RAAA y GNRA son dominios ricos
en purinas (A-G) que forman estructuras terciarias muy conservadas. En la mayoría de
elementos IRES, esta región esta interactuando con el ribosoma, el motivo A es esencial
para mantener esta estructura terciaria, figura 2 (Gálvez, 2012; Salas, 2008).
Figura 2. Estructura de los
elementos IRES.
La figura muestra las regiones que
están integrando las secuencias
IRES. Existen secuencias con
mayor
número
de
C-G
complementarias,
y
no
complementarias,
formando
horquillas, dominios 2 y 4. El
dominio 5 es el involucrado en el
acercamiento al ribosoma en el
proceso de traducción. El dominio
3 presenta una forma característica
de hoja de trébol (Gálvez, 2012;
Salas, 2008). Debido a la confirmación de esta estructura, puede resultar un impedimento para el
barrido del ribosoma, ya que en la traducción IRES dependiente el ribosoma debe ser
reclutado en la región adyacente al codón de inicio. También se ha observado que pequeñas
mutaciones puntuales o la eliminación de algunos nucleótidos en secuencias que forman
tanto los tallos como las estructuras burbuja, pueden ocasionar una disminución o incluso la
inhibición de la capacidad de la traducción del mARN, a pesar de esto, en determinadas
11 ocasiones, las mutaciones que se presentan en estas secuencias IRES, pueden revertirse o
generar mutaciones compensatorias que ayudan para la restauración de las estructuras
secundarias y de su función (Trono, 1988).
Los elementos IRES por lo general se encuentran en mARNs celulares que codifican
proteínas relacionadas con la expresión génica durante el desarrollo, la diferenciación, la
progresión del ciclo celular, el crecimiento celular, la apoptosis, la angiogénesis y el estrés.
Bajo estas situaciones la traducción cap es usualmente reprimida. A diferencia de los
mRNAs virales, los mRNAS celulares poseen la estructura cap, de tal manera que pueden
traducirse mediante ambos mecanismos y producir una proteína idéntica (Jopling, 2004).
Además, el funcionamiento de los elementos IRES en vectores de expresión permite
una traducción selectiva, no sólo bajo condiciones normales para la iniciación del capdependiente sino también cuando este mecanismo ha sido cerrado. Cuando los IRES
celulares se encuentran dentro de regiones codificantes del mARN, se producen dos
proteínas diferentes, una mediante el mecanismo de la traducción cap dependiente y la otra
a través del IRES dependiente. En ciertas ocasiones la traducción de los mARNs celulares
puede ser mas compleja, produciendo isoformas distintas de una misma proteína (Johanes,
1998).
Para que un IRES sea funcional, se requiere que interactúe con proteínas celulares
específicas, las cuales están involucradas activamente en favorecer la unión del ribosoma y
en el inicio de la síntesis de proteínas. Se piensa que estas proteínas están involucradas en
el cambio de conformación de las estructuras de tallo y burbuja presentes en los mARNs.
En los últimos años se ha visto que los eIF3 tienen un rol esencial tanto en la traducción del
cap dependiente como en la traducción IRES dependiente virales; por ejemplo, los factores
eIF4G, eIF4A, eIF2 y eIF3 son indispensables para la formación del complejo que participa
en la traducción IRES dependiente del EMVC y del virus de la fiebre aftosa (FMDV)
(Komar, 2005).
Por otro lado, han sido descritas las proteínas conocidas como factores trans-activadores
(ITAFS, IRES trans acting factors) para regular la traducción IRES dependiente tanto en el
mARN de virus como en los mARN celulares (Martínez, 2001; Stonley, 2004). De estas
12 proteínas se han identificado: PTB, PCBP, hnRNP-C. hnRNP-L, nucleolína, unr, etc., que
en la mayoría de los casos tienen localización nuclear. Sin embargo se ha llegado a conocer
que tras la infección viral, algunos ITAFs, como por ejemplo PTB y la nucleolína, son
relocalizados del núcleo al citoplasma mediante diferentes estrategias, lo que asegura su
presencia en el sitio donde la traducción IRES dependiente se lleva a cabo. Los ITAFs
pueden actuar de diferentes maneras: aumentando o disminuyendo la traducción de los
mRNAs virales o celulares, como chaperonas (Domitrovich, 2005), favoreciendo diferentes
conformaciones en los IRES que permiten el acoplamiento del complejo ribosomal y el
inicio de la síntesis de proteínas, o participar en el reconocimiento del codón de inicio
correcto AUG (Sarnow, 2003).
A medida que se conoce nuevos elementos IRES, se conocen mas factores que
participan en este mecanismo alternativo de la traducción. Los IRES presentan una gran
diversidad en relación a su secuencia, tamaño, estructura primaria, secundaria y terciaria
(tallo y burbuja). Si a esto sumamos la gran variedad de proteínas que interactúan con ellos,
se podría sugerir que aparecieron en diferentes puntos de la evolución, se cree que la
selección de los IRES, depende de su habilidad para interaccionar con factores esenciales
en el reclutamiento de las unidades ribosomales (Sarnow, 2003).
Los mARNs celulares con IRES, típicamente, son activados cuando la célula se
encuentra en estados de estrés, como algunas infecciones virales, la falta de factores de
crecimiento, nutrientes, choque térmico, radiación UV, hipoxia, o durante la mitosis y la
diferenciación celular. En estas circunstancias, la síntesis proteica se inhibe, como resultado
en los cambios a nivel de los componentes en la maquinaria traduccional, como
fosforilación y proteólisis de eIFs. Es decir, la traducción IRES dependiente en los mARNs
celulares puede considerarse como un mecanismo de protección que representa una
maquinaria a prueba de fallas que ayuda a la síntesis de proteínas cuando las células se
encuentran en un estrés transitorio hasta la recuperación. Pero en condiciones de estrés
severas, los IRES que se activan son los que están relacionados a los mARNs que codifican
proteínas que regulan las vías de apoptosis. Es por esto que los IRES pueden constituir una
pieza clave en la sobrevivencia como en la muerte celular programada, lo que pone de
manifiesto la importancia de esta vía alterna de síntesis de proteínas, lo cual podría sugerir
13 que la traducción IRES dependiente actúa como un elemento catalítico adicional para la
síntesis de proteínas en condiciones adversas (Komar, 2005).
Muchos de los mARNs celulares que poseen IRES, codifican proteínas cuya expresión
está finamente regulada, de tal manera que cambios específicos pueden generar cambios a
nivel de su expresión, produciendo efectos fisiológicos y consecuencias patológicas
dramáticas como: en procesos implicados en desórdenes degenerativos o en neoplasias. Es
por ello que, el conocimiento de las estrategias que controlan la actividad de los IRES
puede permitir su uso con fines terapéuticos (Stonley, 2004).
14 3
3.1
OBJETIVOS
Objetivos generales
− Construir un vector bicistrónico con doble fluorescencia para permitir la detección
de la traducción cap-dependiente vs IRES-dependiente
3.2 Objetivos específicos
− Generar un vector que tenga un sitio múltiple de clonaje (MCS) para insertar
cualquier secuencia IRES y pueda ser reconocido mediante la expresión del gen
reportero EGFP a través de la vía de traducción alternativa IRES-dependiente vs. la
expresión de mCherry para detectar la vía de traducción cap-dependiente.
− Uso de EGFP y mCherry conteniendo His-tag para permitir detecciones simultaneas
de las dos proteínas por Western blot.
−
Insertar un 3XMyc-tag en la parte N-terminal de Cherry para la eficaz separación
por tamaño de las proteínas Cherry y EGFP en Western blot y para detectar la
Cherry usando específicamente anticuerpos anti-Myc.
