determinación del límite de cuantificación de plaguicidas

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DETERMINACIÓN DEL LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DE
PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS EN AGUAS
ANALIZADAS POR CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO.
Elaborado por :
Br.Génesis.R.Guédez.L
C.I:18.759.933
Tutor Académico:
Dr.José Alejandro Guaregua
Tutor Empresarial:
Ing. MSc Maira González de Núñez
1
Introducción.
Hoy en día, la necesidad que tiene la industria agroquímica en cumplir con
la gran demanda alimentaria, hace que el uso de plaguicidas químicos sea
imprescindible, considerando que su uso trae mayores ventajas en el desarrollo
económico, restandole importancia a los impredecibles problemas de salud en
humanos y animales, consecuencia de la aplicación de estas sustancias en
suelos agrícolas; además de los posibles daños a la fauna, al desarrollo de
resistencia en plagas, al incremento de la contaminación del agua y aire; sin
olvidar la transgresión a la seguridad alimentaria, ya que en la actualidad, no
solo importa la cantidad de sumistros que pueda existir, sino tambien la calidad,
asegurando un alimento sano y sin contaminación de ningun tipo.
En este sentido, La Fundación CIEPE juega un papel importante en el
fortalecimiento de la seguridad y soberanía alimentaria, a través de la
investigación, acompañamiento, servicios analíticos y formación de talento
humano, con énfasis en los procesos agroindustriales, enmarcadas en leyes,
normas, lineamientos y estándares de calidad que afiancen el desarrollo
sustentable de la Nación.
El proceso de pasantía realizado en dicha fundación, fue desarrollado en
un tiempo estipulado de 12 semanas en la división Fisicoquímica, la cual se
encarga de gestionar, los diversos estudios analíticos y fisicoquímicos
necesarios para la evaluación de la calidad de alimentos, además de realizar
análisis de agua, para la detección de sustancias químicas peligrosas como
son los plaguicidas organoclorados, revelando el nivel de contaminación con el
objetivo de conocer, si la misma tiene niveles de residuos de plaguicidas
superior a los niveles establecidos por los entes oficiales. Por tal motivo, para la
validación global del método aplicado en dicha fundación, se tiene la necesidad
de evaluar el nivel mínimo residual que el método pueda cuantificar, con un
límite de confianza significativo, es por ello, que como actividad principal en el
desarrollo de mi pasantía dentro de la Fundación CIEPE, me fue establecido
evaluar el límite de cuantificación de plaguicidas organoclorados en agua,
siendo relevante si su valor es menor a los límites máximos establecidos en las
normas que rigen el uso de sustancias tóxicas, además de evaluar el
porcentaje de recuperación de dichos químicos, a fin de validar el uso del
procedimiento empleado por la división.
Dentro de ese marco, el conjunto de plaguicidas que se estudiaron
presentan como ingredientes activos, compuestos organoclorados que le
ejercen el poder plaguicida al producto, tales sustancias químicas fueron las
siguientes: Lindano, Heptacloro, Heptacloro Epoxi, Aldrin y Dieldrin; para el
cumplimiento del objetivo principal, se realiza el análisis cromatográfico
establecido y se efectúa la técnica de análisis por extracción líquido-líquido,
para la preparación previa de muestras contaminadas antes del análisis
instrumental.
2
Indice.
Pág.
OBJETIVOS………………………………………………………………… 4
RESUMEN DE ACTIVIDADES REALIZADAS………………………….. 5-14
CONCLUSIONES…………………………………………………………… 15
RECOMENDACIONES…………………………………………………….. 16
GLOSARIO…………………………………………………………………
17
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………. 18
3
Objetivos.
 Objetivo General: Desarrollar la primera experiencia laboral en el sector
industrial bajo el desempeño de un cargo asignado con el propósito de
cumplir actividades especificas, a fin de conocer, aprender y ejecutar
análisis en el área de fisicoquímica.
