File - microbiología veterinaria udec

TECNICAS DE DIAGNOSTICO
DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
J López M MV MSc microbiología
Fac Cs Veterinaria U de Concepción, Chile
DAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO:
AISLAMIENTO:
Siembras en medios de cultivo
Inoculación de cultivos celulares (Clamydia spp. , Clamydophila
spp., Lawsonia intracelularis, micoplasmas en cultivos, etc.)
Inoculación de animales de laboratorio o de aves
(en determinados diagnósticos).
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION
1) relacionar con :
Ex parasitológicos, bioquímicos, toxicológicos , virológicos, antec. Clínica, Anatomía
Patológica, Epidemiología
2) Si agente primario o secundario
3) Los resultados positivos (aislamiento) no siempre implican la causa del proceso
4) Los resultados negativos no siempre comprueba ausencia del agente etiológico
5) Considerar contaminantes ambientales, portadores sanos o la flora normal
6)Tipo de muestra
7) Métodos y técnicas de siembra utilizados
8)Tiempo transcurrido entre toma de muestra y siembra bacteriológica
9) Animales tratados o no (antibióticos, quimioterapeúticos, vacunación)
Esquema Técnicas Diagnóstico General
Muestras (signos y lesiones)
Estado agudo (muestra
representativa)
Estado crónico o sospecha de cepas
de baja patogenicidad (varios tipos
de muestras)
Animales vivos
(secreciones)
Animales sacrificados
(tejidos y orgános
Incubar 370 C c/ ó s/ 5% CO2
(24, 48 horas hasta 7 días)
Medio de cultivos
Enriquecimiento
Mejorados
Selectivos
Diferenciales
Detección del microorganismo
Aislamiento
Detección de los anticuerpos específicos
Estudio de caracteres
Bioquímicos
Digitonina,
Fermentación de la glucosa
Hidrólisis urea
Hidrólisis arginina
Técnicas moleculares
Film y Spot
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Hibridación de ácidos nucleicos (HAN)
Polimorfismo de fragmentos de restricción
(RFLP)
Análisis del DNA polimorfico (RAPD)
Serológicos
Seroaglutinación rápida en placa
Inhibición de la hemoaglutinacion ELISA
Dot-ELISA
Inmunoperoxidasa de las colonias
Inmunofluorescencia de las colonias
Inhibición del crecimiento
IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS
AISLADAS
COLONIAS:
Crec (24 H o 48 H o más)
Comparar crec AS y medios selectivos
Observación:
Tamaño, Hemólisis (presencia y tipo), Pigmento, Olor
Lisas o rugosas, Planas o convexas, Bordes netos o irregulares, Opacas o translúcidas, Viscosas ,
mucosas o butiráceas, Brillantes, brillo metálico o sin brillo, Húmedas, como gotas de rocío o secas
Morfología, disposición y tinción Gram (u otra)
Obtener un cultivo a partir de una colonia separada
BACTERIAS DE INTERÉS EN VETERINARIA:
- Quimioorganotróficas
- Mesófilas
- 32º C y 35º C
- Crecen AS carnero, las NO:
Staphyococcus aureus (Agar Chocolate)
- Anaero fac
- Aerobiosis ( anaero fac, aero estrictas (met oxid) y anaero aerotolerantes
(met ferm), las NO:
microaerófilas
anaerobias estrictas
- No esporulan (excep Bacillus y Clostridium)
- No AAR (excep Mycobacterium, Nocardia asteroides y
Corynebacterium pseudotuberculosis)
- Utilizan la glucosa (hay excep)
Algunos TIPS para
el diagnóstico
BACTERIOLÓGICO
BACTERIAS GRAM - DE INTERÉS VET,
CREC RÁPIDO (24 H A 37º C), AS, AEROBIOSIS:
Oxidasa, prueba más importante en su iden.
EN 24 HORAS
OXIDASA NEGATIVAS
Familia: Enterobacteriaceae
Acinetobacter (Dif TSI, OF y Mc Conkey -)
DAGNÓSTICO. Esquema
Muestras: Tejido, Heces, Leche, etc.
Rutina
Sospecha de Salmonella
Sospecha de Yersinia
*
Agar Sangre,
Agar MacConkey
Lactosa +
Caldos enriquecidos:
Tetrationato
Selenito,
Rappaport ¿Kauffmann?
Lactosa -
Investíguese E. coli
usando “IMVIC”
Enriquecimiento en frío
Subcultivo a
las 24 horas
Agar Verde Brillante,
Agar MacConkey ¿SS?
Colonias sospechosas
Tubo con Agar inclinado TSI y prueba de la lisisna descarboxilasa
IMVIC”+
“IMVIC -
Lactosa +
E. coli
Pruebas de
serottipificación o
enteropatogenicidad
Lactosa -
Otras enterobacterias
Si seconsidera significativo,
identificar con pruebas
bioquímicas
Negativo
Sueros polivalentes a Salmonella
Positivo
Serotipficación completa
* Verde brillante, SS
BACTERIAS GRAM - DE INTERÉS EN VETERINARIO, CREC LENTO (A 37ºC) EN
AS, AEROBIOSIS:
Descartar trat en el animal, TºC incubación u otro
Actinobacillus (algunas spp, medio selectivo)
Yersinia (col pequeñas 24 H Yersinia
pseudotuberculosis en casos crónicos), crece en
medios selectivos para enterobacterias oxidasa Brucella spp. , las que no necesitan
microaerofilia
Haemophilus spp, los que no necesitan Factor V
CREC SÓLO AS CON STAPHYLOCOCCUS
AUREUS (AGAR CHOCOLATE):
Haemophilus spp. que necesitan Factor V
Actinobacillus pleuroneumonie que necesita
factor V (puede crecer a las 24 H de incubación)
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
CULTIVABLES EN AEROBIOSIS
BACILOS:
COCOS:
CATALASA +
CATALASA -
NO RAMIFICADOS
CATALASA +
CATALASA RAMIFICADOS
COCOS
CATALASA +
CATALASA -
Staphylococcus
Streptococcus
Micrococcus
Diplococcus
pneumoninae
BACILOS NO RAMIFICADOS
CATALASA +
Listeria
Corynebacterium (excepto Corynebacterium
haemoliticum y actual Arcanobacterium
pyogenes)
Rhodococcus equi
Bacillus Gruesos esporulados en
determinadas condiciones)
BACILOS NO RAMIFICADOS
CATALASA -
Erisipelothrix
Lactobacillus
Arcanobacterium pyogenes
(hemólisis beta)
Bacillus
(algunos)
BACILOS RAMIFICADOS
Nocardia
Streptomyces
Dermatophilus congolensis
Actinomyces (después del
primer aislamiento)
ANAEROBIOS ESTRICTOS
GRAM POSITVAS:
• Clostridium spp. (son bacilos gruesos)
• (Corynebacterium ) E suis. Riñón y orina de cerdo.
•Actinomyces bovis. Primocultivo de maxilar y/o lengua
de bovinos
GRAM NEGATIVAS:
Dichelobacter nodosus y Bacteroides necrophorum.
Patología de las extremidades en rumiantes
(Pododermitis)
Brachyspira hyodysenteriae. Intestino de cerdo.
Streptobacillus moniliformis Primocultivo (produce
poliartritis en ratones y artritis en pavos).
