AEFA.FCD 2013.T1:AEFA.FCD 2012.T1qxd

TEMA 1
CONCEPTOS BÁSICOS DE
CITOGENÉTICA CLÍNICA
CONVENCIONAL.
ANÁLISIS CROMOSÓMICO
CONSTITUCIONAL
Victoria Simón García
Programa de
Formación Continuada
a Distancia
2013
CONCEPTOS BÁSICOS DE CITOGENÉTICA CLÍNICA CONVENCIONAL.
ANÁLISIS CROMOSÓMICO CONSTITUCIONAL
Dra. Victoria Simón García.
Doctora en Farmacia. Especialista en Análisis Clínicos.
Laboratorio de Análisis Clínicos. Hospital La Plana. Villarreal (Castellón).
INDICE
1.
2.
3.
3.1
3.1.1
3.1.2
3.2
3.2.1
3.2.2
4.
4.1
4.2
5.
6.
INTRODUCCIÓN.
MORFOLOGÍA DEL CROMOSOMA
HUMANO.
CLASIFICACIÓN E INCIDENCIA DE
LAS ANOMALÍAS
CROMOSÓMICAS.
Anomalías cromosómicas numéricas.
Euploidías (o poliploidías).
Aneuploidías.
Anomalías cromosómicas estructurales.
Anomalías balanceadas o equilibradas.
Anomalías cromosómicas no balanceadas o desequilibradas.
INCIDENCIA DE LAS ANOMALÍAS
CROMOSÓMICAS.
Incidencia en recién nacidos vivos.
Incidencia en abortos espontáneos.
INDICACIONES CLÍNICAS DEL
ANÁLISIS CROMOSÓMICO.
PROTOCOLOS DIAGNÓSTICOS
EN CITOGENÉTICA HUMANA.
7.
PROTOCOLOS Y TÉCNICAS DE
CULTIVO EN CITOGENÉTICA
HUMANA CONVENCIONAL.
7.1 Recolección de la muestra.
7.2 Técnicas de sembrado y cultivo
celular.
7.3 Técnicas de sacrificio. Adición de
inhibidor de mitosis.
7.4 Técnicas de recogida de células y
procesado.
7.5 Técnicas de extensión
8.
TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN
CROMOSÓMICA. BANDEO
CROMOSÓMICO.
8.1 Bandas G.
8.2 Bandas C.
8.3 Bandas NOR.
9.
TÉCNICA DE ANÁLISIS
CROMOSÓMICO.
10. EL INFORME EN CITOGENÉTICA.
11. CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
ENLACES DE INTERÉS
CASOS CLÍNICOS
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
En este tema, veremos una introducción que nos recuerde brevemente la patología cromosómica
y, posteriormente, se verá cual es la clasificación e incidencia de las anomalías cromosómicas,
haciendo especial hincapié en el conocimiento de los protocolos diagnósticos y algoritmos de
actuación en Citogenética Convencional, describiendo y desarrollando las principales técnicas, su
utilidad, las indicaciones para el estudio y el significado de las mismas.
Hay que tener en cuenta, y esto es muy importante, que debido al planteamiento del actual tema
y a su extensión, no se puede tratar en su merecida dimensión el Análisis Citogenético Prenatal, el
cual por su importancia y peculiaridad, se merece un tratamiento aparte, debiendo ser objeto de un
nuevo tema a desarrollar posteriormente.
Después de completar esta unidad didáctica, los participantes deben ser capaces de:
OBJETIVOS ESPECÍFICOS (cont):
1. Asimilar conocimientos actualizados en Citogenética Convencional para el procesamiento y
reconocimiento de las alteraciones presentes en las enfermedades cromosómicas
2. Adquirir habilidades en le campo de la Citogenética convencional y en el estudio de los cromosomas, así como familiarizarse con la morfología cromosómica en sí, adquirir habilidades para
el reconocimiento de una anomalía cromosómica y conocer la clasificación e incidencia de las
mismas.
3. Conocer e identificar cuales son las indicaciones clínicas que sugieren la necesidad de un
Análisis citogenético constitucional en la práctica clínica diaria.
4. Conocer los protocolos diagnósticos y algoritmos de actuación en Citogenética en general, así
como las técnicas de cultivo celular y bandeo cromosómico en particular.
5. Comprender la metodología de los estudios citogenéticos en el diagnóstico clínico de las anomalías cromosómicas, el alcance y las limitaciones de los estudios cromosómicos, así como,
conocer e interpretar los resultados obtenidos a partir del análisis cromosómico.
1. INTRODUCCIÓN
La labor que realizan las consultas y laboratorios de Citogenética es fundamental en la estructura sanitaria de cualquier hospital, de modo que, con los avances científicos y tecnológicos
actuales, la Genética ha llegado a tener un papel fundamental en todas las áreas médicas debido
a que las pruebas y diagnósticos que allí se manejan son fundamentales para el diagnóstico,
pronóstico y seguimiento de las enfermedades congénitas y hereditarias.
Es importante por lo tanto que conozcamos de qué medios disponemos en la actualidad en el
laboratorio de citogenética, qué utilidades tiene para la clínica y qué significado tienen estos estudios.
La Citogenética es el área de la genética que se dedica al estudio de los cromosomas, su estructura, su herencia y las enfermedades relacionadas con ellos, causadas por un número y/o una
estructura anormales produciendo las llamadas anomalías cromosómicas.
La citogenética es una ciencia relativamente joven. A mediados del siglo XIX el hombre comenzó
a observar los cromosomas al microscopio, pero hasta final de los años 50 no fue posible individualizar los cromosomas al microscopio, contarlos y conocer su estructura. Con los avances que
se han producido en las últimas décadas, no sólo hemos podido identificar los cromosomas, sino
que hemos llegado a identificar anomalías cromosómicas tan pequeñas que de cualquier otra
forma pasaban desapercibidas.
El Análisis cromosómico se ha convertido en un procedimiento diagnóstico muy importante en
la medicina clínica, debido a que las anomalías cromosómicas constituyen causas importantes de
pérdidas reproductivas y defectos congénitos y son frecuentes en muchas formas de cáncer.
La habilidad para interpretar un informe cromosómico y algunos conocimientos acerca de la
metodología, el alcance y las limitaciones de los estudios cromosómicos son aspectos esenciales
para la práctica clínica diaria de médicos y otros profesionales sanitarios que atienden a pacientes
con defectos congénitos, retraso mental, anomalías del desarrollo sexual y muchos tipos de cáncer
o bien desarrollan su ejercicio profesional en el ámbito del diagnóstico prenatal.
2. MORFOLOGÍA DEL CROMOSOMA HUMANO
El momento más apropiado para estudiar la morfología de los cromosomas es durante la división
del núcleo celular en metafase, ya que, cuando una célula se divide, su material nuclear, la cromatina, que se compone de ácido desoxirribonucleico (ADN) y una compleja serie de proteínas cromosómicas, pierde la apariencia relativamente homogénea característica de las células que no están
en división y se condensa hasta tomar la apariencia de orgánulos en forma de bastoncillo, los
1
cromosomas. Estos cromosomas que sólo son visibles en mitosis presentan un empaquetamiento
de ADN de hasta 1000 veces más que en el núcleo en interfase.
Cada especie tiene un cariotipo (también llamado complemento cromosómico) característico en
cuanto al número y la morfología de sus cromosomas. Los genes, unidades de información genética, se codifican en el DNA cromosómico, y se encuentran en orden lineal a lo largo de los cromosomas donde cada gen posee una posición precisa o locus.
El mapa génico es el mapa de la localización cromosómica de los genes, el cual, también es
característico de cada especie y resulta el mismo en todos los individuos de una misma especie.
Hay dos tipos de división celular: la meiosis y la mitosis.
La meiosis ocurre solo en células de la línea germinativa. Provoca la formación de células reproductivas (gametos), cada una de las cuales tiene solo 23 cromosomas: uno de cada clase de autosoma y
un X o un Y por lo que los gametos poseen la dotación haploide o dotación n. La mitosis es la división habitual de la célula somática. La división mitótica genera dos células hijas, cada una con cromosomas y genes idénticos a los de la célula madre. Estas células somáticas tienen la dotación diploide
o dotación cromosómica 2n, esto es, 46 cromosomas, los cuales constituyen 23 pares. De estos, 22
son semejantes en mujeres y en varones (del par 1 al 22), y se denominan autosomas. El par restante
comprende los cromosomas sexuales: XX en mujeres y XY en varones. Los miembros de un par,
denominados cromosomas homólogos, contienen información genética emparejada; esto es, tienen
los mismos loci genéticos en la misma secuencia, aunque en cualquier locus específico pueden poseer
formas idénticas o algo diferentes denominadas alelos. Aunque parezca obvio, es importante recordar
que un miembro de cada par de cromosomas se hereda del padre y el otro, de la madre.