− Eliminar
el
codón original de inicio ATG de Cherry para evitar el escaneo
ribosomal defectuoso que podría producir una proteína Cherry carente de Myc-tag
− Transfección de células HEK-293 para poder detectar la expresión de Cherry (capdependiente) y la expresión de EGFP (cap-independiente o IRES-dependiente)
mediante:
a) Microscopía de fluorescencia
b) Western blot
15 4
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Diseño y construcción del Vector pMF
Para la construcción del vector bicistrónico pMF se utilizó el programa de
bioinformática Serial Cloner 2-5, el mismo que sirvió para los análisis de las
modificaciones, que se realizaban en las secuencias y al mismo tiempo permitió comprobar,
previamente, los fragmentos de restricción esperados en cada tratamiento.
4.2 Construcción del vector pMFR
4.2.1 Desarrollo de la expresión del vector bicistrónico pMFR A partir de los vectores pEGFP-N2 y pCHERRY se removieron los fragmentos las
proteínas: verde EGFP (alrededor de 27 kDa) y roja mCherry (28.8 kDa) con las enzimas
de restricción BamHI y NotI. Posteriormente, 6XHis-tag han sido añadidos para el extremo
C-terminal de las dos proteínas Cherry y EGFP por miembros del laboratorio SRC.
Otro fragmento3X-Myc, del vector pYIC, fueron insertados en el 5’UTR de Cherry.
La región mcherry del vector, fue obtenida mediante una amplificación por PCR. El oligo
forward utilizado en la reacción de amplificación fue 5’–CCGGACTCAGATCTCGAGCT
C–3’, e incluía el sitio de restricción para la endonucleasa BglII. El oligo reverse presentaba
el sitio de restricción para la enzima SpeI y la secuencia fue 5’–CCGACTAGTCGCGCAA
GATCCTCCTCGGAT–3’; de este modo se produjo el vector pMCHGH por el MycCherry-His-tag-EGFP-His-tag.
A continuación, se removió el fragmento IRES-GFP del vector pMCHiGH,( MycCherry-His-tag-IRES del EMCV-EGFP-His-tag) dando como resultado el vector pMCH,(
Myc-Cherry-His-tag) mediante la reacción de digestión con las enzimas BamHI y NotI.
Luego, se clonó mediante PCR el fragmento GFP utilizando los oligos Fw: 5’-CCGGGAT
CCATGGCCACAACCATGGTGAGC-3’, que presentaba el sitio de restricción para la
enzima BamHI y Rv: 5’-AGAGTCGCGGCCGCTTTAGTG-3’, que tenía el sitio de
restricción para NotI. Al realizar la ligación de pMCH (Myc-Cherry-His-tag) e insertando
16 el fragmento obtenido mediante amplificación, se creó el vector pMCHGH (Myc-CherryHis-tag-EGFP-His-tag).
Posteriormente, se realizó un proceso de mutagénesis dirigida en el primer codón de
inicio, ATG, de la secuencia de cherry, provocando el cambio de una timina por una
adenina en el sitio de inicio de traducción. Los oligos utilizados fueron FwCherryMut: 5’GCGACTAGTCGCCACCAAGGTGAGCAAGGGCGAG-3’; y el reverse RvCherrySalI:
5’- GGTACCGTCGACTGCAGAAT- 3’. Además se realizó una segunda mutagénesis
dirigida en el segundo codón de inicio ATG de cherry. El procedimiento de mutagénesis se
realizó siguiendo el protocolo de QuickChance Site-Directed Mutagenesis (Stratagene®).
Los oligos utilizados para la mutación del segundo codón de inicio fueron forward
FwCherryM2Kmut: 5’-CGAGGAGGATAACAAGGCCATCATCAAGG-3’ y el reverse
RevCherryM2Kmut:
5’-CCTTGATGATGGCCTTGTTATCCTCCTCG-3’,
lo
cual
permitió la obtención de un vector que posee dos mutaciones (pMCHGH2MUT).
Entonces, el vector pMCHGH2MUT fue tratado con la enzima de digestión EcoRI
para introducir un loop que evitaría la expresión de GFP. El loop fue desarrollado mediante
PCR para lo cual se utilizó los oligos forward EcoRISteamLoopFw: 5’ – AATTCAAAAG
GCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTCGCCTAAAG -3’ y reverse
EcoRISteamLoopRev: 5’- AATTCTTTAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTC
GCGACCTCGCCTTTTG -3’; obteniendo así el vector pMCHloopGH2MUT.
4.3 Extracción y purificación de ADN plasmídico mediante Kits de minipreps
y midipreps
La extracción de ADN se realizó utilizando el Kit Wizard Plus, SVMinipreps DNA
Purification de Promega y se siguió el protocolo del kit, (System Technical Bulletin
www.promega.com página 5-6). Mientras que, para la extracción de ADN midiprep se
siguió el protocolo del kit Pure HiPure Plasmid DNA Purification Kits de Invitrogen por
Life technologies (manuals and protocols, www.invitrogen.com/search/support).
La cuantificación del ADN obtenido mediante la extracción de mini o midpreps se
realizó espectrofotometría Thermo scientific NanoDrop 2000.
17 Las purificaciones, tanto de bandas obtenidas a partir del corte de los geles de agarosa o
de los productos de PCR, fueron realizadas siguiendo el protocolo del kit Wizard SV Gel
and PCR clean up System de Promega®. La dilución de la agarosa (para la purificación del
ADN) se llevo acabó en una incubadora shaker thermo scientific confort marca Eppendorf
de 1,5 ml a una temperatura de 65°C. Todos los procesos de centrifugación se realizaron
usando una microcentrifuga de marca Eppendorf 5415R, refrigerada (minipreps) y una
multicentrifuga de alta velocidad refrigerada y ventilada Thermo scientific multifuge X3R,
con velocidad mínima de 300rpm y con una velocidad máxima de 15.200 rpm, con un rotor
de F15-8X50 (midipreps).
Las imágenes de los geles de agarosa fueron foto documentadas en un equipo de Imagen
molecular BioRad gel DOCTM XR y analizados con el software LAbTM.
4.4 Digestión con enzimas de restricción
Todas las reacciones de digestión con endonucleasas de restricción de llevaron a cabo
bajo las mismas condiciones: Buffer 1X 3 µl; enzima de restricción 1,5 µl (1ng); muestra
DNA (1ng/µl); H2O hasta 30µl. La incubación se realizó durante una hora a 37°C y las
enzimas utilizadas fueron fast-digest de Fermentas®. 4.5 Desfosforilación del vector
Para la defosforilación se siguió el protocolo de ADN extremo 5’-terminal, ya
estandarizado en el Laboratorio de Investigación de Anatomía Patológica del Hospital Vall
d’Hebron. Las condiciones y reactivos de la defosforilación fueron: ADN linear (3kb
plásmido) 1µg (1pmol termini); Buffer AP 10X 2µl; Fosfatasa Alkalina Termostable 1µ
(1U); H2O libre de nucleasa hasta 20 µl. La incubación se realizó a 37°C por 10 minutos.
Se detuvo la reacción incubando las muestras durante 5 minutos a 75°C
4.6 Ligación de fragmentos obtenidos para la construcción del vector pMFR
Para todas las reacciones de ligación de las del vector bicistrónico se utilizaron las
condiciones de la enzima ligasa T4 de Fermentas® life science: T4 ligasa Buffer10X 2µl;
T4 ADN ligasa 0,5µl; vector linear ADN 20-100 ng/µl; inserto ADN 1:1 a 3:1en
18 proporción al vector; H2O libre de nucleasas, hasta 20 µl. Para calcular la concentración del
inserto en la reacción de la ligación se utilizó la siguiente formula:
ng
vector * longitud . pares.de.bases.(bp ).del.inserto
µl
longitud .inserto.en. pares.de.bases.(bp )
concentración
Se trabajó en una proporción 1:1 de inserto:vector. Además se realizó una ligación
adicional en la que el vector se encontraba en una concentración de 3 veces mayor que el
inserto. Estas dos proporciones nos permitieron identificar que concentración fue la más
adecuada para continuar con el proceso. Las reacciones fueron incubadas 22°C durante 1
hora.
4.7 Preparación de medios de cultivos agar Luria Bertani (LB)
Para la preparación del medio de cultivo se disolvió 35gr de Luria Bertani (LB) agar en
1 litro de H2O destilada. El H2O se añadió poco a poco mientras el medio se homogenizaba.