 Objetivos Especificos:
1. Fortalecer los conocimientos adquiridos en el ambito de la
cromatografia como herramienta importante para el análisis de
muestras de aguas contaminadas con sustancias peligrosas.
2. Desarrollar el análisis de patrones de plaguicidas organoclorados
por cromatografía gas-líquida, para la determinación del límite de
cuantificación y detección de los plaguicidas en estudio.
3. Realizar el proceso de fortificación de muestras de agua con
patrones de plaguicidas organoclorados, analizadas por la técnica
de extracción líquido-líquido, con el fin de evaluar el porcentaje de
recuperación de cada plaguicida en estudio.
4
RESUMEN DE ACTIVIDADES REALIZADAS.
IDENTIFICACION DE LOS PLAGUICIDAS EN ESTUDIO.
En primer lugar, antes de evaluar los parámetros de validación del
método, se debe conocer los diferentes tiempos de retención característicos
de cada uno de los plaguicidas para su identificación.
Procedimiento: Se procede a inyectar 2µl de patrones de 400µg/l que se
encuentran en solución con hexano en un cromatógrafo de gas, marca: Clarus
500, con detector de captura electrónica (ECD), obteniéndose los valores
reflejados en la Tabla I.
Tabla I: Tiempo de retención (Tr) de los plaguicidas en estudio.
Pl agui ci da
Lindano
Hep t aclor
Aldrin
Hep t aclor Ep oxi
Dieldrin
Tr(mi n)
12,268
13,779
14,47
15,318
16,55
La cromatografía gas-liquida es aplicada para realizar la separación,
identificación y cuantificación de los residuos de plaguicidas en agua, ya que
estos se vaporizan fácilmente sin degradarse, con puntos de ebullición por
debajo de 250ºC y presentan polaridades medias o intermedias en el análisis.
La tabla I refleja el tiempo de retención, el cual no es más que, el tiempo que
transcurre después de la inyección de la muestra hasta que el pico de
concentración del analito es detectado; cuyos tiempos se encuentran en un
rango de 12 a 16 min. En la Tabla II. Se muestran las estructuras químicas de
algunos plaguicidas de este tipo, incluyendo los 5 que se estudiaron; los
cuales, según su grupo químico son: Organoclorados, liposolubles, solubles en
compuestos orgánicos de baja polaridad y se caracterizan por tener una
estructura cíclica y átomos de cloro.
5
Tabla. II: Estructura química de algunos plaguicidas organoclorados.
El lindano presenta el menor tiempo de retención, ya que su afinidad con
la columna fue pobre, comparada con los demás, también por sus propiedades
físicas, al tener el punto de ebullición más bajo, menor peso molecular y
polaridad, debido a su arreglo espacial de los átomos de cloro adyacentes al
anillo. En la siguiente figura 1, se muestra el cromatograma del plaguicida
lindano, con un pico definido en un tiempo de retención de 12,268 min.
Adicionalmente se puede decir, que la elución de cada pico característico de
los 5 plaguicidas con el detector empleado, es definida, completa, logrando la
separación respectiva eficazmente y a un tiempo de análisis relativamente
corto.
Figura.1: Cromatograma del plaguicida Lindano mediante cromatografía gas–
líquido.
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 OBTENCION DE LA CURVA
PLAGUICIDAS EN ESTUDIO.
DE
CALIBRACION
DE
LOS
Condiciones cromatográficas.
A partir de una solucion madre de 800 µg/L de cada plaguicida, se
prepararon mezclas triplicadas de 12,10,8,4,2 y 1 µg/L respectivamente por
diluciones sucesivas, llevadas a un volumen de 25ml; posteriormente se
inyecta por triplicado una alicuota de 2µL de cada solución en el cromatógrafo
de gas, marca: Clarus 500, con detector de captura electrónica (ECD)1 y una
inyección por jeringa a una relación de flujo de 10 mL×s-1.El gas portador
empleado fue nitrógeno a una presión de entrada de 5 psi.