El cariotipo es el conjunto de cromosomas de una especie; es por tanto, el patrón cromosómico
de una especie expresado a través de un código, establecido por convenio, que describe las características de sus cromosomas. El cariotipo es característico de cada especie. Debido a que en el
ámbito de la clínica suelen ir ligados, el concepto de cariotipo se usa con frecuencia para referirse
a un cariograma (Fig. 1), el cual es una foto o dibujo de los cromosomas de una célula metafásica
ordenados de acuerdo a su tamaño y homología.
Bajo el microscopio, los cromosomas se ven como estructuras delgadas y alargadas compuesto
por dos cromátidas. Tienen un brazo corto y otro largo separados por un estrechamiento o constricción primaria, llamada centrómero. El brazo corto se designa como p y el largo como q. El
centrómero es la zona por la que el cromosoma interacciona con las fibras del huso mitótico desde
profase hasta anafase, tanto en mitosis como en meiosis y es parte integral del cromosoma. En la
estructura del centrómero intervienen tanto el ADN centromérico, que consta fundamentalmente de
heterocromatina constitutiva, como proteínas centroméricas. Es esencial para realizar y regular los
movimientos y segregación normales del cromosoma durante la división celular.
Figura 1. Cariograma de un individuo de sexo masculino cromosómicamente normal.
2
Figura 2. Partes de un cromosoma
Figura 3. Cromosomas humanos: metacéntrico (A:Cromosoma 1), submetacéntrico
(B:Cromosoma 12) y acrocéntrico (C:Cromosoma 14)
Los telómeros son los extremos de los cromosomas. Son regiones de ADN no codificante, altamente repetitivas, cuya función principal es la estabilidad estructural de los cromosomas en las
células eucariotas (Fig. 2).
Además de las constricciones primarias, en algunos cromosomas se puede distinguir otro tipo de
"adelgazamiento" denominada constricción secundaria, las que se hallan relacionadas normalmente con la presencia de las secuencias de ADN ribosómico. Tales regiones se denominan
regiones organizadoras del nucléolo (regiones "NORs"). Los cromosomas con NOR en muchos
casos presentan un segmento que une a esta región con el telómero, el cual se denomina satélite,
esto ocurre en los cromosomas acrocéntricos.
Los cromosomas metafásicos humanos presentan tres formas básicas y se pueden clasificar de
acuerdo a la posición que ocupa el centrómero con respecto al cuerpo del mismo, lo cual determina la longitud de los brazos corto y largo. (Fig. 3)
Los cromosomas metacéntricos tienen los brazos corto y largo de aproximadamente la misma
longitud, con el centrómero en el punto medio.
3
Figura 4. Ideograma de los cromosomas 1 (metacéntrico), 9 (submetacéntrico) yb14(acrocéntrico) y
significado de la numeración de las bandas.
Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes desiguales,
con el centrómero más próximo a uno de los extremos.
Los cromosomas acrocéntricos tienen el centrómero muy cerca de un extremo, con un brazo
corto muy pequeño. Con frecuencia tienen constricciones secundarias en los brazos cortos, conectando trozos muy pequeños del DNA, llamados tallos y satélites, al centrómero. Los tallos
contienen genes que codifican el RNA ribosómico.
Los brazos de los diferentes cromosomas se indican por el numero del cromosoma seguido de
las letras p o q; por ejemplo, 11p es el brazo corto del cromosoma 11, y Yq es el brazo largo del
cromosoma Y.
Los diagramas, llamados idiogramas (Fig. 4) son básicamente un "mapa cromosómico" que
muestra la relación entre los brazos corto y largo, el centrómero (cen) y, en el caso de cromosomas
acrocéntricos, los tallos (st, de stalk) y satélites (s). En los ideogramas también se ilustran los
patrones de bandas específicos. Cada banda se numera para ayudar en la descripción de reorganizaciones.
3. CLASIFICACIÓN DE LAS ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS
Las enfermedades o anomalías cromosómicas son las responsables de una proporción significativa de enfermedades genéticas y habitualmente se expresan como alteraciones fenotípicas
múltiples y graves.
Las anomalías cromosómicas se pueden clasificar:
3.1. Anomalías en el número de cromosomas.
3.2. Anomalías en la estructura del cromosoma.
Estas anomalías cromosómicas numéricas o estructurales pueden ocurrir tanto en los autosomas
como en los cromosomas sexuales (o a ambos simultáneamente) y también tanto en las células
somáticas como en los gametos debido a errores en la división celular.
3.1. Anomalías cromosómicas numéricas (Tabla 1)
Se dividen en euploidías y aneuploidías.
4
POLIPLOIDIAS: del
conjunto de cromosomas
entero
Triploidía
69,XXY-69,XXX-69,XYY...
Tetraploidía
92,XXXX - 92,XXYY...
Sexuales
Monosomías
ANEUPLOIDIAS: de un
cromosoma en particular
Sexuales
Trisomías
Autosómica
45,X
47,XXY Sdre. De Klinefelter
47,XXX
47,XYY Sdre. De Jacobs
...
47,XY,+21 Sdre. de Down
47,XY,+18 Sdre. De EdwardS
47,XY,+13 Sdre. De Patau ...
Tabla 1. Anomalías Cromosómicas Numéricas
3.1.1. Euploidías (o poliploidías)
Se deben a una variación del número haploide n (triploidía (3n), tetraploidía (4n)) y son excepcionales en los individuos vivos, siendo relativamente frecuente en los tejidos abortivos y tumorales.
3.1.2. Aneuploidías
Son las anomalías cromosómicas más frecuentes de las que tienen repercusión clínica. En
ellas existe un número anormal de cromosomas, debido a un exceso (trisomías) o pérdida
(monosomías) de algún cromosoma y siempre se asocian con trastornos del desarrollo físico o
mental.
Las aneuploidías se producen por no disyunción meiótica (mala separación de los cromosomas
en la división celular).
La mayoría de las anomalías cromosómicas numéricas (tanto poliploidías como aneuploidías)
son letales y se expresan como abortos. Generalmente cuanto más grande es el cromosoma alterado o más grande es la masa de cromatina involucrada, más graves son los efectos en el fenotipo del individuo.
La especie humana tolera mejor las trisomías que las monosomías (no obstante, sólo sobreviven
parte de aquellos individuos que tienen trisomías de los cromosomas más pequeños (trisomías 21,
18, 13) o bien en los que se produce una trisomía parcial de algún cromosoma) y tolera mejor la
no disyunción que afecta a los gonosomas que a los autosomas. En la especie humana, las monosomías de un cromosoma completo suelen ser letales (con excepción del 5% de las pacientes
afectas de monosomía X, síndrome de Turner que sobreviven).
Algunos ejemplos de las aneuploidías más importantes:
-Trisomía 21 o Síndrome de Down: Es con creces el más común y mejor conocido de los trastornos cromosómicos y constituye la causa genética simple mas frecuente de retraso mental moderado.
La anomalía cromosómica causante de la mayoría de los casos de síndrome de Down (95%) es
la trisomía del par 21, mientras que el resto es debido a otras anomalías cromosómicas por
ejemplo estructurales desequilibradas. El riesgo de tener un hijo con trisomía del 21 se incrementa
con la edad materna, en especial después de los 35 años. El error meiótico que provoca la trisomía
generalmente se produce durante la meiosis materna (cerca del 95% de los casos), predominantemente en la meiosis materna I.
5
Las personas con síndrome de Down habitualmente presentan estatura baja, cabeza redondeada, cara ancha y achatada, frente alta y aplanada, y lengua y labios secos y fisurados, se
acompaña de retraso mental moderado o grave. Presentan epicanto, pliegue simio en las
palmas de las manos. En muchos casos padecen cardiopatías congénitas y tienden a desarrollar leucemia.
-Trisomía 18 o Síndrome de Edwards: Cerca del 95% de los fetos con trisomia 18 abortan
espontáneamente. La supervivencia postnatal también es escasa. La edad materna avanzada
constituye un factor de riesgo. El 95-96% de casos corresponden a trisomía completa producto de
una no-disyunción, siendo el resto trisomía por traslocación.
Clínicamente se caracteriza por bajo peso al nacer, retraso mental y del desarrollo psicomotor,
hipertonía, pie en mecedora, puño trisómico y pliegue simiesco, hipoplasia del cuerpo calloso e
hidrocefalia.
-Trisomía 13 o Síndrome de Patau: Se suele asociar con un problema meiótico materno
(meiosis I), más que paterno y como el síndrome de Down (y la mayoría de las trisomias), el riesgo
aumenta con la edad de la mujer. El 20% de los casos se deben a una translocación desequilibrada. La trisomía 13 es grave y letal ya que los afectados mueren poco tiempo después de nacer,
la mayoría antes de los 3 meses. Presenta retraso en el desarrollo, anomalías en el SNC (Retraso
mental, holoprosencefalía, diversas anomalías faciales como hipotelorismo, anomalías renales
como hidronefrosis, pie en mecedora, mano trisómica e hipotonía muscular.
