Determinación de marcadores moleculares para la predicción de la

Determinación de marcadores moleculares para la predicción de la calidad
espermática y correlación con modelos de interacción espermatozoide-oviducto en
bovinos
Dirección: Dra. Silvina Perez Martinez
Codirección: Lic. Alonso, Carlos Agustín I. y Luciana Castellano (estudiante de biotecnología de
UNSAM)
Lugar de Trabajo: Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO-CONICET)
Relevancia del estudio
Históricamente, la calidad espermática ha sido evaluada a partir del espermograma, el cual consiste en el
análisis de la cantidad, movilidad y forma (morfología) de los espermatozoides. Si bien es un estudio
rápido, muchas veces los resultados que arroja no se correlacionan con la habilidad fecundante de los
individuos in vivo e in vitro. Esto se debe a que el proceso de fecundación involucra muchos factores
que trascienden la simpleza del espermograma. En este sentido, determinar la presencia de marcadores
que predigan de manera más eficiente el comportamiento de una muestra en una situación real, se
vuelve de gran valor para los centros de reproducción tanto humanos como pecuarios.
La fecundación es un proceso que comprende varias etapas. Una de ellas es el establecimiento de
interacciones entre los espermatozoides y el oviducto (tracto reproductor de la hembra donde ocurre la
fecundación), al cual solo se adherirán espermatozoides viables, con movilidad y morfología adecuada.
Este es un paso de selección fisiológica importante, ya que los espermatozoides que no se encuentren
dentro de determinados parámetros, no podrán continuar su viaje por el oviducto.
Luego de pegarse, moléculas presentes en el entorno oviductal favorecerán el despegado de los
espermatozoides de las paredes del oviducto para continuar su camino hacia el oocito. De esta manera,
la capacidad de respuesta a estas señales, también se vuelve otro factor de selección. Si bien estos pasos
son críticos para el proceso de fecundación, a la hora de evaluar la calidad espermática de un individuo,
no todos estos eventos pueden tomarse en cuenta. Resultados previos obtenidos por estudiantes de la
materia química de la ORT, y a través del subsidio otorgado por el Departamento de Química de la
Escuela Técnica ORT (2014), indicaron que:
1. Los espermatozoides bovinos provenientes de muestras de buena calidad tuvieron una adecuada
capacidad de unión y liberación de las células del oviducto.
2. La tasa de fecundación in vitro y de desarrollo embrionario no correlaciona con la calidad previa de la
muestra espermática, evaluado por espermiograma.
3. La capacidad de interacción de los espermatozoides con el oviducto correlaciona con la tasa de FIV
solamente en muestras de buena calidad. Es por esto que el establecimiento de una correlación positiva
entre marcadores moleculares fáciles de evaluar (que estén en estrecha relación con funciones
espermáticas), y la capacidad de unión-liberación al oviducto, podrían generar nuevos e importantes
parámetros para la evaluación de las muestras espermáticas, además de contribuir al desarrollo de
alternativas terapéuticas para la subfertilidad y la infertilidad.
En este trabajo proponemos establecer nuevos modelos como la utilización de explantos oviductales
(folículos del oviducto que mantienen la estructura tridimensional del epitelio) para utilizar en los
estudios de interacción con los espermatozoides y la búsqueda de marcadores de funcionalidad
espermática que nos permitan correlacionar con la calidad espermática. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo es:
Evaluar el comportamiento de muestras espermáticas de buena y mala calidad frente a modelos de
interacción espermatozoide-oviducto y correlacionar estos resultados con el estado de marcadores
moleculares relacionados con la función del espermatozoide en bovinos.
Antecedentes
El espermatozoide
El espermatozoide es una célula haploide que constituye la gameta masculina cuya función es
fecundar al oocito para la formar un cigoto (Figura 1). Cuando los espermatozoides abandonan los
Figura 1. El Espermatozoide: Esquema general de la gameta masculina
túbulos seminíferos del testículo, si bien constituyen células altamente diferenciadas, son inmóviles,
inmaduros y no tienen capacidad de fecundar al oocito (Jones, 1998). La capacidad fecundante la
adquieren durante su tránsito por el tracto reproductor del macho, en un proceso conocido como
maduración espermática, y por el de la hembra, en un proceso conocido como capacitación espermática.
La capacitación espermática implica una serie de cambios estructurales y bioquímicos que le otorga a
los espermatozoides la capacidad de fecundar a un oocito (Yanagimachi, 1981). Una vez que el
espermatozoide Entra en el tracto reproductor de la hembra, nada a través del útero, hasta el oviducto,
sitio al cual se adhieren solo aquellas células con características apropiadas. Una vez que se produce la
ovulación (liberación del oocito), señales presentes en el entorno oviductal se encargan de liberar a los
espermatozoides, los cuales se capacitan, y se encuentran habilitados para llevar a cabo dos eventos
principales: a) Reacción acrosomal: Exocitosis del acrosoma que ayuda al proceso de unión con el
oocito; b) Hiperactivación del flagelo: Cambio en el patrón y velocidad del nado de los
espermatozoides, que le permiten atravesar el oviducto. Por lo tanto, la funcionalidad espermática va a
depender de la morfología, movilidad, capacidad para establecer interacciones con el oviducto,
respuesta a señales, e integridad del acrosoma.
Evaluación de la capacidad fecundante
La evaluación de la capacidad fecundante de los espermatozoides se lleva a cabo mediante la
determinación de diferentes parámetros que analizan la funcionalidad espermática. Esta evaluación se
realiza en un laboratorio en condiciones in Vitro utilizando medios de incubación, con la composición
de sales, fuentes de energía (glucosa, ácido pirúvico, etc) y proteínas, necesarios para mimetizar los
procesos fisiológicos que experimentan estas gametas en el tracto reproductor de la hembra
En algunas especies de mamíferos, los medios de incubación deben ser suplementados con moléculas
presentes en el fluido oviductal que catalizan el proceso de capacitación, como por ejemplo la heparina
que es una molécula inductora de la capacitación espermática en bovinos.
La calidad del semen se evalúa a través de un estudio que analiza las características del mismo
conocido con el nombre de espermograma. Este estudio consta de evaluaciones macroscópicas como el
volumen de semen, aspecto, viscosidad, determinación del pH y microscópicas como el número de
espermatozoides/ml, la viabilidad, la motilidad, la integridad de membrana. Si bien la información
combinada de todas las características ofrece una buena estimación de la calidad seminal, los parámetros
del espermograma clásico por sí solos parecen no siempre son suficientes para predecir adecuadamente
la fertilidad.
Para dar una solución a este problema se han desarrollado técnicas que pretenden alcanzar un mejor
conocimiento de la célula espermática, mediante la evaluación de su estructura y funcionalidad. Entre
las técnicas más utilizadas se encuentran aquellas que permiten evaluar la interacción espermatozoideoviducto, las cuales pueden proporcionar una información más precisa de la capacidad fecundante de los
espermatozoides.
El oviducto y su función
El oviducto de mamíferos es un órgano del tracto reproductor de la hembra en el cual se llevan a cabo
una serie de procesos, entre ellos: el transporte de las gametas (espermatozoides y oocitos), la
capacitación espermática, la fecundación, el desarrollo de los primeros estadios embrionarios y el
transporte sincronizado del embrión hacia el útero para su posterior implantación.
Una vez atravesado el útero, los espermatozoides tomarán contacto con la primer porción del
oviducto, la cual actuará a manera de reservorio proveyendo un ambiente que permite su mantenimiento
y competencia para la fecundación del ovocito (Talevi y Gualtieri, 2001). Una de las funciones del
reservorio es seleccionar a las subpoblaciones de espermatozoides de alta calidad, con características
adecuadas (morfología, movilidad, estado de capacitación) que serán necesarias para fecundar al
ovocito.
La unión de los espermatozoides al epitelio oviductal (figura 2) prolonga la vida del espermatozoide,
hasta que señales moleculares asociadas a la ovulación presentes en el fluido oviductal, inducen su
liberación permitiendo que éste transite hacia la región superior del oviducto (ampulla) para la
fecundación (Suarez 2008).
En la actualidad, es posible aislar células del epitelio oviductal e inseminarlas con muestras
espermáticas para evaluar el comportamiento de estas últimas. Existen dos métodos principales para
estudiar la interacción espermatozoide-oviducto las cuales tienen sus ventajas y desventajas. Una de
ellas es el modelo de explantos o modelo ex Vivo, que consiste en evaluar el comportamiento de los
espermatozoides frente a una masa celular escasamente procesada que mantiene muchas características
del tejido nativo (explantos). Los espermatozoides se pegarán a los explantos de manera desorganizada.