Posteriormente, se autoclavó y se dejó enfriar, se añadió el antibiótico respectivo
(ampicilina o kanamicina) de acuerdo a las concentraciones; kanamicina: 1:200ml y
ampicilina: 1: 1000ml. Se repartió aproximadamente 20 ml de medio en cajas Petri p100 y
se dejó polimerizar el agar. Las placas fueron mantenidas a 4oC hasta su posterior uso.
4.7.1 Preparación de medio de cultivo líquido Luria Bertani (LB)
Para obtener mayor cantidad de clones transformados, se cultivó las colonias de
bacterias positivas en medio de cultivo líquido LB. A partir de cultivos de toda la noche se
realizó la extracción de ADN mediante Miniprep o midipreps. El medio de cultivo líquido
LB, se preparó de la siguiente manera:
Se disolvió 20gr de medio LB en 1 litro de H2O estéril. Se homogenizo el medio y
se autoclavó. El medio fue mantenía a temperatura ambiente y no se le adicionó ningún
antibiótico. Para cada caso en partículas se colocó en antibiótico de acuerdo a las
concentraciones mencionadas anteriormente.
Para el cultivo de bacterias para la extracción de ADN miniprep, se realizaron
cultivos de noche con 3ml del medio de cultivo líquido LB, con el antibiótico respectivo, en
19 un tubo Falcon de15ml estéril. Se utilizó una punta de micropipeta estéril para tomar una
colonia de la muestra y se soltó dentro del tubo Falcon. Los tubos fueron mantenidos en
incubación a 37°C con agitación a 230 rpm. Para las incubaciones se utilizaron dos tipos de
incubadoras: una
de marca: Thermo Scientific MaxQ 5000 y otra incubadora digital
MAxQ Mini 4450 (rango de 5°C a 80°C).
Para obtener mayor cantidad de ADN plasmídico (midipreps) se realizaron cultivos
de noche en 50 ml medio de cultivo líquido LB en un Erlenmeyer. Los cultivos crecieron
en presencia de antibiótico y se añadió 100 µl del medio de crecimiento de cultivos
miniprep. Se incubó a 37oC con agitación de 230 rpm. 4.8 Transformación en Escherichia coli αDH5
Para la transformación de células competentes siguió el protocolo estandarizado del
Laboratorio de Investigación de Anatomía Patológica de Vall d’Hebron.
En un eppendorf de 1,5ml se colocó un volumen de 50-100 µl de bacteria Echerichia
coli αDH5 y se agregó 5 µl de producto de ligación. La reacción fue mantenida en hielo
durante 30 minutos. Luego se realizó choque térmico a 42°C (baño maría) durante 42
segundos. Por último, las muestras fueron incubadas en hielo por 1 minuto. Posteriormente,
se colocó 1ml de medio de cultivo líquido LB y se dejó en incubación a 37°C con agitación
a 230rpm constante por 1 hora. Transcurrido el tiempo de incubación se centrifugó a 3000
rpm por 3 minutos, se recogió 100 µl de pellet y se sembró en cajas Petri (una por cada
muestra). Con ayuda de asas de vidrio, formadas de pipetas Pasteur, se distribuyó la
muestra por todo el medio agar de cultivo que contenía antibiótico.
4.9 Mutagénesis
La mutagénesis fue realizada utilizando el un kit de mutagénesis directa siguiendo el
protocolo descrito por Wang & Malcolm 1999. Se rotularon tubos de PCR de 0,2 ml que
fueron mantenidos en hielo. Se llevaron a cabo dos reacciones separadas: Plásmido de
interés 25-50ng; Oligo mutagénico para la hebra codificante 0,4 µl; 25mM dNTP mix 0,4
µl; 10X cloned KOD DNA polimerasa tampón 5µl; diH2O (estéril) hasta 49µl; KOD Turbo
DNA polymerase 1 µl (2,5 unidades) reacción total 50 µl. La reacción fue realizada en un
20 termociclador AB Applied, Biosystem Veriti de 96 pocillos. Para generar y amplificar el
plásmido mutante, se siguió el programa de PCR detallado:1) 1 minuto a 95°C 2) 10 ciclos
95°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto 30 segundos, 68°C minutos dependiendo del largo
del plásmido; Las muestras del termociclador fueron retiradas y se mezclaron 25ul de cada
tubo de 0,2ml en un eppendorf nuevo de 0,2ml, se añadió 0,75ul de KOD DNA polimerasa
y se continuó con la siguiente reacción: 3) 1 minuto a 95°C 4) 18 ciclos de 95°C por 1
minuto, 55°C por 1 minuto 30 segundos, 68°C minutos dependiendo del largo del plásmido
kb.
Para la comprobación de la mutagénesis se realizó una digestión enzimática con la
endonucleasa DpnI; la reacción de digestión contenía 5 µl de tampón 10x y 1 µl de la
enzima (200 unidades/µl). La digestión fue mantenida a 37°C durante 5 horas.
Posteriormente, se realizó la transformación de E. coli, para lo cual se utilizó 2,5 µl (50ng)
de ADN mutante. Se siguió el protocolo normal de transformación ya descrito.
4.10 Cultivo celular y transfección
Las células HEK-293T fueron cultivadas en 10 ml de medio de cultivo DMEM
(Dulbecco‘s modified Minimum Essential Medium) Gibco® enriquecido con 10% de suero
fetal bovino (50 ml), 5 ml de L-Glutamina, 5,5 ml de penicilina – estreptomicina. Las
placas de cultivo fueron mantenidas a 37°C en una atmosfera totalmente húmeda con 5%
de CO2 en el ambiente.
Para la transfección celular se cultivaron, 24 horas antes, 4x10 6 células por cada placa
de cultivo pP100, y por cada tratamiento. La transfección celular se realizó mediante la
técnica de Fosfato de Calcio (Sigma®): H2O hasta 500µl; Vector 10ug; CaCl 2,5M 50µl; y
se puso en un tubo Falcon de15ml para cada muestra para ser transfectada 15ml de 500ul de
HBS.
4.10.1 Visualización de las células transfectadas El análisis de las células se realizó para la detección de la expresión de eGFP y
mCherry, a las 24 y 48 horas de después de la transfección. La eficiencia de transfección y
21 la foto documentación se realizó con el microscopio de fluorescencia Olympus FSX-BSW
100.
4.11 Lisado de las células para análisis de Western – blot
A las 48 horas de la transfección se realizó el lisado de las células para poder realizar
el análisis de western blot mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).
Para el lisado celular, se preparó el buffer de lisis como se detalla a continuación: Leu 1µl,
Ap 1,4µl, DTT 1µl, PMSE 10µl, Naf 20µl, Nappi 5µl, B-glicerofosfato (todo estos
reactivos se diluyó en 1ml de NP-40 buffer de lisis).
Primero, se retiró el medio de cultivo DMEM de las células con ayuda de la bomba
de vacío. Se realizó dos lavados con 3 ml de PBS, gota a gota, evitando que se desprendan
las células, se agito suavemente y se procedió a retirar el PBS con ayuda de la bomba de
vacío. Se añadió 200 µl de buffer de lisis, las muestras fueron mantenidas en hielo durante
15 minutos, para que el buffer de lisis actúe. Se procedió a centrifugar las durante 10
minutos a 4°C a 16.000rpm. El sobrenadante fue transferido a un tubo eppendorf de 1.5 ml
nuevo.
4.11.1 Concentración de Proteína
Una vez obtenidos los lisados celulares, se procedió a la medición de la concentración
de proteínas con la técnica de Bradford, para lo cual se preparó el buffer a una
concentración 1x y se colocó 200 µl de reactivo y 1 µl de cada muestra en placas de 96
pocillos para la medición de la concentración usando el espectrofotómetro. Además se
utilizó para la medición una escalera de concentración estándar de proteínas (recta patrón),
la misma que fue preparada de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Para la medición
de la concentración se empleó el espectrofotómetro Epoch de BioTek.
