rhizobium trifolii - Tesis Electrónicas UACh

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica
Profesor Patrocinante:
Sra. Marcia Costa Lobo
Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias
CINETICAS DE CRECIMIENTO DE RHIZOBIUM
TRIFOLII CEPA 9E.I., BAJO DIVERSAS CONDICIONES DE
CULTIVO Y SU INFLUENCIA SIMBIOTICA EN EL
DESARROLLO DE PLANTULAS INOCULADAS DE TREBOL
FORRAJERO.
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
HARALD OSCAR ANTONIO WENZEL UBILLA
VALDIVIA - CHILE
2008
PROFESOR PATROCINANTE:
SRA. MARCIA COSTA L.
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
Firma
PROFESOR INFORMANTE:
SR. WILHELM HEIMLICH M.
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
Firma
PROFESOR INFORMANTE:
SRTA. MARIA ADELA MARTINEZ S.
INSTITUTO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
Firma
Dedicado a mis padres, a mi hijo
Heraldito y a mi esposa Carmen Gloria
que creen en mí.
i
ÍNDICE DE MATERIAS
Capítulo
1
2
Página
ÍNDICE DE CUADROS
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
iv
ÍNDICE DE ANEXOS
vii
RESUMEN
1
SUMMARY
2
INTRODUCCIÓN
3
OBJETIVOS
27
3
MATERIALES Y MÉTODOS
28
3.1
Materiales
28
3.2
Métodos experimentales y analíticos
28
3.2.1
Obtención de cepa de Rhizobium leguminosarum Biovar trifolii a estudiar.
28
3.2.2
Preparación de medios líquidos.
28
3.2.3
Medios de cultivo sólidos.
30
3.2.4
Preparación de cultivo primario.
31
3.2.5
Efecto de diferentes factores en los cultivos de Rhizobium.
31
3.2.6
Caracterización microscópica de los cultivos.
32
3.2.7
Determinación de velocidades específicas de crecimiento (μmáx).
33
3.2.8
Determinación del peso seco celular (concentración en peso seco celular).
33
3.2.9
Determinación de pH.
33
3.2.10
Determinación de la cantidad de células viables en un cultivo.
34
3.2.11
Determinación de la infectividad (capacidad nodulativa) de los Rhizobium
obtenidos en cada condición de medio de cultivo.
3.2.12
3.2.13
34
Determinación de la efectividad (capacidad de fijar nitrógeno) de los
Rhizobium inoculados.
35
Estadística.
36
ii
4
RESULTADOS
4.1
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de
incubación sobre las velocidades de crecimiento máximas (μmáx).
4.1.1
49
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de
incubación sobre la infectividad y eficiencia de los Rhizobium obtenidos.
4.4.1
45
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de
incubación sobre la biomasa celular (peso celular seco).
4.4
41
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de
incubación sobre los recuentos celulares (ufc/ml).
4.3
39
Efecto de las variables temperatura de incubación, pH y fuente de carbono
utilizados en la velocidad específica de crecimiento μ.
4.2
39
Curvas de crecimiento celular según temperatura de incubación, pH y
fuente de carbono utilizados.
4.1.2
39
54
Análisis estadístico de la homogeneidad de los resultados obtenidos en la
evaluación descrita en 4.4 para los controles positivos y negativos de cada
56
grupo de tratamiento.
4.4.2
Efecto de las condiciones del medio de cultivo e incubación sobre la
infectividad (capacidad nodulativa) de los Rhizobium inoculados en las
59
plántulas.
4.4.3
Efecto de las condiciones del medio de cultivo e incubación sobre la
efectividad de los Rhizobium inoculados en las plántulas.
65
Relación entre los resultados de nodulación (infectividad) y la eficiencia de
la cepa estudiada.
Relación entre los resultados de rendimiento (peso aéreo) de las plántulas
inoculadas respecto a los resultados obtenidos para los controles positivo y
negativo.
70
5
DISCUSIÓN
74
5.1
CONCLUSIONES
81
6
AGRADECIMIENTOS
82
7
LITERATURA CITADA
83
ANEXOS
89
4.4.4
4.4.5
71
iii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Nº
Página
1
Concentración de fuente de carbono por litro de medio de cultivo.
29
2
Concentración de K2HPO4 y KH2PO4 según pH de trabajo.
30
3
Combinaciones de glúcidos y pH estudiados.
30
4
μ según temperatura de incubación y pH utilizados.
42
5
μ según temperatura de incubación y fuente de carbono utilizados.
43
6
μ según pH fuente de carbono utilizados.
44
7
Valores de recuentos celulares según temperatura de incubación, pH y
fuente de carbono utilizados.
46
8
Recuentos celulares según temperatura de incubación y pH utilizados.
46
9
Recuentos celulares según temperatura de incubación y fuente de
carbono utilizados.
47
10
Recuentos celulares según pH y fuente de carbono utilizados.
47
11
Biomasa celular según temperatura de incubación y pH utilizados.
51
12
Biomasa celular según temperatura de incubación y fuente de carbono
utilizados.
52
13
Biomasa celular según pH y fuente de carbono utilizados.
53
14
Peso aéreo de los controles positivos y controles negativos según grupo
57
de tratamiento.
15
Nodulación según temperatura de incubación y pH utilizados.
16
Nodulación según temperatura de incubación y fuente de carbono
60
utilizados.
61
17
Nodulación según pH y fuente de carbono utilizados.
62
18
Efectividad según temperatura de incubación y pH utilizados.
66
19
Efectividad según temperatura de incubación y fuente de carbono
20
utilizados.
67
Efectividad según pH y fuente de carbono utilizados.
68
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Nº
Página
1
Fotografía electrónica de Rhizobium trifolii.
5
2
Esquema de las primeras etapas de infección de la raíz.
7
3
Esquema de la formación del nódulo.
7
4
Fotografía del curvado del pelo radical producto de la acción del
Rhizobium.
5
8
Fotografías de nódulos en raíces de trébol rosado (Trifolium pratense)
(A) y trébol blanco (Trifolium repens) (B).
9
6
Fotografía de nódulos en raíces de soya (C).
9
7
Esquema de las vías metabólicas relacionadas a la enzima nitrogenasa
producida por el bacteroide.
8
Curvas de crecimiento celular a 25ºC, 28ºC y 30ºC de temperatura de
incubación para manitol (M), sacarosa (S) y glicerol (G) a pH 5,5.
9
39
Curvas de crecimiento celular a 25ºC, 28ºC y 30ºC de temperatura de
incubación para manitol (M), sacarosa (S) y glicerol (G) a pH 6,5.
10
18
40
Curvas de crecimiento celular a 25ºC, 28ºC y 30ºC de temperatura de
incubación para manitol (M), sacarosa (S) y glicerol (G) a pH 7,0.
40
11
Efecto sobre μ de la temperatura de incubación según pH utilizado.
42
12
Efecto sobre μ de la temperatura de incubación del cultivo, según fuente
de carbono utilizada.
13
Efecto sobre μ del pH del medio de cultivo, según fuente de carbono
utilizada.
14
43
44
Efecto de la temperatura de incubación del cultivo sobre los recuentos
celulares.
48
v
15
Efecto del pH del medio de cultivo sobre los recuentos celulares.
48
16
Efecto de la fuente de carbono utilizada sobre los recuentos celulares.
49
17
Efecto sobre la biomasa celular de la temperatura de incubación según
pH utilizado.
18
Efecto sobre la biomasa celular de la temperatura de incubación del
cultivo, según fuente de carbono utilizada.
19
52
Efecto sobre la biomasa celular del pH de incubación del cultivo, según
fuente de carbono utilizada.
20
51
53
Plántulas de trébol obtenidas con rhizobios incubados en medio con
glicerol, sacarosa y manitol como fuente de carbono a pH 7,0 y 30ºC de
temperatura de incubación; y los respectivos controles.
21
54
Detalle de nodulación en plántulas de trébol crecidas en tubos con agar
Jensen, inoculadas con rhizobios incubados con glicerol (G), sacarosa
(S) y manitol (M) como fuente de carbono a pH 7,0 y 30ºC de
temperatura de incubación; y los respectivos controles positivo (C+) y
negativo (C-).
55
22
Peso aéreo de los controles positivos según grupo de tratamiento.
58
23
Peso aéreo de los controles negativos según grupo de tratamiento.
58
24
Efecto sobre la nodulación de la temperatura de incubación del cultivo,
según pH utilizado.
25
Efecto sobre la nodulación de la temperatura de incubación del cultivo,
según fuente de carbono utilizada.
26
62
Efecto sobre la nodulación del pH de incubación del cultivo, según
fuente de carbono utilizada.
27
61
63
Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar
manitol como fuente de carbono, sobre la capacidad de nodulación del
Rhizobium.
28
63
Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar
sacarosa como fuente de carbono, sobre la capacidad de nodulación del
Rhizobium.
64
vi
29
Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar
glicerol como fuente de carbono, sobre la capacidad de nodulación del
Rhizobium.
30
Efecto sobre la eficiencia de la temperatura de incubación del cultivo,
según pH utilizado.
31
32
64
66
Efecto sobre la eficiencia de la temperatura de incubación del cultivo,
según fuente de carbono utilizada.
67
Efecto sobre la eficiencia del pH de incubación del cultivo, según fuente
68
de carbono utilizada.
33
Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar
manitol como fuente de carbono sobre la eficiencia del Rhizobium.
34
Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar
sacarosa como fuente de carbono sobre la eficiencia del Rhizobium.
35
70
Gráfico de dispersión de eficiencia de la cepa estudiada según la
nodulación obtenida en las plántulas inoculadas.
37
69
Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar
glicerol como fuente de carbono sobre la eficiencia del Rhizobium.
36
69
71
Gráfico de medias de peso aéreo de los tratamientos de la cepa incubada
a 25ºC, y los resultados obtenidos para los correspondientes controles
positivo y negativo.
38
72
Gráfico de medias de peso aéreo de los tratamientos de la cepa incubada
a 28ºC, y los resultados obtenidos para los correspondientes controles
positivo y negativo.
39
73
Gráfico de medias de peso aéreo de los tratamientos de la cepa incubada
a 30ºC, y los resultados obtenidos para los correspondientes controles
positivo y negativo.
40
73
Gráfico de crecimiento del rhizobio en recuento celular (ufc/mL) versus
absorbancia (a 600 nm).
92
vii
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo Nº
Página
1
Preparación de medios de cultivo.
90
2
Métodos cuantitativos.
91
3
Curva de Crecimiento del Rhizobio.
92
4
Pauta de caracterización de la nodulación según presencia, forma, color,
tamaño, cantidad y distribución de los nódulos en las raíces (Valderrama y
Balocchi, 1994).
5
93
Pauta de Jerarquerización de la nodulación según tamaño, color, cantidad
y distribución de los nódulos presentes en las raíces de las plantas
(Valderrama y Balocchi, 1994).
6
Ejemplo de jerarquerización de la nodulación según tablas en anexos 4 y
5.
7
94
95
Recuentos celulares finales, rendimiento (concentración final en peso
celular seco), tiempos de duplicación y velocidades de crecimiento celular
(μmáx) para cultivos incubados a 25ºC.
8
96
Recuentos celulares finales, rendimiento (concentración final en peso
celular seco), tiempos de duplicación y velocidades de crecimiento celular
(μmáx) para cultivos incubados a 28ºC.
9
97
Recuentos celulares finales, rendimiento (concentración final en peso
celular seco), tiempos de duplicación y velocidades de crecimiento celular
(μmáx) para cultivos incubados a 30ºC.
98
10
Análisis descriptivo para la variable velocidad de crecimiento celular.
99
11
Análisis de varianza para las μmáx obtenidas bajo las diferentes
condiciones de cultivo estudiadas.
12
13
100
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción
para μmáx.
101
Análisis descriptivo para la variable recuento celular.
103
viii
14
Análisis de varianza para los recuentos celulares obtenidas bajo las
diferentes condiciones de cultivo estudiadas.
15
104
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción
para recuento celular
105
16
Análisis descriptivo para la variable biomasa celular.
107
17
Análisis de varianza para los resultados de biomasa celular obtenidos bajo
las diferentes condiciones de cultivo estudiadas.
18
108
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking, según pH y fuente de
carbono, e interacciones para la variable biomasa celular.
19
109
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking, según pH y fuente de
carbono, e interacciones para la variable biomasa celular.
20
110
Valores de peso aéreo, nodulación, eficiencia, controles positivos y
controles negativos para plántulas inoculadas con cultivos incubados a
25ºC.
21
111
Valores de peso aéreo, nodulación, eficiencia, controles positivos y
controles negativos para plántulas inoculadas con cultivos incubados a
28ºC.
22
112
Valores de peso aéreo, nodulación, eficiencia, controles positivos y
controles negativos para plántulas inoculadas con cultivos incubados a
30ºC.
23
113
Análisis descriptivo para los resultados de peso aéreo de los controles
según grupo de tratamiento.
24
114
Análisis de varianza de los valores de peso aéreo obtenidos en los
controles según grupo de tratamientos.
25
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking, según
115
grupo de
tratamientos para la variable peso aéreo de los controles.
26
Análisis descriptivo para la variable infectividad (capacidad nodulativa)
del Rhizobium.
27
116
117
Análisis de varianza para los resultados de infectividad obtenidos según
las diferentes condiciones de cultivo estudiadas.
118
ix
28
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción
para la infectividad de los cultivos de Rhizobium inoculados.
29
Análisis descriptivo para la variable efectividad de los cultivos de
Rhizobium obtenidos.
30
122
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción
para la eficiencia de los cultivos de Rhizobium obtenidos.
32
121
Análisis de varianza para los resultados de efectividad obtenidos según las
diferentes condiciones de cultivo estudiadas.
31
119
Análisis de regresión y de varianza de los resultados de eficiencia en
relación a los resultados de nodulación de la cepa estudiada.
123
125
1
1. RESUMEN
Se estudió el efecto en las cinéticas de crecimiento de una cepa nativa de Rhizobium
trifolii (cepa 9E.I.), de la temperatura de incubación (25ºC, 28ºC y 30ºC), del pH (5,5, 6,5 y 7,0)
y de la fuente de carbono (manitol, sacarosa y glicerol) utilizados en la preparación del medio de
cultivo.
El medio de cultivo base utilizado correspondió al medio Y.E.M. (Yeast Extract
Mannitol) modificado según los requerimientos de cada experiencia. Se inocularon con 10 mL de
un cultivo primario del orden de 1010 ufc/mL de R. trifolii, por duplicado, matraces de 250 mL
con 100 mL de medio cada uno; y se incubaron según la temperatura en estudio en agitador
orbital a 200 r.p.m. Se determinó absorbancia (λ=600 nm) cada dos horas hasta D.O.=1,0 con la
finalidad de determinar μmax a partir de las curvas de crecimiento. Finalizados los períodos de
incubación se inocularon, en cuadruplicado, plántulas de trébol pregerminadas en tubos con agar
Jensen modificado (pH 5,5) con 0,1 mL de los cultivos producidos (1010 ufc/mL); con la
finalidad de determinar el efecto sobre la infectividad (capacidad nodulativa) y la efectividad
(capacidad fijadora de N2) de los Rhizobium obtenidos.
Los resultados de las cinéticas de crecimiento indican valores de μmax más altos a mayor
temperatura y pH de incubación; aumentando considerablemente al incubar los Rhizobium a 30ºC
y pH 7,0. Respecto a la fuente de carbono, la media de los valores de μmax fue mayor para
manitol, menor para glicerol y sacarosa en un punto medio entre estos dos valores; observándose
un aumento considerable al utilizar manitol como fuente de carbono. Con relación a los valores
de recuentos celulares y rendimientos celulares, no se observaron diferencias estadísticamente
significativas respecto a los resultados obtenidos para cada uno de los factores estudiados.
El análisis estadístico de los resultados de infectividad y efectividad indicó, que tanto la
temperatura de incubación como la fuente de carbono utilizada afectarían la capacidad nodulativa
del rhizobio y que los tres factores estudiados influyen en su capacidad fijadora de nitrógeno,
obteniéndose mejores resultados con cultivos incubados a 30ºC, pH 6,5-7,0 y utilizando manitol
o sacarosa como fuente de carbono.
2
SUMMARY
The effects of incubation temperature (25ºC, 28ºC and 30°C), pH (5,5; 6,5 and 7,0) and
carbon source (mannitol, sucrose and glycerol) on growing kinetics of a native strain of
Rhizobium trifolii (strain 9E.I.), was studied.
The basic culture medium was Y.E.M (Yeast Extract Mannitol) modified according to the
requirements of each experience. 250 mL flasks with 100 mL of medium were inoculated with 10
mL of a prime culture from the order of 1010 colony-forming units (c.f.u.)/mL of R. trifolii, in
duplicate. They were incubated according to the studying temperature in shaker at 200 r.p.m.
Absorbency (λ=600 nm) was determined every two hours until O.D.=1.0, in order to get μmax.
in growing curves. Then, fourth clover plants previously germinated at tubes with Jensen agar,
modified (pH 5,5) were inoculated with 0.1 mL of the produced cultures (1010 c.f.u./mL), in
order to determine the effect, on infectivity (nodulation ability) and efficiency (N2-fixing ability),
of the rhizobia.
The results from growing kinetics show major values of μmax. at higher temperature and
pH (30°C and pH 7,0). In reference to the carbon sources, the media of μmax. values was higher
for mannitol, follow by sucrose and then glycerol; a considerable μmax increases was observed
when
mannitol was used as a carbon source. Statistical significant differences were not
observed, regarding to the number of viable cells and cell performance, in relation to the
results obtained for each of the studied factors.
The statistical analysis on infectivity and efficiency show that temperature of incubation,
as well as the carbon source used, would have an effect in the nodulation capacity of the
rhizobia and these three studied variables would have an influence in its N2-fixing ability; getting
better results with cultures incubated at 30°C, pH 6,5-7,0 and using mannitol or sucrose as carbon
source.
3
2. INTRODUCCION
El aumento de los requerimientos alimenticios ha llevado a la necesidad de mejorar la
producción agrícola. Un área importante de este rubro es la ganadería, en la cual se han buscado
nuevas tecnologías que permitan aumentar los rendimientos, tanto de producción lechera como
de carne, en forma eficiente. Con este fin, se ha intentado perfeccionar la alimentación bobina
mejorando las praderas de pastoreo mediante la utilización de
nuevas variedades y
combinaciones de la flora constituyente; así como utilizando diversos tipos de fertilizantes
artificiales. Dentro de estos productos artificiales se cuenta con los fertilizantes del tipo
nitrogenados (Nitromag, Nitrodoble, Urea, etc.), que si bien dan muy buenos resultados en la
producción de leguminosas, tienen como efecto secundario, la alteración de la composición
natural de los suelos con resultados contaminantes, tanto de éstos como de las aguas que los
riegan. Esto, sumado al incremento en el precio de los mismos, producto de la crisis mundial de
abastecimiento de petróleo (principal fuente de energía utilizada en el proceso Haber-Bosch que
convierte el nitrógeno en amonio), lleva a la urgente necesidad de buscar nuevas alternativas que
permitan mejorar la productividad de los suelos, en forma económica y con los mínimos efectos
contaminantes posibles. Es así como se llegó a una alternativa de tipo natural como es la fijación
biológica de nitrógeno.
A fines del 1800 se puso en práctica el uso de suelos inoculados naturalmente para
cultivar semillas de legumbres y suelos (Smith, 1992). En 1896, se autorizó una patente
estadounidense para la inoculación de suelos con Rhizobium para el cultivo de legumbres (Nobbe
y Hiltner, 1896). La fijación biológica de nitrógeno comenzó a volverse popular entre los
agricultores en los años 30, mediante la aplicación de preparados de Azotobacter en los suelos
cultivables de Rusia. Décadas más tarde especies de la familia Frankiaceae fueron utilizadas en
arbustos madereros, cianobacterias en campos de arroz y Azospirillum en maíz para la fijación
de nitrógeno (Burges, 1998). Estas aplicaciones racionales promueven el crecimiento y nutrición
general de las plantas por varios mecanismos que involucran, la fijación biológica del nitrógeno
(mediante Rhizobium, Azotobacter, Frankia, cianobacterias y Azospirillum), la utilización de
4
fosfatos (mediante micorrizas y Penicillium bilaii), y el aprovechamiento de la humedad
proporcionada por las micorrizas (Burges, 1998).
La fijación biológica de nitrógeno, comprendida dentro del ciclo del mismo elemento, es
ecológica y cuantitativamente, el proceso más importante de todos los implicados en el aporte de
este elemento al suelo y corresponde al tercer proceso fundamental que ocurre en la naturaleza,
después de la respiración y la fotosíntesis (Delwiche, 1970). Según Brill (1977) las leguminosas
son las plantas más estudiadas en cuanto a la simbiosis obligada que mantienen con bacterias del
género Rhizobium, debido a su importancia económica y social. Mientras que los fertilizantes
nitrogenados suministran al suelo anualmente 60 millones de TM de nitrógeno y la fijación
química natural representa unos 30 millones, la fijación biológica supone 130 millones de TM; de
éstas algo más de la mitad se deben a la simbiosis Rhizobium-leguminosa. Corresponde además, a
la de mayor significación agrícola tanto por el gran aporte proteico de estas plantas, para la
alimentación humana y animal, como por tratarse de un proceso natural no contaminante.
El proceso de fijación biológica de nitrógeno puede presentarse producto de dos vías ,
ambas realizadas por microorganismos. Una corresponde a la fijación no simbiótica o de
organismos libres, y la fijación simbiótica propiamente tal. Esta última es producto de la
asociación planta bacteria, donde ninguna de ellas es capaz de fijar nitrógeno en forma
independiente (Stanier y col., 1970).
Los microorganismos implicados en el proceso de fijación biológica de nitrógeno
corresponden a procariotas pertenecientes a las familias Frankiaceae, Rhizobiaceae y a la
división Cianobacteria (algas verde-azuladas). Dentro del grupo de bacterias y sistemas fijadores
de nitrógeno se pueden citar los organismos que viven libremente, como las bacterias y algas
verde-azuladas; los sistemas simbióticos, como los de Rhizobium-leguminosa y angiospermaActinomicetes, y las asociaciones y sistemas asociativos de algas verde azuladas, como rizósfera,
filósfera y líquenes. Todos estos sistemas tienen en común la capacidad de utilizar nitrógeno por
medio de la enzima nitrogenasa, pero difieren en cuanto a su fisiología, estructura metabólica y
características genéticas (Hamdi, 1985).
5
De estas familias las bacterias pertenecientes a las especies del género Rhizobium,
desarrollan vida autónoma, pero su actividad fijadora de nitrógeno, salvo en ciertas especies, sólo
ocurre cuando se establece la simbiosis con plantas leguminosas. Los rhizobios fijan nitrógeno
atmosférico a bajas presiones de oxígeno y proveen de amonio a la planta (Shuler y Kargi, 2002).
La asociación Rhizobium-leguminosa corresponde a una simbiosis obligada donde deben estar
presentes ambos elementos simbiontes para formar una estructura específica, denominada
nódulo, dentro de la cual se produce el proceso de fijación de nitrógeno molecular (Burns y
Hardy, 1975).
Las bacterias del género Rhizobium, corresponden a bacterias aeróbicas gram negativas
pertenecientes a la familia Rhizobiaceae (Buchanan y Gibbons, 1975). Son bacterias heterótrofas
capaces de utilizar una amplia variedad de hidratos de carbono. En general, los compuestos
inorgánicos de nitrógeno (NH4 + , NO3-) son suficientes para su desarrollo; pero, según la cepa,
pueden requerirse uno o más aminoácidos y/o vitaminas para obtener resultados óptimos. Se
desarrollan mejor a temperaturas entre 25 y 30ºC, con una variación de pH que oscila entre 6 y 7
(Vincent, 1975).