Por otro lado existe el modelo de cultivo de células oviductales o modelo in vitro, en el cual las células
oviductales aisladas se cultivan en placas, creciendo uniformemente sobre una superficie y formando
una monocapa. Estos cultivos también pegarán espermatozoides de una manera mucho más visible y
organizada. A modo de resumen, en el modelo de explantos se obtiene una masa celular de manera
rápida que mantiene características nativas del tejido, a la que los espermatozoides se pegan de manera
desorganizada, por lo que se vuelve difícil de contabilizar. En el modelo de cultivo celular se obtiene en
una monocapa de células que demanda mucho más tiempo en crecer, la cual pierde ciertas
características del tejido, aunque pegan espermatozoides de manera eficiente y organizada, por lo que se
vuelve fácil de visualizar y contabilizar.
A
B
Figura 2: El reservorio oviductal: A) Esquema de laa interacción de los espermatozoides con el oviducto y oocito;B) Microscopía
electrónica de de barrido de espermatozoides bovinos unidos al epitelio oviductal en bovinos- Tomado de Lefebvre y col., 1995.
Marcadores moleculares de fertilidad
Si bien se propone una serie de parámetros que va a definir la calidad de una muestra espermática, en
ocasiones los individuos de “buena” calidad espermática fallan al momento de concretar el éxito
reproductivo. Estos individuos pasan a ser infértiles o subfertiles idiopáticos, es decir, sin razón
aparente. En la mayoría de estos casos, las causas de la infertilidad yacen en defectos moleculares de la
fisiología espermática que evitan que el espermatozoide atraviese todas las etapas necesarias para la
fecundación. Existe un gran interés por el descubrimiento de marcadores que permitan evaluar de
manera objetiva y certera el potencial reproductivo de los individuos. Si bien varios y complejos
marcadores moleculares han sido evaluados (Sutovsky y Lovercamp, 2010), hasta la fecha ninguno ha
probado ser efectivamente predictivo de la calidad espermática.
Sin embargo, todavía se encuentra vacante el estudio simultáneo de varios marcadores moleculares
relacionados con procesos básicos de la fisiología espermática como la movilidad, el estado del
acrosoma y su capacidad de respuesta a estímulos. Por otro lado la correlación de estos marcadores con
un proceso fundamental como la adhesión y la liberación de los espermazoides a células del oviducto
nunca ha sido llevado a cabo.
Elaboración de la hipótesis y objetivos
El éxito del proceso de fecundación depende en parte de la calidad de los espermatozoides. Si bien la
determinación de la calidad espermática se realiza tradicionalmente bajo microscopio teniendo en cuenta
ciertos parámetros, muchas veces estos fallan en predecir el desempeño real de una muestra. Muchas
veces las fallas en el éxito reproductivo se encuentran ligados a defectos moleculares. Por lo tanto, hallar
marcadores que predigan de manera más eficiente la calidad espermática podría definir nuevos
parámetros para los espermogramas convencionales.
Teniendo en cuenta que el epitelio oviductal actúa no solo como un reservorio de espermatozoides
sino también que selecciona a las poblaciones de espermatozoides con características adecuadas para la
fecundación, se plantea la siguiente hipótesis de trabajo:
Aquellos individuos cuyas muestras espermáticas muestren defectos en su unión y liberación a
células oviductales, presentarán diferencias en el estado (presencia, ausencia, organización,
localización) de marcadores moleculares relacionados con la fisiología espermática (movilidad,
capacitación espermática, interacción con células oviductales u oocito).
Objetivo general
Evaluar el comportamiento de muestras espermáticas de buena y mala calidad frente a modelos de
interacción espermatozoide-oviducto y correlacionar estos resultados con el estado de marcadores
moleculares relacionados con la función del espermatozoide.
Objetivos particulares
1) Evaluar la movilidad y viabilidad de muestras de “buena” y “mala” calidad espermática
2) Determinar mediante capacitaciones in Vitro la respuesta a heparina, un agente capacitante en
bovinos, de diferente calidad espermática.
3) Evaluar el pegado de espermatozoides a explantos y a cultivos celulares de células oviductales.