Los valores obtenidos fueron remplazados en una hoja de cálculo de Excel para
obtener la concentración exacta de cada proteína. Se mantuvo todos los lisados en una
concentración final de 2 µg/µl.
22 4.12 Western – Blot Gel de Poliacrilamida SDS-PAGE
Para el Western-blot se preparó dos geles de acrilamida en diferentes concentraciones,
para condensar proteínas Stacking gel al 5% : H2O 3,3ml; 30% acrilamida 4,0ml; 1,5M Tris
(pH 8,8) 2,5ml; 10% SDS 100ul; 10% amonio persulfato; TEMED 4ul y para la separación
de las proteínas un gel al 12%: H2O 2,7ml; 30% acrilamida 650ul; 1,0M Tris (pH 6,8)
500ul; 10% SDS 40ul; 10% amonio persulfato 40ul; TEMED 4ul.
A continuación, se preparó el buffer de corrido 1x como se indica: Tris 75,5gr; Gly
360gr SDS 10% 250ml, el mismo que se utilizó para la electroforesis. En cada pocillo del
gel se cargaron 30µl del lisado celular a una concentración de 20 µg/µl. Se utilizó 6 µl de
marcador de peso de proteínas (Bio-Rad). La electroforesis se levó a cabo durante 3-4 horas
a 80 voltios.
4.12.1 Transferencia de Bandas del gel a la membrana de nitrocelulosa
Primeramente, se preparó buffer de transferencia 1x, como se indica: Buffer de
transferencia 10X 100ml, H2O Helix 700ml Metanol (CH4OH) 200ml.
El tamaño de la membrana de nitrocelulosa para la transferencia fue de 7,5 x 8,5 cm y
se la sumergió en metanol durante 1 minuto para su activación. Luego se lavó la membrana
con agua Hélix y finalmente se la mantuvo en buffer de transferencia.
Para la transferencia se colocó la membrana sobre el gel, se eliminó las burbujas de
aire y el gel con la membrana fueron colocados entre dos esponjas. La electroforesis de
transferencia se llevo a cabo durante toda la noche a 50mA. Para el cálculo del amperaje al
cual se debía dejar la electrofresis se dividió 1000 mA para el número de horas que duro la
transferencia (20 horas)
4.12.2 Lavados de la membrana de transferencia
Se preparó TBST 1x, y buffer de leche (DifcoTM Skim Milk) como se indica:
Buffer de transferencia 10X 100ml, H2O Helix 700ml, Metanol (CH4OH) 200ml. El buffer
de leche permite el bloqueo de la membrana lo cual permite una mayor especificidad de los
anticuerpos.
23 Una vez concluida la transferencia, se colocó la membrana de nitrocelulosa en 5 ml
de buffer de leche durante 30 minutos con agitación (Skin milk Difco 5gr, disolver en
100ml de TBS 1X) Posteriormente, se desecho la leche, y se procedió al marcaje por
anticuerpos de la membrana. Se utilizaron dos anticuerpos α-GFP y α-His para la proteína
verde (EGFP) y roja (mcherry), respectivamente. El marcaje se dejó en agitación durante 1
hora a temperatura ambiente.
A continuación, se retiró la membrana del tubo y se procedió a lavarla con 5ml de
TBST 1x durante 10 minutos con agitación. Se realizaron 3 lavados de la membrana a
temperatura ambiente.
4.12.3 Relevado de la membrana de transferencia
Una vez que se retiró el exceso de anticuerpo de la membrana de nitrocelulosa, la
misma fue colocada en el Hypercasette (Amersham, Biosciences). Se preparó en un tubo
eppendorf de 1,5ml la solución de revelado, se colocó 500 µl de solución de peróxido (HRP
substrate peroxide solution) y 500 µl de sustrato de luminol (HRP substrate luminol). El
buffer de revelado fue colocado sobre la membrana de nitrocelulosa, se dejó secar durante 5
minutos. Para el revelado, en un cuarto obscuro, se utilizó un papel de fotografía de rayos X
film de color azul de 18 x 24cm (AGFA). Las exposiciones fueron de 15 segundos hasta 1
minuto.
24 5
RESULTADOS
Con el fin de detectar las secuencias IRES en mARNs celulares se elaboró el vector
bicistrónico pMFR. Para la construcción del mismo se insertando las dos proteínas
fluorescentes mCherry y EGFP, obtenidas mediante digestión enzimática de otro vector.
Los dos cistrones permitieron realizar los seguimientos respectivos, para evaluar la
expresión de cada proteína mediante transfección en células HEK 293T y western blot. 5.1
Construcción del vector de expresión bicistrónico multi-fluorescente (pMF)
5.1.1 Clonación de dos proteínas fluorescentes mCherry y EGPF
La proteína mCherry, posee un 3’His-tag (HHHHHHH), fue clonada previamente
en el laboratorio SRC, mediante una reacción de PCR utilizando los primers Fw: 5’CAAGCAC CATCACCACCATCAC-3’ y Rev: 5’-GTGATGGTGGTGATGGTGCTTG 3’, los cuales poseen un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI. El
producto de la amplificación fue digerido con la endonucleasa e insertado en el vector
pEGFP-N2, el mismo que fue linearizado previamente, para posteriormente poder ligar los
dos fragmentos con la enzima ligasa T4. A continuación, se realizó la transformación en
células competentes E. coli DH5α y de esta manera obtener clones positivos, y finalmente
realizar cultivos de una noche, en medio de cultivo líquido con el antibiótico kanamicina, y
así extraer ADN mediante con los kits de miniprep y midipreps del nuevo vector generado
(pCH-G (por CherryHis-EGFP)).
5.1.2 Introducción de His-tag (diana) en el vector pCH-G (CherryHis-EGFP)
La secuencia de la proteína EGFP con un 3’His-tag (HHHHHH), EGFPH, clonada
previamente por un miembro del laboratorio de SRC, fue amplificada mediante PCR usando los
primers
Fw:
5’-ACAAGCACCATCACCACCATCAC-3’
y
Rev:
5’-GTGATG
GTGGTGATGGTGCTTGT-3’, cada uno presentaba un sitio de restricción para las enzimas
HindIII y NotI. La secuencia una vez amplificada, fue insertada en el vector pCH-G, previamente
linerizado con las mismas endonucleasas, lo cual permitió retirar la secuencia EGFP del pCH-G sin
la diana (3’His-tag). Posteriormente, se realizó el proceso de ligación, transformación y obtención
25 de ADN como se ha descrito previamente. En el vector generado (CherryHis-EGFPHis), se
encuentra el sitio de clonaje múltiple (MCS) del vector original pEGFP-N2 (ver Figura 3 del MCS).
Figura 3. Esquema del vector pEGFP-N2. Se muestra el sitio de clonaje múltiple (MCS), que
fue insertado en el constructo del vector pCH-GH.
5.2
Inserción de un Myg-tag en la secuencia de mCherry para distinguirlo de EGFP
Debido a que las dos proteínas, Cherry-His y EGFP-His, poseen aproximadamente el
mismo peso molecular, se insertó un Myc-tag frente del codón 5’-ATG de la secuencia de
Cherry-His, creándose la secuencia MycCH. Esto permitió la separación e identificación de
las dos proteínas en la autoradiografía del Western blot, ya que provocó que la proteína
cherry adquiera mayor peso; además permitió la detección específica de MycCH y de GH
(EGFPHis-tag) mediante el uso de anticuerpos. La secuencia Myc-tag fue clonada por PCR
a partir del plásmido pYIC. Los primers utilizados para la reacción fueron forward: 5’-CCG
GACTCAGATCTCGAGCTC-3’, que incluía el sitio de reconocimiento para la enzima
BglII y reverse: 5’-CCGACTAGTCGCGCAAGATCCTCCTCGGAT-3’, que contenía el
sitio de restricción para SpeI. El producto de PCR fue digerido con las 2 enzimas y el
fragmento ligado con el vector pCH-GH, previamente linearizado, generándose así el
vector pMCHGH (MycCherryHis-EGFPHis).