FIGURA 1. Fotografía electrónica de Rhizobium trifolii.
6
Este género se caracteriza por su capacidad de penetrar los pelos radicales de leguminosas
de zonas templadas y algunas tropicales, e incitar la formación de nódulos radiculares,
convirtiéndose en un simbionte intracelular de la planta huésped. Cuando la planta leguminosa
susceptible y una cepa de Rhizobium compatible son colocados juntos bajo condiciones
favorables, para el crecimiento e infección, ocurre el proceso de nodulación. Este proceso
comienza por la unión del Rhizobium a los pelos radicales emergentes induciendo un
pronunciado encurvamiento en el cual se agrupan las colonias. El encurvamiento de los pelos
radicales se ve estimulado por la producción de auxinas por parte de las bacterias. La pared
celular de los pelos radicales se degrada en esta región por acción de la poligalacturonasa,
permitiendo que las células bacterianas tengan acceso directo a la superficie externa de la
membrana citoplasmática de la planta (Burns y Hardy, 1975; Taiz y Zeiger, 1991).
Durante el período de maduración del nódulo, la bacteria sufre importantes cambios que
culminan en la transformación fisiológica y bioquímica, convirtiéndose en una bacteria
vacuolada o bacteroide. El cambio principal es la capacidad de reducir el nitrógeno atmosférico,
acompañado de la síntesis de leghemoglobina, proteína que se acumula fuera del bacteroide,
alrededor del nódulo y de color rosado a rojo (Burns y Hardy, 1975).
La especificidad que existe entre el Rhizobium y la leguminosa se debe a la presencia de
lectinas dentro del exudado radicular. Estos compuestos son conocidos como fitohemoglobinas y
corresponden a glicoproteínas con la capacidad de aglutinar las células. Esto ha sido estudiado en
Trifolium repens, donde la lectina se ha denominado trifolina (Dazzo y Hubell, 1982, citado por
Rosso, 1985).
Estos organismos se clasifican en especies o grupos de inoculación según la leguminosa
que infectan, y no todas las especies de Rhizobium forman nódulos en las raíces de cualquier
leguminosa (FAO, 1985; Hamdi, 1985).
7
Atracción de los
rhizobios a la raiz
Curvado del pelo radical
Infección de la raíz
FIGURA 2. Esquema de las primeras etapas de infección de la raíz.
Infección de la raíz
Formación del
nódulo y liberación
de las bacterias de las
vías de infercción
FIGURA 3. Esquema de la formación del nódulo.
8
FIGURA 4. Fotografía del curvado del pelo radical producto de la acción del Rhizobium.
Los principales grupos de Rhizobium nodulantes y sus correspondientes especies de
leguminosas cultivadas son:
* R. meliloti
: Medicago, Melilotus, Trigonella.
* R. leguminosarum : Trifolium, Pisum, Vicia, Lens, Cicers, Lathyrus.
* R. Phaseoli
: Phaseolus.
* R. lupini
: Lupinus, Ornithopus.
* R. bradshilotium : Glicine max.
* R. Cowpea : Vignia, Arachnis y otras especies tropicales (FAO, 1985; Hamdi, 1985;
Taiz y Zeiger, 1991).
9
A
B
FIGURA 5. Fotografía de nódulos en raíces de trébol rosado (Trifolium pratense) (A) y
trébol blanco (Trifolium repens) (B).
C
FIGURA 6. Fotografía de nódulos en raíces de soya (C).
10
La especie Lotus pedunculatus ha sido utilizada con éxito en suelos húmedos y ácidos en
Nueva Zelanda y Estados Unidos (Levy, 1970; Lambert, 1974). En relación Lowther (1980)
estudió factores que afectan el establecimiento y crecimiento de praderas sembradas con trébol
blanco variedad Huia (Trifolium repens), con trébol rosado variedad Pawera (Trifolium pratense)
y Lotus pedunculatos variedad Maku, sembradas en suelos ácidos y de baja fertilidad analizados
en consecutivos cortes, encontrando que los rendimientos de Lotus fueron mayores que los
obtenidos por las otras especies solas o en combinación con Lotus. Las cepas de rhizobios para
Lotus pedunculatos presentan características diferentes a otras cepas, son de crecimiento más
lento y alcalinizantes del medio.
La nodulación corresponde a un proceso biológico, y como tal está sujeto a la influencia
de muchos factores que determinarán la eficiencia del proceso. Los factores que afectan la
nodulación se pueden agrupar en climáticos, bióticos, edáficos y otros de diferente origen.
Los factores climáticos se subdividen en la influencia de la temperatura, disponibilidad de
agua (humedad) y luminosidad. La temperatura es uno de los factores más importantes que
afectan a los Rhizobium en el suelo, existiendo una tolerancia diferencial a las temperaturas
dentro del género. Las cepas de R. meliloti son relativamente tolerantes a las altas temperaturas,
entre límites que varían de 36,5ºC a 42,0ºC, llegando a sobrevivir 21 días a 40ºC en un sustrato
de turba; en cambio temperaturas superiores a 35ºC o 40ºC son mortales para R. leguminosarum
y R. lupini (Hamdi, 1985).
Los Rhizobium son más sensibles a las altas temperaturas en condiciones húmedas que en
secas, siendo las temperaturas óptimas de nodulación y eficiencia simbiótica de Rhizobium, en
climas tropicales, los 30ºC; mientras que para especies de climas templados es alrededor de 20ºC
(Bushby, 1982). Las bajas temperaturas producen un retardo en las infecciones radicales que
conducen a la iniciación de la nodulación (Gibbson , 1980). Lie (1974), señala que las
leguminosas de zonas templadas nodulan a temperaturas muy bajas, alrededor de los 7ºC, pero
que bajo éstas, la estructura del nódulo decrece por un menor crecimiento bacteriano.
11
Con respecto a la disponibilidad de agua, una disminución en la disponibilidad de esta
induce a una disminución en la tasa de fijación, lo que puede revertirse al rehidratar, siempre y
cuando las pérdidas no sean superiores al 20% del peso fresco de los nódulos afectados. Lie
(1981) y Masliack (1976) observaron que una disminución del 20% en el contenido de humedad
de los nódulos se traduce en una reducción del 80% de la actividad de fijación. También se ha
descubierto que el oxígeno se vuelve tóxico cuando la humedad relativa alrededor de las
bacterias desciende del 10%, como en el caso de la peletización de la semilla, donde se postula la
utilidad de agregar compuestos antioxidantes (Bushby, 1982). Hamdi (1985) estudió la
sobrevivencia de los Rhizobium en suelos sometidos a deshidratación por la acción del aire,
observando que R. leguminosarum resultó ser el más resistente a la sequía respecto de R. meliloti
y los Rhizobium del grupo de los Lotus spp.
El desarrollo de los nódulos y su funcionamiento está influenciado además por la
intensidad, calidad y duración de la luz. Cambios en la tasa de fotosíntesis producto de cambios
en la intensidad luminosa afectan el suministro de fotosintatos al nódulo, alterando la
disponibilidad de reductantes, ATP y de los compuestos carbonados requeridos para la
asimilación del nitrógeno (Dixon y Wheeler, 1983).
Con relación a los factores bióticos que pueden afectar la formación de colonias de
Rhizobium en las leguminosas los principales microorganismos implicados corresponden a
bacterias productoras de toxinas, los protozoos y los nemátodos (Hamdi, 1985). Algunos hongos
también pueden afectar la nodulación, Fusarium spp. y Sclerotinia sclerotiorum producen un
efecto antagónico sobre una cepa de R. leguminosarum específica para Trébol subterraneo (San
Martín, 1970). Además, existe una mayor competitividad por cepas de Rhizobium spp.
ineficientes por sobre las cepas eficientes en el momento de la infección del pelo radical (Sinha,
1978).
Entre los factores edáficos más importantes se encuentran la presencia de materia
orgánica, el nitrógeno combinado, las concentraciones de fósforo, molibdeno y el pH del suelo.
12
La materia orgánica del suelo parece tener importancia en la supervivencia de los
Rhizobium a través de la limitación de la capacidad predatoria de antagonistas, especialmente
algunas especies de bacteriófagos. Además la presencia de ácidos húmicos y flúvicos estimulan
el crecimiento de algunas especies de Rhizobium (Bushby, 1982). Sin embargo, la acumulación
de materia orgánica puede llevar a un descenso del pH del suelo, el cual puede ser detrimental
para la sobrevida de la bacteria (Fassbender y Barnemisza, 1987).
La inhibición de los procesos de fijación por nitrógeno combinado afecta virtualmente
todas las etapas del proceso, desde la infección y nodulación, hasta la expresión de la actividad
de la nitrogenasa y senescencia del nódulo (Dixon y Wheeler, 1983). Se ha demostrado que el
efecto inhibitorio se debe a una desviación de los fotosintatos que van a las raíces y por lo tanto,
de una privación de éstos a los nódulos (Lim y Burton, 1982). Azcon de Aguilar (1980), citado
por Lim y Burton (1982), sostiene que el efecto inhibitorio estaría regulado por una enzima
llamada glutamina sintetasa, ya que en presencia de amonio y de otros compuestos nitrogenados
inhibe la actividad de la nitrogenasa.
En cuanto al suministro de fuentes nitrogenadas al suelo, Freire (1984) concluye lo
siguiente:
a) Existe una relación inversa entre el nitrógeno mineral y el fijado simbióticamente, esto se
explica por una compensación de los fotosintatos.
b) Es posible obtener respuestas positivas a las aplicaciones de nitrógeno cuando existen
condiciones de estrés o durante estaciones de crecimiento lento en que el tiempo de
nodulación, fijación nitrogenada o ambos pueden ser inhibidos.
c) El suministro de nitrógeno mineral en el período de establecimiento puede ser beneficioso ya
que la fijación comienza entre los 10 a 14 días después de la germinación.
d) Condiciones adversas prolongadas pueden aumentar la influencia del nitrógeno adicionado.
e) Una nodulación pobre o una nodulación que combina leguminosa-Rhizobium con baja
eficiencia, pueden también facilitar una respuesta a la fertilación nitrogenada.
f) Los fertilizantes con nitratos son más detrimentales para la nodulación que los amoniacales y
al parecer, la urea lo es menos que el nitrato y el amonio.
13
La deficiencia de fósforo en la planta puede afectar la fijación y la nodulación por tener
un rol vital en la transferencia de energía, requerida para la reducción del nitrógeno atmosférico a
amoniaco. La deficiencia de este mineral se ve afectada por la adsorción de óxidos de fierro y
aluminio, partículas de arcilla, aluminio intercambiable y manganeso. El suministro de fósforo al
suelo causa un aumento de la concentración de éste y de nitrógeno en el tejido vegetal (Freire,
1984).
El molibdeno es importante ya que forma parte estructural de la nitrogenasa, sin embargo,
su efecto es negativo cuando se encuentra en exceso. Respuestas positivas se han encontrado en
aplicaciones a suelos con pH bajos y con niveles tóxicos de aluminio intercambiable o
manganeso. En cambio, en suelos con pH altos, la disponibilidad de molibdeno es usualmente
adecuada para la fijación de nitrógeno y no hay respuesta a las aplicaciones de este elemento
(Freire, 1984). La alfalfa necesita de 10 a 15 ppm de molibdeno para fijar la máxima cantidad de
nitrógeno, trébol subterráneo en cambio sólo requiere de 4 a 8 ppm (Hamdi, 1985).
El factor edáfico más importante es el pH, sin embargo, no está totalmente comprendido
si los valores de pH bajos en el suelo, sobre el sistema simbiótico, son efecto directo de una alta
concentración de protones sobre el crecimiento de la planta, desarrollo de la raíz y/o propiedades
simbióticas del Rhizobium o indirecto a través de un efecto de la disponibilidad de nutrientes
minerales, los cuales pueden ser esenciales o tóxicos (Gibbson y Jordan, 1983). Se ha
identificado a la acides del suelo como un factor influyente en la sobre vivencia y nodulación del
rhizobio y esto depende directamente de la especie de rhizobio. Las cepas de R. phaseoli son
tolerantes (Bushby, 1981), mientras que R. meliloti son relativamente sensibles a la acidés del
suelo (Lowendorf y Alexander, 1983). Cepas de R. meliloti seleccionadas por su resistencia a la
acidés en medios de cultivo no funcionaron mejores que las cepas ácido sensitivas cuando fueron
inoculadas en el suelo (Lowendorf y Alexander, 1983) Se ha podido establecer que existe una
correlación entre la acidez del suelo y la disponibilidad a la planta de macro y micro nutrientes
tales como: calcio, fósforo, manganeso, aluminio, bromo, molibdeno y cobre. En muchos suelos
ácidos de zonas tropicales, subtropicales y templadas existen niveles tóxicos de aluminio
intercambiable y manganeso. El efecto de toxicidad del aluminio puede perjudicar la simbiosis
14
Rhizobium-leguminosa dañando directamente a la planta hospedera, reduciendo la sobrevivencia
del Rhizobium, o interfiriendo en la nodulación y funcionamiento del proceso simbiótico
(Barrientos y col., 1994).
Los rangos de pH críticos para la nodulación corresponden a: 4,5 a 5,0 según Dixon y
Wheeler (1983); 4,6 a 4,8 (Freire, 1984) y 4,3 a 4,9 (Norris, 1959 y Morales y col., 1973). Dentro
de las especies de Rhizobium, R. meliloti es muy sensible a la acidez, le sigue R. leguminosarum
en un grado menor, mientras que R. japonicum resulta tolerante (Hamdi, 1985). R. trifolii puede
nodular en condiciones de pH 4,5 a 6,5, alcanzando su media a pH 5,0, para una eficiente acción
del Rhizobium (Kim y col., 1985). Se ha demostrado la capacidad de ciertas cepas para soportar
bajos pH y elevadas concentraciones de aluminio en el suelo, sin embargo, es frecuente que este
tipo de cepas tengan una capacidad simbiótica menor. Al respecto, se han desarrollado diversos
estudios para la selección de cepas de rhizobios tolerantes a condiciones extremas de acidez y
niveles elevados de compuestos que inhiben el normal desarrollo de la bacteria. Keyser y Munns
(1979) estudiaron el efecto de la acidez, aluminio y fosfatos sobre cepas de rhizobios,
encontrando que en general la acidez disminuye el crecimiento en cultivos de la mayoría de las
cepas y detiene el crecimiento del 50% de éstas. Una rápida selección de cepas de rhizobios
tolerantes a acidez podría basarse en la habilidad de crecer en cultivos bajo condiciones
estresantes de pH, sin embargo, una mayor tolerancia a la acidez no significa, en consecuencia,
una mayor tolerancia al aluminio.
Keyser y Munns (1979) estudiaron la infectividad y efectividad de cepas de rhizobios de
crecimiento lento sobre variedades de leguminosa, Vigna unguiculata en diversos tipos de suelos
ajustados a pH 4,6 y pH 6,0-6,2. Los resultados obtenidos confirmaron que dentro de los
rhizobios existe una gran variedad en la tolerancia simbiótica a los suelos ácidos, y que algunas
cepas demuestran una combinación de tolerancia-efectividad. Análisis basados en la habilidad
del Rhizobium a crecer en medios de cultivo ácidos y con altas concentraciones de aluminio
permitieron seleccionar aproximadamente el 65% de las cepas que probaron habilidad simbiótica
en ensayos de invernadero.
15
Lowendorf y Alexander (1983) realizaron ensayos que demostraron la posibilidad de
predecir la sobrevivencia de Rhizobium phaseoli en suelos ácidos, según la tolerancia de la
bacteria a crecer en medios ácidos. Además, las cepas que mostraron mayor tolerancia a crecer en
cultivos a pH ácido, fueron capaces de soportar suelos con mayores niveles de aluminio.
Ayanaba y col. (1983) desarrollaron un método en placas con agar, para seleccionar cepas
de rhizobios tolerantes a acidez y concentraciones elevadas de aluminio. Cepas que mostraron
sensibilidad o tolerancia en las placas, demostraron las mismas cualidades al ser crecidas en
medios de cultivo de similares características. Además, las cepas que formaron colonias secas,
puntiformes fueron más sensibles a acidez-aluminio que las que formaron colonias gomosas y
grandes.
Lowendorf y Alexander (1983) estudiaron la obtención de cepas de Rhizobium meliloti
para alfalfa sobre suelos ácidos, encontrando que cepas de Rhizobium meliloti sensibles a
condiciones de acidez sobreviven mejor en suelos alcalinizados, pero no en suelos ácidos, donde
es mejor la sobrevida de las cepas tolerantes. Estudios realizados por el mismo autor sugieren que
las cepas de R. meliloti a ser inoculadas en alfalfa sobre suelos ácidos, deben ser seleccionadas no
solo por simples propiedades saprofíticas; si no por la estimulación de la legumbre huésped en
condiciones de acidez.
Brose (1992) seleccionó cepas de Rhizobium infectivas y eficientes en fijar nitrógeno en
simbiosis con plantas de Lotus pedunculatos, en condiciones de bajo pH, encontrando cepas que
resultaron infectivas pero ineficientes al ser inoculadas en nuevas plantas huésped. Debido a que
estas fueron inicialmente consideradas eficientes, los resultados sugirieron una posible pérdida de
esta cualidad.
Loi y col. (1993) estudiaron la adaptación de Medicago polymorpha al efecto de la
temperatura de crecimiento y estrés ácido en la nodulación e inducción del gen nod, encontrando
diferencias en los genotipos estudiados respecto a la reducción de nodulación en condiciones de
acidez. Estas diferencias no se relacionaron con el pH del suelo de recolección, ni con los efectos
16
del pH en la producción de exudados radicales de los diversos genotipos de plantas, para
estimular la expresión del gen nod en cepas de Rhizobium meliloti.
Parece entonces interesante estudiar formas económicas de obtener cultivos ricos de
Rhizobium capaces de actuar eficientemente bajo las condiciones adversas, principalmente de
acidez de los suelos (Brose, 1992).
En el sur de Chile tenemos suelos con características bastante adversas de acidez y
concentración de compuestos tóxicos para el crecimiento del Rhizobium. Ensayos similares,
apropiadamente modificados, podrían ser de gran utilidad para seleccionar otros grupos de
rhizobios, útiles en el mejoramiento de las praderas del sur de nuestro país.
Cuando los suelos a sembrar con leguminosas tienen deficiencia en la calidad y cantidad
de bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium, es necesario colocar sobre la semilla o
en el suelo cepas que posean la capacidad de nodular y fijar nitrógeno en simbiosis con la
leguminosa huésped (Vincent, 1975). Con la finalidad de maximizar la fijación biológica de
nitrógeno en la agricultura, es necesario asegurar en la infección la participación de cepas
seleccionadas de Rhizobium con alta capacidad de fijación en asociación simbiótica. Esta puede
ser perfeccionada con la inoculación de semillas de leguminosas, para alcanzar una nodulación
temprana y efectiva (Williams, 1984; Hamdi, 1985 y Vincent, 1975).
El principal objetivo de la inoculación de Rhizobium en semillas de leguminosas es que el
microorganismo nodule en la planta hospedera aportando el nitrógeno suficiente para que la
planta pueda crecer en forma adecuada.
La selección de cepas adecuadas es básica para el proceso de producción de inoculantes y
comúnmente demanda cultivos de cepas específicas para especies, grupos de especies o aún
variedades en un grupo de especies (Williams, 1984).
Una nodulación efectiva es un importante criterio utilizado en la selección de cepas, pero
además es recomendable considerar las siguientes características ecológicas y agronómicas:
a) La capacidad para formar nódulos en competencia con cepas nativas o naturalizadas.
17
b) Competitividad saprofítica que le permita sobrevivir y multiplicarse en los suelos en presencia
o no de la planta huésped (aunque actualmente se cree que a veces esta propiedad no es
deseable pues en algunas ocasiones no permite que se instale en el suelo una nueva cepa)
c) Nodular rápida y efectivamente bajo un amplio rango de temperaturas radiculares.
d) Crecer bien en condiciones de caldos de cultivo,
e) Sobrevivir en el soporte del inoculante y en la semilla.
f) Resistir variaciones de pH del suelo, tolerar macro y micronutrientes y pesticidas en una
proximidad cercana.
g) Poseer estabilidad genética del cultivo de Rhizobium. (Hallyday, 1984; Hamdi, 1985;
Roughley, 1970 Thompson, 1988 y Williams, 1984).
El proceso de selección de cepas normalmente involucra aislamientos preliminares de
numerosas recolecciones, usando como criterio selectivo la nodulación en plantas en macetas,
jarras Leonard o el desarrollo de plantas en macetas bajo condiciones de invernadero. También
pueden usarse salas iluminadas o condiciones de crecimiento de plantas inoculadas en cámaras
climáticas (Williams, 1984). Estas cámaras son especialmente útiles al seleccionar cepas por el
método de inoculación de plántulas en cultivo encerrado en agar para plántulas, como el medio
desarrollado por Jensen (1942), el cual permite realizar una selección rápida (6 a 8 semanas) en
muy poco espacio de incubación de las plántulas.
Las suspenciones bacterianas de Rhizobium a inocular deben tener una concentración de
aproximadamente 109 a 1010 células/mL (Balatti, 1982). Hoy en día es posible obtener recuentos
celulares mayores de 1010 células/mL en tiempo de procesos que varían de 30 a 48 h según los
casos. Para lograr esos niveles de células se deben tener en cuenta tanto los requerimientos
nutricionales de las cepas como, las condiciones de operación que incluyen aireación, velocidad
de agitación, concentración del inóculo, pH, condiciones de esterilización, etc. (Balatti y col.,
1991).
Los requerimientos nutricionales de las cepas de Rhizobium varían según las especies en
sus necesidades de fuente de carbono, fuente de nitrógeno, factores de crecimiento, elementos
minerales y necesidades de oxígeno (Balatti, 1992). Los microorganismos de este género pueden
18
emplear una variedad de fuentes de carbono tales como mono y disacáridos, poli alcoholes y
ácidos orgánicos. En cuanto a las diferencias que presentan las cepas en su velocidad y capacidad
de utilizar determinada fuente de carbono, están relacionadas con las rutas metabólicas que ponen
en juego la degradación de los sustratos.
Los Rhizobium de crecimiento rápido tienen las enzimas del camino metabólico EmbdenMeyerhoff-Parnas, fosfatos de pentosas y Entner-Doudoroff (no poseen la enzima aldolasa). En
los Rhizobium de crecimiento lento debido a la falta de enzima 6-fosfogluconato deshidrogenasa
se hacen dependientes de la vía Entner-Doudoroff (Vincent, 1977).
FIGURA 7. Esquema de las vías metabólicas relacionadas a la enzima nitrogenasa
producida por el bacteroide.
19
Para definir cuantitativamente las fuentes de carbono es necesario conocer el rendimiento
del sustrato a utilizar (Pirt, 1975). En general se estima, para glúcidos, que este valor está
comprendido entre 0,4 - 0,5 gramos de células/gramo de fuente de carbono utilizada (Balatti,
1992).
Respecto a la fuente de nitrógeno, las bacterias de éste género utilizan nitratos y/o sales de
amonio e incluso a veces nitritos. Entre las fuentes nitrogenadas orgánicas simples y compuestas
que son utilizadas por estos microorganismos, podemos mencionar urea, extracto o agua de
macerado de maíz, hidrolizado de caseína, peptonas, subproductos o residuos industriales (Avellá
y col., 1987; Boiardi y col. 1985).