Rampa de Temperatura: La temperatura inicial en el inyector se ajusta a 80
ºC, la cual se mantiene durante 0.5 min, luego se incrementa a 100 ºC×min-1,
hasta 310 ºC, por 10 min. La temperatura de la columna inicialmente a 80 ºC,
se incrementa luego de la inyección a 3 ºC×min –1 hasta 240 ºC y finalmente
hasta 265ºC a 50ºC*min–1, en 360 seg.
Curvas de Calibración.
La cuantificación se realizó preparando patrones con concentraciones de
1, 4, 8,10 y 12 μg /L respectivamente y se construyó para cada plaguicida una
curva de calibración donde se relaciona las diferentes concentraciones de los
estándares y sus respectivos valores de área, con la finalidad de comprobar la
relación lineal entre ambos parámetros y así realizar la cuantificación de dichos
residuos, en el caso de que se tratara de una muestra de agua contaminada. A
continuación, se muestra como modelo, la curva de calibración del lindano y el
Heptacloro.
Fig.2: Curva de calibración de Lindano.
1.
Detector de Captura Electrónica (ECD), es un detector utilizado en la cromatografía de gas, cuando se
necesita realizar análisis de muestras que contengan componentes con grupos electronegativos. Para más
información ver glosario, anexado al presente informe, pag: 17.
7
Fig.3: Curva de calibración del Heptacloro.
 DETERMINACION DE LOS LIMITES DE CUANTIFICACION Y LIMITES
DE DETECCION DE CADA UNO DE LOS PLAGUICIDAS EN ESTUDIO.
En términos generales, el límite de detección (LOD) de un analito se
puede describir como aquella concentración que proporciona una señal del
instrumento, significativamente diferente de la señal del blanco o del ruido de
fondo. El límite de detección (LOD) se calcula con los resultados obtenidos por
la curva de calibración, según la IUPAC, a partir de la fórmula:
Límite de detección (LOD)=Yb +3×Sb
(1)
Yb=Señal del blanco.
Sb= Desviación estándar del blanco.
A su vez, el límite de cuantificación (LOQ) es la mínima concentración de
analito que se puede cuantificar a partir de la recta de calibrado, el cual se
calcula con los resultados obtenidos, a partir de la fórmula:
Limite de cuantificación (LOQ)=Yb+10×Sb (2)
Cabe destacar, que en cromatografía, las determinaciones múltiples del blanco
consumen mucho tiempo y es generalmente, innecesario en este tipo de
muestras, ya que el solvente empleado es hexano de alta pureza, con punto de
ebullición más bajo que todos los plaguicidas en estudio, eluyendo de la
columna a un tiempo muy corto y diferente a los tiempos de retención de los
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cinco plaguicidas. No obstante, se realiza la corrida del solvente con el objetivo
de limpiar la columna, verificando que no existan interferencias en el análisis y
corroborando que el solvente sea el adecuado y no presente impurezas, el
resultado fue el esperado. Por lo tanto, según los métodos de calibración en
análisis instrumental del Miller (I), el valor de la ordenada del origen calculada
en cada curva de calibración, se puede utilizar como una estimación de Yb, la
propia señal del blanco; debería ser una estimación más exacta de Yb que el
simple valor de la medida del blanco y la desviación se calcula, mediante el
estadístico Sy/x que estima los errores aleatorios de la señal del equipo, lo que
nos da una representación de resultados más confiable y significativa de la
capacidad del método.
Sy/x= √(∑ (yi-y`)2)/ (n-2) (3)
yi : Señal de equipo.
(3).
y`: Son los puntos sobre la recta de regresión calculado correspondiente a los
valores individuales de x.
n: Número de muestras en estudio a diferentes valores de x.
En la tabla III. Se presentan los valores de los límites de detección y de
cuantificación para los 5 plaguicidas, cuyos parámetros se representan
gráficamente en la figura 4.
Tabla.III: Limite de detección y de cuantificación de plaguicidas presentes en
agua.