26 5.3 Mutagénesis
5.3.1 Mutación del primer codón de inicio (ATG) de mCherry
Debido a que mediante Western blot se observaron dos bandas, una del Cherry-His y
otra del Myc-tag insertado en el constructo pMCHGH (sin IRES) (figura 5), se realizó una
mutagénesis en la secuencia de mCherry mediante por PCR, alterándose así el codón ATG
por AAG (TxA) utilizando los primers FwCherryMut: 5’- GCGACTAGTCGCCACCAAG
GTGAGCAAGGGCG AG -3’ y RwCherrySalI: 5’- GGTACCGTCGACTGCAGAAT -3’.
La amplificación de Cherry para introducir una mutación en el codón ATG fue hecho
por la técnica de PCR bajo las siguientes condiciones: 10Xbuffer para KOD Hot start DNA
pol 1X (5ul); 25mM Mg SO43 1,5mM(3,5ul); dNTPs (2mM) 0,2mM(5ul); PCR H2O hasta
50ul; Fw primer 100mM (1,5µl); Rv primer 100mM (1,5µl); templado de ADN (50ng)
(1µl); DNA polimerasa 1U/µl (1µl). Las condiciones de la PCR fueron: desnaturalización
inicial 95ºC por 2minutos; seguido por 29 ciclos a 95ºC por 20 segundos; 56ºC por 10
minutos; 70ºC por 40 segundos.
El producto de PCR (900pb) fue aislado del gel de agarosa y fue digerido con las
enzimas de restricción SpeI/SalI, el vector original también fue digerido con SpeI/SalI para
remover el tipo salvaje Cherry y linearizado el esqueleto del vector a partir de un gel de
electroforesis. Después de la ligación el esqueleto del vector con el producto de PCR, fue
transformado en E.coli DH5 α y algunas colonias fueron seleccionadas y dejadas en
crecimiento para minipreps. La correcta introducción de una mutación en el codón ATG
causó la perdida de uno de los 6 sitios de restricción para NcoI. La cual se pudo utilizar
para detectar en gel de agarosa, porque tenían diferente patrón de bandas digeridas, en
relación a las de control (carriles 5 y 6 figura 4); por lo tanto, las colonias que tenían la
mutación correcta. Generaron el vector pMmutCHGH (pMyc-mutacion en cherry-HisEGFP-His-tag).
27 1
2
3
4
5
6
Figura 4. Comprobación de la mutagénesis dirigida del vector del pMmutCHGH
(pMyc-mutacion en cherry-His-EGFP-His-tag). En la figura se puede observar el nuevo
constructo del vector pMmutCHGH por la mutación exitosa que se llevó acabo, lo cual fue
detectado porque el cambio de AAG por ATG, hace que se pierda uno de los 6 sitios de
restricción de NcoI, originando diferencias en el patrón en las bandas (carriles 1-4),
verificándose así la inserción de la nueva secuencia mutada de mCherry. Después de la
digestión, en los carriles 5 y 6 se indica el pMCHIGH (sin mutación) con el elemento
IRES del EMCV utilizado como control y el constructo sin IRES pMCHGH, sin el
mcherry mutado, lo que corrobora los resultados porque ambos vectores mantuvieron el
sitio de corte para NcoI.
1
2
3
4
5
6
7
Figura 5. Análisis de la expresión de la proteína Cherry mediante western blot. En
los carriles 3-7 se observa una banda, que representa la disminución de la expresión de
la proteína Cherry debido a la mutación insertada; a diferencia de lo que se observa en el
carril 2, cuyo vector no presenta la mutación.
28 5.3.2 Mutación del segundo codón de inicio en la secuencia Cherry
Después de la primera mutagénesis, se redujo la traducción del CherryHis sin His-tag
pero al analizar los resultados por Western blot, se pudo observar una nueva banda en
mCherryHis como muestra la figura 5, lo cual probablemente, se debió a otro escaneo del
ribosoma en un segundo codón de inicio que se encontraba 24 pares de bases más abajo del
ATG del mcherryHis. La mutación del segundo ATG se realizó utilizando: los primers:
FwCherryM2Kmut:
RevCherryM2Kmut:
5’-GAGGAGGATAACAAGGCCATCATCAAGG-3’
5’-CCTTGATGATGGCCTTGTTATCCTCCTCG-3’.
Con
y
las
siguientes condiciones: reacción 1 plásmido purificado conteniendo el gen de interés (2550ng); primer mutagénico (100pmol/µl) 0,4µl; 25mM dNTPs mix (25mM cada dATP,
dTTP, dCTP, dGTP) 0,4µl; 10X KOD DNA polimerasa buffer de reacción 5 µl; diH2O
(estéril) hasta 49µl; KOD DNA polimerasa HOT start 1µl (2,5unidades) ; estas condiciones
se repitieron para la segunda reacción, se siguió el siguiente programa de PCR:
desnaturalización inicial a 95°C por 1 minuto; seguido por 10 ciclos a 95°C por 1 minuto,
55°C por 1 minuto 30 segundos, 68°C por 6 minutos (dependiendo del largo del plásmido);
Las muestras del termociclador fueron retiradas y se mezclaron 25ul de cada tubo de 0,2ml
en un eppendorf nuevo de 0,2ml, se añadió 0,75ul de KOD ADN polimerasa y se continuó
con la siguiente reacción: desnaturalización inicial 95°C por 1 minuto; seguido de 18 ciclos
a 95°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto 30 segundos, 68°C por 6 minutos (dependiendo
del largo del plásmido kb). El producto de PCR fue digerido con la enzima de restricción
DpnI. Se siguió el proceso de clonación previamente descrito, obteniéndose el nuevo vector
pM2mutCHGH (p Myc-2mutaciones en CherryHis-tag-EGFPHis-tag) (figura5).
29 1
2
3
4
5
Figura 6. Comprobación de la segunda
mutación del vector pM2mutCHGH en
gel de agarosa 1%. Se observa en el carril
1 el vector modificado (segunda mutación)
en el segundo ATG de la secuencia de
mCherry, el cual fue resistente a la
digestión con la enzima de restricción DpnI
(fue
aislado
y
usado
para
la
transformación). La comparación se
establece con el carril 2 que corresponde al
vector sin mutación completamente
digerido con la misma enzima.
Dado que la enzima DpnI reconoce y degrada las secuencias metiladas en el ADN, al
realizar la reacción de mutagénesis, mediante PCR, las nuevas secuencias generadas no se
encuentran metiladas, razón por la cual la enzima no reconoce sitios para la digestión en el
plásmido, y las secuencias no se degrada; por esta razón, como control, se utilizó el vector
pMmutCHGH sin mutar pero digerido con la enzima, observándose la completa digestión
de su secuencia. En la figura 6 se muestra claramente dos productos sin digerir, que
corresponden a los vectores sin cortes con un peso aproximado de 6500 pares de bases.
Entonces después de la digestión con DpnI, el producto de PCR del plásmido intacto, fue
aislado del gel, purificado y usado para hacer la transformación en E. coli. Algunos clones
fueron seleccionados para obtener más ADN por minipreps.
Como una segunda prueba para verificar la mutagénesis, el plásmido fue cortado con
MscI, porque la mutagénesis de ATG remueve uno de los 3 sitios de MscI ocasionando la
perdida de un fragmento de aproximadamente 1300pb cuando fue cortado con MscI.
30 5.3.3 Inserción de la secuencia IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) en
el constructo pMCH-GH2mut (pMyc-2mutCherryHis-tag-EGFPHis-tag).
La secuencia del elemento IRES-EMCV fue retirada del vector pIRES-EGFP-N2
mediante digestión con las enzimas de restricción BstI/SalI. Esta secuencia fue re-insertada
en el vector pMCH-GH2mut, previamente linearizado con las mismas enzimas. Se realizó
el proceso de clonación y se obtuvo el vector pMCHIGH2mut (pMyc-2mutCherryHis-tagIRES_EMCV-EGFPHis-tag) como se muestra en la figura 7.