4) Evaluar la liberación de espermatozoides a explantos y a cultivos celulares de células oviductades
luego de la incubación con heparina.
5) Estudiar el estado (presencia, ausencia, organización) de marcadores moleculares relacionados con
la funcionalidad espermática, en presencia o ausencia de un agente capacitante:
a) B-tubulina: Proteína del citoesqueleto relacionada con la movilidad y el batido flagelar (de la
cola).
b) Moléculas del acrosoma: Organela que se localiza en la cabeza y que se pierde en las
inmediaciones del oocito.
c) Receptor A1: Receptor de nucleótidos que se ha demostrado es crítico para el proceso de
capacitación (Osycka y col., 2013).
6) Establecer una correlación entre los resultados obtenidos de los modelos de interacción
espermatozoide-oviducto y los resultados del estado de los marcadores moleculares.
Resultados esperados
En el presente trabajo se espera que las muestras que expresen defectos en la unión/liberación a las
células oviductales presenten diferencias en el estado de los marcadores moleculares evaluados con
respecto a las muestras que muestren una unión/liberación exitosa. Por otro lado, estos resultados
pueden o no coincidir con la información procedente de los espermogramas.
Técnicas que se utilizarán para el desarrollo del trabajo
Evaluación de la motilidad progresiva: La motilidad es uno de los parámetros más importantes de la
analítica seminal. Estos métodos evalúan el porcentaje de espermatozoides móviles, así como el tipo de
movimiento que presenta la media de una población espermática. Estas medidas ofrecen una descripción
general de la motilidad espermática, pero la exactitud y precisión están limitadas por las condiciones del
sistema de medida y por la destreza del observador. A pesar de ello, la valoración subjetiva de la
motilidad por personas experimentadas es de gran valor, debido a que la información se presenta de
forma inmediata, al tiempo que es un método económico y de fácil ejecución.
Se evaluará la motilidad espermática colocando una muestra de la suspensión espermática sobre un
portaobjetos montado en una platina del microscopio a 38 ºC. Se realizará una clasificación de los
espermatozoides en dos categorías: los que tienen motilidad progresiva (MP) (movimiento de la célula
hacia delante) y los que tienen motilidad no progresiva (NP) (incluye cualquier otro tipo de motilidad:
circular, motilidad en el lugar, etc). La MP se expresa como el porcentaje de espermatozoides con MP
respecto del total de células observadas.
Evaluación de la viabilidad: Para que el espermatozoide se mantenga viable, es necesario que su
membrana plasmática permanezca intacta. La vitalidad de la célula espermática, generalmente se
determina valorando su integridad a través de la capacidad de la membrana plasmática para excluir
ciertas sustancias extracelulares, como tintas o fluorocromos. Son diversos métodos que se han
desarrollado con el propósito de determinar la integridad de la membrana del espermatozoide, desde los
más simples que solamente evalúan la integridad estructural de la membrana, hasta los más sofisticados
que determinan su funcionalidad. La evaluación morfológica de la integridad de la membrana
plasmática se realiza usando la óptica de contraste de fases, la óptica de contraste diferencial de
interferencia o las tinciones supravitales.
La viabilidad será evaluada utilizando el colorante vital Hoechst 33258 (H258). Las muestras serán
incubadas con H258 durante 5 minutos en estufa a 38,5 ºC, 5% CO2 y posteriormente fijadas con
paraformaldehído 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los espermatozoides serán lavados
con PBS mediante centrifugación durante 5 minutos y montados en portaobjetos con Glicerol:PBS (9:1
v/v). Los espermatozoides serán clasificados en: viables si no se detecta fluorescencia en los mismos, o
no viables si los espermatozoides poseen fluorescencia en su cabeza.
Determinación de la capacitación espermática in Vitro: Las muestras de espermatozoides se
colocarán en una columna de lana de vidrio a fin de seleccionar la población de espermatozoides
mótiles. Posteriormente los espermatozoides serán lavados y centrifugados a 800 g durante 5 min. Una
vez recuperados los espermatozoides, se tomará una alícuota y se considerará esta como tiempo cero.
Los espermatozoides restantes se incubarán en un medio capacitante (contiene sales, bicarbonato,
cloruro de calcio, albúmina bovina (0,3%) con las siguientes condiciones: 10x106 espermatozoides/ml,
5% CO2 atmósfera durante 45 min de incubación en estufa a 39ºC. La capacitación será evaluada
mediante la técnica de CTC.
Técnica de Clorotetraciclina (CTC): El CTC se une al calcio asociado a la membrana plasmática y
emite fluorescencia. Esto se registra en un microscopio de fluorescencia. Si hay redistribución del calcio
intracelular se refleja en un cambio de patrón. Se llama patrón F al encontrado en los espermatozoides
intactos, no capacitados; Patrón B al encontrado en aquellas células capacitadas y AR al encontrado en
los espermatozoides que han sufrido la pérdida del acrosoma.
La capacitación será evaluada mediante la habilidad de los espermatozoides de presentar el patrón B
fluorescente de CTC, indicador del estado capacitado del mismo.
Interacción espermatozoide-oviducto en un modelo bovino ex Vivo e in Vitro: Oviductos: se
perfunden los órganos provenientes de animales del matadero. Los folículos epiteliales se pueden: a)
Dejar en medio un día; b) cultivar por 7-10 días hasta la formación de una monocapa de células
epiteliales. Espermatozoides: se utilizan espermatozoides criopreservados en pajuelas (provenientes de
la cabaña CIAVT de Venado Tuerto- Santa Fé). Se descongelan y se seleccionan mediante el pasaje del
semen por una columna de lana de vidrio. Los espermatozoides obtenidos se cuentan con cámara de
Neubauer (hemocitómetro) y luego se inseminan sobre los explantos o la monocapa de células
oviductales.
Marcadores moleculares: Las técnicas citoquímicas e inmunohistoquímicas permiten la evaluar la
localización de ciertos componentes celulares in situ. Mediante la utilización de diferentes sondas o
anticuerpos que se encuentran acoplados a moléculas fluorescentes, se puede visualizar la presencia y
organización de diferentes estructuras. Muestras de “buena” y “mala” calidad espermática serán
sometidos al agente capacitante heparina en capacitaciones in Vitro como las mencionadas arriba, y
luego se las procesará para el estudio de:
- β-Tubulina, componente principal del citoesqueleto. La b-tubulina también estará involucrada en la
motilidad, dado que componentes del citoesqueleto participan en el proceso de batido flagelar.
- El estado acrosomal se evaluará mediante microscopía de fluorescencia utilizando la técnica de
PSA-FITC, (el PSA es una lectina que une glicoproteínas del acrosoma y permite ver el estado del
mismo). Los patrones serán clasificados en: intactos si los espermatozoides presentan el acrosoma
entero o reaccionado si los espermatozoides poseen el acrosoma alterado o ausencia del mismo.
- Receptor purinérgico A1, el cual hemos demostrado que tiene un rol fundamental en el proceso de
capacitación. Frente a estímulos fisiológicos, el espermatozoide libera una molécula denominada AMPc
al exterior. Esta molécula sufre cambios en el espacio extracelular, que le permiten unirse a los
receptores A1, situados en la cabeza del espermatozoide. A partir de la unión del AMPc modificado con
el receptor A1 se encienden vías de señalización en el espermatozoide que lo llevan a un estado
capacitado.
Lugar de Trabajo
El lugar donde se desarrolla el plan de trabajo es el Laboratorio de la biología de la reproducción de
mamíferos en el Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFyBO-CONICET/UBA), ubicado
en el piso 15 de la Facultad de Medicina de la UBA.
El CEFYBO cuenta con pHmetros, balanzas, centrífugas refrigeradas, cuarto de cultivo, granizadora
de hielo, freezers de –20°C y de –70°C, lector de Elisa, ciclador para Real Time PCR y RT-PCR,
centrífugas y microcentrífuga, evaporador, liofilizador, flujos laminares, estufas a 37 °C para líneas
celulares y para cultivos primarios, estufa a 39°C para incubación de células bovinas, lupas, microscopio
bifocal invertido acoplado a fluorescencia, contador de centelleo.
El laboratorio de Biología de la Reproducción del CEFYBO está a cargo de la postulante del presente
proyecto. Todos los integrantes del grupo de trabajo estarán a disposición del entrenamiento de los
alumnos en el manejo de las técnicas y desarrollo de las actividades experimentales.
Referencias bibliográficas:
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