-Monosomía de la X o Síndrome de Turner: Consiste en la ausencia total o parcial de uno de
los cromosomas X normales presentes en las mujeres. La enfermedad se caracteriza por amenorrea primaria, fenotipo especial, pterygium colli y gónadas en forma de cintas, problemas cardíacos
y renales.
Los afectados son hembras normalmente estériles y de estatura baja, aunque el 3% de las
mujeres con síndrome de Turner pueden tener alguna menstruación, e incluso quedarse embarazadas. Su inteligencia se puede acercar a la normal.
Aproximadamente el 50% de las pacientes con síndrome de Turner tienen un único cromosoma X.
El resto presentan otro tipo de anomalías cromosómicas no necesariamente numéricas, de
hecho, pueden presentar ambos cromosomas X, pero contener en alguno de ellos algún tipo de
anomalía estructural.
3.2. Anomalías cromosómicas estructurales. (Tabla 2)
Son aquellas que afectan a la morfología o estructura del cromosoma. Se originan por una rotura
cromosómica seguida de reconstitución en una combinación anormal. Son muy variadas y sus
efectos son más complejos de predecir. Pueden afectar a varios cromosomas. Se pueden dividir
en balanceadas o equilibradas y no balanceadas o desequilibradas.
3.2.1. Anomalías balanceadas o equilibradas.
Son aquellas donde no existe pérdida o ganancia de material genético (los conjuntos cromosómicos tienen el complemento normal de información genética) y habitualmente no se acompañan de efecto fenotípico, pero pueden tener un riesgo incrementado de anomalía cromosómica en la descendencia. Entre ellas, por ejemplo, tenemos las translocaciones, las inversiones
y las inserciones.
Las translocaciones pueden ser translocaciones recíprocas (intercambio de fragmentos
cromosómicos entre cromosomas no homólogos) y robertsonianas (donde se intercambia material cromosómico entre los cromosomas acrocéntricos).
Las inversiones se producen por una doble rotura de un cromosoma y reunión de nuevo tras
un giro (inversión de 180°). Pueden ser inversiones paracéntricas, si las dos roturas afectan a
un mismo brazo cromosómico (no cambia la morfología del cromosoma), o pericéntricas, si
cada rotura afecta a un brazo cromosómico (cambia la morfología del cromosoma).
6
ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES
EQUILIBRADAS
DESEQUILIBRADAS
Translocaciones Recíprocas
Intercambio de material cromosómico.
Translocaciones Robersonianas
Translocación donde se produce la fusión
de dos cromosomas acrocéntricos.
Inversión
Cambio de sentido de un segmento dentro
del mismo cromosoma
Inserción
Transferencia de un segmento delecionado
de un cromosoma a otro.
Deleción
Pérdida de un segmento de un cromosoma
Duplicación
Repetición una o varias veces de un fragmento cromosómico
Adición
Hallazgo de material extra en un cromosoma (de otro cromosoma)
Anillo
Deleción de ambos brazos cromosómicos y
unión del segmento medio en una estructura circular
Isocromosoma
Pérdida completa de un brazo de un cromosoma y duplicación del otro brazo.
Cromosoma Dicéntrico
Cromosoma con dos centrómeros
Cromosomas Marcadores
Pequeños elementos supernumerarios
Tabla 2. Anomalías Cromosómicas Estructurales.
3.2.2. Anomalías cromosómicas no balanceadas o desequilibradas
Son aquellas en las que existe pérdida o ganancia de material genético, de forma que pueden
ser comparables con una monosomía parcial o una trisomía parcial respectivamente, y por lo
tanto suelen tener repercusiones fenotípicas más o menos graves, defectos congénitos
asociados y/o retraso mental. Entre las anomalías cromosómicas no balanceadas, tenemos las
deleciones (monosomías parciales), las duplicaciones (trisomías parciales), cromosomas en
anillo, isocromosomas y cromosomas dicéntricos entre otros.
4. INCIDENCIA DE LAS ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS
4.1. Incidencia en recién nacidos vivos. (Tabla 3)
Los principales trastornos numéricos de los cromosomas en recién nacidos vivos son:
- 3 trisomías autosómicas: trisomías 21,18 y 13
- 4 tipos de aneuploidías de cromosomas sexuales: 45,X - 47,XXY - 47,XYY y 47,XXX
En cuanto a la incidencia de las anomalías estructurales, es más difícil de determinar, sobre todo
debido a que la variabilidad en la expresión fenotípica hace que a muchos pacientes no se les practique el cariotipo si no existen indicaciones clínicas.
Los primeros estudios que incluyen series amplias de anomalías cromosómicas en la población
de recién nacidos se iniciaron en los años 60. Hook y Hamerton en 1977 publican una recopilación
en la que analizaron un total de 56.952 nacimientos. Posteriormente Unscear en 1982 publica otros
estudios y Thompson en 1991 analiza la frecuencia de anomalías cromosómicas en recién nacidos
publicando los resultados sobre un total de 10.000 casos. Según éste último, la incidencia global
de anomalías cromosómicas en neonatos se estima alrededor de 1/175 nacimientos lo cual significa que afectan a un 0.5-0.6% de la población.
7
TIPO DE ANOMALÍA
PORCENTAJE
INCIDENCIA APROXIMADA
Anomalías numéricas de cromosomas
0.34%
1/300 nacidos vivos
Anomalías numéricas sexuales
0.20%
1/500
45,X
0.04-0.02%
1/2.500-1/5.000
47,XXY
0.055%
1/1.800
47,XYY
0.055%
1/1.800
47,XXX
0.055%
1/1.800
Otras
0.005%
Anomalías numéricas autosómicas
0.14%
1/715
Trisomía 21
0.13%
1/750
Trisomía 18
0.012%
1/8.000
Trisomía 13
0.007%
1/15.000
Otras
Anomalías estructurales (en autosomas y cromosomas sexuales)
0.005
0.23%
1/400 nacidos vivos
Reordenamientos equilibrados
0.18%
1/550
Reordenamientos desequilibrados
0.05%
1/2.000
Anomalías de todos los cromosomas
(autosomas y cromosomas sexuales)
0.57%
1/175 nacidos vivos
Tabla 3. Incidencia de anomalías cromosómicas en recién nacidos vivos (RNV)
4.2. Incidencia en abortos espontáneos. (Tabla 4)
La incidencia global de anomalías cromosómicas en abortos espontáneos es al menos del
50%. De éstos, los tipos de anomalías difieren de las que se observaron en recién nacidos vivos.
ABORTOS con anomalía cromosómica
FRECUENCIA APROXIMADA (porcentaje)
Aneuploidía
74
45,X
20
Monosomía autosómica
<1
Trisomía autosómica
Total
52
Trisomía 16
16
Tisomía 18
3
Trisomía 21
5
Trisomía 22
5
Otras trisomías
23
Triploidía
16
Tetraploidía
6
Reordenamientos estructurales
4
Tabla 4. Tipos de anomalías cromosómicas en abortos espontáneos.
8
La anomalía mas frecuente en abortos es la 45,X (Sdre. De Turner), que está presente en el 20%
de los abortos espontáneos cromosómicamente anormales, pero solo en el 0.04 del total de los recién
nacidos vivos lo cual representa un 7% de los recién nacidos cromosómicamente anormales.
Las otras anomalías de los cromosomas sexuales, que son bastante frecuentes en RNV, son
raras en abortos.
- Otra diferencia es la distribución de los tipos de trisomía; por ejemplo, la trisomía 16 es la más
frecuente en los abortos, pero no se encuentra en RNV.
5. INDICACIONES CLÍNICAS DEL ANÁLISIS CROMOSÓMICO
En general, las indicaciones clínicas que sugieren la necesidad de un Análisis citogenético
constitucional en clínica son: (Tabla 5).
- Presencia de fenotipo específico. Pacientes en los que debido a la presencia de un fenotipo
característico de algún síndrome cromosómico el Análisis cromosómico constituye una parte
estándar de la evaluación clínica.
- Problemas de crecimiento y desarrollo tempranos. Pacientes con fallo o retraso en el crecimiento, facies dismórficas, malformaciones múltiples, estatura corta, genitales ambiguos y retraso
mental son hallazgos frecuentes en niños con anomalías cromosómicas.
- Mortinatos y muerte neonatal. Debido a que la incidencia de anomalías cromosómicas es
mucho mayor en mortinatos que en RNV también es elevada en niños que mueren en el periodo
neonatal. En estos casos, el cariotipo es esencial para el consejo genético preciso y puede proporcionar información importante para el diagnostico prenatal en embarazos futuros.