Figura 7. Extracción de secuencias IRES
para
insertar
en
el
constructo
pMCHGH2mut. Se realizó la digestión
con las enzimas SalI/BstI para retirar las
secuencias IRES de los vectores pIRESGFP
y pCherryIRESGFP, y linearización del
vector pMCHGH2mut.
1
Este
nuevo
2
vector
3
pMCHIGH2mut
(pMyc-2mutCherryHis-tag-IRES_EMCV-
EGFPHis-tag) fue utilizado para evaluar mediante Western blot, la expresión de GFP
mediada por la secuencia IRES (figura 8). Además el vector pCHIGH fue utilizado como
control para evaluar la expresión de cherry con respecto a los constructos.
31 Figura 8. Autoradiografía de la expresión de GFP sin IRES en el vector
pMCHGH2mut. En la figura, en el carril 1 se observa dos bandas, una de mayor peso,
correspondiente a cherry, y bajo esta la de GFP en el vector pMCHIGH, que fue usado
como control, ya que tiene el elemento IRES-EMCV insertado. En el carril 2 se tiene el
vector que no expresa mcherry pero sí posee la secuencia IRES (pCHIGH). En cuanto a
los vectores pMCHGH2mut, que poseen las dos mutaciones en los codones ATG de
mcherry (carriles 3 y 5) se puede observar que va disminuyendo la expresión de mcherry.
5.4 Inserción de estructuras secundarias (horquilla) para detener defectos en
el escaneo ribosomal
5.4.1 Inserción de una horquilla después de mCherry para reducir la traducción no
específica de GFP debido a los defectos en el barrido del ribosoma
Para reducir la eficiencia del barrido del ribosoma durante la traducción de EGFP, se
insertó una horquilla con una fuerte estructura secundaria. Los primers utilizados fueron:
EcoRIStemLoopFw:
5’-AATTCAAAAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTC
GCGACCTCGCCTAAAG-3’ y EcoRIStemLoopRev: 5’-AATTCTTTAGGCGAGGTCG
CGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTCGCCTTTTG-3’. Las secuencias de los
cebadores presentan el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción EcoRI en el
extremo terminal. El vector fue digerido con EcoRI y desfosforilado, usando la fosfatasa
alkalina de Fermentas. Para la unión de la secuencia de primers en tubos eppendorf mezcló
11,25 µl de cada uno con 2,5 µl de buffer de anillamiento 10x (1M NaCl, 100mM TrisHCl, pH 7,4); esta mezcla fue colocada a 95°C durante 5. Finalmente, los tubos fueron
mantenidos en un vaso de precipitación con agua hirviendo, hasta que el agua alcanzó
aproximadamente 30°C (2-3 horas). Posteriormente, se diluyó 1ul del mix de los primers en
32 399 µl de buffer de anillamiento 0,5x. Finalmente, los primers fueron fosforilados para
poder ligarlos con el vector digerido con la enzima EcoRI. La reacción de ligación
contenía: 1µl de dilución de primers, 1 µl del ADN del vector (10-20ng), 1 µl de buffer de
ligación, 1 µl de ligasa T4 y 6 µl de H2O, en un volumen total de 10 µl. De este modo se
desarrollaron 2 vectores: 1) pMCHLGH2mut (pMyc-2mutCherryHis-tag_Loop-EGFPHistag) y 2) pMCHL-I- GH2mut (pMyc-2mutcherry-Loop-CH-IRES-ECMV-GH). La
comprobación de la inserción de la horquilla se hizo mediante la digestión del vector con la
enzima EcoRI (figura 9).
Figura 9. Digestión con EcoRI del
vector pMCHLGH2mut, gel de
agarosa 1%. El gráfico muestra la
comprobación de la inserción de la
horquilla (Loop) de 54pb en el
constructo pMCHLGH2mut, en los
primeros 6 carriles del gel y como
control se utilizó el mismo constructo
pero sin la horquilla insertada,
digerido con la misma enzima
1
2
3
4
5
6
El objetivo de insertar la horquilla dentro del constructo fue para detener la expresión
de la proteína verde, en ausencia de IRES, ya que en la transfección en líneas celulares, al
analizar por microscopía, el vector siempre mostraba un background verde, debido a la
expresión de GFP.
5.4.2 Inserción de una horquilla frente a la secuencia mCherry para reducir los altos
niveles de traducción cap-dependiente de mCherry
Con el fin de reducir los altos niveles de traducción cap-dependiente de la proteína
Cherry, se insertó una segunda horquilla. Los primers utilizados fueron: forward
XhoIStemLoop: 5’-TCGAGAAAAGCGCAGGTCGCGACCGCGCATGCGCGGTCGCG
ACCTGCGCTAAAC-3’ y reverse XhoIStemLoop: 5’- TCGAGTTTAGCGCAGGTCGCG
ACCGCGCATGCGCGGTCGCGACCTGCGCTTTTC-3’. Las secuencias poseen en el
extremo el sitio de restricción para la enzima XhoI. El vector con IRES y sin IRES fue
cortado con la misma enzima (XhoI) y desfoforilado. El proceso de clonación fue realizado
33 como se ha descrito anteriormente, generándose así los vectores pML2CHL1GH2mut
(pMyc-2mutcherry-Loop1-CHLoop2-GH)
y
pML2CHL1IGH2mut
(pMyc-
2mutLoop2CherryHis-tag_Loop1-IRES-EMCV-EGFPHis-tag), futuro pMFR.
Una vez obtenida la inserción de la última horquilla, en el vector pMFR, se realizó la
comprobación mediante la digestión con la enzima de restricción NRUI. Esta enzima existe
en la secuencia de los dos horquillas insertadas, por lo tanto, al cortar con NRUI, hizo el
corte delante de cherry y después de cherry, sise ha insertado correctamente las dos
horquillas la misma que, generó un fragmento de alrededor de 900 pares de bases, lo indica
su la inserción del as horquillas ha sido correcta; como control de digestión se usó el vector
pMCHGH2mut (sin horquillas), figura 10.
Figura 10. Comprobación de la inserción de
las horquillas en el vector pMFR
(pML2CHL1GH2mut). En los carriles 1 y 2
el constructo final, pMFR, con la inserción de
las dos horquillas insertadas, digerido con la
enzima NruI, la misma que al cortar genera un
fragmento de aproximadamente 900 bp de
Myc-Cherry-His porque la horquilla 1 y la
horquilla 2 tienen el sitio de corte de la
enzima. En el carril 3, el vector control sin las
horquillas digerido con la misma enzima.
1
2
3
Mediante Western blot, figura 11, se muestra como disminuyó la expresión de GFP de
acuerdo a cada modificación realizada en el vector; en el ultimo carril de la autoradiografía
se observa la expresión de GFP que es debida a la expresión de la secuencia IRES-EMCV,
el cual fue usado como control.
34 Figura 11. Autoradiografía de Western blot de las modificaciones de los constructos
para obtener pMCH2LGH2mut (pMFR). En el gráfico se puede ver como ha
disminuido la expresión de la proteína GFP en base a las modificaciones que se realizó en
el constructo hasta desaparecer la expresión de GFP en el vector final, comparado con el
constructo que lleva la secuencia IRES-EMCV usado como control.
Además se evalúo la expresión de proteínas de cada uno de los vectores intermedios
mediante transfección en la línea celular HEK293T, incluyendo el vector bicistrónico final
pMFR, mediante microscopía fluorescente. Se pudo determinar que en cada cistrón se
expresaba la proteína mCherry. Con la inserción de las horquillas se logró la reducción de
la traducción de EGFP, en ausencia de secuencias IRES. Como control de la expresión de
EGFP se utilizó el vector que portaba la secuencia IRES-EMCV, figura 12.
35 a)
c) b)
d)
Figura 12. Análisis de microscopía flourescente del vector biscistrónico pMFR. a) Se
muestra vector bicistrónico pMFR la expresión de la proteína roja de mcherry lo cual
indica que la traducción es vía cap-dependiente. b) no hay expresión de la proteína verde
del EGFP vía IRES-dependiente. c)vector pMFR con IRES indicando la expresión de rojo
vía cap-dependiente d) vector pMFR con IRES del EMCV con una fuerte expresión de
verde del EGFP indicando la vía de traducción IRES.