Asistencia obligatoria:
Miércoles 02 de septiembre a práctico demostrativo. API y cómo leer e interpretar resultados
PRUEBAS ADICIONALES A LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS:
Pruebas serológicas
(algunas). Ej.,
Salmonella,
Mycoplasmas spp.,
Fagos (algunas) Se han
usado en la identificación
de algunos géneros y de
especies
Inoculación de animales de
laboratorio (pocas), para la
determinación del poder
patógeno, virulencia o
caracteres toxigénicos
Técnicas de ácidos
nucleicos (Iden. algunos
géneros y especies)
TAREA (Del Miércoles 27 de agosto al Miércoles 10 de septiembre):
Leer, entender, explicar y comunicar un artículo científico que utilice
técnicas de diagnóstico bacteriológico NO TRADICIONAL
Exponer trabajo Miércoles 10 de septiembre
Otras Técnicas
Otros métodos de laboratorio: RECUENTO BACTERIANO
1 Métodos Directos Recuento Bacteriano
2 Métodos Indirectos: a) APC, b) SPC
a)
b)
Un Ej., DETECCION SALMONELLAS
METODOS DE DETECCION:
ALIMENTOS YAMBIENTE
Pre-enriquecimiento
(16 a 20 horas)
Enriquecimiento
(24 horas)
Identificación
(1 a 3 horas)
CLINICA/PATOLOGIA
EnriquecimientoDirecto
(24 horas)
Aislamiento directo
(24 horas)
Aislamiento
(24 horas)
Identificación
(1 a 3 horas)
Identificación
(1 a 3 horas)
Antibiograma
(24 horas)
Aislamiento
(24 horas)
CUALITATIVO
(1/10) Usualmente
25g de muestra,
aunque puede ser
más para ampliar la
sensibilidad.
0,1 a 1 Salmonella/g
CUALITATIVO
(10/100) Usualmente 2g de
heces en 20 mL de medio de
enriquecimiento.
De 5 a 50 Salmonella/g
CUANTITATIVO
Usualmente 0,1 ml en una
placa = 0,002g de heces)
500 Salmonella/g
Fecas
Otro Ej., DIAGNÓSTICO E IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTER
A1
direct
o
Medio de
Skirrow
Medio de
Butzler
Campybap
Medio de
Skirrow
modificado
Examen
directo
48 h, 42-43 ºC
A2
indirecto
Medio selectivo
Campy thio u otro
(4 ºC, 18 h) – (42ºC)
48 h, 42-43 ºC
OTROS MÉTODOS:
PRUEBA DE
SUSCEPTIBILIDAD
A NTIMICROBIANA
A)
B)
-Confluente
- Semi confluente
MÉTODOS SEROLÓGICOS
AGLUTINACIÓN
a) Simple:
b) Microaglutinación (PDF anexo)
IF ó IP
FC
IHA
ELISA (PDF anexo)
ID
METODOLOGÍAS
Los análisis de separación
EP electroforesis
Partículas Antígeno-Anticuerpo ensayos de
reacción
DA aglutinación directa
HA Hemagllutination
FC Citometría de Flujo
LA aglutinación del látex (aglutinación de
partículas de látex)
Antígeno-anticuerpo solubles ensayos de
reacción
ID Identificación Inmunodifusión
CoA coaglutinación
HI Inhibición de la hemaglutinación
RID Inmunodifusión radial RID
NEPH nefelometría
CIE Contrainmunoelectroforesis
IEP Inmunoelectroforesis
IFIX Inmunofijación
Los ensayos inmunohistoquímicos
FA anticuerpos fluorescentes
Procedimientos de inmunoensayo
RIA radioinmunoensayo
DFA directa de anticuerpos
fluorescentes
IRMA radioinmunométricos
Prueba RAST Radioalergoabsorbencia
IFA inmunofluorescencia indirecta
FPIA inmunoensayo de polarización fluorescente
ACIF anticomplemento
inmunofluorescencia
ABIF avidina-biotina
inmunofluorescencia
Los ensayos de quimioluminiscencia CL
EIA inmunoensayo enzimático
EMIT de inmunoensayo enzimático-multiplicada
Micro-IF micro-inmunofluorescencia
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
Inmunoperoxidasa IP
Captura del anticuerpo IgM MAC
ICA Inmuno Ensayo
Micropartículas MEIA Inmunoensayo enzimático
RIPA radioinmunoprecipitación Ensayo
IAA ImmunoArray Ensayo
Técnicas de Biología Molecular
Dot-Blot ADN Dot-blot hibridación
Polimerasa Chain Reaction PCR
RT-PCR PCR transcriptasa inversa
SB Southern Blot
NB Northern Blot
BM inmunotransferencia / Western Blot
RBC líticas ensayos para detectar Reacciones Antígeno-Anticuerpo
CF Fijación de Complemento
Nt Neutralización
Técnicas Moleculares