En cuanto a los requerimientos de vitaminas el grupo de microorganismos de crecimiento
rápido necesita una mayor cantidad de vitaminas tales como biotina, tiamina y pantotenato de
calcio (Chakrabarti y col., 1981). Por lo general estas exigencias, salvo casos especiales, se
aseguran integrando los medios de desarrollo con levadura ya sea como extracto o agua de
levadura. Es importante tener presente que un aumento de concentración del extracto por sobre 6
g/L en algunas cepas produce formas aberrantes o inhibición en el crecimiento. Este efecto puede
deberse a una modificación en la concentración de calcio y magnesio como consecuencia de la
formación de quelatos (Vincent, 1980).
Respecto a las necesidades de elementos minerales, el género Rhizobium posee los
requerimientos generales de las bacterias gram negativo. El fósforo se aporta a los medios en
general como fosfato soluble. El contenido de fósforo de la célula bacteriana es del orden del
1,5% del peso seco de la célula, pero este valor varía con la velocidad de crecimiento y la
temperatura y es proporcional al contenido de RNA del microorganismo. Para bacterias gram
negativo la relación Mg:K:RNA:P es 1:4:5:8 siendo la misma independiente de la velocidad de
crecimiento y de la temperatura (Pirt, 1975). En relación con los requerimientos de potasio se ha
determinado un rendimiento de 60 g de biomasa/g de potasio. La necesidad de potasio se
incrementa con la velocidad de crecimiento de la célula, lo cual se traduce además en un
incremento del RNA de la biomasa. En cuanto a rendimiento de biomasa por gramo de magnesio
consumido, está en el orden de 300 a 900 g y en relación indirecta al contenido de RNA. En lo
20
que concierne al azufre, el rendimiento en biomasa es de 300 g/g de azufre y generalmente se
provee al medio como sulfato o en la forma de cistina y cisteína. Se deben agregar además
oligoelementos (Gibson, 1963). En cuanto a elementos trazas se puede concluir en forma general
que los requerimientos son conocidos cualitativamente y por esta razón se adicionan a los medios
de cultivo en cantidades arbitrarias. Es difícil demostrar la necesidad de elementos traza en razón
de que ellos se encuentran en cantidad suficiente como impurezas de otros constituyentes del
medio; además el extracto de levadura, generalmente utilizado, posee cantidades apreciables de
los mismos y satisface las necesidades de las cepas del género Rhizobium para su normal
desarrollo (Vincent, 1974; 1977).
Las velocidades de crecimiento de los microorganismos en cultivos controlados
dependerá además del sistema de cultivo empleado. El cultivo de estos géneros, puede ser
llevado a cabo aplicando diferentes sistemas y en equipos distintos, que por otra parte pueden ser
comunes para la obtención de células en general y para la obtención de metabolitos de interés
industrial.
Los sistemas más comúnmente empleados son el cultivo en sistema discontinuo (batch),
cultivo en sistema discontinuo alimentado (fed-batch), cultivo continuo o sistema sobre sustrato
sólido. La estructura básica de los sistemas de fermentación ha sido descrita y discutida en detalle
por Pirt (1975) y Moser (1985 a, b y c).
Desde el punto de vista industrial, para la obtención de inoculantes, cualquiera de los
sistemas antes indicados puede ser empleado y aplicado.
El cultivo en sistema discontinuo (batch), utilizado en el presente trabajo, se refiere al
cultivo de células en un envase con una carga inicial de medio que no es alterada por posteriores
adiciones de nutrientes o remociones de productos del metabolismo de las células cultivadas
(Shuler y Kargi, 2002). Este sistema simple de cultivo es ampliamente utilizado en el laboratorio
y es el sistema más empleado en la producción industrial de microorganismos, y es la primera
etapa utilizada en el desarrollo de los otros sistemas. Numerosos parámetros han sido estudiados
en diversos microorganismos sobre la base de éste método. La principal característica de éste
21
sistema de cultivo es la variación de concentración de cada uno de los componentes del medio de
cultivo en el tiempo. Normalmente sólo se adiciona aire durante el proceso y las células se
desarrollan hasta existir condiciones de disminución de nutrientes o acumulación de metabolitos
que producen inhibición del crecimiento (Rehm, 1995).
Los ensayos destinados al estudio de requerimientos nutricionales, efectos de la
concentración de nutrientes y preparación de inóculo en su primera etapa, se realizan en
erlenmeyers, que son colocados en máquinas rotatorias o de vaivén, siendo más utilizadas las
primeras. Estos agitadores favorecen una muy buena transferencia de oxígeno que satisface, en la
mayoría de los casos, la demanda celular de oxígeno de los microorganismos (Bylinkina y col.,
1972).
La multiplicación celular se lleva a cabo en varias fases (Pirt, 1975): fase de latencia, fase
de aceleración, fase exponencial, fase de desaceleración, fase estacionaria y fase de declinación o
muerte celular. Lo deseable en los cultivos en sistema discontinuo es que la fase de latencia sea
lo más corta posible para maximizar la fase de crecimiento exponencial.
Fase de latencia:
Esta fase ocurre inmediatamente después de la inoculación del medio con la cepa a
desarrollar y es un período de adaptación de las células al nuevo ambiente. Los microorganismos
reorganizan sus constituyentes moleculares cuando son transferidos a un nuevo medio.
Dependiendo de la composición de los nutrientes, nuevas enzimas son sintetizadas, la síntesis de
otras enzimas es reprimida, y todo el sistema metabólico de las células se adapta a la nueva
condición de medio ambiente. Al adicionar un inóculo a un medio de cultivo las células se deben
adaptar a esta nueva condición; esto hace que la duración de la fase de latencia varíe y dificulte
su estimación. Durante esta fase la masa celular se incrementa sólo un poco, sin incremento en la
concentración celular. Cuando el inóculo es pequeño, y tiene una baja concentración de células
viables, se produce una seudo fase de latencia, que es el resultado no de adaptación, sino de una
muy pequeña cantidad o pobres condiciones del inóculo (Shuler y Kargi, 2002). Este período es
22
en general más corto cuando las células que forman el inóculo corresponden a células de la fase
exponencial de crecimiento, previamente desarrolladas bajo similares condiciones de cultivo.
Baja concentración de algunos nutrientes y factores de crecimiento podrían causar una
larga fase de latencia. Por ejemplo, la fase de latencia de Enterobacter aerogenes que se
desarrolla en medio con glucosa y buffer fosfato, se incrementa cuando la concentración de Mg 2+
disminuye, debido a que este es un activador de la enzima fosfatasa.
La edad del inóculo tiene un efecto muy fuerte en la duración de la fase de latencia. Esta
edad se refiere a cuanto tiempo se mantuvo el cultivo inóculo en cultivo batch. Usualmente, el
período de latencia se incrementa con la edad del inóculo. En algunos casos, existe una óptima
edad del inóculo que se traduce en una mínima fase de latencia. Para minimizar la duración de
este período, las células deben ser adaptadas al medio de cultivo y condiciones antes de la
inoculación, y las células deben ser jóvenes (células de la fase exponencial) y activas, y el
tamaño del inóculo debe ser grande (5% a 10% del volumen de medio a inocular) (Shuler y
Kargi, 2002). Durante esta fase prácticamente no existe formación de biomasa.
dx/dt = 0
Fase de aceleración:
Esta fase generalmente muy corta se encuentra entre las fases de crecimiento logarítmico
y de crecimiento exponencial. El valor de  (velocidad de crecimiento celular) varía de cero a m
( en la fase exponencial).
Fase de crecimiento exponencial:
En ésta fase las células se encuentran adaptadas al nuevo medioambiente. Después de este
período de adaptación las células pueden crecer rápidamente, y tanto la masa como el recuento
celular se incrementan en forma exponencial con el tiempo. Este es un período de crecimiento
balanceado, en el cual todos los componentes de las células se desarrollan bajo la misma tasa de
crecimiento. Esto se traduce en que la composición de una célula individual permanece
prácticamente constante durante esta fase de crecimiento (Shuler y Kargi, 2002).
La
23
multiplicación celular se encuentra en su máxima expresión durante esta fase; sin embargo, todos
los constituyentes esenciales del medio de cultivo deben encontrarse en cantidades suficientes
para permitir un buen desarrollo celular y no deben existir factores inhibitorios. Debido a que la
concentración de nutrientes es abundante durante esta fase, la tasa de crecimiento es
independiente de la concentración de éstos. Bajo éstas condiciones, el crecimiento se define por
la siguiente ecuación:
y
dx/dt = m X
(1)
lnX – lnX0 = m t
(2)
donde ln(X /X0) = m t
(3)
así la ecuación fundamental de los cultivos en batch es:
X = X0 e m t
(4)
El tiempo de duplicación celular (td) puede ser calculado a partir de la ecuación (4), asumiendo
que:
X = 2 X0
y
t = td
td = ln 2/m = 0,693/m
(5)
td es así definido como el tiempo de generación celular.
Fase de desaceleración:
Esta fase sigue a la fase exponencial. En la mayoría de los casos la producción de biomasa
se detiene cuando la concentración de los componentes del medio que limitan el crecimiento
celular es consumida. Monod (1942) observó que la variación de la tasa crecimiento de acuerdo
con la concentración de los compuestos limitantes del crecimiento estaba dada por la siguiente
ecuación:
 = m (S/(Ks + S)
(6)
24
Donde S (g/L) representa la concentración del componente limitante y KS (g/L) es la constante de
saturación.
Para un típico cultivo de bacterias, estos cambios ocurren durante un muy corto período
de tiempo. Estos cambios rápidos del medio ambiente se traducen en un crecimiento no
balanceado, durante el cual la composición y tamaño celular cambiarán. En la fase exponencial,
el sistema de control metabólico de las células es programado para funcionar a una máxima tasa
de producción. En la fase de desaceleración, el estrés inducido por la falta de nutrientes o gran
acumulación de metabolitos, causan una reestructuración de las células para prolongar la sobre
vivencia en un medio hostil (Shuler y Kargi, 2002).
Fase estacionaria:
Esta fase se inicia inmediatamente después de la fase de desaceleración, cuando la tasa
neta de crecimiento celular es cero (no existe división celular) o cuando la tasa de crecimiento es
igual a la tasa de mortandad. Sin embargo, a pesar de que la tasa de crecimiento es cero durante
esta fase, las células se encuentran metabolicamente activas y producen metabolitos segundarios.
Los metabolitos primarios están relacionados a productos de la etapa de crecimiento y los
metabolitos segundarios están relacionados a ésta etapa de no-crecimiento. En efecto, la
producción de ciertos metabolitos es gatillada y favorecida durante esta fase (por ejemplo
antibióticos, algunas hormonas, etc.) debido a la regulación metabólica. Durante el transcurso de
la fase estacionaria, uno o más de los siguientes fenómenos se producen:
1.
La masa celular total se mantiene constante, pero el número de células viables podría
decrecer.
2.
Podría ocurrir lisis celular y aumento de la masa celular viable. Podría ocurrir una segunda
fase de crecimiento y las células podrían crecer a partir de los productos de la lisis de las
células (crecimiento críptico).
3.
Las células podrían no crecer pero tener un activo metabolismo para producir metabolitos
segundarios. La regulación celular cambia cuando la concentración de ciertos metabolitos
25
(carbón, nitrógeno, fosfato, etc.) se ve disminuida. Se producen metabolitos segundarios
como resultado de la desregulación del metabolismo.
Fase de declinación o muerte celular:
Esta fase sigue a la fase estacionaria, sin embargo algunas células comienzan a morir
durante la fase estacionaria y no siempre es posible determinar una clara demarcación entre estas
dos fases. A menudo la lisis de las células muertas y los nutrientes liberados al medio son
utilizados por los organismos vivos durante la fase estacionaria. Al final de la fase estacionaria,
debido a la falta de nutrientes o a la acumulación de productos tóxicos, comienza la fase de
declinación (Shuler y Kargi, 2002).
Los patrones del crecimiento microbiano se ven influenciados además por las condiciones
ambientales tales como la temperatura, pH y concentración de oxígeno disuelto.
La temperatura es un importante factor que afecta la actividad de las células. A medida
que la temperatura se incrementa hasta alcanzar la temperatura óptima de crecimiento, la tasa de
crecimiento aproximadamente se duplica cada 10 ºC de incremento en la temperatura de
incubación. Sobre el rango de temperatura óptimo, la tasa de crecimiento decrece y se podría
producir muerte celular por sobre temperatura. Cuando la temperatura es incrementada sobre la
temperatura óptima, los requerimientos de mantención de las células se incrementa y el
coeficiente de mantención se incrementa con una energía de activación de 15 a 20 kcal/mol.
La concentración de iones hidrógeno (pH) afecta la actividad de las enzimas y por ende la
tasa de crecimiento microbiano. Generalmente, el rango de pH aceptable varía alrededor de lo
óptimo por +1 a 2 unidades de pH. Diferentes organismos tienen diferentes pH óptimos, y
muchos tienen mecanismos para mantener el pH intracelular a niveles relativamente constantes
en presencia de fluctuaciones en el pH del medio que los rodea. Cuando el pH discrepa del valor
óptimo, los requerimientos de energía de mantención se incrementan. Una consecuencia de
diferentes pH óptimos es que el pH del medio puede ser utilizado para seleccionar un organismo
de otro. Por lo tanto, es muy importante el control de pH por medio de la utilización de buffers o
un sistema activo de control de pH.
26
El oxígeno disuelto es un importante substrato en las fermentaciones aeróbicas y podría
ser un substrato limitante, ya que el oxígeno gaseoso es parcialmente soluble en agua. A altas
concentraciones celulares, la tasa de consumo de oxígeno podría superar la tasa de oxígeno
suministrado al medio, produciéndose limitaciones de consumo de oxígeno (Shuler y Kargi,
2002).
Así, la velocidad de crecimiento máxima se dará mientras la bacteria cuente con los
nutrientes necesarios y no exista acumulación de algún metabolito inhibitorio; y dependerá de las
condiciones de pH, disponibilidad de fuente de carbono, temperatura, oxigenación, establecidas
para su desarrollo.
Se planteó como hipótesis de trabajo que la variación en las condiciones de producción
de cultivos de una cepa nativa de Rhizobium, podría afectar la capacidad simbiótica de la bacteria
al inocular plántulas de trébol pregerminadas, en un medio con características de acidez similares
a las condiciones encontradas comúnmente en los suelos del sur de Chile.
27
OBJETIVOS

Obtener cultivos de una cepa nativa de Rhizobium trifolii crecidos bajo diferentes
condiciones de incubación (fuente de carbono, pH del medio y temperatura de
incubación); evaluando el efecto de estas variables sobre las velocidades específicas de
crecimiento (), biomasa final y recuento celular.

Evaluar el efecto de cada una de estas variables sobre la capacidad de respuesta infectiva
(formación de nódulos) y efectiva (fijación de nitrógeno) al inocular plántulas de trébol
rosado (Trifolium pratense) pregerminadas en tubos con agar Jensen en medio ácido.
28
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
Materiales.
La preparación de los medios de cultivo, realización de los experimentos y los
correspondientes análisis, se realizaron en los diversos laboratorios y dependencias con que
cuenta el Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) de la Universidad
Austral de Chile.
Los equipos utilizados en los diversos procesos incluyen, entre otros, autoclave (Selecta,
modelo CE 95), balanza analítica (Chyo, modelo JK-200), cámara de flujo laminar (Advanced
Instruments, Inc.), agitador orbital termoregulado (Trilab), espectrofotómetro (Pye Unicam,
modelo SP8-100 UV/Vis), pH-metro (26 Radiometer), cámara de cultivo (Gallenkamp, modelo
IH-100), ultracentrífuga (Beckman, modelo J2-HS), estufa de secado (Gallenkamp, modelo Size
Two), material de vidrio y otros elementos incorporados en los métodos utilizados.
3.2
Métodos experimentales y analíticos.
3.2.1 Obtención de cepa de Rhizobium leguminosarum Biovar trifolii a estudiar.
La cepa de Rhizobium trifolii estudiada corresponde a la cepa 9 del Ensayo de Invierno
(9 E I) del cepario seleccionado en 1994 dentro de las primeras fases del Proyecto Fondef AI-22
de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile. Se eligió esta cepa por
poseer cualidades de replicación, crecimiento en medios líquidos y de simbiosis nodulativa,
muy buenas para los estudios deseados.
3.2.2 Preparación de medios líquidos
Los medios de cultivo líquido utilizados fueron preparados sobre la base del medio
Y.E.M. (Yeast Extract Mannitol) descrito por Vincent (1975) (Anexo 1), modificado
reemplazando el manitol por sacarosa o glicerol como fuentes de carbono y utilizando buffer
fosfato para la regulación a los pH de trabajo requeridos.
29
Para reemplazar manitol por sacarosa o glicerol se determinaron las cantidades
necesarias de cada uno de estos compuestos para obtener soluciones de igual concentración de
carbono. De acuerdo a estudios realizados por Vincent (1977), los medios de cultivo deben
contener alrededor de 10 g/L de manitol como fuente de carbono para obtener un crecimiento
celular adecuado. Considerando que en 10 g de manitol (C6H14O6 , PM = 182,17 g/mol) se
tienen 3,95 g de carbono disponibles, se calcularon las concentraciones necesarias de sacarosa y
glicerol para obtener igual cantidad de carbono disponible (Cuadro 1).
CUADRO 1 Concentración de fuente de carbono por litro de medio de cultivo.
Fuente
de Carbono
Concentración
(g/L)
Manitol
10,00
Sacarosa
9,39
Glicerol
10,11
Para mantener los medios de cultivo a los pH de trabajo se determinaron las
concentraciones de buffer fosfato requeridas para cada condición reemplazando los valores de pH
y pKa en la ecuación de Henderson Hasselbach.
pH
=
pKa
+
log [Base 
[Ácido
Ecuación de
Henderson Hasselbach
El fósforo debe ser aportado a los medios de cultivo no sólo como buffer; ya que la célula
también requiere de este elemento en forma estructural. Considerando que según Balatti (1992) el
rendimiento en peso celular seco utilizando hidratos de carbono como fuente de carbono se
estima en 0,4-0,5 g células/g fuente de carbono utilizada y si en estos experimentos se utilizó el
equivalente a 10 g/L de manitol, se tendrá que en condiciones óptimas de crecimiento celular se
podrían obtener alrededor de 5 g/L células. Si el 1,5 % de estas células corresponde a fósforo
(Balatti, 1992; Pirt, 1975), se necesitan 0,075 g de este elemento para satisfacer sólo los
requerimientos celulares, lo que obligó a ajustar las cantidades de buffer para satisfacer dicha
demanda sin afectar las condiciones amortiguadoras (Cuadro 2).
30
CUADRO 2 Concentración de K2HPO4 y KH2PO4 según pH de trabajo.
pH del medio de
cultivo
[K2HPO4
[KH2PO4
(g/L)
(g/L)
7,0
0,567
0,702
6,5
0,198
0,775
5,5
0,021
0,823
Sobre la base de estas fuentes de carbono y pH se prepararon en duplicado medios de
cultivo según las siguientes combinaciones (Cuadro 3).
CUADRO 3 Combinaciones de glúcidos y pH estudiados.
Fuente
pH del medio
de carbono
Manitol
5,5
6,5
7,0
Sacarosa
5,5
6,5
7,0
Glicerol
5,5
6,5
7,0
3.2.3 Medios de cultivo sólidos
Como medios de cultivo sólido se utilizaron el medio Y.E.M. agar rojo Congo (Vincent,
1970) y el medio agar Jensen (Jensen, 1942).
a.- Medio Y.E.M. agar rojo Congo (Yeast Extract Manitol agar rojo Congo): se preparó
según se indica en el anexo 1 y se utilizó en la elaboración de placas de cultivo específicas
para la determinación de Rhizobium. Estas placas se usaron en los recuentos de unidades
31
formadoras de colonias de diluciones de los cultivos obtenidos en cada experiencia. Las
colonias características son por lo general pequeñas colonias acuosas o blancas, que no
absorben el tinte rojo, mucosas, ligeramente abombadas u ovaladas, sobre la superficie del
agar.
b.- Medio Agar Jensen: se preparó según se indica en el anexo 1 y se utilizó en las
determinaciones de infectividad (capacidad nodulativa) y efectividad (capacidad de fijar
nitrógeno) de los Rhizobium producidos.
3.2.4 Preparación de cultivo primario.
Se preparó un cultivo primario a partir de una colonia de la cepa 9 EI de Rhizobium
aislada de una placa de medio Y.E.M. agar rojo Congo e inoculada en 100 mL de medio Y.E.M.
Transcurridas 48 horas de agitación en agitador orbital termoregulado a 30+0,5ºC y 200 r.p.m. se
obtuvo un cultivo de densidad óptica de 1,0 (1010 ufc/mL, según curva de crecimiento en anexo
3). Se comprobó su pureza mediante la observación microscópica de un frotis teñido por la
técnica de Gram y se mezcló con 100 mL de glicerol Merck pro análisis en condiciones
estériles. Se llevaron fracciones de 2,0 mL dicha mezcla a tubos Eppendorf estériles apropiados
para su congelación a -25+3°C (Balatti 1992).
Con la finalidad de confirmar la pureza del cultivo congelado, se sembraron alícuotas de
0,1 mL de diluciones sucesivas de dicho cultivo en placas con medio Y.E.M. agar rojo Congo,
observándose un 100% de pureza.
3.2.5 Efecto de diferentes factores en los cultivos de Rhizobium.
Se inoculó en duplicado, con 1 mL del cultivo primario congelado descrito en la sección
3.2.4., matraces con 100 mL de los medios líquidos descritos en la sección 3.2.2, variando
solamente el factor estudiado. Estos matraces fueron incubados en agitador orbital termoregulado
a 200 r.p.m. para las condiciones de fuente de carbono, pH y temperatura correspondientes a
cada estudio.
32
Efectos estudiados
a.- Fuente de carbono se inocularon medios con diferente contenido de fuente de carbono
(manitol, sacarosa y glicerol) como se describe en la sección 3.2.2
b.- pH su efecto fue estudiado ajustando los medios descritos en (a), a los pH 7,0 6,5 y 5,0
como se describe en la sección 3.2.2 con la finalidad de obtener cultivos con diferentes
condiciones de pH del medio de cultivo.
c.- Temperatura se realizaron incubaciones a 25ºC, 28ºC y 30 C de los cultivos preparados
en (a) y (b) para estudiar posibles variaciones en el crecimiento celular a diferente
temperatura de incubación.
Con la finalidad de realizar curvas de crecimiento se realizaron determinaciones de D.O.
(Densidad Optica) a 600 nm de muestras tomadas durante cada período de incubación como se
describe en la sección 3.2.7.
Finalizados los períodos de incubación (D.O.=1,0) y previa caracterización microscópica
de los cultivos (sección 3.2.6); se realizaron determinaciones de sólidos totales, pH y recuentos
de células viables de cada uno de estos cultivos.
Con la finalidad de determinar efectos nodulativos y de fijación de nitrógeno (secciones
3.2.12 y 3.2.13 respectivamente) de los Rhizobium incubados en cada una de estas condiciones,
se inocularon plántulas pregerminadas de trébol rosado (Trifolium pratense cultivar Quiñequeli)
en tubos de agar Jensen como se describe en la sección 3.2.11.