PERÍODO NEONATAL
PERÍODO DE LACTANCIA
Malformaciones mayores aisladas
Presencia de 3 o más defectos congénitos menores
Recién nacido con rasgos dismórficos
Recién nacido con genitales ambiguos
Parto con producto muerto de causa inexplicable
Muerte neonatal de causa inexplicada
Dificultad para el aprendizaje
Rasgos dismórficos
Retraso psicomotor
PERÍODOS PREESCOLAR-ESCOLAR
PERÍODO DE ADOLESCENCIA
Ginecomastia
Falta de desarrollo puberal
Amenorrea primaria o secundaria
Retraso mental
Rasgos dismórficos
Trastornos del crecimiento
Retraso psicomotor
Rasgos dismórficos
PERÍODO DEL ADULTO
PERIODO PRENATAL
Padres de niños con anomalías cromosómicas
estructurales
Abortos de repetición
Infertilidad de causa desconocida
Comprobación de diagnóstico prenatal
Rasgos dismórficos
Esterilidad
Azoospermia/Oligozoospermia
Edad mayor de 35 años
Ansiedad materna
Triple screening sérico alterado
Oligoamnios-polihidramnios
Retraso de crecimiento intrauterino (CIR)
Sospecha ecográfica de cromosomopatía
Antecedentes de cromosomopatía balanceada en un
progenitor
Tabla 5. Indicaciones Clínicas de Análisis Citogenético en distintas etapas.
9
- Problemas de fertilidad. Los estudios cromosómicos están indicados en pacientes que
presentan amenorrea y en parejas con antecedentes de infertilidad o abortos de repetición. En una
proporción importante (3-6%) con dos abortos sucesivos o mas o infertilidad se observa una
anomalía cromosómica (normalmente un reordenamiento estructural o un mosaicismo de cromosomas sexuales) en uno de los padres.
- Antecedentes familiares. Una anomalía cromosómica conocida o sospechada en un pariente
de primer grado constituye una indicación para el Análisis Cromosómico en ciertas circunstancias.
6. PROTOCOLOS DIAGNÓSTICOS EN CITOGENÉTICA HUMANA
Un protocolo clínico podría definirse como el conjunto de recomendaciones sobre los procedimientos diagnósticos y/o terapéuticos más adecuados a utilizar ante todo paciente con un determinado cuadro clínico o problema de salud.
Estos protocolos surgen ante la necesidad de reducir la variabilidad injustificada en la práctica
clínica y mejorar la calidad del proceso asistencial.
Un Esquema básico de los procesos para los diagnósticos citogenéticos podría ser: (Fig. 5)
Figura 5. Indicaciones Clínicas de Análisis Citogenético en distintas etapas.
Conviene tener en cuenta que los protocolos de diagnóstico en citogenética se desarrollan de
forma paralela a la investigación básica y generalmente están poco estandarizados. Los laboratorios de diagnóstico genético tienen por lo general un carácter híbrido al desarrollar actividades de
investigación básica conjuntamente con la aplicación de dicha investigación al ámbito clínico.
Frecuentemente el desarrollo de una estrategia diagnóstica es en sí misma una línea de investigación básica en la cual está implicada la caracterización de una anomalía cromosómica y el espectro
de expresiones fenotípicas causadas por la patología en estudio.
Los protocolos y algoritmos de actuación en Citogenética se basan en:
- ISCN (2005-2009) (International System for Human Cytogenetics Nomenclature).
- Literatura Técnica y Clínica basada en la experiencia científica.
- Guías de Practica Clínica.
Las guías de práctica clínica (GPC) se utilizan para englobar los protocolos de actuación clínica
y algoritmos de decisión. Estas GPC son conjuntos de recomendaciones que ayudan a los profesionales a tomar decisiones sobre cuál es la asistencia más apropiada en circunstancias clínicas
específicas.
Existen diversas GPC en el campo de la Citogenética (Professional Guidelines for Clinical
Cytogenetics de la Association for Clinical Cytogenetics, Guidelines for Molecular Karyotyping in
10
constitucional Genetic Diagnostics, Best practice guideline: General guideline for humans benetics
(2011), Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance.....) y todas ellas son guías cuyo propósito
es estandarizar una serie de pautas y criterios generales en el manejo de las muestras, en el
desarrollo de las técnicas y también en los planteamientos y ejecución de los diagnósticos, con el
fin de que cada laboratorio de citogenética siente unas bases que le ayuden a establecer sus
propios controles de calidad.
La E.C.A. (European Cytogenetics Association) tiene un Grupo Permanente de trabajo, los cuales
han elaborado y editado una Guía de Citogenética y Control de Calidad (Cytogenetic Guidelines
and Quality Assurance) con el objeto de establecer en todos los países europeos una guía común
y unos procedimientos estándares mínimos que puedan ser usados como manual en todos los
países de UE.
Los laboratorios de Citogenética deberían estar sujetos a los Sistemas de Calidad y Control
Internos y Externos que rigen las normativas nacionales e internacionales estándar (ISO 15189).
La tendencia de todos estos grupos de trabajo es unificar y armonizar criterios de actuación tanto
en la calidad de los test genéticos y citogenéticos como de los procedimientos a seguir en los laboratorios.
Estas guías presentan normas que tienen en cuenta las ya existentes en cuanto a la evaluación
de calidad, las guías de buenas prácticas de laboratorio (GLP) y los procedimientos de acreditación y protocolos de distintos países, así como los documentos de política internacional. Estos
documentos incluye los aspectos de control de calidad y de seguridad para la mayoría de los
métodos de rutina con los que se trabaja actualmente en la práctica clínica diaria de los laboratorios de citogenética, de modo que estas normas deben ser consideradas como criterios mínimos
aceptables. También debe considerarse como una guía para la certificación y / o acreditación de
los laboratorios de citogenética.
Hay que tener en cuenta que los Procesos de Asesoramiento utilizados son los Controles de
Calidad y la Comunicación entre los Profesionales integrantes en los diagnósticos. Cada servicio
o Unidad de Genética debe tener sus propios protocolos y algoritmos de actuación dependiendo
de su capacidad técnica o clínica, siguiendo para ello las normas y recomendaciones de la
Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance.
El proyecto Europeo EUROGENTEST comenzó en enero de 2005 y tiene una duración de cinco
años. Pretende desarrollar la infraestructura, herramientas, recursos, guías y procedimientos que
puedan conducir a una armonización y mejora en la calidad de los servicios de Genética.
Los objetivos de este proyecto Europeo son:
- Armonizar y mejorar los Controles Externos de Evaluación.
- Facilitar el desarrollo de guías
- Ayudar y financiar los servicios de acreditación y certificación.
- Promover el desarrollo y colaboración entre los centros públicos y privados así como promover el
acercamiento entre los entre los centros académicos y el sector tecnológico.
- Fomentar y promocionar las mejores y más económicas técnicas de diagnóstico.
- Crear una red (Network of Excellence) basada en los cuatro principios de la ética médica: no
malevolencia, beneficencia, autonomía y justicia.
Estos objetivos serán alcanzados a través de los siguientes aspectos:
- Acreditación de los test diagnósticos genéticos o citogenéticos realizados en los laboratorios de
Genética.
- Valoración Externa de la Calidad.
- Control de la calidad Interna de la actividad del Laboratorio.
Para representar y describir todas las anomalías cromosómicas existe una nomenclatura de
consenso recogida en el ISCN 2005 y en su versión más actual el ISCN 2009 (Sistema
Internacional de Nomenclatura de Citogenética humana), los cuales recogen una serie de recomendaciones del Comité Permanente Internacional de Nomenclatura en Citogenética Humana, por
lo que se ha convertido en referencia indispensable para citogenetistas, técnicos y estudiantes
para la correcta emisión e interpretación de informes.
11
7. PROTOCOLOS Y TÉCNICAS DE CULTIVO EN CITOGENÉTICA HUMANA
CONVENCIONAL
Aunque a mitad del siglo XVIII ya era posible visualizar cromosomas al microscopio, no fue hasta
1950 cuando la aparición de nuevas técnicas de cultivo mejoró su visualización al conseguir una
máxima condensación y separación. La técnica de Moorhead & cols. para obtener preparados de
cromosomas en metafase a partir de muestras de sangre periférica significó un importante avance.
El arresto mitótico con colchicina y la posterior hipotonización celular, facilitaron enormemente el
análisis microscópico ya que permitían obtener preparados con mayor cantidad de células en
metafase y con cromosomas menos superpuestos entre sí. Todo ello permitió la elaboración de
cariotipos y por tanto la detección de alteraciones numéricas y estructurales. Desde entonces se
sucedieron una serie de descubrimientos de patologías humanas con aberraciones cromosómicas
en número y en morfología que dejaron en claro la importancia de la citogenética en la clínica
médica.
La Citogenética Convencional permite estudiar los cromosomas de las células obtenidas tras el
cultivo in vitro de las mismas. El estudio de cromosomas mediante las técnicas de citogenética
convencional y algunas técnicas de citogenética molecular (FISH), requiere la presencia de células
en división. Únicamente durante la división celular, especialmente en metafase, los cromosomas
pueden ser identificados individualmente al microscopio. En principio, cualquier tejido que
contenga células en división puede utilizarse para un estudio citogenético convencional.