Nº
1
2
3
4
5
Plaguicida
Lindano
Heptaclor
Heptaclor Epoxi
Dieldrin
Aldrin
LOD [µg/L]
0,0005
0,0001
0,0058
0,0069
0,0003
LOQ [µg/L]
0,0015
0,0004
0,0193
0,0229
0,0010
Valor Aceptable [µg/L]
2
0,03
0,1
0,03
0,03
En la columna 5 se muestra los valores máximos aceptables de residuos de plaguicidas organoclorados en agua según
las normas COVENIN 1932-82.
Como puede observarse en la Figura 4. Los valores del límite de detección y
cuantificación presentan concentraciones inferiores a 0,1 µg/L para todos los
plaguicidas. Los mejores limites de detección y de cuantificación los presenta el
Heptaclor con valores 0,0001 y 0,0004µg/L respectivamente. Por el contrario,
los límites más elevados se hallan para el dieldrin de 0,0069 y 0,0229 µg/L .
9
Fig.4: Representación gráfica de los limites de detección y de cuantificación de
cada uno de los plaguicidas.
Según la gaceta oficial de la República Bolivariana de Venezuela, que
establece los valores máximos de descarga permisibles de plaguicidas
organoclorados en agua, se encuentra que el valor permitido más elevado es
de 2 μg /L para el lindano y el inferior es de 0,03 μg /L para dieldrin, aldrin y
Heptaclor. Como puede observarse en la Tabla III, se puede indicar, que los
resultados hallados, son satisfactorios para todos los casos, ya que se obtienen
valores de cuantificación inferiores, a los que establece la ley, por lo que se
puede concluir que el método es confiable, reproducible y aceptable ya que se
logra lo esperado al poder identificar pequeñas trazas de concentración de
plaguicidas.
 METODOLOGIA APLICADA PARA EL ANALISIS DE PLAGUICIDAS
ORGANOCLORADOS EN AGUA.
En la División Fisicoquímica de la Fundación CIEPE, se prestan servicios
para el análisis de agua de diferente origen, con el propósito de realizar su
análisis fisicoquímico y examinar si presenta contaminación a causa de la
exposición directa o indirecta de plaguicidas. El procedimiento se efectuó para
muestras de aguas fortificadas, por cada uno de los plaguicidas en estudio, los
cuales vale la pena destacar, son los más utilizados en siembras de algodón,
trigo, maíz, arroz; en el caso de los cultivos de frutas de la naranja, mango,
melón y piña, así como en las plantaciones de café y caña de azúcar, cultivos
de gran importancia en el Estado Yaracuy.
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La contaminación del agua puede ser originada al momento de la
aplicación del plaguicida, durante su proceso de fabricación, transporte o
almacenamiento. En las zonas agrícolas ocurre directa o indirectamente,
cuando se aplican al agua para matar larvas de mosquitos u otros organismos,
por drenajes de áreas agrícolas tratadas y durante el lavado del equipo de
aspersión o por derrames accidentales.
El análisis de plaguicidas en agua está sujeto a la complejidad de la matriz
de la misma y a las concentraciones bajas a las cuales estos compuestos están
presentes. Por lo tanto, la extracción de los residuos constituye el paso más
crítico. Este paso consiste en la extracción de los analitos desde su matriz con
un disolvente apropiado, opcionalmente se puede realizar la remoción de
sustancias que podrían causar interferencias mediante varios pasos de
limpieza y finalmente, la reducción del volumen del disolvente en el extracto
antes del análisis instrumental. Una vez que el laboratorio de la División
Fisicoquímica recibe las muestras de agua, debidamente identificadas se
procede a ejecutar la siguiente técnica de análisis de laboratorio reconocida por
el Ministerio del Ambiente de la Republica Bolivariana de Venezuela: APHA,
Standard Methods for the examination of wáter and wastewater pg 6-91 al 6104 part 6630A .
