BIOLOGIA 4 Guía de Trabajos Prácticos
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Escuela de Ciencia y Tecnología BIOLOGIA 4 Guía de Trabajos Prácticos Biología Segundo Cuatrimestre año 2009 Coordinadores de la materia Dra. Prof. Deborah R. Tasat Lic. Leonardo Storani Docentes Responsables de Teóricos y TP Dr. Federico Mollard Dra. Andrea Gioffré Lic. Leonardo Storani Ayudantes de Segunda Carlos Hernando Características Generales El curso de Biología General se desarrollará en 15 semanas y comprende: Clases Teóricas de 3 horas cada una (1 clase por semana) Trabajos Prácticos de 3 horas cada uno (1 TP por semana) Exámenes Parciales: 2 Clases Teóricas Teniendo en cuenta la imposibilidad material para desarrollar la totalidad de los temas debido al avance creciente de los conocimientos en Biología, las clases teóricas están dedicadas básicamente a la actualización de los temas fundamentales de la materia. No obstante, la totalidad de los tópicos del Programa Analítico deben ser estudiados utilizando la bibliografía aconsejada. Para facilitar la compresión de los contenidos desarrollados en las clases teóricas, es esencial el estudio previo de los temas a ser dictados. Clases Prácticas El Trabajo Práctico es una actividad de asistencia obligatoria. Las bases conceptuales de los temas de TP son desarrollados previamente en las Clases Teóricas. El alumno deberá poseer los conocimientos teóricos correspondientes al tema del día, los que serán evaluados mediante interrogatorios orales o escritos. El alumno deberá tener aprobado el 80% de los interrogatorios en cada una de las partes de esta materia para la aprobación de los TPs. La inasistencia al TP se considerará como Insuficiente. Parciales Durante el curso lectivo se tomarán 2 (dos) exámenes parciales cada uno de los cuales se aprobarán con el 60% de la nota. Ambos parciales se podrán recuperar una sola vez en las fechas previstas por la Universidad. Examen Final Los alumnos que hayan aprobado los parciales con una nota igual a 6 (seis) en su primer instancia o en los recuperatorios correspondientes deberán rendir examen final. La nota de aprobación será equivalente a la del exámen parcial. Aquellos alumnos que hayan aprobado los dos parciales sin recuperatorios, podrán rendir examen final en la primer o segunda fecha de diciembre. Aquellos alumnos que recuperaren parciales, SÓLO podrán rendir examen final en la segunda fecha de diciembre. PROGRAMA: Sistemas de Clasificación. Reino Fungi. Principales grupos y características. Reino Plantae. Principales grupos. Alternancia de generaciones. La célula vegetal. Principales organelas. Origen y funciones. Tejidos vegetales. Tejido fundamental, de conducción y de protección. Órganos vegetales. Raíz, tallo y hoja. Principales funciones. El agua y las plantas. Potencial agua. Absorción de agua por las raíces. Nutrición mineral. Absorción de nutrientes por la raíz. Potencial electroquímico. Transporte activo y pasivo. Transporte por floema. Transporte por xilema. Carga y descarga del floema. Transpiración. Teoría coheso-tensotranspiratoria. Regulación de la apertura estomática. Balance agua. Diferencias histológicas entre monocotiledóneas y dicotiledóneas en raíz, tallo y hoja. La flor como órgano reproductivo de las angiospermas. Reproducción. Polinización. Arabidopsis thaliana como modelo de investigación en plantas. Fotosíntesis. Etapa lumínica y Fijación del carbono. Fotorrespiración. Metabolismo C3, C4 y CAM. Balance de carbono. Crecimiento y desarrollo vegetal. Hormonas vegetales. Auxinas, citoquininas, etileno, ABA y giberelinas. Biosíntesis y principales funciones. Fotomorfogénesis. La luz como regulador del crecimiento y desarrollo. Cronograma CRONOGRAMA de BIOLOGIA IV AGOSTO Viernes 21. TEÓRICO: Sistema de Clasificación. Elementos de taxonomía. Reino Fungi. Clasificación y principales grupos. TP: Clase Teórica. Reino Vegetal. Principales grupos. Alternancia de Generaciones. Viernes 