Los cromosomas metafásicos se suelen obtener in vivo, a partir de muestras que tienen un alto
índice de división mitótica (vellosidades coriales, médula ósea, tumores sólidos, etc.), e in vitro
induciendo químicamente la división celular (linfocitos de sangre periférica, biopsias de tejido y
células de líquido amniótico) mediante la realización de cultivos celulares.
Aunque las técnicas específicas difieren según el tejido usado, el Protocolo básico para el
cultivo, la obtención de preparaciones cromosómicas y el estudio y la identificación de
anomalías cromosómicas es el siguiente:
- Obtención de la muestra y preparación inicial.
- Técnicas de siembra y cultivo celular.
- Técnicas de sacrificio. Adición de un inhibidor de la mitosis para detener las células en metafase
- Técnicas de recogida de las células. Este paso es muy importante para obtener preparaciones de
alta calidad. Implica exponer las células a una solución hipotónica, seguida de una serie de soluciones fijadoras.
- Técnicas de extensión. Para que las células se expandan, de modo que los cromosomas se
extiendan y puedan examinarse individualmente.
A partir de aquí, una vez obtenido el material de estudio se recurre a técnicas para poder identificar y estudiar el material cromosómico:
- Técnicas de bandeo y tinción de las preparaciones cromosómicas para detectar los posibles
cambios numéricos y/o estructurales.
- Estudio de los cromosomas al microscopio.
- Obtención del cariotipo y análisis citogenético del mismo.
- Emisión del informe citogenético.
Por supuesto que los protocolos de trabajo en el laboratorio de citogenética deben estar escritos
y expresados con claridad, actualizados y a disposición del personal del laboratorio
7.1. Recolección de la muestra
Se realiza exclusivamente de tejidos vivos que contengan células con núcleo.
- En Genética Clínica Postnatal:
Sangre Periférica: Principalmente se emplean los glóbulos blancos que se hallan en la sangre por
su fácil accesibilidad. Importante obtener una muestra fresca de sangre periférica (SP), para
12
asegurarnos que ésta contiene células vivas capaces de dividirse. 1-5 mL de SP en un tubo con
heparina sódica al 1%.
Otros tejidos: Biopsia de piel, biopsia gonadal, etc.
- En Diagnóstico Prenatal:
Líquido amniótico: Se obtiene por amniocentesis, técnica de diagnóstico prenatal invasiva.
Obtención de Vellosidades Corionicas (OVC): Por vía transcervical o transabdominal.
Cordocentesis (MPSCU o Foniculocentesis): Se obtiene una muestra de sangre fetal directamente del cordón umbilical.
- En Diagnóstico Oncológico: Se puede usar médula ósea, sangre periférica, ganglios linfáticos y
biopsias de tumor.
7.2. Técnicas de sembrado y cultivo celular
La realización de cultivos celulares, se debe llevar a cabo en condiciones estériles y con material previamente esterilizado, con el objetivo de prevenir posibles contaminaciones que pudiesen
afectar a la viabilidad celular. Además para todo tipo de muestras, se recomienda, siempre que sea
posible, hacer la siembra por duplicado y realizar los cultivos de forma independiente, incluso en
distinta estufa si se puede.
- Cultivo: Estufa 37 ºC
- Directo: Médula ósea.
- Semidirecto 24h: Médula ósea, vellosidades coriales.
- Corto plazo 48-72h: Sangre periférica, sangre de cordón umbilical y médula ósea.
- Largo plazo 2-3 semanas: Líquido amniótico, restos abortivos, vellosidad corial, fibroblastos de
piel y otros tejidos.
Técnica de cultivo de sangre periférica
La muestra de SP puede sembrarse al cabo de varios días de haber sido extraída; sin embargo,
para la obtención de un cultivo óptimo, la siembra debe realizarse dentro de las primeras 24 horas
tras la extracción. La muestra debe mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento,
evitando en cualquier caso temperaturas extremas pero sobre todo la congelación. Todas las
operaciones se deben realizar en la campana de flujo laminar.
Las células se hacen crecer en un medio de cultivo acuoso (Por ejemplo, PB-MAX, Karyotiping
Medium o medio de cultivo RPMI). Se siembra la muestra en un tubo de fondo redondo que
contiene de medio de cultivo a 37 ºC. El medio de cultivo contiene una solución salina consistente
en un sistema tamponado encargado de mantener el pH suplementado con Suero fetal bovino que
contiene factores esenciales para un buen crecimiento celular y L-glutamina, aminoácido esencial
para el crecimiento celular. Normalmente también lleva algún tipo de antibiótico que retrasa el
crecimiento de microorganismos evitando contaminaciones del cultivo. Los fungicidas sólo se usan
en caso estrictamente necesario, ya que tienen el inconveniente de que retrasan el crecimiento
celular. Además también se suplementa con Fitohematoglutinina (PHA) al 4%, que es una lecitina
mitógena que se une a la membrana plasmática de los linfocitos T estimulando su proliferación.
Tras la siembra, de aproximadamente 1 mL de sangre periférica, el cultivo se mantiene en una
estufa a 37ºC. El cultivo se mantiene en la estufa con el tubo inclinado (en posición horizontal) y el
tapón herméticamente cerrado, hasta alcanzar el pico máximo de crecimiento exponencial celular,
lo cual tiene lugar aproximadamente a las 72 horas de cultivo.
7.3. Técnicas de sacrificio. Adición de Inhibidor de mitosis
En este momento, se inicia la extracción de las células en metafase del cultivo. A esta extracción
se le denomina sacrificio. Éste proceso se inicia añadiendo colchicina (p.e. Colcemid. KARIO-MAX
13
Colcemid Solution) utilizando una jeringuilla de insulina estéril y se incuba a 37ºC durante 30 min.
en posición horizontal. Este antimitótico colcemid, análogo de la colchicina, se une a una proteína
conocida como tubulina, impidiendo la despolimerización del huso mitótico. De este modo, al
impedir la separación de las cromátidas hermanas en anafase, las células quedan bloqueadas en
estado de metafase. Una exposición demasiado prolongada al antimitótico, si bien aumenta el
número de células en metafase, también aumenta la condensación cromosómica, lo cual dificultará
posteriormente la detección de anomalías cromosómicas.
7.4. Técnicas de recogida de células y procesado
Terminada la incubación se trasvasa la suspensión de células a un tubo de fondo cónico y a continuación, se centrifuga, se aspira el sobrenadante y se resuspende el sedimento golpeando el fondo
del tubo.
Se somete la suspensión celular a un choque hipotónico añadiendo una solución de Cloruro
Potásico a temperatura ambiente, se mezcla por inversión y se deja actuar durante 20 min. a
temperatura ambiente. Esta solución hipotónica, al contener una menor concentración de sales
que el citoplasma de la célula, provoca la entrada de agua en la célula por un fenómeno de ósmosis
haciendo que ésta se hinche para que aumente el volumen celular y los cromosomas se separen.
Se considera que el choque hipotónico es un paso crítico del cual dependerá más tarde la obtención de buenas extensiones cromosómicas. Conviene controlar muy bien el tiempo, ya que si la
exposición es demasiado prolongada la célula podría lisarse, en cambio una exposición demasiado
corta no hincharía suficientemente las células, lo cual dificultaría la obtención de buenas extensiones.
Seguidamente se realiza una prefijación añadiendo solución fijadora Carnoy, recién preparado,
mezclando metanol y ácido acético en proporción 3:1. La solución se añade dentro de la suspensión agitando por aspiración y expulsión utilizando una pipeta pasteur. Posteriormente se centrifuga a 1.500 rpm durante 5 min.
Se aspira el sobrenadante, se resuspende golpeando el fondo del tubo y se realiza una primera
fijación añadiendo 5 mL de Carnoy. Esta solución se añade en un principio gota a gota (el primer
mL), por la pared del tubo. De este modo se consigue detener la acción de la solución hipotónica
y fijar las células. El metanol precipita la cromatina y el ácido acético lisa las distintas estructuras
membranosas de la célula sin precipitarlas. Tras ello se incuba 10 min. a Tª ambiente y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 min.
Posteriormente, se realizan lavados adicionales con Carnoy para eliminar los restos celulares,
siendo necesarios unos 2 o 3 lavados para obtener un material limpio. Así se realiza una segunda
fijación del mismo modo que la primera pero mezclando el Carnoy por inversión del tubo.
En la tercera y última fijación se aspira el sobrenadante obteniéndose un botón celular blanco
el cual se resuspende añadiendo 5 mL de Carnoy. De este modo, puede conservarse el material
fijado a 4ºC hasta el momento de realizar las extensiones.
7.5. Técnicas de Extensión
Finalmente, la suspensión celular fijada se extiende sobre un portaobjetos previamente desengrasado con metanol absoluto a -20ºC durante 20 min. o a 4 ºC durante 24 h. y secado manualmente con papel de celulosa que no deje restos, en el caso de la realización de extensiones de
forma manual, o desengrasados y lavados con jabón y prehumedecidos en agua destilada en el
caso de realizar las extensiones con un equipo automático que estandariza y reproduce las condiciones prefijadas.