Procedimiento:
Hacer el montaje de filtrado, colocar un embudo de separación de 500 ml.
Agregar 250 ml de la muestra de agua previamente homogeneizada con un
cilindro graduado de 250ml.
Agregar 100ml de cloruro de metileno CH2CL2. Agitar por un minuto y dejar
reposar hasta separación de las fases.
Filtrar el extracto hacia un
balón de fondo redondo de
250ml,
provisto
de
un
embudo de filtración y papel
de filtro watham nº 1,
conteniendo 2g de Sulfato
de Sodio Anhidro.
Fig.5.Montaje de filtración de la muestra de
agua.
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Repetir la extracción, esta vez con dos (2) porciones de 50ml de Cloruro de
Metileno CH2CL2.
Llevar el balón al rotavapor a 30 ºC hasta sequedad, asegurando el vacio
utilizando una bomba y que la columna de destilación este lo suficientemente fría
para que condense la muestra, utilizando una manta de enfriamiento. Cuando
evapore, apagar la bomba, bajar la velocidad al rotavapor, sostener el balón y
quitar el vacio. Retirar el balón.
Fig.6.Evaporación del extracto de la muestra de agua con un rotavapor
water Bath 200.
Colocar 2ml de Hexano grado Pesticida al balón con una pipeta volumétrica.
Asegurar recoger todo el contenido, dejando pasar por todo el balón el hexano
añadido.
Recoger el líquido en un vial, previamente identificado. Proceder a inyectar 2µl al
cromatógrafo de gas CLARUS 500 con detector de captura electrónica
(ECD).
12
Fig.7.Cromatógrafo de gas CLARUS 500.
La fortificación de agua bidestilada se hizo con la finalidad de determinar
el factor de recuperación de cada plaguicida al tratarse la muestra de agua por
la técnica de extracción líquido-líquido anteriormente descrita. Así, con cada
set de muestras constituidas por cuatro de cada concentración de 5.71 ,2 , 1 y
0.03 µg/l respectivamente, se calculó dicho parámetro utilizando las rectas de
calibración de cada plaguicida. En la tabla IV,se muestra los valores de
recuperación obtenidos a cada concentración.
Tabla IV. Evaluación del porcentaje de recuperación en función a la
concentración.
Concentracion teorica [µg/L]
5,71
2
1
0,03
Lindano
94
89
83
80
Porcentaje de recuperacion (%)
Heptaclor
Aldrin
Heptaclor Epoxi
67
61
78
63
60
77
62
53
72
60
50
70
Dieldrin
55
50
48
43
A continuación, se presenta un cromatograma obtenido al inyectar una
muestra fortificada de concentración de 1 µg/L de cada plaguicida. Es
importante destacar, que el estudio de porcentaje de recuperación se realizó en
un lapso de 2 semanas para cada valor de concentración, con el fin de estudiar
la repetibilidad de los resultados ; además, se prepararon las muestras de
estudio el mismo día en que se iba a proceder la extracción o en un máximo de
dos días almacenadas a una temperatura inferior de los 20ºC antes de su
extracción e inyección en el cromatógrafo de gas. Por lo que, los porcentajes
de recuperación pueden variar,dependiendo del tiempo de almacenaje de la
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muestra, ya que los plaguicidas organoclorados, aunque son altamente
persistente en el entorno en que se encuentran, estos pueden degradarse
detectandose solo sus metabolitos y no una concentracion real, de la que se
presentan en el sitio de origen, donde se tomo la muestra contaminada. Sin
embargo, se puede decir que los factores de recuperación son satisfactorios,
presentandose un máximo de recuperación de plaguicida organoclorado para el
Lindano y un mínimo para Dieldrin; otro aspecto importante que señala la tabla
IV. es la disminución del factor de recuperación a medida que disminuye la
concentración del plaguicida, siendo esto aceptable, ya que la muestra se
somete a diferentes preparaciones antes de la inyección en el equipo, en la que
una concentración que representa solo trazas mínimas en grandes cantidades
de volumen,en este caso, que se trabajó en 250ml de agua, el tratamiento de la
muestra va siendo más delicado a tal punto en que las condiciones aun siendo
óptimas, la recuperación no aumenta, como en el caso del dieldrin que a una
concentración de 5,71µg/L su máximo valor de recuperación obtenido fue de un
55%. Finalmente se puede concluir, que tanto la optimización de la muestra
como el análisis cromatográfico realizado en la Fundacion CIEPE, dieron
resultados positivos por alcanzar a cuantificarse concentraciones inferiores al
nivel establecido por las leyes Venezolanas.
Fig.7: Cromatograma obtenido al realizar el analisis de extracción liquidoliquido a una muestra fortificada con cinco plaguicidas organoclorados en agua.
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Conclusiones.
 Las técnicas aplicadas en la Fundación CIEPE referentes al análisis de
plaguicidas organoclorados en agua, permiten obtener resultados
confiables y reproducibles.
 Los límites de cuantificación y de detección para cada uno de los
plaguicidas de estudio, fueron menores a los niveles máximos
permisibles.
 Se
obtuvo
un
porcentaje
de
recuperación
de
plaguicidas
considerablemente alto a la concentración máxima aceptada de 0,03
µg/L en agua para el lindano, Heptacloro y Heptacloro epoxi, al realizar
la técnica de análisis de extracción liquido-liquido.
 El dieldrin presento una máxima recuperación de 55% y en la
concentración de 0,03 µg/L el porcentaje de recuperación fue de 43%,
siendo el más bajo porcentaje de recuperación entre todos los
plaguicidas en estudio.
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Recomendaciones.
 Realizar el estudio para la evaluación del porcentaje de recuperación de
los plaguicidas organoclorados en agua contaminada, lo más rápido
posible, de manera que los resultados obtenidos sean representativos y
no se altere la muestra a causa de la degradación de los plaguicidas del
que se sospeche su existencia.
 Evaluar el sistema de muestreo de las aguas contaminadas de estudio,
de forma que se obtenga una respuesta representativa y segura del
grado de contaminación de un cuerpo de agua, más aún, si se trata de
grandes dimensiones de volumen, como embalses, lagunas, ríos u otras
corrientes de agua en las que se puede basar el estudio analítico.
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Glosario.
 Plaguicida: Son sustancias químicas o mezclas de sustancias,
destinadas a matar, repeler, regular o interrumpir el crecimiento de seres
vivos considerados plagas.
 Cromatografía: Es un método físico de separación para la
caracterización de mezclas complejas. Es un conjunto de técnicas
basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar
los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes.
 Cromatografía gas-liquido: Permite la separación de mezclas de
compuestos gaseosos o de sustancias susceptibles de vaporizarse por
calor. La mezcla vaporizada es conducida mediante un gas inerte a
través de una columna, por la que los componentes fluyen en diferentes
proporciones, siendo detectados al final de la misma.
 Detector de captura electrónica: Es un tipo de detector utilizado en
cromatografía de gases. Su funcionamiento básico se basa en la
emisión de una partícula β (electrón) por parte de átomos como el 63Ni o
tritio adsorbido sobre una placa de platino o titanio. Este detector es muy
selectivo y es sensible a la presencia de moléculas con grupos
electronegativos como halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro.
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Referencia Bibliográfica.
(1). MILLER.N.JAMES, MILLER.C. JANE. Estadística y quimiometría
para química analítica. Primera edición. España: PEARSON PRENTICE
HALL, 2002. pág.: 111-125.
(2). NIVIA ELSA. Mujeres y plaguicidas. Primera edición. Colombia:
RAPALMIRA, 2000. pág.:83-87.
(3). SKOOG. WEST. Principios de análisis instrumental. Quinta edición.
España: Mc GRAW HILL, 2000.
(4). http://www.quimica.urv.es/quimio/general/lod.pdf.
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