28. TEÓRICO: La célula Vegetal. Características generales. Organelas. TP1: Reino Fungi. Principales grupos, estructuras, ciclos de vida. Observación de estructuras reproductivas de los hongos. Miniteorico fungi ALBERTó SEPTIEMBRE Viernes 4 TEÓRICO: Tejidos Vegetales. Principales funciones. Diferenciación de determinados tipos vegetales. TP2: Reino Plantae. Principales grupos. Alternancia de Generaciones. Órganos reproductivos Briofitas, Pteridofitas, Gimnosperma y angiospermas. Viernes 11 TEÓRICO: El agua y las plantas. Concepto de potencial agua y sus componentes. Absorción de agua por la raíz. Factores que afectan la entrada de agua por la raíz TP3: La célula vegetal. Observación al microscopio diferentes organelas vegetales (cloroplastos en Elodea sp., amiloplastos en Solanum tuberosum (papa), vacuolas en (remolacha), cromoplastos en Daucus carota (zanahoria), estomas en un ejemplar de Pterodifitas). Pared celular primaria y secundaria (fotos) Reconocimiento de tallo raiz y hoya y sus modificaciones Viernes 18 TEÓRICO: Nutrición mineral. Nutrientes esenciales y beneficiosos. Macro y micronutrientes. Absorción de nutrientes por raíz. Transporte activo y pasivo. Transporte por xilema. Carga y descarga del floema. TP4: Histología y Anatomía I. Raíz. Histología de la raíz. Observación al microscopio de cortes de hoja de monocotiledóneas y dicotiledóneas. Principales adaptaciones. Viernes 25 TEÓRICO: Hoja. Transpiración. Teoría coheso-tenso-transpiratoria. Regulación de apertura estomática. Factores ambientales que regulan la tranpiración. Déficit hídrico. TP5: Histología y Anatomía II. Tallo. Observación al microscopio de cortes de tallos de mono y dicotiledóneas. Modificaciones principales. OCTUBRE Viernes 2 TEÓRICO: Órganos reproductores de angiospermas. La Flor. Reproducción. Polinización. Frutos. TP 6: Histología y Anatomía III. Hoja. Observación al microscopio de cortes de hojas de mono y dicotiledóneas. Morfología relacionada a funciones, modificaciones más importantes de las hojas (cactus). Viernes 9 PRIMER PARCIAL Viernes 16 TEÓRICO: Fotosíntesis I. La luz y el aparato fotosintético. Etapa lumínica y fijación del carbono. Metabolismo C3. TP7: La Flor como órgano reproductivo de las angiospermas. Arabidopsis thaliana como modelo de investigación en plantas. Realización de cruzamiento entre plantas. Viernes 23 TEÓRICO: Fotosíntesis II: Fotorrespiración. Metabolismo C4 y CAM. Factores que afectan la fotosíntesis. Balance de carbono en plantas. TP8: Actividad fotosintética de los cloroplastos I. Aislamiento de cloroplastos mediante centrifugación por gradiente de sacarosa. Repaso de Fotosíntesis. Viernes 30 TEÓRICO: Crecimiento y desarrollo I. Hormonas vegetales: auxinas, citoquininas, etileno, ABA, giberelinas. Principales funciones. Germinación. TP9: Actividad Fotosintética de los cloroplastos II. Reacción de Hill. Medición de actividad de cloroplastos aislados frente a diferentes fuentes lumínicas. Discusión de resultados. NOVIEMBRE Viernes 6 TEÓRICO: Crecimiento y desarrollo II. Fotomorfogénesis. La luz como fuente de información. TP10: Regulación hormonal de la germinación. Evaluación de los efectos de diferentes hormonas vegetales en la germinación y crecimiento de L. esculentum y A. Viernes 13 TEÓRICO: Mecanismos moleculares de la acción de las hormonas y los fotorreceptores. TP11: Fotomorfogénesis. Observación de fenotipos de mutantes de Arabidopsis thaliana frente a diferentes fuentes lumínicas. Tropismo y respuesta de competencias a plantas vecinas. Discusión de trabajo: Increased phytocrome B alleviate density effects on tuber yield of field potato crops” Plant Physiology (2003). Viernes 20 SEGUNDO PARCIAL. Viernes 27 PRIMER RECUPERATORIO DICIEMBRE Viernes 4 SEGUNDO RECUPERATORIO. Trabajo Práctico N º1 Reinos Fungi. Hongos: Introducción teórica: Características generales de los hongos. Divisiones: Chytridiomycota, Oomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota. Ciclos