Una buena preparación debe tener un número suficiente de metafases bien extendidas, con el
menor número de solapamientos posibles y libres de citoplasma. Existen numerosas variantes que
afectan a la obtención de buenas extensiones, entre ellas:
- temperatura ambiente
- humedad
14
- el propio tratamiento hipotónico
- altura desde la que se realiza la extensión
-el uso de portaobjetos humedecidos con metanol
La alta temperatura y la humedad favorecen la obtención de buenas preparaciones. El material
sobrante se puede conservar a –20º C, durante 5-6-años.
8. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN CROMOSÓMICA. BANDEO CROMOSÓMICO
Hacia fines de los años 60' Torbjörn Caspersson y Lore Zech observaron que los cromosomas
teñidos con ciertos colorantes del ADN como la quinacrina presentaban un patrón de bandas específico.
A principios de los 70' dos trabajos independientes demostraron que las bandas
producidas por la quinacrina podían reproducirse en preparados teñidos con colorantes no
fluorescentes como el colorante de Giemsa. La técnica utilizada por la Dra. Marina Seabright en
Inglaterra consistía en colorear los preparados tras someterlos a una digestión con una enzima
proteolítica: la tripsina, obteniéndose un patrón de bandas, tras la tinción con colorante de Giemsa,
que era enteramente equivalente al patrón de bandas Q (de quinacrina) obtenido por Caspersson.
En este bandeo no fluorescente, las bandas que se teñían de oscuro (bandas G) eran las mismas
que se observaban brillantes en la tinción con quinacrina, mientras que las bandas claras correspondían a las bandas apagadas u opacas con quinacrina. Este patrón de bandas no fluorescentes
se denominó G (de Giemsa).
A partir de este descubrimiento se han desarrollado un gran número de técnicas de bandeo para
la identificación individualizada de los cromosomas, dividiéndose en dos tipos:
Aquellas que producen un patrón alternativo de bandas a lo largo de todo el cromosoma, creando
un patrón único para cada par de cromosomas homólogos: Bandas G, Bandas R (Bandeo
Reverso) y bandas Q.
Aquellas que tiñen selectivamente una determinada región de algunos o de todos los cromosomas:
Bandas C y Bandas NOR, la técnica “harlequín” de coloración diferencial de cromátides, técnica
Distamicina/DAPI, técnicas de “patrones de replicación”, el bandeo T (telomérico)...
Los bandeos cromosómicos más utilizados son:
- Bandas G
- Bandas C
- Bandas NOR.
8.1. Bandas G
Actualmente es el método de bandeo más usado. Previamente es necesario envejecer las preparaciones con el objetivo de que pierdan humedad y se deshidrate la muestra. Esto se realiza en
estufa a 65ºC durante 14 h o durante 3 días a temperatura ambiente.
Este método es conocido como Bandeo GTG (Bandas G obtenidas con Tripsina y Giemsa). Los
cromosomas son tratados enzimáticamente con tripsina, que desnaturaliza su contenido proteico,
y posteriormente teñidos con colorante Giemsa. Los tiempos se establecen en función del tipo de
muestra y de las condiciones particulares de cada laboratorio. En algunos laboratorios realizan la
tinción con dos colorantes, Giemsa y Wrigth, ya que el empleo de los dos mejora la calidad del
resultado, puesto que facilita el análisis al microscopio para el citogenetista creando un contraste
de color en las bandas que se formaron al emplear la tripsina
Con este método, se obtiene un patrón de bandas claras y oscuras específico de cada cromosoma, de 400 bandas si se ha realizado un cultivo estándar y en torno a 850 bandas en el caso de
un cultivo de alta resolución. Cada una de estas bandas corresponde aproximadamente a 8.000
Kb de ADN.
- Las bandas oscuras son regiones ricas en A-T (adenina-timina) de replicación tardía (estas zonas
15
se condensan pronto en el ciclo celular pero se replican tarde). Poseen muy pocos genes activos.
Los genes que contienen suelen ser grandes porque los exones están separados por largos
intrones.
- Las bandas claras son regiones ricas en C-G (citosina-guanina) de replicación temprana (estas
zonas se condensan tarde en el ciclo celular pero se replican pronto). Estas bandas tienen un
mayor significado biológico ya que se consideran regiones genéticamente muy activas. Los genes
que contienen suelen ser más pequeños porque los exones están más juntos.
- El nivel de resolución mínimo exigible para un análisis citogenético constitucional común para la
detección de aneuploidias es de un patrón de bandeo de 400 bandas, mientras que para el estudio
de pacientes con retraso mental, defectos congénitos, niños con rasgos dismórficos o parejas con
abortos recurrentes, la resolución mínima debe ser de 550 bandas.
Con una resolución de 400-550 bandas, es posible detectar deleciones o duplicaciones de un
tamaño superior a 5-8 Mb, mientras que con una resolución de 800 bandas es posible detectar
anomalías de 3-5 Mb. (Fig. 6 y 7)
Figura 6. Cromosomas mostrando bandas CTG. Bandeo de 550 (Bandeo de alta resolución).
Figura 7. Cromosomas mostrando bandas CTG. Bandeo de 650 bandas (Bandeo de alta resolución).
16
8.2. Bandas C
También denominadas como bandas CBG (bandas C obtenidas con hidróxido Bárico usando
Giemsa). El método consiste en introducir las preparaciones en una cubeta con HCl 0,02N (2 ml
HCl+100 ml H2O destilada) a temperatura ambiente durante 10 min. Se lava con agua y se dejan
secar al aire. A continuación, se introducen las preparaciones en una cubeta a 60ºC con Ba(OH)2
saturado (100 ml H2O+304 g de Ba(OH)2) durante 1 min. El hidróxido de bario despuriniza y
desnaturaliza el ADN. Se realizan dos lavados con agua destilada y metanol para eliminar restos
de bario. Se dejan secar las preparaciones y se incuban en el detergente 2xSSC a 65ºC durante
15 min. Se lavan las preparaciones y se dejan secar. Se tiñen con colorante Giemsa durante 5-10
min. Hay que tener en cuenta, que ésta técnica degrada un 50% del material cromosómico, lo cual
dificulta la posterior aplicación de otras técnicas.
La heterocromatina constitutiva resiste a la degradación y es por tanto el único material que queda
teñido, por este motivo, en el bandeo C se tiñe selectivamente la heterocromatina constitutiva.
Las bandas C positivas (Fig. 8) comprenden las regiones alrededor de los centrómeros, que
contienen secuencias altamente repetitivas ordenadas en tándem de ADN α-satélite de replicación
tardía y las áreas ampliamente polimórficas presentes en los cromosomas 1, 9, 16 y región distal
del brazo largo del cromosoma Y. Estas bandas son especialmente útiles para la caracterización
de cromosomas dicéntricos (o pseudodicéntricos) y también para la determinación de heterocromatina en cromosomas marcadores, que son pequeños elementos supernumerarios detectados en
el cariotipo constitucional, formados por material cromosómico a priori no identificado, con o sin
repercusión en el fenotipo, dependiendo del tipo de material del que estén formados. Los cromosomas marcadores pequeños con frecuencia consisten en poco más que heterocromatina céntrica.
Pero los más grandes con frecuencia contienen algún material de uno o ambos brazos cromosómicos, lo que crea un desequilibrio para los genes presentes en ese material cromosómico.
8.3. Bandas NOR
Para la obtención de unas bandas NOR se requiere una solución de nitrato de plata al 50% (0,5
g AgNO3+1 ml de agua destilada) que debe filtrarse. Se añaden 0,2 µL de esta solución sobre la
preparación y además 6-8 gotas de una solución de formaldehído al 0,3% (en agua destilada) que
acelera la tinción. Se incuba a 37ºC durante 24 h. protegido de la luz.
Las bandas NOR permiten identificar cromatina con secuencias medianamente repetidas de ADNr,
asociada a las regiones NOR del cromosoma ya que tiñen selectivamente las regiones organizadoras del
nucleolo (Nucleolar Organizer Regions) localizadas en las regiones tallo (stalks) y los satélites de los
cromosomas acrocéntricos (Fig. 9). Estas regiones contienen RNA de origen ribosomal y se tiñen con
nitrato de plata. Las bandas NOR son útiles en la identificación de cromosomas marcadores, reorganizaciones cromosómicas y polimorfismos en los cuales estén involucrados los cromosomas acrocéntricos.
Figura 8. Cromosomas de un paciente de sexo femenino mostrando bandas CBG (bandas C con
hidróxido de bario usando Giemsa).