A continuación la figura 13 muestra un esquema del vector final pMCH2LGH2mut
(pMyc-2mut-1LoopCherrryHis-tag-2LoopEGFPHis-tag-), pMFR, con las variaciones que
se han ido generando a lo largo de este trabajo.
36 a)
b)
Figura 13. Esquema del vector final pMFR. a) representación circular del vector pMFR,
y el MCS. b) plásmido lineal indicando en donde fueron hechas las modificaciones al
constructo hasta obtener el vector final pMFR. 37 6
DISCUSIÓN
Para la construcción del vector bicistrónico pMFR se insertó 6-His-tag tanto en la
proteína cherry como en EGFP, en el sitio N-terminal, lo cual permite la detección
mediante anticuerpos, para poder visualizar las bandas mediante autoradiografías de
Western blot, de una forma clara, sin que provoque confusión al momento de analizar los
resultados y así poderlos interpretar de una forma fiable.
Debido a que la proteína EGFP y mCherry poseen un peso relativamente similar, para
poder diferenciar las dos proteínas, se insertó en la secuencia de cherry un 3-Myc-tag, el
cual fue extraído del vector pYiC, así se consiguió un mayor peso en mcherry sin afectar la
expresión de la proteína. Ya que la secuencia de Myc-tag es corta, puede ser clonado
upstream o downstream del gen de interés, lo cual facilita la fusión a la proteína y permite
una buena detección, purificación y localización de la proteína diana sin interferir con la
estructura y funcionamiento. El c-Myc se caracteriza por tener 10 aminoácidos: 3 ácidos
glutámicos, 1 glutamina, 2 lisinas, 1 isoleucina, 1 serina y 1 ácido aspártico. Para
incrementar la sensibilidad en la diana blanco se debe insertar varias repeticiones del Myc,
lo cual ha sido exitoso y en la literatura se reporta la inserción de 3 a 5 repeticiones tags, los
cuales son tolerables y en la mayoría de los casos están como horquillas externas (Jarvik &
Telmer, 1998). En este caso tres repeticiones fueron insertadas.
Por otro lado, se llevo a cabo una mutagénesis puntual en el primer codón de la proteína
mcherry, el cambio fue de una adenina por una timina, en el codón de inicio ATG, de la
secuencia cherry para evitar que siga la traducción de esta proteína, ya que al parecer este
codón, estaba siendo reconocido por el ribosoma y traducía la secuencia de una proteína
que interfería con los resultados, porque en el análisis del Western blot se observaban dos
bandas, una del myc-tag y otra del mcherry. Al remover esta banda y al analizar mediante
Western blot los resultados, se observó una nueva banda, de un tamaño más pequeño,
cercana a la región de expresión de mcherry. Analizando la secuencia del plásmido con el
programa Serial Cloner, se identificó que en la secuencia de mcherry 24 nucleótidos más
abajo del primer codón de inicio, ya mutado, había otro codón de inicio, ATG, que
38 provocaba el mismo problema y era reconocido por la maquinaria de traducción. Por este
motivo se llevó a cabo la segunda mutagénesis puntual, en el segundo codón de inicio de la
secuencia de mcherry (Figura 9). La mutagénesis se realizó por la PCR, alterando así los
dos codones de inicio y permitió la inserción de sitios de restricción en la nueva secuencia,
para luego su fácil reinserción dentro del constructo, esta técnica también puede ser usada
para generar un constructo de un gen híbrido de dos genes independientes de necesitarlo
además que hizo posible la introducción de la mutación específica dentro de la secuencia
con una eficiencia del 100% con pocos pasos como se describió en metodología (Ho, et al.,
1987).
En cuanto a la expresión de GFP, en las transfecciones realizadas y en los análisis de
Western blot se pudo detectar que siempre existía un background verde a pesar de la
ausencia de una secuencia IRES que active la expresión de esta proteína. Esta expresión
podría ocasionar fallas en la interpretación de resultados del análisis de secuencias que
presenten una traducción vía IRES-dependiente, por este motivo se insertó una horquilla
frente a la proteína GFP para reducir esta expresión, que nos puede dar falsos positivos en
los análisis. Para la expresión de mcherry, (figura8), para ciertos constructos la expresión
de mcherry parecería que iba disminuyendo, pero podría tratarse también de la cantidad de
proteína utilizada para los análisis de Western blot, ya que en aquellas muestras que no
presentaban una fuerte expresión había menos concentración de proteína para ambos casos.
En todo caso, con cada modificación realizada en el constructo se realizó las verificaciones
y siempre se utilizó el vector con la secuencia IRES-EMCV, como control, y sin IRES para
ver la expresión de los dos cistrones.
Para el control de la inserción de las dos horquillas en el vector pMFR se realizo la
digestión con la enzima NruI; esta enzima corta dentro de la horquilla 1 y también dentro
de la horquilla 2, en cada sitio del mycCherry, generando un fragmento de
aproximadamente 900 pares de bases cuando existan las dos horquillas, en nuestro estudio
se obtuvo un resultado positivo (figura 10), obteniéndose así el constructo final
pM2LCH1LGH2mut, vector (pMFR).
Finalmente, se transfectó las células HEK239T para medir la eficacia del vector, tanto
por fluorescencia como por western blot. En la autoradiografía del Western blot se pudo
39 constatar como fue variando la expresión de la proteína EGFP, la cual fue disminuyendo
hasta desaparecer, debido a las modificaciones que se realizaron en los constructos.
Además, fue necesario introducir horquillas que detengan la traducción, así como realizar
mutaciones puntuales para equiparar la sobre expresión de ambas proteínas. De esta manera
se pudo llegar a generar el vector pMFR con un elemento IRES conocido del EMCV y
poder medir la eficacia en la detección, por medio de una buena expresión de GFP con la
técnica de fluorescencia y por western blot, con el uso de anticuerpos anti-His; como se
puede ver en la figura 11, ultimo carril, con la nomenclatura pMCH2L-I-GH2mut, que
indica myc CherrryHis-tag-2horquillas insertadas-GFPHis-tag-2 mutaciones que fueron
llevadas a cabo.
Es necesario seguir haciendo mas pruebas con el plásmido pMFR, para poder
comprobar bien como se comportan las horquillas insertadas y como podría afectar en la
traducción y la insertando diferentes tipos de secuencias IRES conocidos y en diferentes
líneas celulares(Hela, L, CHO, etc) y también in vivo en animales modelo como el ratón, ya
que se ha visto que los niveles de expresión pueden variar de 6% al 100% dependiendo del
tipo celular y el funcionamiento de los genes reporteros, lo que daría una valiosa
información para ir mejorando o darle un amplio espectro en las aplicaciones. El plásmido
pMFR ser secuenciado para confirmar si tiene inserto todas las modificaciones que se han
hecho.
40 7
CONCLUSIONES Y FUTURO
En este proyecto, se generó un vector pMFR, que contiene varias modificaciones con el fin
de resolver varias limitaciones:
1. El His-tag presente en un C-terminal de las proteínas Cherry y GFP permite la fácil
detección por Western blot de las dos proteínas..
2. Un Myc-tag en la parte N-terminal de Cherry permite una mejor separación por tamaño
de las proteínas Cherry y EGFP por Western blot. Además, para Myc-tag hay un
anticuerpo determinado, permitiendo la detección específica de la proteína Myc-Cherry.
3. La mutagénesis dirigida de los dos siguientes putativos codones de iniciación ATG
presentes en la proteína Cherry, permiten una expresión más eficaz de myc-Cherry
evitando que se generen formas más cortas, que no contendrían Myc-tag.
4. Al introducir una horquilla corta de RNA después de cherry (en frente de cualquier
secuencia IRES) se previene cualquier defecto en el escaneo ribosomal y por tanto se
evita una falsa expresión de EGFP.
5. Al introducir una horquilla corta de RNA frente a cherry se reduce la traducción fuerte
de cap-dependiente de Cherry (debido a la generación de una óptima región 5’UTR que
precede al codón de inicio ATG.
6. La inserción de la secuencia IRES del virus EMCV en el vector pMFR, demuestra que
el nuevo plásmido generado está funcionando correctamente para detectar la activación
de EGFP (traducción cap-independiente).
7. Se han conservado varios sitios de restricción únicos entre las secuancias codificantes
para Cherry y
EGFP para facilitar la introducción de un elemento IRES. La
conservación de un único sitio de restricción para la enzima BglII en frente de Cherry y
otro sitio de restricción NotI después de EGFP nos facilita la clonación directa de
cualquier fragmento de Cherry-Ires-EGFP dentro de un vector retroviral (pLPCX).
En conclusión, se ha desarrollado un vector bicistrónico fluorescente que permite
41 fácilmente la introducción de cualquier secuencia IRES y su fácil subclonación dentro de
un vector retroviral. El vector puede ser utilizado para comparar el modo de traducción capdependiente vs. IRES-dependiente por varias técnicas como microscopia fluorescente,
citometría de flujo y Western blot. Clonaje de líneas celulares pueden ser fácilmente
detectables y quizá ser utilizados en una escala mayor de detección química o de siRNA
con robots y fluorescencia como lectura (en placas de 384 pocillos). El vector también
puede ser susceptible a generación de ratones reporteros transgénicos para de IREStraducción in vivo.
42 8
BIBLIOGRAFIA
Domitrovich, A., Diebel, K., Ali, N., Sarker, S.,Siddiqui, A. 2005 Role of la
autoantigen and polypirimidinetract- bindingprotein in HCV replication. Virology 335:7286.
de Felipe, P., Martın, M., Cortes, M., Ryan and Izquierdo, M. 1999. Use of the 2A
sequence from foot-and-mouth disease virus in the generation of retroviral vectors for gene
therapy. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Centro de Biología Molecular
Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Ciencias, Cantoblanco
28049, Madrid, Spain and University of St Andrews. Department of Biochemistry. St
Andrews. Fife. UK.
Gálvez, F. 1012. Elementos IRES. Estructura en virus. Microbiología-virología.
www.drosophila.es/blog/2012/01/27/elementos-ires-estructura-en-virus/ (on line).(visitado
21-06-2012).
Gallardo, H. Tan C. Sadelain M. 1997. The internal ribosamal entry site of the
encephalomyelitis virus enables reliable co-expression of two transgenes in human primary
T lymphocytes. Gene Ther. 4: 1115-1119.
Hersey, J., Merrick W. 2000. Thepathway and machacism of initiation of
proteinsynthesis. En Translational control of gene expresión. Cold Spring Harbor
LaboratoryPress, Cold Spring Harbor. NY. pp 33-88.
Ho, F., Hunt, H., Horton, M., Pullen, K. and Pease, L. 1989. Site-directed mutagenesis
by overlap extention using the polymerase chain reaction. Gene, 77: 51-59.
Jan, E., Sarnow, P. 2002. Factor less ribosome assembly on the internal ribosome
entry site of cricket paralysis virus. J Mol Biol. 324: 889-902.
Jin, Y., Z., Wei, H. Zhang, Z., Zhou, Y., Wang, Y. and Zhang, X. 2007. Split mCherry
as a new red biomolecular fluorescence complementation system for visualizing proteinprotein interactions in living cells. Biochemical and Biophysical Research communication.
367: 47-53
Jarvik, J and Telmer, Ch. 1998. Epitope Tagging. Department of Biological Sciences.
Annu. Rev. Genet.32:601-618.
Johanes, G., Sarnow P. 1998. Cap-independent polysomal association of natural
mRNAs enconding c-myc, BiP and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA.
4:1500-1513.
Jopling C., Springs K., Mitchel, S., Stonoley, M. Willis, A. 2004. L-Myc protein
synthesis is initiated by internal ribosome entry. RNA 10: 287-98.
43 Komar, A., Hatzoglou, M. 2005. Internal ribosome entry sites in celular mRNAs:
mistery of their existence. J BiolChem 280: 23425-28.
Kozac, M. 1989. The scanning model for translation: an update. J CellBiol 108: 22941.
Lee, J., Pestova, T., Shin, B., Sang, C., Choi, K. and Dever, T. 2002. Initiation factors
eIF5B catalyzes second GTP-dependent step in eukaryotic translation initiation. PNAS 99:
16689-94.
Life science source. 2012. www.biovision.com/mcherry-fluorescent-protein-2210.html
(on line) visitado el 20-06-1012.
Macejak, D. Sarnow, P. 1991. Internal initiation of translation mediated by the 5’
leader of a celular mRNA. Nature 353: 90-94.
Martínez, E., Ramos, R., Lafuente, E. Lopez, S. 2001 Funtional interactions in
internal translation initiation detected by viral and cellular IRES elements. J Gen Virol
82:973-84.
Martínez, E. 2008. The impact of RNA structure on picornavirus IRES activity. Cell
press. Trends in Microbiology.Vol-16.N5:230-237.
Martínez, S. 2010. Mecanismos de regulación traduccional mediados por el factor de
inicio 4E: las dos caras de la moneda. Departamento de Bioquímica. Universidad Nacional
Autónoma de México. REB 29(3): 82-91.
Mountford, PS., Smith A. 1995. Internal ribosome entry sites and dicistronic RNAs in
mammalian transgénesis. TrendsGenet. 4: 179-184.
Mutagénesis: 1999. Sitio de mutagenesis dirigido para diseño
de los
oligonucleotidos para la mutagenesis.sitio de internet: Site-DirectedMutagenesis Kit,
catalog
#
200518,
and.(http://www.genomics.agilent.com)http://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpa
ge.aspx?PageType=Product&SubPageType=ProductDetail&PageID=379; (visitado el 24
de mayo 2013)
Mutagenesis manual de la mutagénesisversison web en dirección
http://www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/210518.pdf;
www.cellbio.duke.edu/faculty/soderling/labpage/protocols/site-directedmutagenesis.pdf
(visitado el 24 de mayo 2012.).
:
Nie, M. and Htun, H. 2006. Different modes and potencies of translational repression
by sequence-specific RNA-protein interaction at the 5’ UTR. Nucleic Acids Research.
Vol.34, Nº- 19: 5528-5540.
Pelletier, J., Sonenberg, N. 1988 Internalinitiation of translation of
eukaryoticmRNAdirectedby a sequencedrivedfrompoliovirus RNA. Nature 334:320-25.
44 Protocolos. Purificación extracción de ADN miniprep y midiprep
(SystemTechnicalBulletinwww.promega.com
página
5-6);
protocolo
del
kit
PureHiPurePlasmid DNA Purification Kits de Invitrogen por Lifetechnologies (manuals
and protocols, www.invitrogen.com/search/support ).
Sarnow, P. 2003. Viral internal ribosom eentry site elements: novel ribosome-RNA
complexes and roles in viral pathogenesis. J Virol 77:2802-06.
Song, J. and Markley, J. 2007. Cationary Tail: The prescence of an N-Terminal Tag on
Dynein Light-Chain Roadblock/LC7 Affects Its Interaction whit a Functional Partner.
Protein and Peptide Letters:14, 265-268.
Stoneley, M., Willis, A. 2004. Cellular internal ribosome entry segments: structures,
trans-actingfactors and reulation of gene expression. Oncogene 23:3200-07.
Terpe, K. 2002. Overview of tag proteins fusion: from molecular and biochemical
fundamentals to commercial systems. Microbiol Biotechnol.60:523-533.
Trono, D. , Andino, R., Baltimore, D. 2005. An RNA sequence of hundreds of
nucleotides at the 5’ end of poliovirus RNA isinvolved in allowing viral proteinsynthesis. J
Virol 62: 2291-99.
Wagstaff, M., Smith, J., Robinson M. Coffin, R. and Latchman D. 1998. Gene transfer
using a disabled herpes virus vector containig the EMCV IRES allow multiple gene
expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 5:1566-1570.
45