de vida. Desarrollo del práctico: Observación a lupa y microscopio de micelios y estructuras reproductivas de las distintas divisiones. Trabajo Práctico N°2 Reino Plantae Las plantas modernas se pueden clasificar en diez divisiones separadas. Las plantas se pueden clasificar además según cuatro grupos informales; las plantas no vasculares, las vasculares sin semilla, las vasculares con semilla Gimnospermas y las vasculares con semillas Angiospermas. En este trabajo práctico analizaremos un miembro. Plantas No vasculares. División Briofitas. Ej: Musgo. Las biofitas son plantas no vasculares ya que carecen de un sistema de raices bien desarrollados y de estructuras especializadas en el tranposte de agua. Crecen por lo general en ambientes muy húmedos y sombreados. Las biofitas tienen una estructura comparativamente simple y son pequeñas (de 20 cm apox). Como todas las plantas las briofitas tienen un ciclo de vida con alternancia de generaciones, aunque a diferencia de las plantas vasculares, las biofitas se caracterizan por tener un gametofito haploide más grande que el esporofito diploide. El ciclo de vida de un musgo comienza con la liberación de esporas de la cápsula, que se abre cuando se expulsa una pequeña tapa denominada opérculo (arriba derecha). La espora germina y da lugar a un protonema filamentoso ramificado, a partir del cual se desarrolla un gametofito foliáceo. Los espermatozoides, que son expulsados del anteridio maduro, son atraídos al arquegonio donde uno de ellos se fusiona con la ovocélula y produce el cigoto. El cigoto se divide por mitosis y forma el esporofito. Al mismo tiempo, la base del arquegonio se divide y forma la caliptra protectora. El esporofito maduro consiste en una cápsula, que puede estar sostenida por un pedicelo -que es también parte del esporofito- y un pie. La meiosis ocurre dentro de la cápsula y da como resultado la formación de esporas haploides. En este musgo, los gametofitos llevan tanto anteridios como arquegonios. En otras especies, un sólo gametofito puede llevar anteridios o arquegonios, pero no ambos. Plantas Vasculares Sin Semilla. División Pterofitas. Ej: Helecho. Uno de los hechos más sorprendentes en la evolución de las plantas ha sido el desarrollo de sistemas conductores cada vez más eficientes que comunican las dos porciones del cuerpo de la planta, el vástago (que comprende el tallo y las hojas) y la raíz. Con el desarrollo de raíces, hojas y sistemas conductores eficientes, las plantas "resolvieron" efectivamente los problemas más básicos con los que se enfrentaban los organismos multicelulares fotosintéticos en tierra: adquirir abastecimientos adecuados de agua y nutrientes, y distribuirlos entre todas las células que constituyen el organismo. Otra tendencia pronunciada que se observa en la evolución de las plantas es la reducción en el tamaño del gametofito. En todas las plantas vasculares y, a diferencia de lo que hemos visto en los briofitos, el gametofito es más pequeño que el esporofito. Sin embargo, en los representantes contemporáneos de las plantas vasculares más primitivas, el gametofito está separado y es nutricionalmente independiente del esporofito. En los grupos que han evolucionado más recientemente -las gimnospermas y las angiospermas- el gametofito se ha reducido a un tamaño microscópico y a una condición de extrema dependencia respecto del esporofito. Relacionada también con el ciclo reproductor, hay una tendencia hacia la heterosporia, es decir, la producción de dos tipos de esporas. Las plantas vasculares más primitivas producían sólo un tipo de espora (homosporia) en un tipo de esporangio. A1 germinar, estas esporas típicamente producen gametofitos en los cuales se forman tanto anteridios como arquegonios. En las plantas que son heterósporas, se desarrollan un gametofito que lleva los arquegonios y otro que lleva los anteridios. A medida que los gametofitos se fueron reduciendo de tamaño, los arquegonios y los