17
Figura 9. Metafase con bandas NOR
Todas las técnicas de bandeo cromosómico anteriormente descritas, requieren que las células
estén en división y detectan anomalías a nivel de una única célula, permitiendo identificar la existencia de heterogeneidad celular (mosaicismos cromosómicos). Los métodos clásicos de bandeo
cromosómico han sido durante muchos años la única herramienta para la detección de anomalías
cromosómicas tanto numéricas como estructurales. Toda esta batería de técnicas ayudó a distinguir anomalías cromosómicas imposibles de observar con técnicas de coloración homogénea,
como por ejemplo inversiones paracéntricas y translocaciones entre fragmentos cromosómicos de
tamaño similar que no modifican la morfología de los cromosomas participantes, de modo que
gracias a ellas se han podido identificar muchas anomalías cromosómicas asociadas a diferentes
malformaciones congénitas, síndromes o cánceres colaborando eficazmente en la comprensión de
la etiología de dichas patologías.
9. TÉCNICA DE ANÁLISIS CROMOSÓMICO
1. Captura de metafases: Se debe recorrer minuciosamente cada una de las extensiones realizadas y teñidas para localizar metafases completas y con los cromosomas bien individualizados y
convenientemente bandeados. (Fig.10).
2. Cariotipado de las metafases: Se debe recortar y ordenar (cariotipar) por parejas de cromosomas homólogos cada uno de los cromosomas que conformen la metafase,2. teniendo especial
cuidado en el estudio posterior de los cromosomas involucrados en una superposición con otro
cromosoma.
Figura 10. Metafase de célula humana masculina con bandeo G
18
3. Análisis de metafases: Se debe analizar la muestra para evidenciar posibles anomalías numéricas
y/o estructurales. En general, se deben analizar un mínimo de 5 metafases completas para un cariotipo constitucional. Se le puede practicar el análisis a un número mayor de metafases en función de
la política del laboratorio. Todos los casos deben tener una imagen almacenada a ser posible de
forma informática para su posterior revisión.
4. Interpretación: Informe citogenético.
10. EL INFORME EN CITOGENÉTICA
Según las guías editadas por la ECA, es responsabilidad del citogenetista suministrar una
descripción clara y sin ambigüedades de los hallazgos citogenéticos, además de una explicación
de las implicaciones clínicas del resultado.
Los informes deben ser realizados de forma estandarizada, y de fácil lectura para el no especialista.
Los informes deben incluir la información siguiente:
• Fecha de recepción y fecha del informe.
• Servicio del cual procede y nombre del facultativo peticionario.
• Identificación del laboratorio.
• Identificación del paciente (nombre, Tarjeta Sanitaria, historia...).
• Motivo de consulta o de petición de análisis citogenético.
• Tipo de tejido examinado
• Nivel de resolución de las bandas obtenidas para el estudio. Si la calidad de bandeo de las metafases estudiadas están por debajo del estándar mínimo hay que dar información acerca de las limitaciones del resultado. Cuando ésto ocurre, pero no se detectan anomalías clínicamente significativas en el análisis citogenético, ésto debe constar en el informe para evitar la repetición de procedimentos invasivos cuando no están clínicamente justificados.
• Fórmula del cariotipo utilizando la nomenclatura correcta y estandarizada según el ISCN 2005 o
2009.
• Se informa, además, la conclusión diagnóstica de forma comprensiva acerca de la normalidad o
posible anormalidad de las líneas celulares observadas.
• Nombre y firma de la persona responsable del informe.
Si el informe es de un caso cromosómicamente anormal, además de lo anterior debe incluir:
• Descripción de la anomalía, independientemente de que ésta sea balanceada o desbalanceada.
• Interpretación escrita de todos los resultados cromosómicamente anormales (comprensible para
los no especialistas).
• El nombre de cualquier Síndrome conocido o enfermedad asociada.
• El número de células analizadas.
• Si el resultado citogenético es consistente con los rasgos clínicos y/o una descripción del fenotipo esperado si se puede.
• Recomendaciones para el Consejo Genético cuando proceda, acerca de las recomendaciones
hacia futuros embarazos o posible descendencia.
11. RESUMEN
• El Análisis cromosómico se ha convertido en un procedimiento diagnóstico muy importante en
la medicina clínica, debido a que las anomalías cromosómicas constituyen causas importantes de
pérdidas reproductivas y defectos congénitos y son frecuentes en muchas formas de cáncer.
• El cariotipo es el conjunto de cromosomas de una especie; es por tanto, el patrón cromosómico
19
de una especie expresado a través de un código, establecido por convenio, que describe las características de sus cromosomas. El cariotipo es característico de cada especie.
• Las anomalías cromosómicas se pueden clasificar en anomalías cromosómicas numéricas o
anomalías cromosómicas estructurales las cuales pueden ocurrir tanto en los autosomas como en
los cromosomas sexuales (o afectar a ambos simultáneamente). La incidencia global de anomalías cromosómicas en neonatos se estima alrededor de 1/175 nacimientos lo cual significa que
afectan a un 0.5-0.6% de la población.
• Cada servicio o Unidad de Genética debe tener sus propios protocolos y algoritmos de actuación
dependiendo de su capacidad técnica o clínica, siguiendo para ello las normas y recomendaciones
de la Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance. Para representar y describir todas las anomalías cromosómicas existe una nomenclatura de consenso recogida en el ISCN 2005 o ISCN 2009,
referencia indispensable para la correcta emisión e interpretación de informes.
• El Protocolo básico para el cultivo, la obtención de preparaciones cromosómicas y el estudio y
la identificación de anomalías cromosómicas es el siguiente:
- Obtención de la muestra y preparación inicial.
- Cultivo celular.
- Sacrificio y recogida de las células.
- Extensión, bandeo y tinción de las preparaciones cromosómicas
- Estudio de los cromosomas al microscopio, obtención del cariotipo y análisis citogenético del
mismo.
- Emisión del Informe Citogenético.
20
BIBLIOGRAFÍA
1. ISCN (1995): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Mitelman F (ed);
S. Karger, Basel. ISBN: 978-3-8055-6226-3.
2. Cytogenetic Guidelines and Quality Assurance. A common European framework for quality
assessment
for
constitutional
and
acquired
cytogenetic
investigations.Coordinators:Authors:Ros Hastings, Rod Howell, Franca Dagna Bricarelli, Ulf Kristoffersson,
Simona Cavani .
3. Citogenética. Juan Ramón Lacadena. Ed. Complutense. 1ª Edición. Marzo 1996.ISBN: 8489364-58-X
4. Nelly TE. Clinical Genetics and genetics Counseling.Year Book Medical publishers. 2.nd ed.
Chicago;1986.
5. Harper PS. Practical Genetic Counseling. Butterworth-Heinemann, 5.th ed. Oxford, 1998.
6. Galvez E. Aplicaciones del laboratorio de citogenética a la Clínica. Pediatría Integral.
2002;9:820-30.
7. Nussbaum RL. Genética en Medicina. Thompson and Tompson.7ª ed. 2008. ISBN:
9788445818701.
8. Connor JM, Fergusson-Smith MA Chromosomes. In: Essential Medical Genetics. Blackwell
Scientific Publications. Oxford, 4th ed. 1993. p. 38-51.
9. Jorde LB, Carey JC, Bamshad MJ, White RL. Citogenética Clínica: bases cromosómicas de la
enfermedad humana. En: Genética Médica. Ed Harcourt International, 2ª edición. Madrid,
2000. p. 108-35.
10. Paris Conference, Suppl<ement (1975): Standardization in human cytogenetics. Cytogenet
Cell Genet 15:201-238. PMID: 767059.
11. Yunis JJ, Sánchez O. (1975) The G-banded prophase chromosomes of man. Humangenetik
27: 167-172.PMID: 50274.
12. Trask BJ (2002) Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting. Nature Rev
Genet 3: 769-778. PMID: 12360235.
21
ENLACES DE INTERÉS
· ECA (Asociación Europea de Citogenetistas):
http://www.e-c-a.eu/EN/
· ACC (Asociación de Citogenética Clínica del Reino Unido):
http://www.cytogenetics.org.uk/
· Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología:
http://atlasgeneticsoncology.org
· Variación Cromosómica en el Hombre (Base de Datos): Catálogo de Variantes y
AnomalíasCromosómicas:
http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/index.html
22
EVALUACIÓN
CASO CLÍNICO 1
Paciente femenina de 14 años de edad, producto del primer embarazo de una madre ama de
casa, de 34 años sana y un padre de 36 años, comerciante, sano.
Embarazo: Únicamente informa de una infección urinaria que fue tratada con antibióticos en
el primer trimestre de embarazo y una colestasis gravídica en el tercer trimestre de embarazo
sin mayores consecuencias. El peso de la recién nacida fué de 3650 gr, 50 cm de talla, 32 de
perímetro craneal, 8-10 en el Apgar. Evaluada al nacer se le encontró: linfedema, cuello corto
y ancho y un sutil edema en el dorso de los pies.