3.2.6 Caracterización microscópica de los cultivos.
Para verificar la pureza de los cultivos obtenidos se realizaron tinciones de Gram de frotis
de cada uno de estos observándose por microscopía de campo claro el tipo de tinción y forma de
las bacterias. Los caracteres distintivos a esperarse corresponderían a bacterias Gram negativas
en forma de bastones de una longitud aproximada de 2 m y 0,5 a 1 m de ancho (Buchanan y
Gibbons, 1975).
33
3.2.7 Determinación de velocidades específicas de crecimiento (máx).
Con la finalidad de observar variaciones en la velocidad específica de crecimiento del
Rhizobium bajo las distintas condiciones de fuente de carbono, pH y temperaturas de incubación,
se graficaron las determinaciones de D. O. a 600 nm de muestras tomadas de cada cultivo
durante el transcurso de estas incubaciones. A partir de las respectivas curvas de crecimiento
obtenidas, se determinaron las velocidades específicas de crecimiento (máx) para cada condición
de cultivo.
Esto se realizó determinando los tiempos de duplicación bacteriana, que
correspondería al tiempo necesario para duplicar un valor de absorbancia medido en la fase de
crecimiento exponencial de la curva. Reemplazando estos valores en la fórmula descrita por
Nielsen y Villadsen (1993) para la determinación de la velocidad de crecimiento máxima (máx)
max
=
ln (X/X0)
t
Donde X/X0 = 2, ya que X corresponde exactamente al doble de concentración celular
que X0 y t es el tiempo necesario para duplicar la concentración X0; por lo tanto la ecuación
resultante se simplifica a:
max
=
ln 2
t
=
0,693
t
3.2.8 Determinación del peso seco celular (concentración en peso seco celular = biomasa).
Se determinó por el método gravimétrico (A. O. A. C. 16032, 1984) modificado descrito
en el anexo 2.
3.2.9 Determinación de pH.
Se realizaron determinaciones de pH de los medios de cultivo antes de inocular y
finalizados los procesos de incubación. Las muestras fueron analizadas inmediatamente luego de
obtenidas, usando un pH-metro Radiometer modelo PH M 26.
34
3.2.10 Determinación de la cantidad de células viables en un cultivo.
Para el recuento de las células viables en las muestras se utilizó el método de diluciones
sucesivas (Vincent, 1970) modificado descrito en el anexo 2.
3.2.11 Determinación de la infectividad (capacidad nodulativa) de los Rhizobium obtenidos
en cada condición de medio de cultivo.
Esta determinación se realizó según el método de cultivo de plántulas inoculadas con
cepas de Rhizobium en agar Jensen (anexo 1). Las determinaciones se realizaron en bloques que
correspondieron a grupos de tratamiento, cada uno de los cuales incluyó su correspondiente
control positivo y negativo. Para cada combinación de temperatura, pH y fuente de carbono
estudiadas se obtuvieron dos cultivos finalizando su etapa de crecimiento exponencial (D.O. 
1,0), cada uno de los cuales fue inoculado sobre plántulas pregerminadas por cuadruplicado. Se
incluyó en cada bloque controles positivos con presencia de nitrógeno (0,05% nitrato de potasio)
sin inoculante y controles negativos en ausencia de nitrógeno y sin presencia de inoculante. Estos
controles fueron preparados sobre plántulas pregerminadas y adicionados por cuadruplicado a
cada grupo de tratamientos. Los tubos de agar Jensen con las plántulas inoculadas y los controles
fueron colocados al azar sobre gradillas especialmente diseñadas para este efecto y que
mantenían la zona inferior radicular en oscuridad, mientras que permitían un libre paso de luz
hacia la parte aérea de plántulas en los tubos. Las gradillas fueron dispuestas sobre repisas de
crecimiento en cámara controlada respecto a ciclo circadiano, intensidad de luz, temperatura,
aireación y humedad del Laboratorio de Rhizobiología de la Facultad de Ciencias Agrarias,
Universidad Austral de Chile. Estas condiciones fueron controladas durante la realización de todo
el experimento. Finalizada cada etapa de crecimiento, determinada por el momento en que los
controles negativos comienzan a cenecer (aproximadamente 40-50 días) se realizaron
evaluaciones cuantitativas para determinar los niveles de respuesta obtenidos para cada condición
de inoculación según las pautas tanto de caracterización de nodulación como de jerarquización de
la nodulación (Valderrama y Balocchi, 1994) basadas en la combinación de las variables
presencia, forma, color, tamaño, cantidad y distribución de los nódulos en sus distintos niveles
(Anexos 4, 5 y 6).
35
En los anexos 20, 21 y 22 se presentan los promedios de los resultados de peso aéreo, nodulación
y eficiencia obtenidos de las cuatro réplicas de cada duplicado de cada combinación de las
condiciones estudiadas (temperatura, pH y fuente de carbono de incubación de la cepa de
Rhizobium inoculada en las plántulas).
Los valores de los controles positivos corresponden a los promedios de los pesos aéreos de las
cuatro plántulas crecidas bajo condiciones de presencia de nitrato de potasio, incluidas en cada
bloque o grupo de tratamientos (Anexos 20, 21, 22, 23 y 25).
Los valores de peso aéreo de los controles negativos fueron determinados y utilizados para los
cálculos de eficiencia en relación con los rendimientos de la parte aérea de las plántulas
obtenidas para cada condición estudiada (Anexos 20, 21, 22, 23 y 25).
3.2.12 Determinación de la efectividad (capacidad de fijar nitrógeno) de los Rhizobium
inoculados.
La evaluación de efectividad en la fijación de nitrógeno se realizó por determinaciones de
peso seco (60+2 C, 72 h) de la parte aérea de cada planta obtenida en la sección 3.2.11; debido
a la comprobación de que la relación entre la parte aérea de las plantas y las raíces es mayor
cuando las plantas poseen un adecuado nivel de nitrógeno que cuando carecen de este elemento;
indicando esto además que las raíces poseen más bajo contenido de nitrógeno que los brotes
(Erdmann y Means, 1953).
El mejoramiento debido a la nodulación se expresó en forma logarítmica:
log Xi - log C
donde
= E
Xi
= rendimiento con cepa ‘ i ’
C
= rendimiento con testigo no inoculado con N.
E
= eficiencia
Se usó esta forma de expresión por tener la ventaja de presentar los datos de un modo
mucho más práctico a los efectos del análisis estadístico, eliminando la relación que de otra
manera se establece entre la varianza y la media (Vincent, 1970).
36
3.2.13 Estadística
Para estimar el efecto de las diferentes condiciones de cultivo (fuente de carbono, pH y
temperaturas de incubación) sobre la velocidad de crecimiento máxima, rendimiento celular,
recuento celular, infectividad y efectividad de la bacteria, los valores promedio de cada carácter
evaluado fueron sometidos a análisis estadístico.
Modelo estadístico
El modelo estadístico utilizado corresponde a un diseño factorial, de 3 factores:
Temperatura
pH
Fuente de carbono
Los niveles se detallan a continuación:
Factor
niveles
Temperatura
25
28
30
pH
5.5
6.5
7
1
2
3
Fuente de carbono
donde:
1: Manitol
2: Sacarosa
3: Glicerol
El modelo estadístico será:
y =  + F1 + F2 + F3 + F1xF2 + F1xF3 + F2xF3 + e
donde:
y
= Es la variable respuesta (dependiente): recuento celular (ufc/mL) ó biomasa (g
células/mL) ó velocidad de crecimiento celular (1/h) o infectividad (nodulación) o
eficiencia.
37

= Efecto medio del ensayo.
F1 = Es el efecto del factor 1: Temperatura
F2 = Es el efecto del factor 2: pH
F3 = Es el efecto del factor 3: Fuente de carbono
F1xF2 = Interacción F1 por F2
F1xF3 = Interacción F1 por F3
F2xF2 = Interacción F2 por F3
e = Es el error.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se compone de 2 tipos:
a.- Análisis descriptivo: se presenta a través de Cuadros, estos contienen el número de
observaciones para cada factor e interacción, valores mínimos, medios, máximos, varianza,
desviación estándar y coeficiente de variación en porcentaje (%), permite entregar una
primera aproximación a los datos.
b.- Análisis inferencial: ésta etapa permite realizar inferencias respecto a la población de
interés, de acuerdo a un cierto grado de significancia estadística (probabilidad).
Esto consistió en realizar el análisis de varianza para el modelo planteado (Lindman, 1992); y se
realizó mediante los programas estadísticos statgraphics 2.0 y 5.1.
Para realizar el análisis de varianza se comprobaron los dos supuestos básicos:
- Los tratamientos tienen que distribuirse normales, se aplicó el test de Shapiro-Wilks al 95% de
confianza.
- Las varianzas entre los tratamientos deben ser iguales (homogeneidad de varianzas). Se
realizó con el test Barltett, al 95% de confianza.
- Además la variable de interés tiene que ser continua
38
Si al menos uno de estos supuestos no se cumplió, se probaron las transformaciones LOG
(logaritmo) y raíz cuadrada, seleccionando aquella transformación que presento mejores valores
de ajustes (tanto para normalidad, como para homogeneidad de varianzas).
Al existir diferencias significativas entre algunos de los tratamientos analizados, de acuerdo al
modelo planteado, se realizaron las respectivas comparaciones múltiples, mediante la técnica de
Tukey al 95% de confianza.
39
4. RESULTADOS
4.1
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de incubación
sobre las velocidades de crecimiento máximas (máx).
A partir de las determinaciones de D.O. realizadas según se describe en 3.2.7 se
obtuvieron las curvas de crecimiento celular para cada condición de medio de cultivo e
incubación y a partir de estas curvas, se determinaron las respectivas velocidades específicas de
crecimiento celular (máx) las que se presentan en los anexos 7, 8 y 9.
4.1.1 Curvas de crecimiento celular según temperatura de incubación, pH y
fuente
de
carbono utilizados.
Se realizaron las curvas de crecimiento celular para las diversas condiciones utilizadas a
partir de los valores obtenidos de los anexos 7, 8 y 9.
Crecimiento celular
(Abs. a 600 nm)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
M 25 ºC
S 25 ºC
G 25 ºC
M 28 ºC
S 28 ºC
G 28 ºC
M 30 ºC
S 30 ºC
G 30 ºC
Tie mpo de incubación
(h)
FIGURA 8. Curvas de crecimiento celular a 25ºC, 28ºC y 30ºC de temperatura de
incubación para manitol (M), sacarosa (S) y glicerol (G) a pH 5,5.
40
Crecimiento celular
(Abs. a 600 nm)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
M 25 ºC
S 25 ºC
G 25 ºC
M 28 ºC
S 28 ºC
G 28 ºC
M 30 ºC
S 30 ºC
G 30 ºC
Tie mpo de incubación
(h)
FIGURA 9. Curvas de crecimiento celular a 25ºC, 28ºC y 30ºC de temperatura de
incubación para manitol (M), sacarosa (S) y glicerol (G) a pH 6,5.
Crecimiento celular
(Abs. a 600 nm)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
M 25 ºC
S 25 ºC
G 25 ºC
M 28 ºC
S 28 ºC
G 28 ºC
M 30 ºC
S 30 ºC
G 30 ºC
Tie mpo de incubación
(h)
FIGURA 10. Curvas de crecimiento celular a 25ºC, 28ºC y 30ºC de temperatura de
incubación para manitol (M), sacarosa (S) y glicerol (G) a pH 7,0.
41
4.1.2 Efecto de las variables temperatura de incubación, pH y fuente de carbono utilizados
sobre la velocidad específica de crecimiento ()
A continuación se presenta el resultado del análisis estadístico de las observaciones
registradas durante el ensayo, con relación al efecto de la temperatura de incubación, del pH y de
la fuente de carbono utilizados, sobre .
a. Análisis descriptivo:
El análisis descriptivo se presenta en el anexo 10.
b. Análisis inferencial:
Al comprobar los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza entre los
tratamientos, como resultado, la variable de interés, velocidad de crecimiento celular, cumplió
con el supuesto de igualdad de varianza. La normalidad no fue posible analizarla debido a que
(por razones prácticas) cada tratamiento tiene sólo dos observaciones. Se asumirá entonces que
cada tratamiento proviene de una población que se distribuye normal.
El análisis de varianza (anexo 11) para el modelo planteado, resultó ser altamente
significativo para los tres factores analizados y sus respectivas interacciones al 99% de confianza
(P-valor<0.01), luego, se concluye que las medias dentro de cada factor e interacción son
distintas.
A continuación se presentan las comparaciones múltiples de Tukey, ranking de
tratamientos según factor e interacción estudiados (Cuadros 4, 5 y 6) y gráficos de las
interacciones (Figuras 11, 12 y 13) para la variable velocidad de crecimiento celular.
42
CUADRO 4.  según temperatura de incubación y pH utilizados.
Velocidad específica de crecimiento,  x 10-4 ( h-1)
pH
Temperatura
Promedio según
temperatura
7,0
6,5
5,5
30ºC
0,1540 a
0,1437 ab
0,1335 b
0,1437 a
28ºC
0,1194 c
0,1132 cd
0,1062 de
0,1129 b
25ºC
0,1067 de
0,1008 e
0,0981 e
0,1019 c
0,1267 a
0,1192 b
0,1126 c
Promedio
según pH
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 12).
Medias marginales estimadas de velocidad de crecimiento máxima
Velocidad de crecimiento
celular (1/h)
(X 0,001)
158
pH de cultivo
5,5
148
6,5
7,0
138
128
118
108
98
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 11. Efecto sobre  de la temperatura de incubación según pH utilizado.
43
CUADRO 5.  según temperatura de incubación y fuente de carbono utilizados.
Velocidad específica de crecimiento,  x 10-4 ( h-1)
Fuente de carbono
Temperatura
Promedio según
temperatura
Manitol
Sacarosa
Glicerol
30ºC
0,1519 a
0,1449 ab
0,1344 b
0,1437 a
28ºC
0,1174 c
0,1119 cd
0,1095 cd
0,1129 b
25ºC
0,1070 cd
0,1002 d
0,0984 d
0,1019 c
0,1254 a
0,1190 b
0,1141 c
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 12).
Medias marginales estimadas de velocidad de crecimiento máxima
Velocidad de crecimiento
celular (1/h)
(X 0,001)
158
Fuente de carbono
Manitol
148
Sacarosa
Glicerol
138
128
118
108
98
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 12. Efecto sobre  de la temperatura de incubación del cultivo, según fuente de
carbono utilizada.
44
CUADRO 6.  según pH y fuente de carbono utilizados.
Velocidad específica de crecimiento,  x 10-4 ( h-1)
Fuente de carbono
pH
Promedio
según pH
Manitol
Sacarosa
Glicerol
7,0
0,1351 a
0,1265 ab
0,1184 ab
0,1267 a
6,5
0,1249 ab
0,1194 ab
0,1135 ab
0,1192 b
5,5
0,1162 ab
0,1110 b
0,1105 b
0,1126 c
0,1254 a
0,1190 b
0,1141 c
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 12).
Medias marginales estimadas de velocidad de crecimiento máxima
Velocidad de crecimiento
celular (1/h)
(X 0,001)
158
Fuente de carbono
Manitol
148
Sacarosa
Glicerol
138
128
118
108
98
5.5
6.5
7
pH
FIGURA 13.
utilizada.
Efecto sobre  del pH del medio de cultivo, según fuente de carbono
45
4.2
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de incubación
sobre los recuentos celulares (ufc/mL).
A continuación se presenta el resultado del análisis estadístico de las observaciones
registradas durante el ensayo, con relación al efecto de la temperatura de incubación, del pH y de
la fuente de carbono utilizados, sobre los recuentos celulares (ufc/mL) obtenidos finalizados los
períodos de incubación según se describe en 3.2.10.
a. Análisis descriptivo:
El análisis descriptivo se presenta en el anexo 13
b. Análisis inferencial:
Al comprobar los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza entre los
tratamientos, como resultado, la variable de interés, recuento celular, cumplió con el supuesto de
igualdad de varianza. La normalidad no fue posible analizarla debido a que (por razones
prácticas) cada tratamiento tiene sólo dos observaciones. Se asumirá entonces que cada
tratamiento proviene de una población que se distribuye normal.
El análisis de varianza (anexo 14) para el modelo planteado, resultó ser no significativo
para los tres factores analizados y sus respectivas interacciones al 95% de confianza (Pvalor>0,05), luego, se concluye que las medias dentro de cada factor son iguales.
A continuación se presentan los valores de recuentos celulares medios para los
tratamientos según factor estudiado (Cuadros 7, 8, 9 y 10) y gráficos de las medias (Figuras 14,
15 y 16).
No se presentan interacciones debido a que las medias, como se mencionó anteriormente,
son iguales dentro de cada factor estudiado.
46
CUADRO 7 Valores de recuentos celulares según temperatura de incubación, pH y fuente
de carbono utilizados.
Recuento celular ( 1/1010 ufc/mL).
TEMPERATURA
pH
Fuente de carbono
30ºC
8,054 a
7,0
8,056 a
Manitol
8,052 a
28ºC
8,050 a
6,5
8,049 a
Sacarosa
8,051 a
25ºC
8,048 a
5,5
8,048 a
Glicerol
8,049 a
Medias de cada columna con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de probabilidad,
según prueba de Tukey (Anexos 14 y 15).
CUADRO 8. Recuentos celulares según temperatura de incubación y pH utilizados.
Recuento celular ( 1/1010 ufc/mL).
pH
Temperatura
Promedios según
temperatura
7,0
6,5
5,5
30ºC
8,060 a
8,053 a
8,048 a
8,054 a
28ºC
8,060 a
8,043 a
8,047 a
8,050 a
25ºC
8,047 a
8,050 a
8,048 a
8,048 a
8,056 a
8,049 a
8,048 a
Promedios
según pH
Medias de cada columna con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de probabilidad,
según prueba de Tukey (Anexo 15).
47
CUADRO 9. Recuentos celulares según temperatura y fuente de carbono utilizados.
Recuento celular ( 1/1010 ufc/mL).
Fuente de carbono
Temperatura
Media según
temperatura
Manitol
Sacarosa
Glicerol
30ºC
8,053 a
8,053 a
8,055 a
8,054 a
28ºC
8,052 a
8,043 a
8,055 a
8,050 a
25ºC
8,052 a
8,055 a
8,038 a
8,048 a
8,052 a
8,051 a
8,049 a
Promedios
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 15).
CUADRO 10. Recuentos celulares según pH y fuente de carbono utilizados.
Recuento celular ( 1/1010 ufc/mL).
Fuente de carbono
pH
Promedios
según pH
Manitol
Sacarosa
Glicerol
7,0
8,055 a
8,057 a
8,055 a
0,1267 a
6,5
8,053 a
8,052 a
8,042 a
0,1192 a
5,5
8,048 a
8,043 a
8,052 a
0,1126 a
8,052 a
8,051 a
8,049 a
Promedios
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 15).
48
Medias e intervalos a la prueba de Tukey
Recuento celular
(X 1,E8)
806,8
806,4
806
805,6
805,2
804,8
804,4
804
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 14. Efecto de la temperatura de incubación del cultivo sobre los recuentos
celulares.
Medias e intervalos a la prueba de Tukey
Recuento celular
(X 1,E8)
806,4
806
805,6
805,2
804,8
804,4
804
5.5
6.5
7
pH
FIGURA 15. Efecto del pH del medio de cultivo sobre los recuentos celulares.
49
Medias e intervalos a la prueba de Tukey
Recuento celular
(X 1,E8)
806,4
1 = Manitol
2 = Sacarosa
3 = Glicerol
806
805,6
805,2
804,8
804,4
804
1
2
3
Fuente de Carbono
FIGURA 16. Efecto de la fuente de carbono utilizada sobre los recuentos celulares.
4.3
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de incubación
sobre la biomasa celular (peso celular seco).
A continuación se presenta el resultado del análisis estadístico de las observaciones
registradas durante el ensayo, con relación al efecto de la temperatura de incubación, del pH y de
la fuente de carbono utilizados, sobre la biomasa celular (g células/mL) obtenida luego de
finalizados los períodos de incubación según se describe en 3.2.8.
a. Análisis descriptivo:
El análisis descriptivo se presenta en el anexo 16
b. Análisis inferencial:
Al comprobar los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza entre los
tratamientos, como resultado, la variable de interés biomasa celular, cumplió con el supuesto de
igualdad de varianza. La normalidad no fue posible analizarla debido a que (por razones
50
prácticas) cada tratamiento tiene sólo dos observaciones. Se asumirá entonces que cada
tratamiento proviene de una población que se distribuye normal.
El análisis de varianza (anexo 17) para el modelo planteado, resultó ser no significativo
para el factor temperatura al 95% de confianza (P-valor>0.05), luego, se concluye que las medias
dentro del factor temperatura son iguales. Para los factores: pH y fuente de carbono resultó ser
altamente significativo al 99% de confianza (P-valor<0.01), luego, se concluye que las medias
dentro de estos factores son distintas.
Respecto a las interacciones una resulto ser altamente significativa al 99% de confianza
(P-valor<0.01) AB (temperatura: pH), se concluye que las medias dentro de esta interacción son
distintas; y las otras dos resultaron ser no significativas al 95% de confianza (P-valor>0.05) AC
(temperatura: fuente de carbono) y BC (pH : fuente de carbono), se concluye entonces que las
medias dentro de éstas interacciones son iguales (es decir, no existe interacción).
A continuación se presentan las comparaciones múltiples de Tukey, ranking de
tratamientos según los factores temperatura, pH y fuente de carbono utilizados, la interacción de
éstos factores (Cuadros 11, 12 y 13) y gráfico de la interaccion (Figuras 17, 18 y 19 ) para la
variable biomasa celular.
51
CUADRO 11. Biomasa celular según temperatura de incubación y pH utilizados.
Biomasa celular (g de células/mL)
pH
Temperatura
7,0
6,5
30ºC
4,953 ab
4,925 bc
4,937 abc
4,938 a
28ºC
4,915 bc
4,972 a
4,900 c
4,929 a
25ºC
4,950 ab
4,913 bc
4,922 bc
4,928 a
4,939 a
4,937 a
4,919 b
Promedio
según pH
5,5
Promedio según
temperatura
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexos 18 y 19).
Medias marginales estimadas de biomasa celular
pH
5,5
6,5
7
(g de células/mL)
biom asa celular
4,98
4,96
4,94
4,92
4,9
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 17. Efecto sobre la biomasa celular de la temperatura de incubación según pH
utilizado.
52
CUADRO 12. Biomasa celular según temperatura de incubación y fuente de carbono
utilizados.
Biomasa celular (g de células/mL)
Fuente de carbono
Temperatura
Promedio según
temperatura
Manitol
Sacarosa
Glicerol
30ºC
4,948 a
4,945 a
4,922 a
4,938 a
28ºC
4,935 a
4,932 a
4,920 a
4,929 a
25ºC
4,938 a
4,923 a
4,923 a
4,928 a
4,941 a
4,933 ab
4,922 b
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 12).
Medias marginales estimadas de biomasa celular
Fuente_C
1
2
3
(g de células/mL)
biom asa celular
4,95
4,945
4,94
4,935
4,93
4,925
4,92
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 18. Efecto sobre la biomasa celular de la temperatura de incubación del cultivo,
según fuente de carbono utilizada
53
CUADRO 13. Biomasa celular según pH y fuente de carbono utilizados.
Velocidad específica de crecimiento,  x 10-4 ( h-1)
Fuente de carbono
pH
Promedio
según pH
Manitol
Sacarosa
Glicerol
7,0
4,942 a
4,938 a
4,938 a
4,939 a
6,5
4,955 a
4,938 a
4,917 a
4,937 a
5,5
4,925 a
4,923 a
4,910 a
4,919 b
4,941 a
4,933 ab
4,922 b
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 12).
Medias marginales estimadas de biomasa celular
Fuente_C
1
2
3
(g de células/mL)
biom asa celular
4,96
4,95
4,94
4,93
4,92
4,91
5.5
6.5
7
pH
FIGURA 19. Efecto sobre la biomasa celular del pH de incubación del cultivo, según fuente
de carbono utilizada
54
4.4
Efecto de la composición del medio de cultivo y de las condiciones de incubación
sobre la infectividad y eficiencia de los Rhizobium obtenidos.
A partir de los ensayos en plantas de trébol descritos en las secciones 3.2.11 y 3.2.12 para
determinar la influencia, tanto de las condiciones de medio de cultivo (pH y fuente de carbono)
como de la temperatura de incubación de los cultivos, sobre la infectividad y efectividad del
Rhizobium, se obtuvieron los resultados descritos en los anexos 20, 21 y 22, figuras 20 y 21.
Control (-)
Glicerol
Sacarosa
Manitol
Control (+)
FIGURA 20. Plántulas de trébol obtenidas con rhizobios incubados en medio con glicerol,
sacarosa y manitol como fuente de carbono a pH 7,0 y 30ºC de temperatura
de incubación; y los respectivos controles.
55
M
C+
S
C-
G
NODULOS
C+
M
S
G
C-
FIGURA 21. Detalle de nodulación en plántulas de trébol crecidas en tubos con agar
Jensen, inoculadas con rhizobios incubados con glicerol (G), sacarosa (S) y
manitol (M) como fuente de carbono a pH 7,0 y 30ºC de temperatura de
incubación; y los respectivos controles positivo (C+) y negativo (C-).
56
4.4.1
Análisis estadístico de la homogeneidad de los resultados obtenidos en la evaluación
descrita en 4.4 para los controles positivos y negativos de cada grupo de
tratamiento.
La inoculación e incubación de las plantas se realizó en seis grupos de tratamientos
(bloques) sometidos a las mismas condiciones descritas en la sección 3.2.11. Con la finalidad de
determinar diferencias estadísticamente significativas entre estos seis grupos de tratamientos; se
sometió a análisis estadístico a los valores de peso aéreo obtenidos para los controles positivos
(con nitrógeno) y para los controles negativos (sin nitrógeno) de cada grupo de tratamiento
(Anexos 20, 21 y 22), obteniéndose los siguientes resultados (Cuadro 14).
a. Análisis descriptivo:
El análisis descriptivo para los resultados de peso aéreo de los controles positivo y
negativo, se presenta en el anexo 23.
b. Análisis inferencial:
Al comprobar los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza entre los
tratamientos, como resultado, las variables de interés peso aéreo de los controles positivo y
negativo según grupos de tratamiento, cumplieron con el supuesto de igualdad de varianza. La
normalidad no fue posible analizarla dado que cada tratamiento tiene sólo 4 observaciones tanto
para control positivo como para control negativo. Se asumirá entonces que cada tratamiento
proviene de una población que se distribuye normal.
El análisis de varianza (anexo 24) para el modelo planteado, resultó ser significativo (al
95% de confianza P-valor<0.05) para ambas variables estudiadas. Sin embargo a pesar de que se
concluye que las medias son distintas entre los grupos de tratamiento tanto en los controles
positivos como negativos, el valore de P-valor para ambos casos es muy cercano a 0,05 lo que
indica que las condiciones fueron estables entre los grupos de tratamiento.
57
A continuación se presentan las comparaciones múltiples de Tukey, ranking de los
grupos de tratamiento (Cuadro 14) y gráfico de medias e intervalos a la prueba de Tukey (Figuras
22 y 23).
CUADRO 14. Peso aéreo de los controles positivos y controles negativos según grupo de
tratamiento.
Grupo de tratamiento
1
2
3
4
5
6
Peso aéreo de los
controles (+) (g)
0,00933 0,00935 0,00942 0,00938 0,00947 0,00938
a
ab
ab
ab
b
ab
Peso aéreo de los
controles (-) (g)
0,00478 0,00487 0,00491 0,00491 0,00496 0,00505
a
ab
ab
ab
b
ab
Medias de cada fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05% de probabilidad,
según prueba de Tukey (Anexo 25).
58
Medias e intervalos a la prueba de Tukey
peso aéreo (g)
(X 0,0001)
96
95
94
93
92
1
2
3
4
5
6
Grupo de tratamiento
FIGURA 22. Peso aéreo de los controles positivos según grupo de tratamiento.
Medias e intervalos a la prueba de Tukey
peso aéreo (g)
(X 0,0001)
52
51
50
49
48
47
46
1
2
3
4
5
6
Grupo de tratamiento
FIGURA 23. Peso aéreo de los controles negativos según grupo de tratamiento.
59
4.4.2 Efecto de las condiciones del medio de cultivo e incubación sobre la infectividad
(capacidad nodulativa) de los Rhizobium inoculados en las plántulas.
Resultados del análisis estadístico de las observaciones registradas durante el ensayo, con
relación al efecto de la temperatura de incubación, del pH y de la fuente de carbono utilizados,
sobre la capacidad nodulativa del Rhizobium (Cuadros 15, 16 y 17).
a. Análisis descriptivo:
El análisis descriptivo se presenta en el anexo 26
b. Análisis inferencial:
Dado que la variable Nodulación esta catalogada como escala (variable ordinal), donde el
1 representa: malo hasta llegar a 7: muy bueno, entonces, esta variable es del tipo continuo (que
corresponde a uno de los requisitos del ANOVA).
Al comprobar los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza entre los
tratamientos, como resultado, la variable de interés infectividad, cumplió con el supuesto de
igualdad de varianza. La normalidad no fue posible analizarla dado que cada tratamiento tiene
sólo cuatro observaciones, se asumirá entonces que cada tratamiento proviene de una población
que se distribuye normal.
El análisis de varianza (anexo 27) para el modelo planteado, indica que:
-
Para los factores: temperatura (T) y pH (P) resultó ser significativo al 95% de confianza (Pvalor<0.05), luego se concluye que las medias dentro de cada factor son distintas.
-
Para el factor fuente de carbono (F) sus medias son iguales al 95% de confianza (Pvalor>0.05).
-
Respecto a las interacciones, todas resultaron ser no significativas al 95% de confianza (Pvalor>0.05), se concluye entonces que las medias dentro de cada interacción son iguales.
60
A continuación se presentan las comparaciones múltiples de Tukey para la variable
infectividad, ranking de tratamientos según los factores temperatura, pH y fuente de carbono, la
interacción de éstos factores (Cuadros 15, 16 y 17), gráficos de interacciones de los factores
estudiados (Figuras 24, 25 y 26) y gráficos de interacciones según fuente de carbono utilizada
(Figuras 27, 28 y 29).
CUADRO 15. Nodulación según temperatura de incubación y pH utilizados.
Nodulación
pH
Temperatura
Promedio según
temperatura
7,0
6,5
5,5
30ºC
6,25 a
6,08 a
6,17 a
6,17 a
28ºC
6,00 a
5,92 a
5,58 a
5,83 ab
25ºC
6,08 a
5,75 a
5,42 a
5,75 b
6,11 a
5,92 ab
5,72 b
Promedio
según pH
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 28).
61
Medias marginales estimadas de nodulación
Nodulació n
6,4
pH
5,5
6,5
7
6,2
6
5,8
5,6
5,4
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 24. Efecto sobre la nodulación de la temperatura de incubación del cultivo, según
pH utilizado.
CUADRO 16. Nodulación según temperatura de incubación y fuente de carbono utilizados.
Nodulación
Fuente de carbono
Temperatura
Promedio según
temperatura
Manitol
Sacarosa
Glicerol
30ºC
6,25 a
6,25 a
6,00 a
6,17 a
28ºC
6,08 a
5,67 a
5,75 a
5,83 ab
25ºC
5,83 a
5,83 a
5,58 a
5,75 b
6,06 a
5,92 a
5,78 a
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 28).
62
Medias marginales estimadas de nodulación
Nodulació n
6,4
Fte_de_C
1
2
3
6,2
6
5,8
5,6
5,4
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 25. Efecto sobre la nodulación de la temperatura de incubación del cultivo, según
fuente de carbono utilizada.
CUADRO 17. Nodulación según pH y fuente de carbono utilizados.
Nodulación
Fuente de carbono
pH
Promedio
según pH
Manitol
Sacarosa
Glicerol
7,0
6,33 a
5,92 a
6,08 a
6,11 a
6,5
5,92 a
6,00 a
5,83 a
5,92 ab
5,5
5,92 a
5,83 a
5,42 a
5,72 b
6,06 a
5,92 a
5,78 a
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 28).
63
Medias marginales estimadas de nodulación
Nodulació n
6,3
Fte_de_C
1
2
3
6,1
5,9
5,7
5,5
5,3
5.5
6.5
7
pH
FIGURA 26. Efecto sobre la nodulación del pH de incubación del cultivo, según fuente de
carbono utilizada.
Medias marginales estimadas de nodulación para manitol.
Nodulació n
6,5
pH
5_5
6_5
7
6,3
6,1
5,9
5,7
5,5
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 27. Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar manitol
como fuente de carbono sobre la capacidad de nodulación del Rhizobium.
64
Medias marginales estimadas de nodulación para sacarosa
pH
5_5
6_5
7
Nodulació n
6,5
6,3
6,1
5,9
5,7
5,5
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 28. Efecto de la temperatura y el pH de incubación del cultivo al utilizar sacarosa
como fuente de carbono sobre la capacidad de nodulación del Rhizobium.
Medias marginales estimadas de nodulación para glicerol
Nodulació n
6,5
pH
5_5
6_5
7
6,2
5,9
5,6
5,3
5
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 29. Efecto de la temperatura y el pH de incubación del cultivo al utilizar glicerol
como fuente de carbono sobre la capacidad de nodulación del Rhizobium.
65
4.4.3 Efecto de las condiciones del medio de cultivo e incubación sobre la efectividad de los
Rhizobium inoculados en las plántulas.
Resultados del análisis estadístico de las observaciones registradas durante el ensayo, con
relación al efecto de la temperatura de incubación, del pH y de la fuente de carbono utilizados,
sobre la capacidad de fijar nitrógeno del Rhizobium.
a. Análisis descriptivo:
El análisis descriptivo se presenta en el anexo 29.
b. Análisis inferencial:
Al comprobar los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza entre los
tratamientos, como resultado, la variable de interés efectividad, cumplió con el supuesto de
igualdad de varianza. Respecto a la normalidad, en esta oportunidad no fue posible analizarla
dado que cada tratamiento tiene sólo cuatro observaciones, se asumirá entonces que cada
tratamiento proviene de una población que se distribuye normal.
El análisis de varianza (anexo 30) para el modelo planteado, resultó ser altamente
significativo para los tres factores analizados: temperatura (A), pH (B) y fuente de carbono (C) y
sus respectivas interacciones al 99% de confianza (P-valor<0.01), luego, se concluye que las
medias dentro de cada factor e interacciones son distintas, excepto para la interacción AC
(temperatura: fuente de carbono), donde sus medias son iguales, es decir, no existe interacción.
A continuación se presentan las comparaciones múltiples de Tukey para la variable
efectividad, ranking de tratamientos según los factores temperatura, pH y fuente de carbono, la
interacción de éstos factores (Cuadros 18, 19 y 20), gráficos de interacciones de los factores
estudiados (Figuras 30, 31 y 32) y gráficos de interacciones según fuente de carbono utilizada
(Figuras 33, 34 y 35).
66
CUADRO 18. Efectividad según temperatura de incubación y pH utilizados.
Eficiencia (1/104)
pH
Temperatura
Promedio según
temperatura
7,0
6,5
5,5
30ºC
2480 a
2223 b
1696 c
2133 a
28ºC
1360 d
1329 d
1119 e
1269 b
25ºC
1101 e
1178 de
484 f
921 c
1647 a
1576 b
1100 c
Promedio
según pH
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 31).
Medias marginales estimadas de eficiencia
(X 0,001)
25
pH
5,5
6,5
7
Eficiencia
20
15
10
5
0
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 30. Efecto sobre la eficiencia de la temperatura de incubación del cultivo, según
pH utilizado.
67
CUADRO 19 Efectividad según temperatura de incubación y fuente de carbono utilizados.
Eficiencia (1/104)
Fuente de carbono
Temperatura
Promedio según
temperatura
Manitol
Sacarosa
Glicerol
30ºC
2259 a
2164 a
1975 a
2133 a
28ºC
1397 a
1329 a
1081 a
1269 b
25ºC
999 a
997 a
767 a
921 c
1552 a
1497 b
1274 c
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 31).
Medias marginales estimadas de eficiencia
Eficiencia
(X 0,001)
23
Fte_de_C
1
2
3
19
15
11
7
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 31. Efecto sobre la eficiencia de la temperatura de incubación del cultivo, según
fuente de carbono utilizada.
68
CUADRO 20. Efectividad según pH y fuente de carbono utilizados.
Eficiencia (1/104)
Fuente de carbono
pH
Promedio
según pH
Manitol
Sacarosa
Glicerol
7,0
1809 a
1747 a
1384 ab
1647 a
6,5
1654 ab
1606 ab
1469 ab
1576 b
5,5
1192 ab
1138 ab
970 b
1100 c
1552 a
1497 b
1274 c
Promedio
según fuente
de carbono
Medias de cada columna y fila con igual letra no difieren significativamente al 0,05 % de
probabilidad, según prueba de Tukey (Anexo 31).
Medias marginales estimadas de eficiencia
(X 0,0001)
197
Fte_de_C
1
2
3
Eficiencia
177
157
137
117
97
5.5
6.5
7
pH
FIGURA 32. Efecto sobre la eficiencia del pH de incubación del cultivo, según fuente de
carbono utilizada.
69
Medias marginales estimadas de eficiencia para manitol
pH
5_5
6_5
7
0,03
Eficiencia
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 33. Efecto de la temperatura y pH de incubación del cultivo al utilizar manitol
como fuente de carbono sobre la eficiencia del Rhizobium.
Medias marginales estimadas de eficiencia para sacarosa
0,03
pH
5_5
6_5
7
Eficiencia
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 34. Efecto de la temperatura y el pH de incubación del cultivo al utilizar sacarosa
como fuente de carbono sobre la eficiencia del Rhizobium.
70
Medias marginales estimadas de eficiencia para glicerol
(X 0,001)
24
pH
5_5
6_5
7
Eficiencia
20
16
12
8
4
0
25
28
30
Temperatura (ºC)
FIGURA 35. Efecto de la temperatura y el pH de incubación del cultivo al utilizar glicerol
como fuente de carbono sobre la eficiencia del Rhizobium.
4.4.4
Relación entre los resultados de nodulación (infectividad) y la eficiencia de la cepa
estudiada.
Resultados del análisis estadístico de las observaciones registradas durante el ensayo, con
relación a la eficiencia versus infectividad de la cepa estudiada.
Los resultados del análisis de regresión (Anexo 32) entregan la siguiente ecuación del
modelo ajustado:
Eficiencia = -0,00543239 + 0,0033535*Nodulación
El análisis de la varianza (Anexo 32) muestra un p-valor en la tabla ANOVA inferior a
0.01, lo que indica que existe relación estadísticamente significativa entre eficiencia y nodulación
para un nivel de confianza del 99%. El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
13,0082% de la variabilidad en Eficiencia y el coeficiente de correlación es igual a 0,3607,
71
indicando una relación relativamente débil entre las variables. El error estándar de la estimación
muestra la desviación típica de los residuos que es 0,005603.
A continuación se presenta un gráfico de dispersión de los resultados obtenidos en el
análisis de regresión de la variable efectividad versus nodulación (Figura 36).
Gráfico del Modelo Ajustado
0,03
Eficiencia
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
5
5,4
5,8
6,2
6,6
7
Nodulación
FIGURA 36. Gráfico de dispersión de eficiencia de la cepa estudiada según la nodulación
obtenida en las plántulas inoculadas.
4.4.5
Relación entre los resultados de rendimiento (peso aéreo) de las plántulas inoculadas
respecto a los resultados obtenidos para los controles positivo y negativo.
Resultados del análisis de las observaciones registradas durante el ensayo, con relación al
rendimiento (peso aéreo) de las plántulas inoculadas con la cepa en estudio respecto a los
resultados obtenidos para los controles positivo y negativo.
72
Los resultados de rendimiento en peso aéreo para los controles positivo, negativo y
tratamientos se pueden observar en los gráficos de medias que se presentan a continuación
(Figuras 37, 38 y 39);
donde,
Control positivo = Control (+)
Control negativo = Control (-)
Rhizobio = resultado obtenido con el tratamiento
Los tratamientos corresponden a:
pH: 5,5; 6,5 y 7,0
fuentes de carbono: manitol (1), sacarosa (2) y glicerol (3)
0,01
0,009
0,008
0,007
0,006
0,005
0,004
0,003
0,002
0,001
0
Control (+)
Rhizobio
Control (-)
5,
5_
1
5,
5_
2
5,
5_
3
6,
5_
1
6,
5_
2
6,
5_
3
7,
0_
1
7,
0_
2
7,
0_
3
Peso aéreo (g)
temperaturas de incubación: 25, 28 y 30ºC.
Tratamiento
FIGURA 37. Gráfico de medias de peso aéreo de los tratamientos de la cepa incubada a
25ºC, y los resultados obtenidos para los correspondientes controles positivo y
negativo.
0,01
0,009
0,008
0,007
0,006
0,005
0,004
0,003
0,002
0,001
0
Control (+)
Rhizobio
Control (-)
5,
5_
1
5,
5_
2
5,
5_
3
6,
5_
1
6,
5_
2
6,
5_
3
7,
0_
1
7,
0_
2
7,
0_
3
Peso aéreo (g)
73
Tratamiento
FIGURA 38. Gráfico de medias de peso aéreo de los tratamientos de la cepa incubada a
28ºC respecto a los resultados obtenidos para los controles positivo y
0,01
0,009
0,008
0,007
0,006
0,005
0,004
0,003
0,002
0,001
0
Control (+)
Rhizobio
Control (-)
5,
5_
1
5,
5_
2
5,
5_
3
6,
5_
1
6,
5_
2
6,
5_
3
7,
0_
1
7,
0_
2
7,
0_
3
Peso aéreo (g)
negativo.
Tratamiento
FIGURA 39. Gráfico de medias de peso aéreo de los tratamientos de la cepa incubada a
30ºC respecto a los resultados obtenidos para los controles positivo y
negativo.
74
5. DISCUSIÓN
Las figuras 8, 9 y 10 muestran las curvas de crecimiento celular obtenidas con la cepa de
rhizobio incubada bajo las distintas condiciones de temperatura, pH y fuente de carbono de
incubación; indicando en general fases de latencia (Lag phase) de aproximadamente 2 horas para
cada una de las condiciones estudiadas. Los tiempos de incubación necesarios para obtener
cultivos con densidades ópticas de 1, para las distintas condiciones de pH (5,5, 6,5 o 7,0), fueron
menores a mayor temperatura de incubación (aproximadamente 20 h a 30ºC, 24 h a 28ºC y 28 h
a 25ºC) y al utilizar manitol o sacarosa como fuentes de carbono. Esto es de gran importancia si
se requiere obtener grandes volúmenes de cultivos de tipo industrial.
Los resultados del análisis de varianza de las máx obtenidas de las cinéticas de
crecimiento, mostraron que los tres factores analizados (temperatura de incubación, el pH y la
fuente de carbono utilizados) y sus respectivas interacciones, tuvieron un efecto estadísticamente
significativo respecto a los valores de máx obtenidos, en cada condición de medio de cultivo e
incubación. Se obtuvieron mayores valores de máx a mayor temperatura y pH de incubación,
observándose un aumento considerable al incubar los rhizobios a 30ºC y pH 7,0 (Cuadro 4,
figura 11), lo que difiere con los resultados obtenidos por Balatti (1992) en cultivos de Rhizobium
meliloti, donde se estableció un pH óptimo de cultivo de 6,5 para las cepas estudiadas. Los
resultados obtenidos relacionados con la literatura consultada (Keyser y Munns, 1979) indican
que la cepa utilizada presenta cierto grado de tolerancia a crecer en medio ácido, obteniéndose
cultivos ricos en rhizobios, a pesar de las velocidades de crecimiento celular disminuidas. Al
comparar los resultados de máx obtenidos según temperatura y fuente de carbono utilizados
(Cuadro 5, figura 12), la media de los valores de max fue mayor para manitol, menor para
glicerol y sacarosa en un punto medio entre estos dos valores, observándose un aumento
considerable al utilizar manitol como fuente de carbono. Esto difiere con los resultados obtenidos
por Ballati (1992) en cultivos de Bradyrhizobium japonicum, donde se obtuvieron mejores
resultados al utilizar glicerol como fuente de carbono, seguido por manitol y con muy bajo
crecimiento celular al utilizar sacarosa. En cuanto a la temperatura de incubación, los resultados
de máx fueron mayores al utilizar mayor temperatura.
75
Respecto a los resultados de las interacciones de los factores fuente de carbono y
temperatura, los mejores resultados se observaron al utilizar manitol y 30ºC de incubación,
seguido por sacarosa y finalmente glicerol a la misma temperatura de incubación. Al utilizar
temperaturas menores, 28 y 25ºC respectivamente, no se observaron diferencias al utilizar
sacarosa o glicerol, pero sí entre estos y manitol; sin embargo los resultados para manitol a 25ºC
equivalen a los resultados obtenidos para glicerol a 28ºC, y son superados por los resultados
obtenidos para sacarosa a igual temperatura.
Los resultados de la interacción entre pH y fuente de carbono (Cuadro 6, figura 13)
indican que los mejores resultados se obtuvieron al utilizar pH 7,0 y manitol; seguido por un
segundo grupo con resultados estadísticamente iguales que incluye la utilización de manitol a pH
6,5 y 5,5; sacarosa o glicerol a pH 7,0 y 6,5. Las menores velocidades de crecimiento se
observaron al utilizar sacarosa o glicerol a pH 5,5.
Los tiempos de incubación necesarios para la obtención de las concentraciones celulares
requeridas (cultivos de Rhizobium del orden de 1010 ufc/mL) fueron bastante menores a los
indicados en la literatura para similares cepas de rhizobios (Balatti, 1992). Aún en las
condiciones de baja temperatura (25ºC) y bajo pH (pH 5,5) los tiempos de duplicación celular
fueron considerablemente menores a lo obtenido por Munns y Keyser (1979), en un estudio
similar de selección de cepas en cultivos a pH ácido, lo que se debe posiblemente a que cuando el
medio se inocula y se comienza el proceso con concentraciones iniciales de células viables
inferiores a 107 ufc/mL, se produce una modificación del desarrollo que se traduce en una
disminución de la velocidad de crecimiento del cultivo; debido a que la transferencia de un
pequeño inóculo a un gran volumen de medio puede producir una difusión de vitaminas e iones
requeridos a nivel intracelular para el crecimiento del microorganismo. La limitación al
desarrollo del cultivo empleando bajas concentraciones iniciales de células, aumenta
sensiblemente el tiempo de proceso y los riesgos de contaminación, como así también se
incrementan los costos de producción. Es decir, que la cantidad y calidad de inóculo puede
determinar el éxito de un proceso (Balatti, 1992).
76
Con relación al efecto de los factores estudiados, sobre los valores de recuentos celulares
(ufc/mL), no se observaron diferencias estadísticamente significativas respecto a los resultados
obtenidos para cada uno de estos factores (Cuadros 7, 8, 9 y 10; figuras 14, 15 y 16). Los valores
de recuentos celulares obtenidos (1010 ufc/mL), corresponden con los indicados por la mayoría de
los autores para similares condiciones de cultivo.
Con respecto a los valores de rendimientos celulares (biomasa celular en g células/mL)
obtenidos (Cuadros 11, 12 y 13; figuras 17, 18 y 19 ), éstos se encuentran levemente sobre los
indicados por Ballati (1992), para similares condiciones de cultivos celulares de los géneros
Rhizobium y Bradyrhizobium, observándose un efecto estadísticamente significativo de los
factores pH y fuente de carbono utilizados; sin existir diferencias estadísticamente significativas
entre las tres temperaturas de incubación estudiadas. Los mejores resultados según pH se
obtuvieron al utilizar pH 7,0 o 6,5. En cuanto a la fuente de carbono se obtuvieron mayores
valores de rendimiento celular al utilizar manitol, seguido por sacarosa y glicerol en último lugar;
sin embargo no se observan diferencias estadísticamente significativas entre los resultados al
utilizar manitol o sacarosa, y con respecto a los resultados para esta última y glicerol.
Respecto a las interacciones, se observaron resultados estadísticamente significativos sólo
en la interacción temperatura y pH de incubación, observándose mejores rendimientos celulares
al incubar a 28ºC y pH 6,5.
El análisis de varianza de los resultados obtenidos para los controles positivos y negativos
en los ensayos de infectividad y eficiencia de los cultivos inoculados en plántulas de trébol
pregerminadas e inoculadas en tubos con agar Jensen entregó en ambos casos un valor de p-valor
muy cercano a 0,05 (Anexo 24); lo que indicó que a pesar de que hubo diferencias
estadísticamente significativas respecto a las desviaciones estándares de los valores de peso seco
aéreo de los controles positivos y negativos dentro de los seis grupos de tratamiento analizados,
las condiciones se mantuvieron muy estables entre estos grupos de tratamiento (Cuadro 14,
figuras 22 y 23).
77
El análisis estadístico de las observaciones registradas, con relación al efecto de los
factores estudiados sobre la nodulación de las plantas inoculadas, indicaron que tanto la
temperatura de incubación como el pH, tuvieron un efecto estadísticamente significativo sobre
los resultados de nodulación obtenidos (Anexo 27), observándose mejores resultados con los
cultivos incubados a 30ºC y al utilizar pH 7,0 (Figuras 20 y 21). Con relación a la fuente de
carbono utilizada, no se observaron diferencias de respuesta infectiva al utilizar manitol, sacarosa
o glicerol en el crecimiento de los cultivos de la cepa (Cuadros 16 y 17; figuras 25 y 26).
El análisis de las interacciones de los tres factores estudiados sobre la variable
infectividad (nodulación) indicó que no existen diferencias estadísticamente significativas entre
las medias de cada interacción, es decir, no existe interacción (Cuadros 15, 16 y 17; figuras 24,
25 y 26).
El gráfico del efecto de las condiciones de temperatura y pH de incubación de la cepa
sobre su capacidad infectiva al utilizar manitol como fuente de carbono (Figura 27) indica que se
obtuvieron mejores resultados para las condiciones de incubación a temperaturas de 25 y 28ºC al
utilizar pH 7,0 y que a 30ºC no hubo diferencias según pH utilizado. La mejor condición
correspondió a la utilización de pH 7,0 y 28ºC de temperatura de incubación. Para sacarosa
(Figura 28) los mejores resultados se obtuvieron al incubar la cepa a 30ºC, sin existir diferencias
según pH empleado a esta temperatura de incubación. En cambio a 28ºC se observan mejores
resultados al utilizar pH 6,5. En el caso del glicerol (Figura 29) los mejores resultados se
observaron a una temperatura de incubación de 30ºC y pH 7,0. No se observaron mayores
diferencias a temperaturas de incubación de 25 o 28ºC al utilizar pH de incubación de 6,5 o 7,0;
pero sí se observaron resultados menores al utilizar a estas temperaturas pH 5,5. Los resultados
indican que la cepa analizada pierde cierto grado de infectividad al ser desarrollada bajo
condiciones de acidez a menor temperatura de incubación o bien no es capaz de sobrevivir
eficientemente al ser inoculada en plántulas a pH ácido (Lowendorf y Alexander, 1983; Loi y
col., 1993). En el análisis de infectividad se obtuvieron mejores resultados de nodulación a mayor
pH; indicando que la capacidad infectiva de la cepa estudiada disminuye al utilizar cultivos
crecidos en medios ácidos. Sin embargo, cuando se tiene sacarosa o glicerol igualmente es
78
posible una nodulación alta a pH bajo si se dan las condiciones de incubación apropiadas (30ºC
de temperatura de incubación). La ocurrencia de pérdida de eficiencia de cepas de rhizobio por
mutaciones ya ha sido reportada (Rolfe y col. 1980, Zurkowski 1982). También se ha constatado
que los génes nif, responsables de la fijación simbiótica del nitrógeno, están localizados en
plasmidios de la célula bacteriana (Zurkowski 1982, Mathis y col. 1985, Leyva y col. 1987). De
esta forma, cualquier alteración o pérdida de alguno de estos plasmidos podrá traducirse en
alteraciones o pérdida de eficiencia de las cepas.
Los resultados del análisis estadístico respecto a la influencia de los factores estudiados
sobre el nivel de eficiencia de los Rhizobium obtenidos, indicaron que cada uno de estos tuvo una
influencia estadísticamente significativa en los niveles de respuesta observados (Anexo 30);
obteniéndose mejores resultados en las plantas inoculadas con rhizobios incubados a mayor
temperatura; siendo significativamente mayor al utilizar la cepa incubada a 30ºC (Cuadro 18,
figura 30). Respecto al pH utilizado se observaron mejores resultados al inocular las plántulas
de trébol con las cepas incubadas a mayor pH. En cuanto a la influencia de la fuente de carbono
utilizada en la producción de los cultivos sobre la eficiencia de éstos; se observaron diferencias
estadísticamente significativas y los mayores resultados se obtuvieron al utilizar manitol como
fuente de carbono, sacarosa en segundo lugar y glicerol en tercer lugar.
El análisis de las interacciones de los tres factores estudiados sobre la variable efectividad
indicó que existen diferencias estadísticamente significativas entre las medias de las
interacciones AB (temperatura: pH) y BC (pH: fuente de carbono) solamente (Cuadros 18 y 20;
figuras 30 y 32); y que en el estudio de la interacción AC (temperatura: fuente de carbono) sus
medias fueron iguales, por lo tanto no existe interacción (Cuadro 19, figura 31). En cuanto a la
interacción temperatura: pH, los mayores resultados de eficiencia se observaron con las cepas
incubadas a 30ºC y pH 7,0, 6,5 y 5,5 respectivamente, para cualquiera de las fuentes de carbono
utilizadas. Con relación al estudio de la interacción pH: fuente de carbono, los mayores
resultados se observaron con las cepas incubadas con manitol o sacarosa a pH 7,0 (Cuadro 20,
figura 32). El estudio de interacción temperatura: fuente de carbono (Anexo 30, cuadro 19) si
bien muestra que no hay interacción, el gráfico de medias marginales estimadas de eficiencia
79
(Figura 31) indica que los mayores resultados se obtuvieron al incubar las cepas a 30ºC para
cualquiera de las fuentes de carbono estudiadas.
El gráfico de medias marginales estimadas de eficiencia para manitol, sacarosa y glicerol
como fuente de carbono (Figuras 33, 34 y 35) indican que los mejores resultados de eficiencia se
obtuvieron a temperatura de incubación de 30ºC y pH 7,0; lo que corresponde con los resultados
observados en los gráficos de medias marginales estimadas de nodulación (Figuras 27, 28 y 29);
sin embargo pueden obtenerse también buenos resultados de nodulación y eficiencia a pH más
bajos y alta temperatura de incubación.
La comparación vía análisis de regresión (Anexo 32) y gráfico de dispersión de los
resultados de eficiencia obtenidos con relación a los resultados de nodulación (Figura 36) indica
que existe una relación estadísticamente significativa, pero débil entre estas dos variables;
aumentando la eficiencia a medida que aumenta la nodulación.
La comparación de los rendimientos obtenidos en las plántulas inoculadas respecto a los
controles positivo y negativo se puede observar en los gráficos de medias de peso aéreo de los
tratamientos de la cepa inoculada (Figuras 37, 38 y 39). Se obtuvieron valores constantes en los
controles positivo y negativo como se demostró en los análisis de varianza correspondientes
(Anexos 24 y 25) y para todos los tratamientos los resultados obtenidos con las plántulas
inoculadas siempre resultaron mayores a lo obtenido en los controles negativos; obteniéndose
valores mayores a mayor pH y temperatura de incubación. Al incubar la cepa a 30ºC y pH 6,5 –
7,0 se obtuvieron rendimientos muy cercanos a los obtenidos en los controles positivos,
especialmente a pH 7,0 y utilizando manitol o sacarosa como fuente de carbono.
Los resultados obtenidos en las cinéticas de crecimiento y en los ensayos de infectividad y
efectividad indican que la cepa analizada posee excelentes características para su utilización en la
preparación de inoculantes de tipo comercial; si bien deberán ser realizados nuevos ensayos para
perfeccionar su producción industrial utilizando como componentes de los medios de cultivo
subproductos y/o residuos industriales más económicos (Cervellini y col. 1991; Balatti, 1992).
Varios subproductos industriales han sido utilizados en otras especies de rhizobios con buenos
80
resultados. Altos recuentos celulares de Rhizobium leguminosarum bv. viceae se obtuvieron,
utilizando extracto de levadura como única fuente de carbono y nitrógeno, en fermentadores de
200 L de capacidad (Meade y col. 1985). Sin embargo se deben tomar precauciones al
seleccionar las concentraciones de nutrientes a utilizar. Numerosos investigadores han
demostrado efectos deletéreos sobre el recuento de células viables, nodulación y habilidad en la
fijación de N2 al utilizar concentraciones entre 3,5 y 10 g/L de este extracto (Staphorst y
Strijdom, 1972).
81
5.1.

CONCLUSIONES
Del análisis de las cinéticas de crecimiento, infectividad y efectividad para la bacteria
estudiada se desprende que las mejores condiciones de producción de dicha bacteria
corresponderían a un medio preparado utilizando manitol o sacarosa como fuente de
carbono a pH 6,5-7,0 y con una temperatura de incubación de 30ºC.

La mejor condición de temperatura de incubación de la cepa tanto por la disminución en
el tiempo de incubación como por los mejores resultados de infectividad y efectividad
observados correspondería a los 30ºC.

La posibilidad de utilizar sacarosa en reemplazo de manitol es de gran utilidad desde el
punto de vista económico por el reducido valor comercial de este azúcar permitiendo
disminuir considerablemente los costos de producción del Rhizobium, especialmente en
procesos de carácter industrial.

En cuanto a la influencia sobre la infectividad y efectividad del Rhizobium del pH de
producción, contrario a lo esperado, se observaron mejores resultados al utilizar pH
cercanos o iguales a 7,0; sin embargo a temperaturas altas de incubación (30ºC) también
es posible obtener buenos resultados a pH ácido.

El método de germinación e inoculación en agar Jensen mostró ser un rápido y útil
método de ensayo de cepas según sus capacidades infectivas y efectivas.

La cepa analizada aumento proporcionalmente su eficiencia con relación al aumento de
su capacidad nodulativa. Además su eficiencia fue altamente significativa al comparar
los resultados de rendimiento obtenidos en las plántulas inoculadas respecto a los
controles positivos (plántulas fertilizadas con nitrógeno) y controles negativos (plántulas
sin fertilización); lo que la convierte en una excelente herramienta a ser ensayada en la
preparación de inoculantes para trébol.
82
6. AGRADECIMIENTOS
 A mi profesora patrocinante Sra. Marcia Costa L. por la confianza que a tenido en mi, por los
múltiples conocimientos entregados y por lo grato de ver crecer, a pesar de las dificultades
(trabajos de científico, mecánico, agricultor, etc.), la semilla de una idea hecha realidad.
 A Don Wilhelm Heimlich, profesor informante de este trabajo, y Don Emilio Teixido por sus
conocimientos, apoyo y facilidades para que esta tesis llegue a buen término.
 A María Adela Martínez, profesora informante de esta tesis, por su apoyo y esas largas pero
entretenidas horas de trabajo juntos.
 A mis colegas de laboratorio, especialmente a Mariela por la paciencia e inagotable apoyo
brindados día a día.
 A todos los profesores del Instituto de Bioquímica (especialmente a Don Luis Burzio y a la
Directora de Escuela Dra. Ana María Zárraga), por los conocimientos y formación brindada; y
la oportunidad de llevar a término esta tesis.
 A todos los profesores y colegas del Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos por
haberme recibido e integrado en sus laboratorios y actividades.
 Al Sr. Luigi Ciampi por su buena disposición en facilitar dependencias de los laboratorios a su
cargo para parte de la realización práctica de esta tesis.
 A los auxiliares del ICYTAL, Sr. Jose Briceño A., Sr. Hector Pangui A., Sra. Luisa Martin, Sr.
Alex Caro B., Sr. Otto Rehl M., etc. por su servicial y desinteresada ayuda.
 A mis padres Harald y Antonieta por su gran comprensión y apoyo ...
 A mi Señora Carmen Gloria y a mi hijo Harald Orlando Marcelo; por que se sientan
orgullosos de tener un esposo y padre profesional.
 A todas aquellas personas que de alguna forma colaboraron en la realización de este trabajo.
 El presente trabajo fue financiado a través del proyecto FONDEF AI-22 del Instituto de
Ciencia y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) de la Facultad de Ciencias Agrarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia.
83
7. LITERATURA CITADA
A.O.A.C. 16032. (1984) Official Methods of Analysis of the Association of Oficial Analytical
Chemists. 14ª Ed. Arlington, Va.
Avellá, L. M., Pastor, M. D., Mazza, L. A. y Balatti, A. P. (1987). Crecimiento y sobre vivencia
de Rhizobium meliloti 323 en medio líquido y sobre turba estéril. Rev. Lat. Amer.
Microbiol. vol. 29, 321-328.
Ayanaba A., Asanuma S. y Munns D.N. (1983) An agar plate method for rapid screening of
Rhizobium for tolerance to acid- aluminium stress. Soil Sci. Soc. Am. J., 47,256-258.
Balatti, A. P. (1982). Culturing Rhizobium in large escale fermentor. In: Biological nitrogen
fixation technology for tropical agriculture. Graham and Harris (ed.). CIAT, Colombia. pp
127-132.
Balatti, A. P., Pastor, M. D. y Mazza, L. A. (1991).Effect of media nutrient concentrations on
growth of Bradyrhizobium japonicum. Tropical Agriculture. vol. 68. pp 215-218.
Balatti, A.P. (1992) Producción de inoculantes para leguminosas. Tecnología de las
fermentaciones aplicada a los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium. Santa Rosa,
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89
ANEXOS
90
ANEXO 1
Preparación de medios de cultivo.
Medio Y.E.M.: Se preparó adicionando K2HPO4 x 3 H2O (calidad p.a., Merck) 0,5 g/L,
MgSO4 x 7H2O (calidad p.a., Merck) 0,2 g/L, NaCl (calidad p.a., Merck) 0,1 g/L, extracto
de levadura (Difco para preparación de medios de cultivo) 1,0 g/L y manitol (D(-)-Manitol para
microbiología, Merck) 10,0 g/L. Se agregaron oligoelementos (Gibson, 1963) a razón de 1,0
mL/L de una solución madre que contenía: 0,05 % de boro, 0,05 % de manganeso, 0,005 % de
zinc, 0,005 % de molibdeno y 0,002 % de cobre
Medio Y.E.M. agar rojo Congo
(Yeast Extract Manitol agar rojo Congo): se preparó
adicionando 16 g de agar (Agar-agar purificado y libre de inhibidores para microbiología, Merck)
y 10 mL de solución rojo congo (indicador de pH 3,0-5,2; Merck) 0,25 % p/v por litro de medio
Y.E.M..
Medio Agar Jensen: Se preparó según la siguiente composición: CaHPO4 (calidad p.a., Merck)
1,0 g/L , K2HPO4 x 3 H2O (calidad p.a., Merck) 0,2 g/L , MgSO4 x 7 H2O (calidad p.a.,
Merck) 0,2 g/L , NaCl (calidad p.a., Merck) 0,2 g/L , FeCl3 (calidad p.a., Fluka) 0,1 g/L y agar
(Agar-agar purificado y libre de inhibidores para microbiología, Merck) 10,0 g/L. Se agregaron
además oligoelementos (Gibson, 1963) a razón de 1,0 mL/L de una solución madre que contenía:
0,05 % de boro, 0,05 % de manganeso, 0,005 % de zinc, 0,005 % de molibdeno y 0,002 % de
cobre. Se llevó a pH 5,5 con HCl 1,0 M con el fin de obtener un medio con características de
acidez similares a las condiciones encontradas comúnmente en los suelos del sur de Chile. Este
medio se utilizó en la preparación de tubos de 50 mL con 12 mL de agar Jensen (Vincent, 1975).
Para la preparación de los controles positivos (plántulas fertilizadas con nitrógeno) se
agregó este elemento a los tubos correspondientes en una concentración final aproximada de 70
p.p.m. de nitrógeno. Esto se realizó agregando al agar Jensen correspondiente 0,05% KNO3
(calidad p.a., Merck).
91
ANEXO 2
Métodos cuantitativos.
Método gravimétrico (A. O. A. C. 16032, 1984) modificado: Se centrifugaron 30 mL de cada
cultivo por duplicado a 15.000 r.p.m. por 25 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se
resuspendieron las células en 20 mL de agua destilada,
centrifugando nuevamente en las
mismas condiciones antes descritas. Esto se realizó dos veces más resuspendiendo finalmente en
5 mL de agua destilada y secando con calor (60ºC) en cápsulas apropiadas hasta peso constante.
Su valor se expresó como gramos de células por litro de cultivo.
Método de diluciones sucesivas (Vincent, 1970) modificado: Se vertió 1,0 mL de muestra en
un tubo que contenía 9,0 mL de 1/4 medio Y. E. M. Se agitó en forma aséptica y se trasvasijó
1,0 mL de esta solución a otro tubo que contenía igual volumen de medio que el primero. Se
agitó el segundo tubo y se continuó así sucesivamente hasta la dilución 10-12. Se llevaron en
duplicado 0,1 mL de las diluciones 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 y 10-12 a placas Petri previamente
preparadas con 20 mL de medio Y. E. M. agar rojo Congo estéril. Se esparció este volumen
homogéneamente en cada una de las placas y se llevaron a incubadora a 32ºC por un período
de aproximadamente cuatro días (hasta la aparición de pequeñas colonias blancas, mucosas,
ligeramente abombadas u ovaladas sobre la superficie del agar). Cada colonia representa una
bacteria; contando éstas en la dilución que lo permitió y multiplicando esta cantidad por el
número de dilución en el cual se contó, se determinó el número de Rhizobium contenidos en la
muestra original.
92
ANEXO 3
Recuento Celular (ufc/mL)
Curva de Crecimiento de Rhizobio
1,E12
1,E11
1,E10
1,E9
1,E8
1,E7
1,E6
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
Absorbancia (600 nm)
Figura 40. Gráfico de crecimiento del rhizobio en recuento celular (ufc/mL) versus
absorbancia (a 600 nm).
93
ANEXO 4
Pauta de caracterización de la nodulación según presencia, forma, color, tamaño, cantidad
y distribución de los nódulos en las raíces. (Valderrama y Balocchi, 1994).
Parámetro
Presencia
Forma
Color
Tamaño
Cantidad
Descripción
Presencia
Clave
1
Ausencia
2
Globosa
1
Semiglobosa
2
Elongada
3
Elongada lobulada
4
Rosado
1
Rojo
2
Verde con Rojo
3
Verde
4
Blanco
5
Negro
6
Grande ( 1 mm).
1
Chicos ( 1 mm).
2
Muchos (20-30 por planta o más)
1
(5  n  10)
2
Pocos
Distribución
Intermedio (10  n  20)
3
Escasos
4
( 5)
Raíz principal, cerca de la corona
1
Raíz lateral, lejos de la corona
2
Raíz lateral, cerca de la corona
3
Raíces laterales
4
Raíz principal
5
En todas las raíces
6
94
ANEXO 5
Pauta de Jerarquerización de la nodulación según tamaño, color, cantidad y distribución de
los nódulos presentes en las raíces de las plantas (Valderrama y Balocchi, 1994).
PARÁMETRO
Escala
Tamaño
Color
Cantidad
Distribución
1
1-2
4-6
X
X
2
5
2-4
X
1
3
2
2
2
5
3
1-3-5-6
2
5
1
2-4
2
5
1
1-3-5-6
1
5
2-4
X
1
5
3
2-4
1
5
3
1-3-5-6
1
5
1
2-4
1
5
1
1-3-5-6
1-2
1-2
2-4
X
2
1-2
3
2-4
2
1-2
3
1-3-5-6
1
1-2
3
1-3-5-6
1
1-2
1
2-4
1
1-2
1
1-3-5-6
2
1-2
1
1-3-5-6
2
3
4
5
6
7
X : Para cualquiera de las clasificaciones.
95
ANEXO 6
Ejemplo de jerarquerización de la nodulación según tablas en anexos 4 y 5.
Se realiza un lavado cuidadoso de las raíces de la planta evitando dañar o soltar los nódulos
presentes.
Mediante la utilización de lente de aumento se caracterizan los nódulos según pauta de
caracterización de la nodulación (anexo 3), determinando la presencia, forma, color, tamaño,
cantidad y distribución de los mismos en las raíces.
Ejemplo:
Presencia:
si existe presencia de nódulos se designa la clave correspondiente
=1
Forma:
si la forma es semiglobosa la clave correspondiente es
=2
Color:
si el color es rojo, la clave correspondiente es
=2
Tamaño:
si el tamaño predominante es grande (> 1 mm), su clave es
=1
Cantidad:
si la cantidad es muchos (20-30 por planta o más), su clave es
=1
Distribución: si la distribución es en la raíz lateral, cerca de la corona, su clave es
=3
En base a estos resultados de caracterización de la nodulación se realiza la jerarquización de la
nodulación de la planta según escala presentada en el anexo 4, la cual se basa en los resultados
para tamaño, color, cantidad y distribución de los nódulos en las raíces.
Para nuestro ejemplo el resultado es:
PARÁMETRO
Escala
Tamaño
Color
Cantidad
Distribución
7
1
2
1
3
El resultado de jerarquización de la nodulación indica que en nuestro ejemplo nos encontramos
frente a una planta en simbiosis con una cepa de rhizobium con muy buenas características de
nodulación, ya que a mayor valor obtenido en la escala, mejor es la evaluación obtenida.
96
ANEXO 7
Recuentos celulares finales, rendimiento (concentración final en peso celular seco), tiempos
de duplicación y velocidades de crecimiento celular (máx) para cultivos incubados a 25ºC.
Temperatura
de
incubación
pH
del
medio
Fuente
de
carbono
utilizada
(ºC)
Recuento
celular
final
Concentración
final en peso
celular seco
Tiempo de
duplicación
celular (t)
Velocidad de
crecimiento
celular (máx)
(ufc/mL)
(gr/mL)
(h)
(h-1)
25
5,5
Manitol
8,07 x 1010
4,92
6,65
0,1042
25
5,5
Manitol
8,04 x 1010
4,95
6,61
0,1049
25
5,5
Sacarosa
8,06 x 1010
4,92
7,29
0,0951
10
4,91
7,24
0,0957
25
5,5
Sacarosa
8,05 x 10
25
5,5
Glicerol
8,04 x 1010
4,91
7,32
0,0947
10
4,92
7,37
0,0941
25
5,5
Glicerol
8,03 x 10
25
6,5
Manitol
8,04 x 1010
4,94
6,64
0,1044
25
6,5
Manitol
8,05 x 1010
4,93
6,64
0,1044
25
6,5
Sacarosa
8,07 x 1010
4,89
6,94
0,0999
25
6,5
Sacarosa
8,06 x 1010
4,90
6,84
0,1013
25
6,5
Glicerol
8,05 x 1010
4,89
7,14
0,0971
10
4,93
7,09
0,0978
25
6,5
Glicerol
8,03 x 10
25
7,0
Manitol
8,05 x 1010
4,95
6,24
0,1111
25
7,0
Manitol
8,06 x 1010
4,94
6,15
0,1127
25
7,0
Sacarosa
8,05 x 1010
4,95
6,68
0,1038
25
7,0
Sacarosa
8,04 x 1010
4,97
6,57
0,1055
25
7,0
Glicerol
8,03 x 1010
4,94
6,69
0,1036
Glicerol
10
4,95
6,71
0,1033
25
7,0
8,05 x 10
97
ANEXO 8
Recuentos celulares finales, rendimiento (concentración final en peso celular seco), tiempos
de duplicación y velocidades de crecimiento celular (máx) para cultivos incubados a 28ºC.
Temperatura
de
incubación
pH
del
medio
Fuente
de
carbono
utilizada
(ºC)
Recuento
celular
final
Concentración
final en peso
celular seco
Velocidad
de crecimiento
celular (máx)
(gr/mL)
Tiempo
de
duplicación
celular (t)
(h)
(ufc/mL)
(h-1)
28
5,5
Manitol
8,06 x 1010
4,92
6,51
0,1065
28
5,5
Manitol
8,02 x 1010
4,89
6,50
0,1066
28
5,5
Sacarosa
8,04 x 1010
4,91
6,54
0,1060
10
4,93
6,51
0,1065
28
5,5
Sacarosa
8,03 x 10
28
5,5
Glicerol
8,06 x 1010
4,88
6,56
0,1057
10
4,87
6,56
0,1057
28
5,5
Glicerol
8,07 x 10
28
6,5
Manitol
8,05 x 1010
4,98
5,85
0,1185
28
6,5
Manitol
8,07 x 1010
4,95
5,85
0,1185
28
6,5
Sacarosa
8,02 x 1010
4,98
6,28
0,1104
28
6,5
Sacarosa
8,05 x 1010
4,99
6,23
0,1113
28
6,5
Glicerol
8,04 x 1010
4,98
6,29
0,1102
10
4,95
6,28
0,1104
28
6,5
Glicerol
8,03 x 10
28
7,0
Manitol
8,04 x 1010
4,95
5,47
0,1267
10
4,92
5,44
0,1274
28
7,0
Manitol
8,07 x 10
28
7,0
Sacarosa
8,05 x 1010
4,90
5,85
0,1185
28
7,0
Sacarosa
8,07 x 1010
4,88
5,85
0,1185
28
7,0
Glicerol
8,06 x 1010
4,93
6,15
0,1127
28
7,0
Glicerol
8,07 x 1010
4,91
6,16
0,1125
98
ANEXO 9
Recuentos celulares finales, rendimiento (Concentración final en peso celular seco), tiempos
de duplicación y velocidades de crecimiento celular (máx) para cultivos incubados a 30ºC.
Temperatura
de
incubación
pH
del
medio
Fuente
de
carbono
utilizada
(ºC)
Recuento
celular
final
Concentración
final en peso
celular seco
Velocidad
de crecimiento
celular (máx)
(gr/mL)
Tiempo
de
duplicación
celular (t)
(h)
(ufc/mL)
(h-1)
30
5,5
Manitol
8,06 x 1010
4,95
5,05
0,1373
30
5,5
Manitol
8,04 x 1010
4,92
5,03
0,1378
30
5,5
Sacarosa
8,03 x 1010
4,95
5,31
0,1305
10
4,92
5,24
0,1323
30
5,5
Sacarosa
8,05 x 10
30
5,5
Glicerol
8,05 x 1010
4,95
5,27
0,1315
10
4,93
5,28
0,1313
30
5,5
Glicerol
8,06 x 10
30
6,5
Manitol
8,05 x 1010
4,97
4,59
0,1510
30
6,5
Manitol
8,06 x 1010
4,96
4,55
0,1523
30
6,5
Sacarosa
8,06 x 1010
4,95
4,71
0,1472
30
6,5
Sacarosa
8,05 x 1010
4,92
4,74
0,1462
30
6,5
Glicerol
8,04 x 1010
4,89
5,21
0,1330
10
4,86
5,24
0,1323
30
6,5
Glicerol
8,06 x 10
30
7,0
Manitol
8,07 x 1010
4,94
4,16
0,1666
30
7,0
Manitol
8,04 x 1010
4,95
4,17
0,1662
30
7,0
Sacarosa
8,07 x 1010
4,98
4,44
0,1561
30
7,0
Sacarosa
8,06 x 1010
4,95
4,42
0,1568
30
7,0
Glicerol
8,05 x 1010
4,94
5,00
0,1386
Glicerol
10
4,96
4,96
0,1397
30
7,0
8,07 x 10
99
ANEXO 10
Análisis descriptivo para la variable velocidad de crecimiento celular.
Temperatura (T)
25
28
30
Número obs.
18
18
18
Mínimo
0.0941
0.1057
0.1305
Media
0.1019
0.1129
0.1437
Máximo
0.1127
0.1274
0.1666
Varianza
2.888E-05
4.833E-05
1.453E-04
Des.Estandar
5.374E-03
6.952E-03
1.206E-02
Coef.Var. %
5.28
6.16
8.39
PH (P)
Número obs.
18
18
18
Mínimo
0.1033
0.0941
0.0971
Media
0.1267
0.1126
0.1192
Máximo
0.1666
0.1378
0.1523
Varianza
4.859E-04
2.526E-04
3.740E-04
Des.Estandar
2.204E-02
1.589E-02
1.934E-02
Coef.Var. %
17.40
14.12
16.22
Número obs.
18
18
18
Mínimo
0.1042
0.0951
0.0941
Media
0.1254
0.1190
0.1141
Máximo
0.1666
0.1568
0.1397
Varianza
4.686E-04
4.302E-04
2.515E-04
Des.Estandar
2.165E-02
2.074E-02
1.586E-02
Coef.Var. %
17.26
17.43
13.90
TP
25_5,5
25_6,5
25_7,0
28_5,5
28_6,5
28_7,0
30_5,5
30_6,5
30_7,0
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
0.0941
0.0971
0.1033
0.1057
0.1102
0.1125
0.1305
0.1323
0.1386
Media
0.0981
0.1008
0.1067
0.1062
0.1132
0.1194
0.1335
0.1437
0.1540
Máximo
0.1049
0.1044
0.1127
0.1066
0.1185
0.1274
0.1378
0.1523
0.1666
Varianza
2.515E-05
9.934E-06
1.727E-05
1.747E-07
1.689E-05
4.228E-05
1.044E-05
7.804E-05
1.523E-04
Des.Estandar
5.015E-03
3.152E-03
4.156E-03
4.179E-04
4.110E-03
6.502E-03
3.231E-03
8.834E-03
1.234E-02
Coef.Var. %
5.11
3.13
3.90
0.39
3.63
5.45
2.42
6.15
8.01
TF
25_1
25_2
25_3
28_1
28_2
28_3
30_1
30_2
30_3
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
0.1042
0.0951
0.0941
0.1065
0.1060
0.1057
0.1373
0.1305
0.1313
Media
0.1070
0.1002
0.0984
0.1174
0.1119
0.1095
0.1519
0.1449
0.1344
Máximo
0.1127
0.1055
0.1036
0.1274
0.1185
0.1127
0.1666
0.1568
0.1397
Varianza
1.501E-05
1.772E-05
1.705E-05
8.487E-05
3.074E-05
9.883E-06
1.667E-04
1.280E-04
1.402E-05
Des.Estandar
3.874E-03
4.210E-03
4.130E-03
9.213E-03
5.544E-03
3.144E-03
1.291E-02
1.131E-02
3.745E-03
Coef.Var. %
3.62
4.20
4.20
7.85
4.96
2.87
8.50
7.81
2.79
PF
5,5_1
5,5_2
5,5_3
6,5_1
6,5_2
6,5_3
7,0_1
7,0_2
7,0_3
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
0.1042
0.0951
0.0941
0.1044
0.0999
0.0971
0.1111
0.1038
0.1033
Media
0.1162
0.1110
0.1105
0.1249
0.1194
0.1135
0.1351
0.1265
0.1184
Máximo
0.1378
0.1323
0.1315
0.1523
0.1472
0.1330
0.1666
0.1568
0.1397
Varianza
2.739E-04
2.732E-04
2.877E-04
4.709E-04
4.691E-04
2.539E-04
6.334E-04
5.757E-04
2.752E-04
Des.Estandar
1.655E-02
1.653E-02
1.696E-02
2.170E-02
2.166E-02
1.594E-02
2.517E-02
2.399E-02
1.659E-02
Coef.Var. %
14.24
14.89
15.35
17.38
18.14
14.04
18.63
18.96
14.01
7,0
5,5
6,5
Fuente de C (F)
1
2
3
100
ANEXO 11
Análisis de varianza para las máx obtenidas bajo las diferentes condiciones de cultivo
estudiadas.
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Valor F
P-Valor
Efecto principal (Factor)
A:Temperatura
2
0.01692200
0.00846099
1461.6
0.000**
B: pH
2
0.00179259
0.00089630
154.83
0.000**
C: Fuente de C
2
0.00115088
0.00057544
99.4
0.000**
AB
4
0.00022838
0.00005709
9.86
0.000**
AC
4
0.00021238
0.00005309
9.17
0.000**
BC
4
0.00019658
0.00004915
8.49
0.000**
Residual
35
0.00020261
0.00000578
Total corregido
53
0.02070540
Interacciones
**: Altamente significativo al 99% de confianza P-valor<0.01
101
ANEXO 12
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para máx.
Lugar
1
2
3
Lugar
1
2
3
Lugar
1
2
3
Temperatura (T) Numero observaciones
30
18
28
18
25
18
PH (P)
7,0
6,5
5,5
Media
Grupos*
0.1437 a
b
0.1129
c
0.1019
Numero observaciones
18
18
18
Media
Grupos*
0.1267 a
b
0.1192
c
0.1126
Fuente de C (F) Numero observaciones
1
18
2
18
3
18
Media
Grupos*
0.1254 a
b
0.1190
c
0.1141
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TP
30_7,0
30_6,5
30_5,5
28_7,0
28_6,5
25_7,0
28_5,5
25_6,5
25_5,5
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
Grupos*
0.1540 a
0.1437 a b
b
0.1335
c
0.1194
cd
0.1132
de
0.1067
de
0.1062
e
0.1008
e
0.0981
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TF
30_1
30_2
30_3
28_1
28_2
28_3
25_1
25_2
25_3
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
Grupos*
0.1519 a
0.1449 a b
b
0.1344
c
0.1174
cd
0.1119
cd
0.1095
cd
0.1070
d
0.1002
d
0.0984
102
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para máx
(continuación).
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PF
7,0_1
7,0_2
6,5_1
6,5_2
7,0_3
5,5_1
6,5_3
5,5_2
5,5_3
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
0.1351
0.1265
0.1249
0.1194
0.1184
0.1162
0.1135
0.1110
0.1105
Grupos*
a
ab
ab
ab
ab
ab
ab
b
b
*: Letras distintas en la columna indican diferencias significativas al 95% de confianza (P-valor<0.05).
103
ANEXO 13
Análisis descriptivo para la variable recuento celular.
Temperatura (T) Número obs. Mínimo
Media
Máximo
25
18
8.030E+10 8.048E+10 8.070E+10
28
18
8.020E+10 8.050E+10 8.070E+10
30
18
8.030E+10 8.054E+10 8.070E+10
Varianza
1.559E+16
3.059E+16
1.310E+16
Des.Estandar
1.249E+08
1.749E+08
1.145E+08
Coef.Var. %
0.16
0.22
0.14
PH (P)
7,0
5,5
6,5
Número obs. Mínimo
Media
Máximo
18
8.030E+10 8.056E+10 8.070E+10
18
8.020E+10 8.048E+10 8.070E+10
18
8.020E+10 8.049E+10 8.070E+10
Varianza
1.673E+16
2.183E+16
1.869E+16
Des.Estandar
1.294E+08
1.478E+08
1.367E+08
Coef.Var. %
0.16
0.18
0.17
Fuente de C (F) Número obs. Mínimo
Media
Máximo
1
18
8.020E+10 8.052E+10 8.070E+10
2
18
8.020E+10 8.051E+10 8.070E+10
3
18
8.030E+10 8.049E+10 8.070E+10
Varianza
1.948E+16
2.056E+16
2.056E+16
Des.Estandar
1.396E+08
1.434E+08
1.434E+08
Coef.Var. %
0.17
0.18
0.18
TP
25_5,5
25_6,5
25_7,0
28_5,5
28_6,5
28_7,0
30_5,5
30_6,5
30_7,0
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
8.030E+10
8.030E+10
8.030E+10
8.020E+10
8.020E+10
8.040E+10
8.030E+10
8.040E+10
8.040E+10
Media
8.048E+10
8.050E+10
8.047E+10
8.047E+10
8.043E+10
8.060E+10
8.048E+10
8.053E+10
8.060E+10
Máximo
8.070E+10
8.070E+10
8.060E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.060E+10
8.060E+10
8.070E+10
Varianza
2.167E+16
2.000E+16
1.067E+16
3.867E+16
3.067E+16
1.600E+16
1.367E+16
6.667E+15
1.600E+16
Des.Estandar
1.472E+08
1.414E+08
1.033E+08
1.966E+08
1.751E+08
1.265E+08
1.169E+08
8.165E+07
1.265E+08
Coef.Var. %
0.18
0.18
0.13
0.24
0.22
0.16
0.15
0.10
0.16
TF
25_1
25_2
25_3
28_1
28_2
28_3
30_1
30_2
30_3
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
8.040E+10
8.040E+10
8.030E+10
8.020E+10
8.020E+10
8.030E+10
8.040E+10
8.030E+10
8.040E+10
Media
8.052E+10
8.055E+10
8.038E+10
8.052E+10
8.043E+10
8.055E+10
8.053E+10
8.053E+10
8.055E+10
Máximo
8.070E+10
8.070E+10
8.050E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
Varianza
1.367E+16
1.100E+16
9.667E+15
3.767E+16
3.067E+16
2.700E+16
1.467E+16
1.867E+16
1.100E+16
Des.Estandar
1.169E+08
1.049E+08
9.832E+07
1.941E+08
1.751E+08
1.643E+08
1.211E+08
1.366E+08
1.049E+08
Coef.Var. %
0.15
0.13
0.12
0.24
0.22
0.20
0.15
0.17
0.13
PF
5,5_1
5,5_2
5,5_3
6,5_1
6,5_2
6,5_3
7,0_1
7,0_2
7,0_3
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
8.020E+10
8.030E+10
8.030E+10
8.040E+10
8.020E+10
8.030E+10
8.040E+10
8.040E+10
8.030E+10
Media
8.048E+10
8.043E+10
8.052E+10
8.053E+10
8.052E+10
8.042E+10
8.055E+10
8.057E+10
8.055E+10
Máximo
8.070E+10
8.060E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.060E+10
8.070E+10
8.070E+10
8.070E+10
Varianza
3.367E+16
1.467E+16
2.167E+16
1.067E+16
2.967E+16
1.367E+16
1.900E+16
1.467E+16
2.300E+16
Des.Estandar
1.835E+08
1.211E+08
1.472E+08
1.033E+08
1.722E+08
1.169E+08
1.378E+08
1.211E+08
1.517E+08
Coef.Var. %
0.23
0.15
0.18
0.13
0.21
0.15
0.17
0.15
0.19
104
ANEXO 14
Análisis de varianza para los recuentos celulares obtenidas bajo las diferentes condiciones
de cultivo estudiadas.
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Valor F
P-Valor
Efecto principal (Factor)
A:Temperatura
2
2.93E+16
1.46E+16
0.77
0.473ns
B: pH
2
6.37E+16
3.19E+16
1.67
0.204ns
C: Fuente de C
2
7.04E+15
3.52E+15
0.18
0.833ns
AB
4
7.41E+16
1.85E+16
0.97
0.437ns
AC
4
1.31E+17
3.27E+16
1.71
0.170ns
BC
4
6.30E+16
1.57E+16
0.82
0.519ns
Residual
35
6.69E+17
1.91E+16
Total corregido
53
1.04E+18
Interacciones
ns: No significativo al 95% de confianza P-valor>0.05
105
ANEXO 15
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para recuento
celular
Lugar
1
2
3
Temperatura (T)
30
28
25
Numero observaciones
18
18
18
Media
8.054E+10
8.050E+10
8.048E+10
Lugar
1
2
3
PH (P)
7,0
6,5
5,5
Numero observaciones
18
18
18
Media
8.056E+10
8.049E+10
8.048E+10
Lugar
1
2
3
Fuente de C (F)
1
2
3
Numero observaciones
18
18
18
Media
8.052E+10
8.051E+10
8.049E+10
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TP
28_7,0
30_7,0
30_6,5
25_6,5
25_5,5
30_5,5
25_7,0
28_5,5
28_6,5
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
8.060E+10
8.060E+10
8.053E+10
8.050E+10
8.048E+10
8.048E+10
8.047E+10
8.047E+10
8.043E+10
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TF
25_2
28_3
30_3
30_1
30_2
25_1
28_1
28_2
25_3
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
8.055E+10
8.055E+10
8.055E+10
8.053E+10
8.053E+10
8.052E+10
8.052E+10
8.043E+10
8.038E+10
106
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para recuento
celular (continuación).
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PF
7,0_2
7,0_1
7,0_3
6,5_1
5,5_3
6,5_2
5,5_1
5,5_2
6,5_3
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
8.057E+10
8.055E+10
8.055E+10
8.053E+10
8.052E+10
8.052E+10
8.048E+10
8.043E+10
8.042E+10
107
ANEXO 16
Análisis descriptivo para la variable biomasa celular.
Temperatura (T) Número obs.
25
18
28
18
30
18
Mínimo
4.89
4.87
4.86
Media
4.93
4.93
4.94
Máximo
4.97
4.99
4.98
Varianza
5.088E-04
1.434E-03
8.265E-04
Des.Estandar
2.256E-02
3.787E-02
2.875E-02
Coef.Var. %
0.46
0.77
0.58
PH (P)
7,0
5,5
6,5
Número obs.
18
18
18
Mínimo
4.88
4.87
4.86
Media
4.94
4.92
4.94
Máximo
4.98
4.95
4.99
Varianza
5.938E-04
5.350E-04
1.459E-03
Des.Estandar
2.437E-02
2.313E-02
3.819E-02
Coef.Var. %
0.49
0.47
0.77
Fuente de C (F) Número obs.
1
18
2
18
3
18
Mínimo
4.89
4.88
4.86
Media
4.94
4.93
4.92
Máximo
4.98
4.99
4.98
Varianza
4.526E-04
1.094E-03
1.097E-03
Des.Estandar
2.127E-02
3.308E-02
3.312E-02
Coef.Var. %
0.43
0.67
0.67
TP
25_5,5
25_6,5
25_7,0
28_5,5
28_6,5
28_7,0
30_5,5
30_6,5
30_7,0
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
4.91
4.89
4.94
4.87
4.95
4.88
4.92
4.86
4.94
Media
4.92
4.91
4.95
4.90
4.97
4.92
4.94
4.93
4.95
Máximo
4.95
4.94
4.97
4.93
4.99
4.95
4.95
4.97
4.98
Varianza
2.167E-04
5.067E-04
1.200E-04
5.600E-04
2.967E-04
5.900E-04
2.267E-04
1.870E-03
2.267E-04
Des.Estandar
1.472E-02
2.251E-02
1.095E-02
2.366E-02
1.722E-02
2.429E-02
1.506E-02
4.324E-02
1.506E-02
Coef.Var. %
0.30
0.46
0.22
0.48
0.35
0.49
0.30
0.88
0.30
TF
25_1
25_2
25_3
28_1
28_2
28_3
30_1
30_2
30_3
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
4.92
4.89
4.89
4.89
4.88
4.87
4.92
4.92
4.86
Media
4.94
4.92
4.92
4.94
4.93
4.92
4.95
4.95
4.92
Máximo
4.95
4.97
4.95
4.98
4.99
4.98
4.97
4.98
4.96
Varianza
1.367E-04
9.467E-04
4.667E-04
9.900E-04
1.977E-03
1.760E-03
2.967E-04
5.100E-04
1.497E-03
Des.Estandar
1.169E-02
3.077E-02
2.160E-02
3.146E-02
4.446E-02
4.195E-02
1.722E-02
2.258E-02
3.869E-02
Coef.Var. %
0.24
0.62
0.44
0.64
0.90
0.85
0.35
0.46
0.79
PF
5,5_1
5,5_2
5,5_3
6,5_1
6,5_2
6,5_3
7,0_1
7,0_2
7,0_3
Número obs.
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Mínimo
4.89
4.91
4.87
4.93
4.89
4.86
4.92
4.88
4.89
Media
4.93
4.92
4.91
4.96
4.94
4.92
4.94
4.94
4.93
Máximo
4.95
4.95
4.95
4.98
4.99
4.98
4.95
4.98
4.95
Varianza
5.100E-04
2.267E-04
9.200E-04
3.500E-04
1.737E-03
1.987E-03
1.367E-04
1.577E-03
5.100E-04
Des.Estandar
2.258E-02
1.506E-02
3.033E-02
1.871E-02
4.167E-02
4.457E-02
1.169E-02
3.971E-02
2.258E-02
Coef.Var. %
0.46
0.31
0.62
0.38
0.84
0.91
0.24
0.80
0.46
108
ANEXO 17
Análisis de varianza para los resultados de biomasa celular obtenidos bajo las diferentes
condiciones de cultivo estudiadas.
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Valor F
P-Valor
Efecto principal (Factor)
A:Temperatura
2
0.001137
0.000569
1.18
0.319ns
B: pH
2
0.004226
0.002113
4.38
0.020**
C: Fuente de C
2
0.003270
0.001635
3.39
0.045**
AB
4
0.019785
0.004946
10.26
0.000**
AC
4
0.000907
0.000227
0.47
0.757ns
BC
4
0.002019
0.000505
1.05
0.397ns
Residual
35
0.016870
0.000482
Total corregido
53
0.048215
Interacciones
ns: No significativo al 95% de confianza P-valor>0.05
**: Altamente significativo al 99% de confianza P-valor<0.01
109
ANEXO 18
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking, según pH y fuente de carbono, e
interacciones para la variable biomasa celular.
Lugar
1
2
3
Lugar
1
2
3
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PH (P)
7,0
6,5
5,5
Numero observaciones
18
18
18
Media
4.939
4.937
4.919
Fuente de C (F) Numero observaciones
1
18
2
18
3
18
Media
4.941
4.933
4.922
a
ab
b
Media
4.972
4.953
4.950
4.937
4.925
4.922
4.915
4.913
4.900
Grupos*
a
ab
ab
abc
bc
bc
bc
bc
c
TP
28_6,5
30_7,0
25_7,0
30_5,5
30_6,5
25_5,5
28_7,0
25_6,5
28_5,5
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Grupos*
a
a
b
Grupos*
*: Letras distintas en la columna indican diferencias significativas al 95% de confianza (P-valor<0.05).
110
ANEXO 19
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking, según pH y fuente de carbono, e
interacciones para la variable biomasa celular.
Lugar
1
2
3
Temperatura (T)
30
28
25
Numero observaciones
18
18
18
Media
4.938
4.929
4.928
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TF
30_1
30_2
25_1
28_1
28_2
25_2
25_3
30_3
28_3
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
4.948
4.945
4.938
4.935
4.932
4.923
4.923
4.922
4.920
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PF
6,5_1
7,0_1
6,5_2
7,0_3
7,0_2
5,5_1
5,5_2
6,5_3
5,5_3
Numero observaciones
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Media
4.942
4.938
4.938
4.938
4.925
4.923
4.917
4.910
111
ANEXO 20
Valores de peso aéreo, nodulación, eficiencia, controles positivos y controles negativos para
plántulas inoculadas con cultivos incubados a 25ºC.
Temperatura
de
incubación
pH
del
medio
Fuente
de
carbono
utilizada
Peso
aéreo
de las
plántulas
(g)
25
5,5
Manitol
0,00560
5,50
0,0571
0,00938
0,00491
25
5,5
Manitol
0,00547
5,50
0,0469
0,00938
0,00491
25
5,5
Sacarosa
0,00554
5,75
0,0524
0,00938
0,00491
25
5,5
Sacarosa
0,00557
5,50
0,0548
0,00938
0,00491
25
5,5
Glicerol
0,00532
5,25
0,0348
0,00938
0,00491
25
5,5
Glicerol
0,00544
5,00
0,0445
0,00938
0,00491
25
6,5
Manitol
0,00655
6,00
0,1208
0,00942
0,00496
25
6,5
Manitol
0,00652
5,50
0,1188
0,00942
0,00496
25
6,5
Sacarosa
0,00655
6,00
0,1208
0,00942
0,00496
25
6,5
Sacarosa
0,00654
5,75
0,1201
0,00942
0,00496
25
6,5
Glicerol
0,00642
5,25
0,1121
0,00942
0,00496
25
6,5
Glicerol
0,00645
6,25
0,1141
0,00942
0,00496
25
7,0
Manitol
0,00665
6,00
0,1273
0,00942
0,00496
25
7,0
Manitol
0,00667
6,25
0,1286
0,00942
0,00496
25
7,0
Sacarosa
0,00662
5,50
0,1254
0,00942
0,00496
25
7,0
Sacarosa
0,00661
6,25
0,1247
0,00942
0,00496
25
7,0
Glicerol
0,00598
5,25
0,0812
0,00942
0,00496
25
7,0
Glicerol
0,00587
5,75
0,0732
0,00942
0,00496
(°C)
Nodulación Eficiencia Control (+) Control (-)
por grupo por grupo
de
de
tratamiento tratamiento
(medias)
(medias)
(g)
(g)
Los valores de peso aéreo, nodulación y eficiencia corresponden al promedio de los resultados de
cuatro repeticiones de cada tratamiento; y los valores correspondientes a los controles (+) y (-)
son las medias de peso aéreo para cada control según grupo de tratamiento analizado (Anexos 23,
24 y 25).
112
ANEXO 21
Valores de peso aéreo, nodulación, eficiencia, controles positivos y controles negativos para
plántulas inoculadas con cultivos incubados a 28ºC.
Temperatura
de
incubación
pH
del
medio
Fuente
de
carbono
utilizada
(°C)
Peso
aéreo
de las
plántulas
(g)
Nodulación Eficiencia Control (+) Control (-)
por grupo por grupo
de
de
tratamiento tratamiento
(medias)
(medias)
(g)
(g)
28
5,5
Manitol
0,00654
5,75
0,1280
0,00935
0,00487
28
5,5
Manitol
0,00652
6,25
0,1267
0,00935
0,00487
28
5,5
Sacarosa
0,00635
5,50
0,1152
0,00935
0,00487
28
5,5
Sacarosa
0,00645
5,50
0,1220
0,00935
0,00487
28
5,5
Glicerol
0,00588
5,00
0,0818
0,00935
0,00487
28
5,5
Glicerol
0,00610
5,25
0,0978
0,00935
0,00487
28
6,5
Manitol
0,00679
6,00
0,1443
0,00935
0,00487
28
6,5
Manitol
0,00675
5,75
0,1418
0,00935
0,00487
28
6,5
Sacarosa
0,00668
5,75
0,1372
0,00935
0,00487
28
6,5
Sacarosa
0,00666
6,00
0,1359
0,00935
0,00487
28
6,5
Glicerol
0,00644
6,00
0,1214
0,00935
0,00487
28
6,5
Glicerol
0,00637
5,75
0,1166
0,00935
0,00487
28
7,0
Manitol
0,00709
6,25
0,1474
0,00947
0,00505
28
7,0
Manitol
0,00713
6,25
0,1498
0,00947
0,00505
28
7,0
Sacarosa
0,00702
5,00
0,1430
0,00947
0,00505
28
7,0
Sacarosa
0,00704
6,00
0,1443
0,00947
0,00505
28
7,0
Glicerol
0,00659
6,25
0,1156
0,00947
0,00505
28
7,0
Glicerol
0,00659
5,75
0,1156
0,00947
0,00505
Los valores de peso aéreo, nodulación y eficiencia corresponden al promedio de los resultados de
cuatro repeticiones de cada tratamiento; y los valores correspondientes a los controles (+) y (-)
son las medias de peso aéreo para cada control según grupo de tratamiento analizado (Anexos 23,
24 y 25).
113
ANEXO 22
Valores de peso aéreo, nodulación, eficiencia, controles positivos y controles negativos para
plántulas inoculadas con cultivos incubados a 30ºC.
Temperatura
de
incubación
pH
del
medio
Fuente
de
carbono
utilizada
(°C)
Peso
aéreo
de las
plántulas
(g)
Nodulación Eficiencia Control (+) Control (-)
por grupo por grupo
de
de
tratamiento tratamiento
(medias)
(medias)
(g)
(g)
30
5,5
Manitol
0,00718
6,00
0,1767
0,00933
0,00478
30
5,5
Manitol
0,00723
6,25
0,1797
0,00933
0,00478
30
5,5
Sacarosa
0,00708
6,25
0,1706
0,00933
0,00478
30
5,5
Sacarosa
0,00703
6,25
0,1675
0,00933
0,00478
30
5,5
Glicerol
0,00698
5,75
0,1644
0,00933
0,00478
30
5,5
Glicerol
0,00689
5,75
0,1588
0,00933
0,00478
30
6,5
Manitol
0,00848
6,50
0,2373
0,00938
0,00491
30
6,5
Manitol
0,00833
6,25
0,2296
0,00938
0,00491
30
6,5
Sacarosa
0,00829
6,00
0,2275
0,00938
0,00491
30
6,5
Sacarosa
0,00819
6,50
0,2222
0,00938
0,00491
30
6,5
Glicerol
0,00794
5,50
0,2087
0,00938
0,00491
30
6,5
Glicerol
0,00793
5,75
0,2082
0,00938
0,00491
30
7,0
Manitol
0,00909
6,25
0,2675
0,00938
0,00491
30
7,0
Manitol
0,00903
6,25
0,2646
0,00938
0,00491
30
7,0
Sacarosa
0,00889
6,00
0,2578
0,00938
0,00491
30
7,0
Sacarosa
0,00879
6,25
0,2529
0,00938
0,00491
30
7,0
Glicerol
0,00820
6,25
0,2227
0,00938
0,00491
30
7,0
Glicerol
0,00819
6,00
0,2222
0,00938
0,00491
Los valores de peso aéreo, nodulación y eficiencia corresponden al promedio de los resultados de
cuatro repeticiones de cada tratamiento; y los valores correspondientes a los controles (+) y (-)
son las medias de peso aéreo para cada control según grupo de tratamiento analizado (Anexos 23,
24 y 25).
114
ANEXO 23
Análisis descriptivo para los resultados de peso aéreo de los controles según grupo de
tratamiento.
Análisis descriptivo para los resultados de peso aéreo de los controles positivos:
Grupo de
tratamiento
Número obs.
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
1
2
3
4
5
6
4
4
4
4
4
4
0.009270
0.009300
0.009380
0.009300
0.009380
0.009300
0.009330
0.009353
0.009420
0.009380
0.009473
0.009380
0.009390
0.009380
0.009480
0.009420
0.009560
0.009450
4.07E-09
1.42E-09
1.87E-09
3.20E-09
6.76E-09
4.60E-09
6.38E-05
3.77E-05
4.32E-05
5.66E-05
8.22E-05
6.78E-05
0.68
0.40
0.46
0.60
0.87
0.72
Análisis descriptivo para los resultados de peso aéreo de los controles negativos:
Grupo de
tratamiento
Número obs.
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
1
2
3
4
5
6
4
4
4
4
4
4
0.004680
0.004750
0.004890
0.004850
0.004890
0.004800
0.004780
0.004870
0.004960
0.004910
0.005050
0.004910
0.004890
0.004980
0.005030
0.004980
0.005260
0.005020
8.73E-09
1.02E-08
5.67E-09
4.87E-09
2.57E-08
9.13E-09
9.35E-05
1.01E-04
7.53E-05
6.98E-05
1.60E-04
9.56E-05
1.96
2.07
1.52
1.42
3.17
1.95
115
ANEXO 24
Análisis de varianza de los valores de peso aéreo obtenidos en los controles según grupo de
tratamientos.
Análisis de varianza de los valores de peso aéreo obtenidos en los controles positivos:
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Entre grupos
5
5.16333E-08 1.03267E-08
Intra grupos
18
6.57500E-08 3.65278E-09
Total corregido
23
1.17383E-07
Valor F
2.830
P-Valor
0.047*
*: significativo al 95% de confianza P-valor<0.05
Análisis de varianza de los valores de peso aéreo obtenidos en los controles negativos:
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Entre grupos
5
1.62E-07
3.24E-08
Intra grupos
18
1.93E-07
1.07E-08
Total corregido
23
3.55E-07
*: significativo al 95% de confianza P-valor<0.05
Valor F
3.030
P-Valor
0.037*
116
ANEXO 25
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking, según
grupo de tratamientos para la
variable peso aéreo de los controles.
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking para la variable peso aéreo de los controles
positivos:
Lugar
1
2
3
4
5
6
Grupos de
tratamiento
5
3
4
6
2
1
Numero
observaciones
4
4
4
4
4
4
Media
0.009473
0.009420
0.009380
0.009380
0.009353
0.009330
Grupos*
a
ab
ab
ab
ab
b
*: letras distintas en la columna indican diferencias significativas al 95% de confianza (P-valor<0.05).
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking para la variable peso aéreo de los controles
negativos:
Lugar
1
2
3
4
5
6
Grupos de
tratamiento
5
3
4
6
2
1
Numero
observaciones
4
4
4
4
4
4
Media
0.005050
0.004960
0.004910
0.004910
0.004870
0.004780
Grupos*
a
ab
ab
ab
ab
b
*: letras distintas en la columna indican diferencias significativas al 95% de confianza (P-valor<0.05).
117
ANEXO 26
Análisis descriptivo para la variable infectividad (capacidad nodulativa) del Rhizobium.
Temperatura (T) Número obs.
25
36
28
36
30
36
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
5.00
5.00
5.00
5.75
5.83
6.17
7.00
7.00
7.00
0.421429
0.428571
0.314286
0.649175
0.654654
0.560612
11.29
11.22
9.09
PH (P)
7,0
5,5
6,5
Número obs.
36
36
36
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
5.00
5.00
5.00
6.11
5.72
5.92
7.00
7.00
7.00
0.387302
0.377778
0.421429
0.622336
0.614636
0.649175
10.18
10.74
10.97
Fuente de C (F) Número obs.
1
36
2
36
3
36
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
5.00
5.00
5.00
6.06
5.92
5.78
7.00
7.00
7.00
0.282540
0.421429
0.520635
0.531545
0.649175
0.721550
8.78
10.97
12.49
TP
25_5,5
25_6,5
25_7,0
28_5,5
28_6,5
28_7,0
30_5,5
30_6,5
30_7,0
Número obs.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
6.00
5.42
5.75
6.08
5.58
5.92
6.00
6.17
6.08
6.25
6.00
7.00
7.00
6.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
0.265152
0.386364
0.446970
0.265152
0.446970
0.545455
0.333333
0.446970
0.204545
0.514929
0.621582
0.668558
0.514929
0.668558
0.738549
0.577350
0.668558
0.452267
9.51
10.81
10.99
9.22
11.30
12.31
9.36
10.99
7.24
TF
25_1
25_2
25_3
28_1
28_2
28_3
30_1
30_2
30_3
Número obs.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
6.00
5.00
5.00
5.83
5.83
5.58
6.08
5.67
5.75
6.25
6.25
6.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
0.333333
0.333333
0.628788
0.265152
0.424242
0.568182
0.204545
0.386364
0.363636
0.577350
0.577350
0.792961
0.514929
0.651339
0.753778
0.452267
0.621582
0.603023
9.90
9.90
14.20
8.46
11.49
13.11
7.24
9.95
10.05
PF
5,5_1
5,5_2
5,5_3
6,5_1
6,5_2
6,5_3
7,0_1
7,0_2
7,0_3
Número obs.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
5.00
6.00
5.00
5.00
5.92
5.83
5.42
5.92
6.00
5.83
6.33
5.92
6.08
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
7.00
0.265152
0.333333
0.446970
0.265152
0.545455
0.515152
0.242424
0.446970
0.446970
0.514929
0.577350
0.668558
0.514929
0.738549
0.717741
0.492366
0.668558
0.668558
8.70
9.90
12.34
8.70
12.31
12.30
7.77
11.30
10.99
118
ANEXO 27
Análisis de varianza para los resultados de infectividad obtenidos según las diferentes
condiciones de cultivo estudiadas.
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Valor F
P-Valor
Efecto principal (Factor)
A:Temperatura
2
3.50000
1.75000
4.72
0.014*
B: pH
2
2.72222
1.36111
3.67
0.034*
C: Fuente de C
2
1.38889
0.69444
1.87
0.172ns
AB
4
1.27778
0.31944
0.86
0.511ns
AC
4
0.77778
0.19444
0.52
0.733ns
BC
4
1.55556
0.38889
1.05
0.408ns
Residual
81
33.0278
0.371099
Total corregido
107
44.25000
Interacciones
ns: No significativo al 95% de confianza P-valor>0.05
**: Altamente significativo al 99% de confianza P-valor<0.01
119
ANEXO 28
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para la
infectividad de los cultivos de Rhizobium inoculados.
Lugar
Temperatura (T)
1
2
3
30
28
25
Lugar
PH (P)
1
2
3
7,0
6,5
5,5
Numero
obs.
36
36
36
Numero
obs.
36
36
36
Media
6.17
5.83
5.75
Media
6.11
5.92
5.72
Grupos*
a
ab
b
Grupos*
a
ab
b
120
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para la
infectividad de los cultivos de Rhizobium inoculados (continuación).
Lugar
1
2
3
Fuente de C (F)
1
2
3
Numero observaciones
36
36
36
Media
6.06
5.92
5.78
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TP
30_7,0
30_5,5
25_7,0
30_6,5
28_7,0
28_6,5
25_6,5
28_5,5
25_5,5
Numero observaciones
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Media
6.25
6.17
6.08
6.08
6.00
5.92
5.75
5.58
5.42
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TF
30_1
30_2
28_1
30_3
25_1
25_2
28_3
28_2
25_3
Numero observaciones
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Media
6.25
6.25
6.08
6.00
5.83
5.83
5.75
5.67
5.58
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PF
7,0_1
7,0_3
6,5_2
5,5_1
6,5_1
7,0_2
6,5_3
5,5_2
5,5_3
Numero observaciones
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Media
6.33
6.08
6.00
5.92
5.92
5.92
5.83
5.83
5.42
121
ANEXO 29
Análisis descriptivo para la variable efectividad de los cultivos de Rhizobium obtenidos.
Temperatura (T) Número obs.
25
36
28
36
30
36
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
0.00325
0.00606
0.01529
0.00921
0.01269
0.02133
0.01344
0.01563
0.02761
0.000012
0.000004
0.000013
0.003532
0.001916
0.003615
38.36
15.10
16.95
PH (P)
7,0
5,5
6,5
Número obs.
36
36
36
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
0.00612
0.00325
0.01039
0.01647
0.01100
0.01576
0.02761
0.01900
0.02394
0.000041
0.000027
0.000023
0.006416
0.005198
0.004787
38.96
47.26
30.37
Fuente de C (F) Número obs.
1
36
2
36
3
36
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
0.00453
0.00500
0.00325
0.01552
0.01497
0.01274
0.02761
0.02667
0.02289
0.000038
0.000033
0.000034
0.006133
0.005787
0.005810
39.53
38.66
45.59
TP
25_5,5
25_6,5
25_7,0
28_5,5
28_6,5
28_7,0
30_5,5
30_6,5
30_7,0
Número obs.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
0.00325
0.01039
0.00612
0.00606
0.01113
0.01118
0.01529
0.02044
0.02155
0.00484
0.01178
0.01101
0.01119
0.01329
0.01360
0.01696
0.02223
0.02480
0.00612
0.01311
0.01344
0.01333
0.01469
0.01563
0.01900
0.02394
0.02761
0.000001
0.000001
0.000007
0.000004
0.000001
0.000003
0.000001
0.000001
0.000004
0.000824
0.000758
0.002629
0.002016
0.001161
0.001595
0.001017
0.001199
0.002078
17.02
6.43
23.88
18.01
8.74
11.73
5.99
5.39
8.38
TF
25_1
25_2
25_3
28_1
28_2
28_3
30_1
30_2
30_3
Número obs.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
0.00453
0.00500
0.00325
0.01227
0.01138
0.00606
0.01634
0.01643
0.01529
0.00999
0.00997
0.00767
0.01397
0.01329
0.01081
0.02259
0.02164
0.01975
0.01344
0.01306
0.01206
0.01563
0.01472
0.01233
0.02761
0.02667
0.02289
0.000013
0.000012
0.000011
0.000001
0.000001
0.000003
0.000015
0.000014
0.000008
0.003616
0.003434
0.003305
0.001081
0.001190
0.001755
0.003865
0.003802
0.002763
36.19
34.45
43.12
7.74
8.96
16.23
17.11
17.57
13.99
PF
5,5_1
5,5_2
5,5_3
6,5_1
6,5_2
6,5_3
7,0_1
7,0_2
7,0_3
Número obs.
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Mínimo
Media
Máximo
Varianza
Des.Estandar
Coef.Var. %
0.00453
0.00500
0.00325
0.01105
0.01166
0.01039
0.01228
0.01188
0.00612
0.01192
0.01138
0.00970
0.01654
0.01606
0.01469
0.01809
0.01747
0.01384
0.01900
0.01753
0.01687
0.02394
0.02305
0.02120
0.02761
0.02667
0.02289
0.000030
0.000025
0.000029
0.000027
0.000023
0.000021
0.000041
0.000037
0.000042
0.005464
0.004953
0.005354
0.005152
0.004824
0.004591
0.006388
0.006046
0.006492
45.85
43.54
55.18
31.14
30.03
31.27
35.32
34.61
46.90
122
ANEXO 30
Análisis de varianza para los resultados de efectividad obtenidos según las diferentes
condiciones de cultivo estudiadas.
Fuente de
Variación
Grados
Libertad
Suma
Cuadrados
Cuadrados
Medios
Valor F
P-Valor
Efecto principal (Factor)
A:Temperatura
2
0.00280289
0.00140144
2152.590
0.000**
B: pH
2
0.00063711
0.00031855
489.290
0.000**
C: Fuente de C
2
0.00015530
0.00007765
119.270
0.000**
AB
4
0.00013356
0.00003339
51.290
0.000**
AC
4
0.00000394
0.00000098
1.510
0.277ns
BC
4
0.00002522
0.00000631
9.690
0.000**
Residual
89
0.00006753
0.00000075
Total corregido
107
0.00382554
Interacciones
ns: No significativo al 95% de confianza P-valor>0.05
**: Altamente significativo al 99% de confianza P-valor<0.01
123
ANEXO 31
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para la eficiencia
de los cultivos de Rhizobium obtenidos.
Lugar
1
2
3
Lugar
1
2
3
Lugar
1
2
3
Temperatura (T) Numero observaciones Media
Grupos*
30
36
0.02133 a
28
36
b
0.01269
25
36
c
0.00921
PH (P)
7,0
6,5
5,5
Numero observaciones Media
Grupos*
36
0.01647 a
b
36
0.01576
c
36
0.01100
Fuente de C (F) Numero observaciones Media
Grupos*
1
36
0.01552 a
b
2
36
0.01497
c
3
36
0.01274
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TP
30_7,0
30_6,5
30_5,5
28_7,0
28_6,5
25_7,0
28_5,5
25_6,5
25_5,5
Numero observaciones
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Media
Grupos*
0.02480 a
b
0.02223
c
0.01696
d
0.01360
d
0.01329
de
0.01178
e
0.01119
e
0.01101
f
0.00484
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
PF
7,0_1
7,0_2
6,5_1
6,5_2
6,5_3
7,0_3
5,5_1
5,5_2
5,5_3
Numero observaciones
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Media
0.01809
0.01747
0.01654
0.01606
0.01469
0.01384
0.01192
0.01138
0.00970
Grupos*
a
a
ab
ab
ab
ab
ab
ab
b
124
Comparaciones múltiples de Tukey y ranking según factor e interacción para la eficiencia
de los cultivos de Rhizobium obtenidos (continuación).
Lugar
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TF
30_1
30_2
30_3
28_1
28_2
28_3
25_1
25_2
25_3
Numero observaciones
12
12
12
12
12
12
12
12
12
Media
0.02259
0.02164
0.01975
0.01397
0.01329
0.01081
0.00999
0.00997
0.00767
125
ANEXO 32
Análisis de regresión y de varianza de los resultados de eficiencia en relación a los
resultados de nodulación de la cepa estudiada.
Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X
Variable dependiente: Eficiencia
Variable independiente: Nodulación
Parámetro
Error
estándar
Estimación
Estadístico
T
P-valor
Ordenada
-0,00543239
0,0050128
-1,08371
0,2810
Pendiente
0,0033535
0,000842318
3,98128
0,0001
Análisis de la Varianza
Fuente
Suma de
cuadrados
GL
Cuadrado
medio
Modelo
0,000497635
1
0,000497635
Residuo
0,00332791
106
0,0000313954
Total (Corr.)
0,00382554
107
Cociente-F
15,85
P-valor
0,0001
126
Análisis de regresión y de varianza de los resultados de eficiencia en relación a los
resultados de nodulación de la cepa estudiada (continuación).
Coeficiente de Correlación = 0,360669
R-cuadrado = 13,0082 porcentaje
R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 12,1875 porcentaje
Error estándar de est. = 0,00560316
Error absoluto medio = 0,00442378
Estadístico de Durbin-Watson = 0,31286 (P=0,0000)
Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,832411