anteridios también disminuyeron de tamaño, hasta desaparecer completamente en las angiospermas. En las angiospermas, así como en las gimnospermas, el gametofito masculino recibe el nombre de polen. El gametofito femenino, en tanto, produce células haploides contenidas en una estructura denominada óvulo. El óvulo, en las plantas angiospermas, consta del gametofito femenino y el tegumento (2n) que lo recubre. El óvulo fecundado o semilla es una de las innovaciones más importantes que contribuyen a explicar el enorme éxito de las plantas vasculares en tierra firme. La semilla es una estructura compleja que contiene al esporofito joven, o embrión, rodeado de una cubierta externa protectora, la cubierta seminal. Esta cubierta, que deriva de tejidos del esporofito materno, protege al embrión mientras éste permanece latente, a veces durante muchos años, hasta que las condiciones sean favorables para su germinación. Las semillas más tempranas que se conocen se fosilizaron en depósitos del Devónico superior, hace aproximadamente 360 millones de años. En los helechos, como en todas las plantas vasculares vivientes, la generación dominante es el esporofito. Plantas Vasculares Con Semilla. Gimnospermas. División Coniferophyta. Ej: Pino. Las plantas con semillas existían ya cerca del final del período Carbonífero. Por entonces, y de acuerdo con el registro fósil, la exuberante vegetación estaba dominada por helechos y licopodios arborescentes de gran tamaño. Durante el período Pérmico, las gimnospermas se diversificaron. Cuatro grupos de gimnospermas tienen representantes vivos: tres divisiones pequeñas -Cycadophyta, Ginkgophyta y Gnetophyta- y una división grande y familiar para todos nosotros -Coniferophyta-. Las coníferas ("portadoras de conos") incluyen a los pinos, abetos, piceas, Tsuga del Canadá, juníperos, alerces y araucarias de Argentina y Chile, así como las secuoyas gigantes de California y Oregon. La semilla es una estructura protectora por medio de la cual los embriones pueden dispersarse y permanecer latentes hasta que las condiciones se tornen favorables para su supervivencia. Así, sus funciones se asemejan a las esporas de las bacterias o a los cigotos resistentes de las algas de agua dulce. Si bien existe esta superficial similitud, la estructura de las semillas es mucho más compleja. Una semilla incluye el embrión (el esporofito latente, joven), una reserva de tejido nutritivo y una cubierta protectora externa. En las plantas con semillas, la generación del gametofito se reduce aun más y depende totalmente del esporofito. Todas las gimnospermas son heterósporas y producen dos tipos diferentes de esporas en dos tipos diferentes de esporangios. Las esporas que originan los gametofitos masculinos se conocen como micrósporas y se forman en estructuras conocidas como microsporangios. Las esporas a partir de las cuales se desarrollan los gametofitos femeninos, se conocen como megaspora y se forman en los megasporangios. Un megasporangio contiene una sola célula madre de la megaspora, que origina, por meiosis, a una megaspora, y está rodeada por una o dos capas de tejido, el tegumento. Las estructuras reproductoras son los conos, dentro de los cuales se forman las esporas sobre las escamas. Las microsporas se desarrollan a partir de las células madre de las microsporas y las megasporas, a partir de las células madre de las megasporas. Las microsporas desarrollan granos de polen, que son gametofitos masculinos inmaduros. Dentro de los óvulos, las megasporas desarrollan un gametofito femenino; cada gametofito femenino contiene varios arquegonios, cada uno con una ovocélula. Aunque más de una ovocélula pueda ser fecundada, habitualmente sólo se desarrolla completamente un embrión en cada gametofito femenino. Los gametos masculinos inmóviles son llevados al arquegonio por el tubo de polen, y la ovocélula es fecundada. Después de la fecundación, el óvulo madura formando la semilla; la semilla consiste en el esporofito embrionario, que rodea al tejido nutritivo del gametofito femenino y una cubierta externa derivada de las capas protectoras (tegumento) del óvulo. Cuando la semilla madura, el cono se abre y libera las semillas aladas que germinan produciendo la plántula. Ambos tipos de conos se desarrollan en el mismo esporofito maduro. Plantas Vasculares Con Semilla. Las plantas con Flor. División Anthophyta Se cree que las angiospermas -plantas con semillas encerradas y protegidas- evolucionaron a partir de un grupo actualmente extinguido de gimnospermas. Aparecieron en el registro fósil § en abundancia durante el período Cretácico, hace unos 120 millones de años, cuando los dinosaurios estaban en su apogeo. El momento en que se originaron las angiospermas es aún objeto de debate. Las angiospermas tienen dos estructuras nuevas interrelacionadas, que las distinguen de todo el resto de las plantas: la flor y el fruto. Ambas estructuras están relacionadas con la reproducción y dispersión de las plantas. Se conocen aproximadamente 235.000 especies de angiospermas. Dominan las regiones tropicales y templadas del mundo, ocupando más del 90% de la superficie vegetal de la Tierra. En la actualidad, las angiospermas incluyen no sólo a las plantas con flores conspicuas, sino también a los grandes árboles de madera dura, a todos los frutales, hortalizas, hierbas, y a los granos y forrajes que son componentes básicos de la dieta humana y la base de la economía agrícola de todo el mundo. Estas plantas tremendamente diversas se clasifican en dos grandes grupos: la clase de las monocotiledóneas y la clase de las dicotiledóneas. Entre las monocotiledóneas se encuentran plantas tan familiares como los pastos (gramíneas), lirios, iris, orquídeas, espadañas o totoras, y palmeras. Las dicotiledóneas incluyen muchas de las hierbas, casi todos los arbustos y árboles (excepto las coníferas) y muchas otras plantas. Durante el ciclo de vida de una angiosperma, dentro de la antera de la flor, las células madres de las microsporas se dividen meióticamente originando, cada una, cuatro microsporas haploides. El núcleo de cada microspora se divide luego mitóticamente y la microspora desarrolla un grano de polen bicelular, que es un gametofito masculino inmaduro. Una de las células se divide posteriormente otra vez, habitualmente después del desarrollo del tubo polínico, dando como resultado tres células haploides por grano de polen: dos gametos masculinos inmóviles y la célula generadora del tubo polínico. Dentro del óvulo, una célula madre de la megaspora se divide meióticamente y forman cuatro megasporas haploides. Tres de las megasporas se desintegran; la cuarta se divide mitóticamente, da lugar a el saco embrionario -el gametofito femenino- que consiste en siete células con un total de ocho núcleos haploides (la célula central grande contiene dos núcleos, los núcleos polares). Una de las células más pequeñas, que contiene un solo núcleo haploide es la ovocélula. El polen germina sobre el estigma, produciendo un tubo de polen que crece a través del estilo hasta el ovario. El tubo de polen en crecimiento penetra en el óvulo a través de una pequeña abertura conocida como micrópilo. Los dos gametos masculinos inmóviles pasan a través del tubo al saco embrionario; el núcleo de un gameto masculino fecunda a la ovocélula. El otro se fusiona con los núcleos polares, formando una célula triploide (3n) que se desarrolla en un tejido nutritivo, el endosperma. El embrión pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra aún dentro del ovario de la flor, el ovario mismo madura y se transforma en fruto. La semilla, liberada del esporofito materno en estado latente, germina finalmente formando una plántula. Trabajo Práctico N°3 Células y organelas vegetales Identificar, observar y dibujar la morfología y características principales de distintos tipos de células y organelas vegetales: 1) Observación de células de tejidos fotosintéticos: Montar en portaobjetos (con una gota de agua) una hoja de Elodea sp. Observar los cloroplastos y su distribución intracelular. Qué es la ciclosis? 2) Observación de células de órganos de reserva: Montar en portaobjetos un corte fino de tubérculo de papa. Observar amiloplastos. Qué ocurre al colorearlos con lugol? 3) Observación de vacuolas: Montar en portaobjetos un corte fino de remolacha, y pétalos de distintas flores. Observar las vacuolas que contienen pigmentos. Qué tipo de pigmentos se almacenan en esta organela?. 4) Observación de cromoplastos: Montar en portaobjetos un corte fino de zanahoria. Observar los cromoplastos, que presentan diversas formas. Qué tipo de pigmentos se almacenan en esta organela?. 5) Observación de estomas y células epidérmicas: Montar en portaobjetos epidermis de helecho obtenida mediante pinza y bisturí. Observar células epidérmicas, estomas y cloroplastos. Es común la presencia de cloroplastos en la epidermis?. Trabajo Práctico N°4 Histología vegetal I: Raíz de monocotiledónea y dicotiledónea. Tejidos y estructuras a distinguir en raíces primarias: Epidermis: uni o pluriestratificada, sin cutícula, pelos. Corteza: parénquima con espacios intercelulares, esclerénquima, colénquima, endodermis sin espacios intercelulares y con bandas de Cáspary. Cilindro vascular (estela): Reconocer desde afuera hacia el centro: Periciclo (1 o 2 capas de células que originan raíces secundarias, proto-floema, meta-floema, proto-xilema, meta-xilema. Médula parenquimática central (puede o no haber). Tejidos y estructuras a distinguir en tallos: Epidermis con cutícula: uni o pluriestratificada. Colénquima, esclerénquima. Clorénquima: parénquima con cloroplastos. Médula y corteza parenquimáticas (dicotiledóneas), o parénquima disperso (monocotiledóneas). Haces vasculares dispersos: Reconocer desde afuera hacia el centro: esclerénquima, floema, xilema. Raíz de Monocotiledónea Raíz de Dicotiledónea Trabajo Práctico N°5 Histología vegetal II: Tallo de monocotiledónea y dicotiledónea. Observar cortes transversales de tallos primarias de mono y dicotiledóneas, En ellos se deberán distinguir los distintos tejidos, su disposición, tipos de células que los componen, función de las mismas. Observar las diferencias entre estos dos grupos de angiospermas. Realizar un esquema general que indique la disposición de los tejidos, utilizando la simbología de Metcalfe. Seleccionar una parte representativa del corte y realizar un dibujo detallado de los tejidos, teniendo en cuenta la morfología de las células, sus tamaños relativos, la existencia o no de espacios intercelulares, etc. Observar: Distinguir distintos tejidos. Epidermis. Corteza. (en dico). Disposicion de los haces vasculares. Tallo de Dicotiledónea Haces Vasculares Parénquima cortical Epidermis Médula Tallo de Monocotiledónea. Xilema Floema Parénquima Epidermis Observación de modificaciones de tallos. Tallos fotosintéticos (cactus) Tallos subterráneos. Rizomas de helechos. Trabajo Práctico N°6 Histología vegetal III: hojas de mono y dicotiledóneas Observar y dibujar distintos tipos de hojas, desde ojas simples a compuestas, hojas lisa, aserrada, lobulada, etc. Observar cortes transversales de hojas de mono y dicotiledóneas provistos por los docentes. En ellos se deberán distinguir los distintos tejidos, su disposición, tipos de células que los componen, función de las mismas. Observar las diferencias en la histología foliar de estos dos grupos de angiospermas. Realizar un esquema general que indique la disposición de los tejidos, utilizando la simbología de Metcalfe. Seleccionar una parte representativa del corte y realizar un dibujo detallado de los tejidos, teniendo en cuenta la morfología de las células, sus tamaños relativos, la existencia o no de espacios intercelulares, etc. Hacer dos tipos de esquemas, uno dibujando tal cual lo ven y otro utilizando los símbolos de METCALFE para simbolizar tejidos vegetales colénquima epidermis Floema Clorénquima o mesófilo xilema parénquima esclerénquima Tejidos y estructuras a distinguir en hojas: Epidermis con cutícula, estomas, pelos. Mesófilo (con cloroplastos) en empalizada y esponjoso. Tejidos de sostén: colénquima, fibras de esclerénquima, esclereidas. Haces vasculares: xilema (hacia epidermis superior) y floema, células parenquimáticas que separan los haces vasculares del mesófilo (vainas). Otras estructuras: cristales de oxalato de calcio. Hoja de Monocotiledonea Hoja de Dicotiledonea Trabajo Práctico N°7 Flor. Trabajo Práctico N° 8 y 9. Actividad fotosintética de cloroplastos aislados Objetivo: Verificar la integridad del sistema fotosintético de los cloroplastos aislados. Introducción Los procesos físicos, químicos y bioquímicos que involucran la captación y transferencia de la energía lumínica y su almacenamiento en forma de energía química reciben en su conjunto el nombre de FOSINTESIS. La fotosíntesis no solo es utilizada para transformar el CO2 en hidratos de carbono, (CH20)n, sino también para reducir el sulfato (SO4= a SH) y el nitrato (NO3- a NH2), cuyos estados más reducidos se encuentran en numerosas moléculas biológicas (por ej., los grupos sulfidrilos y aminos de proteínas). Desde el punto de vista cuantitativo el tipo de fotosíntesis más importante es la oxigénica, en la cual se consumen H2O, CO2 y luz para generar (CH20) n y O2. Este tipo de fotosíntesis es llevado a cabo no solo por las plantas y algas (eucariotas), sino también por las cianobacterias, mal llamadas algas azul-verdosas dada su naturaleza procariota. En los eucariotas la fotosíntesis es llevada a cabo íntegramente dentro de organelas especializadas: los cloroplastos. Estos están delimitados por una bicapa lipídica y es por esto que mediante los procedimientos adecuados pueden aislarse del resto de los componentes celulares y conservar su actividad fotosintética. Objetivos: 1- Evaluar la capacidad fotosintética de los cloroplastos aislados (reacción de Hill) y su integridad (visualización al microscopio) 2- Ensayar la acción de distintos tratamientos sobre su capacidad fotosintética (efecto de los detergentes e iluminación a diferentes longitudes de onda). Materiales Buffer de homogeneización (BH10): Tris-HCL 30 mM (pH7.4) MgCl2 5 mM Sacarosa 10% w/v (292 mM) DCPIP: 0.1 mg/ml (3.2 mM) de 2,6-diclorofenol- indofenol en BH10 SDS, Tritón-X100 0,8% w/v en BH10 Metodología 1- Lavar con agua corriente unos 200 gramos de hojas de espinaca frescas (compradas en el día). Escurrir, destroncar y trozar las hojas en pedazos más o menos chicos, y colocarlos en el vaso de la licuadora. 2- Agregar 350 ml de BH10 frío y licuar en forma intermitente hasta que las hojas queden en pedacitos de unos 1-2 milímetros de tamaño. 3- Filtrar en embudo por algodón (previamente humedecido en BH10) y centrifugar el filtrado a 40C 10 min. X 5.000 rpm (3000 g) y descartar el sobrenadante volcándolo con cuidado (ojo: el precipitado que contiene los cloroplastos es muy inestable) Es importante que de ahora en adelante todas las suspensiones de cloroplastos sean manipuladas con la mayor delicadeza posible, ya que estos son frágiles y manteniéndolas todo el tiempo posible en hielo. Entonces en las manipulaciones siguientes manejarlos siempre: con pipeta Pasteur tomando suspensiones en forma suave y soltándolas también suavemente sobre la pared del tubo evitar la formación de espuma 4- Resuspender el pellet de cloroplastos en 2ml de BH10 y dejarlos en hielo. 5- Armar el gradiente de sacarosa en un tubo transparente de centrifuga de 50 ml agregando con pipeta Pasteur las siguientes soluciones sucesiva y lentamente sobre la pared del tubo para no mezclar las capas: BH20 8 ml BH40 8 ml BH 60 8 ml 6- Cargar (suavemente) al tope del gradiente toda la suspensión de cloroplastos (aprox. 2 ml) y centrifugar a 4oC por 15 min (5 min a 4000 rpm = 2000g y 10 min a 7000 rpm= 6000 xg, sin parar la corrida y sin freno) 7- Los cloroplastos enteros quedarán en la interfase entre BH40 y BH60 (parecerán "agrumados” pero están bien). Retirar solamente estos, pasándolos a un tubo de vidrio limpio. Homogeneizar la suspensión lentamente con pipeta Pasteur hasta disolver los "grumos" y dejarla en hielo. Aquí los cloroplastos han sido aislados de la mayoría de los componentes celulares y están listos para comenzar con los ensayos siguientes. Verificación de la actividad fotosintética e integridad de los cloroplastos aislados: Reacción de Hill: Rotular 4 tubos de ensayo y agregarles en el siguiente orden: tubo BH10 DCPIP Suspensión de cloroplastos 1 4ml - 2 4ml 5 gotas 3 3ml 1ml - 4 3ml 1ml 5 gotas Una vez agregados los cloroplastos mezclar de inmediato agitando suavemente el tubo, y colocar una serie de los duplicados en la oscuridad y la otra bajo luz blanca. Observación al microscopio 1- Colocar en un tubo de vidrio 1ml de BH10, agregarle 3 gotas de cloroplastos y mezclar suavemente (rehidratación). 2- Dejar a temperatura ambiente 5 min 3- Colocar una gota sobre un portaobjetos y montar el cubreobjetos 4- Observar al microcopio Otros ensayos sobre la preparación de cloroplastos a-Iluminación a distintas longitudes de onda Preparar 4 tubos conteniendo 3ml de BH10 y 1 ml de DCPIP y mezclar Agregar a cada tubo 5 gotas de la suspensión de cloroplastos, mezclar suavemente y de inmediato iluminar a distintas longitudes de onda (azul, verde, rojo y oscuridad). b-Efecto de los detergentes BH10 Control 3ml SDS 3ml TX-100 3ml DCPIP SDS Triton X-100 1ml - 1ml 0.05 o 0.005 ml - 1ml 0.05 o 0.005 ml -Mezclar suavemente sin hacer espuma, agregar 5 gotas de los cloroplastos a cada tubo y volver a mezclar -Incubar bajo luz blanca. TP10: Regulación hormonal de la germinación Trabajo Práctico N°11 Fototropismo y respuesta a la competencia de plantas vecinas de Arabidopsis thaliana Objetivo: Analizar las respuestas fototrópicas de plántulas del modelo experimental Arabidopsis thaliana, estimuladas direccionalmente por distintas porciones del espectro lumínico. Métodos: Fototropismo y percepción lumínica. Una semana antes del inicio del TP se sembrarán en cajitas transparentes que contienen una solución 0.8% m/V de agar, semillas de Arabidopsis. Utilizaremos semillas de 2 genotipos: el salvaje y de los mutantes para el gen phot1, phyB y cop1. En cada caja se colocarán 8 semillas en hilera, de a una por vez, con una aguja mojada. Todas las semillas sembradas serán incubadas durante 3 días a 4 ºC en oscuridad y posteriormente se les aplicará un pulso de 30´ para estimular la germinación. En el caso del mutante phot1, se cultivarán las plántulas 48 hs en oscuridad (25 ºC) y luego se dará un pulso de luz azul (430 nm) desde uno de los laterales y desde arriba. Los mutantes phyb y cop1 serán cultivados durante 4 días bajo luz roja (660 nm). Paralelamente, se cultivarán todos los genotipos en oscuridad. Respuesta de competencia a plantas vecinas La respuesta de competencia con plantas vecinas es una respuesta plástica caracterizada por alargamiento de los entrenudos y de los pecíolos de las hojas, cambio en el ángulo de inserción foliar y floración temprana. Este síndrome es inducido por cambios en la composición espectral de la luz. El fitocromo B (phyB) percibe cambios en la relación R (660 nm) / RL (730 nm) que se traducen en señales tempranas de futura competición por la luz, redirigiendo recursos hacia la expresión de la respuesta de competencia. Mutantes en el phyB, phyb, presentan una respuesta de competencia constitutiva, aún creciendo bajo plena solar. Metodología Plantas de tres semanas de Arabidopsis thaliana serán irradiadas durante las tres horas del trabajo práctico con rojo lejano (730 nm). Sobre estas plantas se medirá la variación del ángulo de inserción de las hojas respecto del eje vertical de la planta. Seminario: “Increased phytochrome B alleviates density effects on tuber yiels of field potato crops” Plant Physiology (2003).