Actualmente acude a la consulta por amenorrea primaria y estatura baja. A la exploración se
observa el pecho con forma de escudo y pezones muy separados, así como manchas
marrones en las piernas. Tras la realización de diversas pruebas se observa además, ecográgicamente ovarios rudimentarios con una disginesia gonadal, junto con una coartación
aórtica, infección urinaria, hipertensión renal y otitis media de repetición. Además en la analítica destaca la presencia de un hipotiroidismo leve.
Tras la realización del análisis citogenético en sangre periférica se informa una fórmula
cromosómica 46, XX, i(X)(q10), correspondiente a una variante de Síndrome de Turner.
1 - En Citogenética, un cariotipo es:
a) Complemento cromosómico característico en cuanto al número y la morfología de sus cromosomas e independiente de la especie
b) Representación o fotografía del conjunto de cromosomas de una especie ordenados por
tamaño y homología.
c) Complemento cromosómico característico de una especie en cuanto al número y la morfología de sus cromosomas
d) Mapa de la localización cromosómica de los genes, característico de cada especie.
2 - Los cromosomas tienen un brazo corto y otro largo separados por un estrechamiento o constricción primaria, llamada centrómero. No es cierto sobre el centrómero de un cromosoma:
a) Es esencial para el movimiento y segregación normales del cromosoma durante la
división celular.
b) Es parte integral del cromosoma.
c) Es el punto de unión del huso mitótico
d) Están situados en los extremos de los cromosomas formados por regiones de ADN no codificante, altamente repetitivas.
3 - Las enfermedades o anomalías cromosómicas son las responsables de una proporción significativa de enfermedades genéticas. En cuanto a las enfermedades cromosómicas es falso:
a) Generalmente cuanto más grande es el cromosoma alterado o más grande es la masa de
cromatina involucrada, más graves son los efectos en el fenotipo del individuo.
b) Habitualmente se expresan con alteraciones fenotípicas múltiples y/o graves
c) La especie humana tolera mejor las trisomías que las monosomías, así mismo, tolera mejor
las anomalías cromosómicas producidas por la no disyunción meiótica que afecta a los autosomas que a los gonosomas.
d) Las enfermedades cromosómicas debidas a anomalías cromosómicas estructurales, son muy
variadas y sus efectos son más complejos de predecir que las debidas anomalías cromosómicas numéricas.
23
4 - El Síndrome de Turner puede ser diagnosticado practicando el cariotipo en cualquier momento
de la vida, incluyendo la edad adulta si los signos son escasos. Sin embargo, por regla general
el diagnóstico se suele producir en neonatos con algún problema cardíaco específico o que
muestran linfedema y cuello corto y ancho, a veces con pliegue cutáneo, o bien en niños y
adolescentes, con crecimiento lento y baja estatura. Respecto al síndrome de Turner, es cierto:
a) Se debe siempre a la falta de un cromosoma X.
b) Las pacientes afectadas son siempre estériles
c) Consiste en la ausencia total o parcial de uno de los cromosomas X, y se puede deber tanto
a una anomalía numérica como a una estructural.
d) A y B son ciertas
5 - Respecto a los reordenamientos cromosómicos desequilibrados en las que existe pérdida o
ganancia de material genético:
a) Los hay recíprocos y robertsonianos
b) Pueden ser comparables con trisomías y/o monosomías parciales.
c) La mayoría producen un fenotipo normal.
d) Ejemplos de ellos son las deleciones, inserciones e inversiones.
24
CASO CLÍNICO 2
Recién nacido de sexo masculino de madre primogestante de 24 años de edad, con controles
prenatales en los que se le administró sulfato ferroso desde el primer trimestre, cursó con
infección de vías urinarias sin tratamiento al inicio de la gestación. La ecografía con biometría fetal demostró hidroureteronefrosis izquierda. En el último trimestre cursó con oligohidramnios y preeclampsia leve, que motivó su hospitalización y posterior parto por cesárea.
Al examen físico se encontró un Recién Nacido (RN), pequeño para la edad gestacional por
retraso de crecimiento intrauterino. Talla de 43 cm., peso de 1800 gr. y perímetro cefálico de
30 cm. Buena vitalidad, APGAR 8/9 al minuto y 9/10 a los 5 minutos. RN con llanto inmediato,
plagicefalia, micrognatia, orejas pequeñas de implantación baja con sobreplegamiento del
hélix, pliegue palmar único derecho, pie equino varo izquierdo con reducción activa y pasiva,
sobreposición del 4º dedo sobre el 3º (bilateral) y sin déficit neurológico.
Ingresó a la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales con signos de distress respiratorio,
desarrollando alcalosis metabólica hiperoxémica. En el hemograma se observó intensa
plaquetopenia. Mediante ecografía abdominal se confirmó la hidronefrosis izquierda y en el
ecocardiograma se observó dextrocardia con situs solitus y foramen oval permeable. El
cuadro clínico evolucionó a sepsis neonatal más trombocitopenia.
Se le realizó estudio citogenético para la obtención del cariotipo empleando la técnica de
bandeo G sobre cromosomas en metafase tras cultivo de 72 horas de linfocitos de sangre
periférica. El análisis de los cromosomas en 30 metafases mostró una fórmula cromosómica
46,XY,+13,der(13;15)(q10;q10), cuyo cromosoma 13 extra era un derivado de una translocación con el cromosoma 15, recomendándose por ello la realización del análisis cromosómico
a los padres. En el cariotipo en sangre periférica de los padres se obtuvo, para el padre, una
fórmula cromosómica 46,XY y para la madre, 45,XX,t(13;15)(q10;q10) concluyéndose que su
anomalía cromosómica era de origen materno al haber heredado, de forma no balanceada,
una translocación materna en principio equilibrada.
La radiografía de tórax reveló infiltrados alveolares pulmonares y la valoración por
Otorrinolaringología determinó una incoordinación velopalatina. A los pocos días el RN
comenzó con apneas frecuentes requiriendo ventilación mecánica, con evolución desfavorable hasta el exitus letalis a los 36 días.
6 - Las características del informe citogenético correspondieron a qué Síndrome, producido por
una trisomía parcial, cuyo cromosoma extra proviene de una translocación robertsoniana
heredada de origen materno.
a) Síndrome de Klinefelter
b) Síndrome de Edwards
c) Síndrome de Patau
d) Síndrome de Turner
7 - El medio de cultivo en el que se siembra la sangre periférica para la fase de
sembrado y cultivo celular:
a) Contiene una solución salina consistente en un sistema tamponado encargado de mantener
el pH suplementado con suero fetal bovino
b) Se suplementa con un mitógeno como la Fitohematoaglutinina para estimular la proliferación
de los linfocitos T.
c) Se suplementa con un antimitótico como la colchicina para impedir la despolimerización del
huso mitótico.
d) A y B son ciertas.
25
8 - El informe en Citogenética:
a) Deben ser realizados de forma estandarizada y suministrar una descripción clara y sin ambigüedades de los hallazgos citogenéticos.
b) Deben incluir la fórmula del cariotipo utilizando la nomenclatura correcta y estandarizada
según el ISCN 2005 o 2009.
c) Deben incluir el nombre y firma de la persona responsable del informe.
d) Todas son ciertas.
9 - Para la obtención del cariotipo tanto del paciente como de sus progenitores se utilizó la
técnica de bandeo GTG. Es cierto en este tipo de bandeo:
a) Con este método, se obtiene un patrón de bandas claras y oscuras específico de cada cromosoma. Cada banda representa un solo gen.
b) Los cromosomas son tratados enzimáticamente con tripsina y posteriormente teñidos con
hidróxido de bario.
c) Las bandas oscuras son regiones ricas en C-G (citosina-guanina) de replicación temprana
d) Los cromosomas son tratados enzimáticamente con tripsina y posteriormente teñidos
con giemsa.
10 - Las Guías de Práctica Clínica en el campo de la Citogenética
a) Tienen como propósito estandarizar una serie de pautas y criterios generales en el desarrollo
de las técnicas citogenéticas.
b) Cada Unidad de Citogenética debe tener sus propios protocolos y algoritmos de actuación
dependiendo de su capacidad técnica o clínica, siguiendo para ello las normas y recomendaciones de las GPC.
c) Estos documentos incluye los aspectos de control de calidad con los que se trabaja actualmente en los laboratorios de citogenética. Estas normas deben ser consideradas como criterios mínimos aceptables.
d) Todas son ciertas.
26
NOTAS
27
NOTAS
28
NOTAS
29
ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE
FARMACÉUTICOS ANALISTAS
c/ Modesto Lafuente, 3 - entreplanta C y D
28010 Madrid
Tel.: 91 593 84 90 - Fax: 91 593 01 34
Correo electrónico:
Secretaría: [email protected]
Tutoría y envío de resultados: [email protected]
Web: www.aefa.es
COMISIÓN DE FORMACIÓN CONTINUADA
Coordinación y tutoría:
Miriam Martínez Villanueva
ISBN: 978-84-616-2639-7
Depósito Legal: M-2138-2013
Imprime: AYREGRAF
Colabora: