SínteSiS y caracterización de compoSitoS de quitoSana y/o

Síntesis y caracterización
de compositos de quitosana
y/o
DLPLG reforzados con
nanotubos de carbono para su
aplicación en ingeniería tisular
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
Ricardo Duarte Jáquez
Rector
David Ramírez Perea
Secretario General
Manuel Loera de la Rosa
Secretario Académico
Juan Ignacio Camargo Nassar
Director del Instituto de Ciencias Sociales y Administración
Luis Enrique Gutiérrez Casas
Coordinador General de Investigación y Posgrado
Ramón Chavira Chavira
Director General de Difusión Cultural y Divulgación Científica
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
Síntesis y caracterización
de compositos de quitosana
y/o
DLPLG reforzados con
nanotubos de carbono para su
aplicación en ingeniería tisular
Imelda Olivas Armendáriz
Carlos Alberto Martínez Pérez
Florinda Jiménez Vega
Claudia Lucía Vargas Requena
Santos Adriana Martell Estrada
María Concepción Chavarría Gaytán
Ingeniería y Tecnología
Coordinación General de Investigación y Posgrado
Lisbeily Domínguez Ruvalcaba
Coordinadora de la colección
Olivas Armendáriz, Imelda; Martínez Pérez, Carlos Alberto; Jiménez
Vega, Florinda; Vargas Requena, Claudia Lucía; Martell Estrada, Santos Adriana; Chavarría Gaytán, María Concepción.
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o DLPLG
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería
tisular / Imelda Olivas Armendáriz, Carlos Alberto Martínez Pérez,
Florinda Jiménez Vega, Claudia Lucía Vargas Requena, Santos Adriana Martell Estrada, María Concepción Chavarría Gaytán. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, 2013. (Colección
Textos Universitarios, Serie Investigación)
64 p.; 30 cm.
Incluye bibliografía
Colección Reportes Técnicos de Investigación Isbn: 978-607-7953-80-7
Serie IIT, Vol. 8. isBn: 978-607-520-016-3
Contenido:
1.– Introducción. 2.– Planteamiento. 3.– Metodología. 4.– Resultados.
5.– Conclusiones.
D. R. © Olivas Armendáriz, Imelda; Martínez Pérez, Carlos Alberto; Jiménez Vega,
Florinda; Vargas Requena, Claudia Lucía; Martell Estrada, Santos Adriana; Chavarría
Gaytán, María Concepción.
La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Dirección General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección
de Publicaciones.
Índice
Resumen
Abstract
Palabras clave Usuarios potenciales
Reconocimientos
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11
11
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I. Introducción
II. Planteamiento
Antecedentes
Tejido óseo Osteoblastos
Osteoclastos Osteocitos
Matriz extracelular Factores de crecimiento
Mecanismos de osificación y remodelado
Injertos de hueso
Biomateriales
Quitosana
Ácido poli-L-láctico Nanotubos de carbono
Biomateriales compuestos
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III. Metodología
Materiales
Síntesis de soportes poliméricos
Análisis estructural Análisis térmico
Análisis de propiedades mecánica
Criterios de inclusión para cultivos celulares Obtención de las muestras
Cultivo celular
Recuento celular
Siembra de osteoblastos en los compositos
Biocompatibilidad
Adhesión celular
Proliferación celular
Citotoxicidad
Valoración de morfología y calcificación celular
Producción de matriz y mineralización
Análisis de expresión de marcadores moleculares
Análisis estadístico
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31
IV. Resultados
Morfología de los compositos Análisis de las propiedades mecánicas
Resultados de análisis génicos
Caracterización morfológica de los osteoblastos aislados
Curva patrón
Adhesión celular
Proliferación
Cebadores estandarizados
Expresión génica
Adhesión celular
Proliferación celular
Discusión
Referencias
V. Conclusiones
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41
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50
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54
Resumen
S
e fabricaron compositos de quitosana, ácido poli-L-láctico y nanotubos de carbón de pared múltiple por separación de fases inducida térmicamente para
su uso en ingeniería tisular. Obteniendo como resultados que las propiedades
mecánicas de la quitosana/PLLA son mejoradas con la adición de pequeñas
cantidades de nanotubos de carbono y que la morfología entrecruzada presenta tamaños de poros adecuados para la adhesión y proliferación celular. El análisis de proliferación osteoblástica muestra una proliferación mayor a los 14 días de cultivo.
9
Abstract
P
orous composites scaffolds of chitosan/poly(D,L-lactide-co-glycolide) were
fabricated for tissue engineering applications by thermally induced phase
separation and lyophilization techniques. The cumulative results suggest
that mechanical properties of the composites increase with small percentage of carbon nanotubes, morphology and pore size is adequate for cell adhesion and
proliferation, and that osteoblast proliferation assay was significantly greater at day
14 of cell culture.
Palabras clave
Quitosana, PLLA y nanotubos de carbono.
Usuarios potenciales
Personas con pérdida de tejido óseo considerable, en el cual las técnicas tradicionales pueden llevar a cabo una regeneración de tejido deficiente.
Reconocimientos
Se agradece el apoyo financiero al Programa de mejoramiento del Profesorado
(PROMEP) para la realización del proyecto.
Se agradece a los estudiantes de maestría Manuel Alejandro Hernández y Aurora
de la Paz, así como a los Institutos de Ingeniería y Tecnología y Ciencias Biomédicas.
11
I. Introducción
E
l daño estructural del hueso producido por traumatismo o enfermedades
óseas es la principal causa de dolor crónico, discapacidad y pérdida de la
función del tejido; este problema requiere de medicamentos, rehabilitación
física y tratamiento quirúrgico que conlleva a un costo elevado en la salud.
El hueso como soporte del cuerpo, se distingue por su rigidez y resistencia, cuando
se ve afectado por traumatismos o enfermedades degenerativas, inicia los procesos
de regeneración ósea para recuperar el tejido perdido; este mecanismo es útil cuando
existe un daño parcial, pero cuando la pérdida del tejido es considerable la regeneración puede ser deficiente.
En esta situación, se requiere de la aplicación de un injerto para completar la regeneración ósea, las opciones disponibles son el autoinjerto, tomar hueso del mismo
paciente e injertarlo a la parte afectada, el aloinjerto, toma y procesamiento del hueso de un cadáver y trasplantarlo al paciente, o el xenoinjerto, fragmentos de hueso
obtenidos de animales de diferente especie. Sin embargo el autoinjerto no es factible
de realizar en sitios donde la perdida de hueso es considerable o no se cuenta con
suficiente zona donadora de tejido óseo, mientras que en el aloinjerto la respuesta
puede ser escasa debido a la ausencia de células generadoras de hueso o por riesgo
de rechazo debido a la incompatibilidad entre el donante y el receptor; el xenoinjerto
por ser una especie diferente tiene una probabilidad elevada de producir rechazo por
incompatibilidad, para disminuir este riesgo se están realizando estudios para obtener animales genéticamente modificados, pero esta fase aún se encuentra en etapa
de experimentación (Yélamos et al., 2000; Estrada et al., 2006).
Como una alternativa a este problema surge la ingeniería tisular, una ciencia
interdisciplinaria, que aplica principios de ingeniería y las ciencias de la vida para
crear sustitutos biológicos que restauren o mantengan la función de un tejido que ha
sido afectado (Estrada et al., 2006; Rincón et al., 2007). La ingeniería tisular está desarrollando implantes de materiales artificiales con actividad osteogénica, que pueden mejorar la calidad de vida de aquellas personas que han perdido masa ósea, y
que no es posible recuperar el tejido mediante la aplicación de autoinjerto, aloinjerto
o xenoinjerto. Los biomateriales pueden ser de polímeros, metales, cerámicas, de ori-
13
14
gen natural (microbiano, vegetal o animal), y compositos que son la combinación de
dos o más de los anteriores (Yilgor et al., 2010).
Actualmente las matrices porosas fabricadas por técnicas diversas, han permitido
el procesamiento de materiales metálicos, cerámicos, poliméricos de origen natural
como la quitosana, o sintéticos que incluyen a los polihidroxiácidos, como el ácido
poli-L-láctico (PLLA), que se han utilizado en ingeniería tisular por sus ventajas de
amplia disponibilidad, facilidad de procesamiento, degradación ajustable y baja respuesta inflamatoria (Estrada et al., 2006; He et al., 2009).
La quitosana, es un biopolímero ampliamente distribuido en la naturaleza, se obtiene por desacetilación de la quitina, es producida por crustáceos, moluscos, insectos
y hongos, su fuente habitual son los desechos de caparazones de crustáceos y conchas
de moluscos (Kim et al., 2008). Una de las características importantes de la quitosana es la relación entre el grado de desacetilación y su biocompatibilidad, estudios
realizados por Tomihata e Ikada (1997) han demostrado que a mayor grado de desacetilación mayor biocompatibilidad, las membranas de quitosana con un grado de
desacetilación entre 65 y 80% favorecen la osteogénesis, además la quitosana tiene
una superficie hidrofílica que promueve la adhesión, proliferación y diferenciación
celular (Hidaka et al., 1999).
Los nanotubos de carbono (NTC) tienen un futuro promisorio en el campo médico,
actualmente se valora utilizarlos como una vía para encapsular medicamentos en su
interior, y transportarlo por la circulación sanguínea hasta el sitio objetivo, también
se busca utilizarlos como sensores inteligentes en instrumental quirúrgico; en estudios de imagen por resonancia magnética se usa como portador de carbono-13. En
relación a nuestro objetivo de estudio los NTC se están probando como refuerzo mecánico en un soporte para la regeneración ósea y a la vez puedan inducir el crecimiento
de cristales de hidroxiapatita (Rivas et al., 2007).
Dado que las células son sensibles a su entorno, el comportamiento de los biomateriales depende en gran medida de su interacción con el ambiente biológico, por lo tanto entender los mecanismos por el cual las células detectan y responden a las señales
de la superficie de estos compuestos, facilitará el desarrollo de nuevos biomateriales
para el control del comportamiento de las células (Okada et al., 2010).
En los últimos años los avances en la investigación, de ingeniería tisular, de estructuras poliméricas artificiales que conduzcan a la construcción y regeneración de
células y tejidos ha tenido grandes avances, sin embargo esto continúa siendo un gran
reto, ya que estas estructuras aun no presentan las propiedades mecánicas ideales
para no colapsar durante el tratamiento ni durante las actividades normales del paciente. Atendiendo esta problemática en este proyecto se propone el desarrollo de un
composito que contenga Nanotubos de carbono (NTC), siendo estos las nanopartículas más utilizadas en el refuerzo mecánico de matrices poliméricas. Aunque existen
investigaciones previas con polímeros biodegradables, como la quitosana, Poli (DL,
láctido) y el Poli(láctico-co-glicólico), hasta el momento no se ha encontrado el soporte adecuado ni estudiado a profundidad su interacción con NTC y células óseas. Ya
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
que los estudios publicados se basan en observaciones histológicas y citoquímicas sin
embargo el contar con un patrón de expresión génica permitirá tener un alcance más
completo de los procesos fisiológicos que se están regenerando en el tejido. Por ello,
la combinación óptima de los polímeros y los NTC así como el estudio de la expresión
génica a través de cultivos in vitro permitirá diseñar y fabricar un biomaterial con
propiedades más adecuadas. La elaboración y el desarrollo de la metodología de estos biomateriales de soporte serán de suma importancia para establecer mecanismos
adecuados para su producción y utilización
Por lo anterior, el propósito de este estudio será caracterizar las propiedades morfológicas, mecánicas y con técnicas de cultivo celular, los compositos de quitosana/
PLLA reforzados con nanotubos de carbono probados en células osteoblásticas de
Calvaria rata, evaluando la adhesión celular, proliferación celular, perfiles de expresión génica y cuantificación de calcio durante la consolidación ósea.
I. Introducción
15
II. Planteamiento
Antecedentes
Tejido óseo
E
l tejido óseo es un tipo especializado de tejido conectivo, que se caracteriza
por su rigidez y su resistencia, tanto a la tracción como a la compresión.
Está formado por los osteoblastos y osteocitos, que son las células de sostén;
por el osteoide, una matriz no mineral de colágeno y de glucosaminoglicanos, por sales minerales inorgánicas depositadas en la matriz y por los osteoclastos,
las células de remodelación (Stevens y Lowe, 2006).
Las células óseas se encuentran dentro del propio tejido óseo, o en el estroma conjuntivo de la médula ósea, esta última, es el reservorio de las células mesenquimales
pluripotenciales indiferenciadas (las células osteoprogenitoras), que dan origen a los
linajes condrogénico y osteogénico, en respuesta a señales moleculares, que van a
activar diferentes genes específicos. El linaje condrogénico da origen en el cartílago a
los condrocitos y el osteogénico a los osteoblastos y osteoclastos en el hueso (Fernández-Tresguerres et al., 2006).
Osteoblastos
Producen la mayor parte de las proteínas presentes en el hueso de la matriz extracelular (MEC) su función más importante es formar huesos mineralizados, definiéndose entonces como la célula formadora de hueso. Sintetizan la matriz orgánica
o sustancia osteoide 2 a 3 µm por día, sintetizan proteínas colágenas y no colágenas
de la matriz orgánica del hueso y contribuyen a la mineralización de la sustancia
osteoide en conjunto con la fosfatasa alcalina. Pueden expresar los marcadores como
sialoproteína ósea, osteopontina, osteonectina y fosfatasa alcalina (Yamaguchi et al.,
2000; Fernández-Tresguerres et al., 2006).
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18
Osteoclastos
Se encargan de reabsorber o eliminar la materia ósea, contienen fosfatasa ácidatartrato resistente, que permite la desfosforilación de las proteínas, cuya actividad
es aprovechada para su identificación. Los osteoclastos se encuentran adheridos a la
superficie ósea en zonas de resorción ósea activa o en depresiones que ellos mismos
excavan en el hueso llamadas lagunas de Howship. Tienen un borde en cepillo en
donde se lleva a cabo la reabsorción y una zona clara, rica en microfilamentos, con
integrinas que sirven de anclaje a la matriz. (Fernández-Tresguerres et al., 2006;
Stevens y Lowe, 2006)
Osteocitos
Constituyen el estadio final, son las células osteoblásticas maduras, cuando la matriz es mineralizada algunos osteoblastos quedan atrapados adentro, convirtiéndose
en osteocitos, las células más abundantes en el hueso, incapaces de renovarse. Participan en la síntesis y mineralización de la matriz osteoide, pero su función principal
es controlar el remodelado óseo (Stevens y Lowe, 2006).
Matriz extracelular
La matriz ósea o sustancia osteoide constituye una tercera parte del peso del hueso, se sintetiza por los osteoblastos. Esta formada de un componente orgánico, el colágeno, del cual el tipo I representa >95% y el tipo V <5%, que le dan forma y capacidad
al hueso para resistir las tensiones, y un componente inorgánico o mineral que le da
su rigidez característica y resistencia a la compresión (Fernández-Tresguerres et al.,
2006; Stevens y Lowe, 2006).
El 90% de la MEC está constituida por colágeno y el 10% de glicoproteínas no colágenas como la osteocalcina, que influye en la organización de la matriz y la mineralización del hueso, la osteonectina implicada en la adhesión celular y la sialoproteína
del hueso. La MEC también tiene los factores de crecimiento, Interlecucinas 1 y 6 y
las proteínas morfogenéticas óseas (Yamaguchi et al., 2000).
La dureza y rigidez del hueso se debe a la presencia de un complejo cristalino de
calcio y de hidróxidos de fosfato (hidroxiapatita). Para que se produzca la mineralización deben existir concentraciones de Ca+ y PO4- por arriba de su umbral, la
osteocalcina fija iones de Ca+ extracelulares aumentando su concentración y la enzima fosfatasa alcalina aumenta las concentraciones locales de iones de Ca+ e iones
de PO4-, los osteoblastos producen vesículas de matriz que pueden acumular estos
iones. Las vesículas de matriz durante la formación del osteoide se separan del osteoblasto por gemación y pasan a la matriz donde forman el sitio de precipitación de la
hidroxiapatita (Stevens y Lowe, 2006).
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
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Factores de crecimiento
Los factores de crecimiento regulan la migración y proliferación celular, teniendo
un rol importante en la regeneración ósea. Los factores de crecimiento más relacionados con la osteogénesis y la formación de hueso, motivo de investigación en este
trabajo, son las proteínas morfogenéticas óseas (bone morphogenetic protein BMP),
factores de crecimiento similar a la insulina (insulin-like growth factor IGF), IGF
1 y el factor transformador del crecimiento de tipo β TGF-β (Transforming Growth
Factor β) sintetizado por las plaquetas y macrófagos el cual estimula la producción de
colágeno y fibronectina (Yamaguchi et al., 2000; Fernández-Tresguerres et al., 2006;
Estrada et al., 2006).
Las BMP son las reguladoras más potentes de la diferenciación de los osteoblastos,
los primeros 4 clones obtenidos de cADN de BMP humano fueron BMP-1, BMP-2A
(BMP-2), BMP-2B (BMP-4) y BMP-3. En la actualidad al menos 15 subtipos de BMP
se han clonado a excepción de BMP-1 que corresponde a la subfamilia de TGF-β (Yamaguchi et al., 2000).
Mecanismos de osificación y remodelado
Son los mecanismos por los cuales el tejido conjuntivo se transforma en hueso,
incluye la proliferación de elementos vasculares para nutrir al tejido conectivo, la
diferenciación de los osteoblastos a partir de los fibroblastos de tejido y la formación
de los elementos intercelulares para permitir el depósito de sales de calcio. En el
embrión la formación de hueso puede ser por dos mecanismos, osificación intramembranosa y osificación endocondral. La primera es la condensación celular a partir
de láminas mesenquimales primitivas, que actúan como membranas formadoras de
hueso, diferenciándose en osteoclastos, la segunda sucede a partir de un molde de
cartílago, las células mesenquimales se diferencian en condroblastos que a su vez
producen la matriz cartilaginosa (Stevens y Lowe, 2006)
El proceso de renovación del hueso se conoce como remodelado, este permite mantener un equilibrio entre las fuerzas mecánicas del hueso, previniendo la aparición
de lesiones por fatiga y asegura el abastecimiento de hueso nuevo. Se produce por
la reabsorción de una cantidad determinada de tejido óseo llevada a cabo por los
osteoclastos quienes excavan un túnel en el tejido, para renovar su composición, los
osteoblastos forman la matriz osteoide para su posterior mineralización y reconstrucción de un hueso nuevo (Garzón et al., 2004). El remodelado permite en condiciones
normales la renovación de un 5 a 15 % del tejido óseo total al año, para fin de garantizar su integridad (Fernández-Tresguerres et al., 2006).
Injertos de hueso
Generalmente la dinámica del remodelado óseo es suficiente para reparar una
fractura y reconstruir defectos comunes o mínimos, sin embargo en casos de desII. Planteamiento
20
trucción masiva del hueso, como las encontradas en tumores, traumatismos graves,
infecciones o defectos congénitos, el tejido dañado no es capaz de regenerase por si
mismo. En estos casos se requiere un injerto o un sustituto de hueso para subsanar
la deficiencia del tejido óseo.
Hoy en día el material más utilizado, es el tejido del propio paciente, por sus propiedades osteoconductivas, que proveen una matriz para que las células puedan proliferar, osteoinductivas, debido a que inducen la proliferación de células indiferenciadas a osteoblastos, y osteogénicas, porque son un deposito de células con capacidad
de formar hueso nuevo (Estrada et al., 2006). Este tipo de tratamiento tiene una tasa
elevada de éxito, pero su gran limitante, es la escasa cantidad de tejido donador que
puede ser tomado, y las dificultades técnicas que pudieran presentarse durante su
extracción, así como el riesgo de infección, y fracturas.
El uso de donantes para la obtención de tejidos, como el aloinjerto, que implica
procesar el hueso de un cadáver, o el xenoinjerto, en donde se utiliza un fragmento de
hueso, obtenido de animales de diferente especie, se restringe por la escasez de fuentes donadoras, la transmisión de enfermedades, los problemas de rechazo por histocompatibilidad, y en el caso del xenoinjerto, por la carencia de células generadoras de
hueso y por los problemas en función de la filogenia (Yélamos et al., 2000; Rivera et
al., 2004; Rincón et al., 2007).
Biomateriales
Tratar la pérdida excesiva de hueso, ha sido uno de los mayores retos de los investigadores, cuando no es factible utilizar injertos para recuperar el hueso dañado,
la ingeniería tisular viene a plantear la posibilidad de utilizar células y materiales
diversos, desarrollando biomateriales como sustitutos biológicos y como alternativa
para regenerar, mantener o mejorar la función del tejido perdido (Estrada et al.,
2006; Rincón et al., 2007).
Por otra parte, el sustituto óseo ideal debe ser estéril, no tóxico, osteoconductivo,
biocompatible, bioabsorbible, disponible en cantidades suficientes, capaz de inducir
la diferenciación de las células osteoblásticas y al mismo tiempo que proporcione un
andamio conductivo, gradualmente reabsorbible para la formación de hueso nuevo
(Rivera et al., 2004; Rincón et al., 2007; Jones et al., 2009; Vachirajov et al., 2009).
La ingeniería tisular se ha venido desarrollando en las últimas dos décadas, realizando cultivos de osteoblastos en un material degradable, antes de implantarlo al
paciente, con la finalidad de obtener matrices que proporcionen estabilidad al hueso,
favorezcan la adhesión, proliferación y diferenciación celular (Jones et al., 2009; Vachirajov et al., 2009).
La demanda de materiales sintéticos se ha incrementado, debido a su capacidad
de regeneración de tejidos; con el fin de crear nuevos sistemas de materiales con
propiedades superiores, diversas nanopartículas se han utilizado como cargas de refuerzo en matrices elastoméricas (Bokobza, 2007). Entre los materiales sintéticos
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
más utilizados están los de las prótesis de dióxido de titanio y sus aleaciones, que
son empleados en prótesis dentales; empero en el organismo humano, se requieren
de materiales que sean flexibles y resistentes a la fatiga (Gutiérrez, 2009; Parada et
al., 2009). Esta necesidad ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas, las vías
de investigación en biomateriales se han encaminado a tres grupos; cerámicas e hidroxiapatita, quitosana, y las matrices de nanotubos de carbono, estos biomateriales
se han estudiado tanto in vitro como en experimentación animal.
Quitosana
La quitosana es un polisacárido obtenido de la desacetilación de la quitina natural,
su estructura es análoga al glucosaminoglicano del hueso, y, por tanto, podría ser utilizado como material de sustitución ósea. Ha llamado la atención por sus características
biológicas favorables; ya que posee una alta densidad de carga, que le permite adherirse a superficies cargadas negativamente, es un biopolímero que puede biodegradarse
en el cuerpo humano, es biocompatible, bioabsorbible, no tóxico, no antigénico, y tiene
propiedades antibacterianas en heridas (Li et al., 2005; Kim et al., 2008).
La superficie del polímero quitosana es hidrófila y por lo tanto promueve la adhesión celular, proliferación y diferenciación, forman capas de fosfato de calcio en la
superficie, con una mínima reacción de cuerpo extraño al implantarse (Manjubala et
al., 2007; Jayakumar et al., 2009;), además ayuda al crecimiento de osteoblastos y
osteoclastos, con cambios mínimos de degradación del material en etapas tempranas
(Jones et al., 2009).Los andamios híbridos de quitosana con un grado de desacetilación bajo promueven la osteoconductividad (Vachirajov et al., 2009).
Sin embargo, a pesar de su aceptación como un material biocompatible, los biomateriales de quitosana son mecánicamente débiles e inestables y son incapaces de mantener una forma predefinida para el trasplante, como resultado de la hinchazón (Li et al.,
2005). La quitosana se ha estudiado como composito con NTC, en donde se ha visto que
el rendimiento y las propiedades de los nanocompuestos son afectados por la compatibilidad interfacial entre el polímero y el nano relleno, es por ello que se necesita modificar
su preparación para mejorar la compatibilidad del composito (Liu et al., 2009).
Ácido poli-L-láctico
El ácido poli-L-láctico (PLLA) es un polímero sintético, semicristalino que se sintetiza mediante la polimerización producida por la apertura del anillo diéster cíclico
del ácido láctico. Este polímero biodegradable y el ácido poliglicólico, se han utilizado como materiales para implantes óseos (Estrada et al., 2006; He et al., 2009). El
PLLA se utiliza ampliamente en material de suturas, e implantes bioabsorbibles por
su capacidad de permitir el crecimiento controlado del tejido biológico durante su
biodegradación controlada, esto abre la posibilidad de utilizarlo en múltiples aplicaciones médicas una de ellas es mejorar la adaptación de los implantes metálicos para
II. Planteamiento
21
22
reducir el tiempo de osteointegración y por su capacidad de bioabsorción evitar una
segunda cirugía para extraer el implante (Parada et al., 2009).
Diversos polímeros naturales y sintéticos están disponibles para aplicarse en ingeniería tisular, pero pueden carecer de integridad mecánica. En los últimos años, se
ha destacado la importancia de los nanotubos de carbono para apoyar el crecimiento
del hueso (Sahithi et al., 2010).
Nanotubos de carbono
Por su parte los nanotubos de carbono (NTC) están entre los materiales más fuertes, y más duros, son materiales con propiedades mecánicas, eléctricas (Gopalan et
al., 2006; Sahithi et al., 2010), ópticas, térmicas y químicas (Feng et al., 2009). La
combinación de estas propiedades ha despertado el interés para usarlos como material de relleno para compuestos de polímeros para mejorar las propiedades de los
materiales (Bokobza, 2007). La producción, caracterización y aplicación de NTC ha
sido motivo de diversas investigaciones en la última década (Loos et al., 2007; Feng et
al., 2009) desde su descubrimiento por Iijima Sumio (Iijima, 1991).
Los biomateriales que contienen polímeros naturales o sintéticos frecuentemente
son colocados adyacentes al hueso, actualmente se analiza el uso de NTC en estos
biomateriales aplicados al hueso, principalmente para mejorar sus propiedades mecánicas y se espera que actúen como andamios para promover y guiar la regeneración
del tejido óseo. Los NTC pueden apoyar el crecimiento de las células osteoblásticas,
dado que no son biodegradables, se comportan como una matriz inerte en el que las
células pueden proliferar y depositar nuevo tejido celular, que se convierte en hueso
funcional (Sahithi et al., 2010).
Los NTC están constituidos por átomos de carbono dispuestos en una red hexagonal cilíndrica, sus extremos pueden estar abiertos o pueden estar cerrados por media
esfera de fulereno, están unidos por fuerzas de Van der Waals, o mezclándose con
otros materiales para formar nanocompuestos. Debido a que el tejido óseo está compuesto de fibras de colágeno e hidroxiapatita, los NTC inducen el crecimiento de los
cristales de hidroxiapatita y posiblemente atraen los iones de calcio para promover el
proceso de cristalización, dando una mayor resistencia, flexibilidad y biocompatibilidad (Rivas et al., 2007), por lo tanto tienen un gran potencial para ser utilizados en
ingeniería tisular para la regeneración ósea.
La combinación de NTC y biopolímeros para producir materiales compuestos con
propiedades superiores ha sido de gran interés. Hasta la fecha, los desafíos son lograr
la dispersión homogénea de los NTC en una matriz polimérica y una excelente adhesión de interface entre dos componentes. Las estrategias incluyen el uso de nanotubos
de carbono de pared múltiple (MWNT) como relleno conductor en el aislamiento de
matrices poliméricas y como refuerzos en materiales estructurales (Feng et al., 2009).
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
23
Biomateriales compuestos
En los compositos de polímeros, la dispersión de relleno, y las interacciones interfaciales son los parámetros cruciales para mejorar las propiedades mecánicas, la escasa dispersión y unión interfacial limitan la plena utilización de NTC para reforzar
los polímeros, haciendo necesario optimizar las condiciones de transformación para
lograr una buena dispersión y buenas interacciones con las cadenas del polímero,
esto podría hacerse mediante la introducción de un agente de acoplamiento capaz de
reaccionar con las dos fases (Bokobza, 2007).
El uso de biopolímeros, reforzados con nanotubos de carbono, ha sido un desafío,
debido a las dificultades para lograr una buena dispersión y transferencia de carga.
Para mejorar esta dispersión se han intentado varias técnicas, entre ellas el uso de
surfactantes, sonicación (Xie et al., 2004; Ramanathan et al., 2005), coagulación, oxidación o funcionalización química de la superficie del tubo (Bokobza, 2007). Uno de
los mayores retos es obtener una dispersión homogénea de los nanotubos de carbono
en una matriz polimérica, porque las interacciones de Van der Waals entre los tubos
individuales a menudo conducen a una significativa gregación o aglomeración. Hasta
la fecha, a pesar de que se ha avanzado en las técnicas de procesamiento, la mejora
mecánica provocada por la incorporación de nanotubos sigue siendo menor, con respecto a los potenciales en sí de las propiedades de los nanotubos (Bokobza, 2007).
Es de particular interés en la medicina regenerativa, y en la ingeniería tisular, el
desarrollar un material poroso útil como andamio, que imite las propiedades naturales
de la matriz extracelular, en términos de estructura, composición química y mecánica,
además que favorezca el crecimiento sostenido de las células osteoblásticas (Abarrategi
et al., 2008; Sahithi et al., 2010), y que puedan mejorar la absorción de proteínas y subsecuentemente la adhesión celular. Además, los condrocitos tienden a la desdiferenciación, presentando cambios fenotípicos durante su crecimiento in vitro, por lo tanto, el
mantenimiento de un fenotipo condrocítico es realmente difícil (He et al., 2009).
Las matrices de nano polímeros desempeñan un papel fundamental en proveer apoyo y anclaje para las células, manteniendo el fenotipo de condrocitos, fomentando su
crecimiento así como la síntesis de la matriz. El éxito de la ingeniería tisular depende de
la formación de éstas matrices que permitan el soporte necesario a las células para que
proliferen y mantengan sus funciones y señales biológicas requeridas para conservar y
expresar los genes específicos en el tejido óseo (Rincón et al., 2007; He et al., 2009).
Por ello, este estudio se enfoca en la caracterización mecánica , morfológica y
de compatibilidad de los compositos de quitosana/ácido poli-L-láctico reforzados con
nanotubos de carbono, mediante el análisis de expresión génica de los factores de
crecimiento y valoración de la correcta integración del biomaterial, de tal manera que
permita regenerar y mantener el tejido óseo.
II. Planteamiento
24
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
III. Metodología
L
Materiales
a técnica para trabajar en el laboratorio será en condiciones completamente
estériles, utilizando alcohol al 70% como desinfectante de las superficies
de contacto, además de usar bata, guantes y cubre bocas. El instrumental
(pinzas, bisturí, pipetas, puntas de pipetas) medios de cultivo y recipientes
(placas de petri, multiplacas, tubos) serán esterilizados por autoclave (Harvey). Se
trabajará bajo campana de flujo laminar horizontal (Fisher Hamilton Type II A1, modelo 541924), para asegurar condiciones de asepsia, manteniendo un ambiente estéril, libre de partículas y posibles contaminantes (bacterias o levaduras) que pudieran
introducirse a las células cultivadas.
El medio para cultivar los osteoblastos será α-MEM (Alpha Minimum Essential
Medium) que contiene ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y L-Glutamina, al cual
se le adicionará suero fetal bovino (FBS) al 10%, gentamicina-penicilina al 3% como
antibiótico, β-glycerolfosfato 3mM y 10 µg/mL de ácido ascórbico.
Síntesis de soportes poliméricos
Los MWCNTs fueron obtenidos por pirolisis de una mezcla de ferroceno/benceno
dentro de un tubo de cuarzo en el centro de estudios de materiales avanzados, CIMAV
(Chihuahua, México) por Aguilera y col. (2006). Ahora bien, material compuesto al
que se le añadió un porcentaje de MWNTs fue fabricado a partir de una matriz de
chitosan/PLLA, La matriz es obtenida por la técnica de separación de fases térmicamente inducida (por sus siglas en ingles TIPS)
Dicha matriz se ha obtenido por cuatro etapas. El primer paso, se prepararon los
reactivos de chitosan y PLLA disolviéndolos, ácido acético al 2% y cloroformo respectivamente, posteriormente se adiciono los MWNTs a la solución de chitosan, ahora se
procede a la integración de dichas soluciones, el PLLA se agrega en cantidades de 0.5 ml
cada 3 min. hasta integrar bien ambas fases. En segundo paso, se somete a congelación
25
26
por 2hrs (-78 oC) y liofilización (-80 oC) por 48hrs. El tercer paso, se procede a la neutralización del soporte agregando una mezcla de solución acuosa de NaOH - CH3CH2OH
(80% etanol con 0.5 % en peso de NaOH) a -20oC por 12 horas. El cuarto pasó, se procede
hacer lavados en agua destilada y posteriormente deshidratado por liofilización.
Análisis estructural
La morfología fue analizada en un microscopio de escaneo de electrones por emisión de campo (FESEM) JEOL JSM-7000F; las muestras fueron secadas previamente
por 3 días a temperatura ambiente en una estufa de vacío (-677 mbar). El tamaño de
poro y la distribución de poro fueron medidas usando Scandium Universal SEM Imaging Platform software (Soft Imaging System) desde las imágenes FESEM en magnificación original. Se utilizaron tres diferentes secciones transversales de los soportes
para estimar el tamaño de poro y al menos se midieron 120 poros para estimar la
distribución. Los compositos secos fueron congelados en nitrógeno líquido y cortados
en pequeñas piezas (5 mm x 5 mm x 10 mm) con una navaja para obtener la sección
transversal para su análisis en FESEM. El voltaje eléctrico fue controlado a 1.0 kV.
Análisis térmico
El análisis termogravimétrico (TGA) de los compositos de quitosana/PLLA y quitosana/PLLA/NTC fue desarrollado en un instrumento SDT Q600 de TA Instruments
(Estados Unidos). Las muestras secas fueron calentadas desde temperatura ambiente hasta 750o C a 5oC/min en una atmósfera de nitrógeno a una velocidad de flujo de
160mL/min. La primer derivada del cambio de masa con respecto al tiempo (DTG)
fue calculada y graficada como una función de la temperatura. Las mediciones por
escaneo calorimétrico diferencial fueron llevadas a cabo en un instrumento Netzsch
DSC 200 PC (Alemania). Con la finalidad de borrar el historial térmico de todas las
muestras primeramente fueron calentadas desde temperatura ambiente hasta 260º
C a 20oC/min. Posteriormente, fueron enfriadas desde 260oC hasta -20oC a la misma
temperatura a una velocidad de 20o C/min. Finalmente, fueron calentadas desde
-20o C hasta 260o C a 10o C/min en una atmósfera de nitrógeno. El instrumento de
análisis reométrico RSA III (Rheometrics Analyzes System) TA fue utilizado para
hacer un barrido de temperatura a una frecuencia de 6.2832 rad/s y en un rango de
temperatura de 35.0o C hasta 300o C, para todas las muestras. Discos de aproximadamente 5 mm de espesor y 15 mm de diámetro fueron utilizados en todos los experimentos. Las muestras fueron montadas en una prensa de compresión.
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Análisis de propiedades mecánica
La resistencia a la comprensión mecánica y el modulo de los soportes serán obtenidos mediante pruebas de esfuerzo-deformación realizadas a 40ºC a una velocidad
de comprensión de 0.001mm/s. hasta alcanzar un 30% de su altura original. Las probetas tendrán una medida estándar de 13mm de diámetro por 12 mm de altura. El
equipo es un instrumento RSA III (Rheometrics System Analyzes) TA. En un rango
de frecuencia de 1X10-6 a 80 Hz. P.
Criterios de inclusión para cultivos celulares
Se utilizarán para la extracción de tejido óseo, crías de rata de cepa Sprague
Dawley en estadio neonatal de 14 días de nacidas, debido a que tienen una capacidad
proliferativa elevada, las ratas provendrán de hembras en edad reproductiva, del
bioterio de la UACJ. Utilizaremos la calvaria para extraer los osteoblastos, y realizar
los cultivos primarios, específicamente del hueso frontal y ambos huesos parietales,
que se encuentran cubriendo la porción superior y lateral de la calvaria.
Obtención de las muestras
Las ratas serán sacrificadas por decapitación siguiendo las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio de la Norma Oficial Mexicana. NOM-062-ZOO-1999 (SAGARPA 2001), solicitando además la autorización del comité de bioética para el uso de animales de investigación de la UACJ.
Las crías de rata serán anestesiadas colocándolas en un frasco conteniendo algodón impregnado con cloroformo, posterior al efecto anestésico serán decapitadas
y con una hoja de bisturí se realizará una incisión media sobre la piel de la cabeza
desde el hueso frontal hasta la base del cráneo, retirando la piel, posteriormente se
realizará una incisión con unas tijeras, circundando el hueso frontal y los parietales
para extraer la calvaria, una vez extraída será depositada en una caja de petri con
abundante solución PBS 1X y con la ayuda de pinzas de disección se limpiará la calvaria retirando el periostio sin salir de la solución PBS 1X ni de la campana de flujo
laminar, una vez limpia la calvaria se le harán múltiples cortes longitudinales y horizontales para disminuir su tamaño.
Cultivo celular
Para el aislamiento y cultivo de osteoblastos de calvaria de rata, se utilizará la metodología desarrollada en el Instituto de Ciencias Biomédicas de la UACJ (Gutiérrez,
2009). A los fragmentos obtenidos de la calvaria se le realizarán lavados con solución
III. Metodología
27
28
PBS 1X, tantas veces como sea necesario, para eliminar células sanguíneas, tejido conectivo y otras células diferentes a las del tejido óseo. Posteriormente se hará la digestión con enzimas utilizando una solución previamente esterilizada y oxigenada de colagenasa tipo I en PBS (2.5mg/mL), al terminar la digestión se llevará a cabo la disgregación celular mecánicamente mediante pipeteo y maceración de las piezas de hueso.
Se hará una centrifugación del contenido de la extracción a 200 g por 5 minutos
a 35oC, recolectando el sobrenadante en un matraz de Falcon y agregando dos volúmenes de medio α-MEM adicionado con FBS y penicilina-estreptomicina colocándolo
en un matraz de Falcon y se dejará incubar. Una vez incubado el precipitado tendrá
otro proceso de disgregación y posteriormente pasará a una centrifugación a 200 g
por 15 minutos, retirando el sobrenadante y el precipitado será resuspendido en 5mL
de medio α-MEM (adicionado con FBS, penicilina-estreptomicina, ácido ascórbico y
β-glicerofosfato), colocándolo en un frasco de cultivo y se incubará a 37oC con 5% de
CO2 y 95% de O2.
Para el mantenimiento del cultivo primario de los osteoblastos se realizará recambio de medio cada tercer día, retirando 100 μL de la parte más superficial y agregando 100 μL de medio fresco. Los cambios de medio de cultivo se realizarán en campana
de flujo laminar bajo condiciones de asepsia.
Recuento celular
Las células osteoblásticas serán observados en el microscopio invertido a 400x,
utilizando el método de recuento en la cámara de Neubauer. Las células serán transferidas con una micropipeta penetrando por acción capilar. Primero se ubicará la
cuadricula central para poder visualizar enseguida los 25 cuadros a 400x, se contarán
las células presentes en 5 campos aleatorios, cuadro por cuadro, delimitados por tres
líneas, que son fundamentales en el momento del conteo pues definen cuales células
son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la
segunda línea se contarán, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Después
de contar las células se calculará el número de células por unidad de volumen. Se promediará el número de células de la cámara de arriba con la de abajo, se multiplicará
por el factor de dilución y por un factor F igual a 104, este valor se multiplica por la
cantidad de mililitros de medio, esta cantidad se expresa en µL.
Cantidad de células = (10,000) (Factor de dilución) (células contadas)
Siembra de osteoblastos en los compositos
Los soportes se esterilizarán con etanol al 70% por 30 minutos y con luz UV por
30 minutos seguido de secado en condiciones estériles a temperatura ambiente por 2
horas. Cada andamio se sembrará con los osteoblastos y se observará la proliferación.
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
A los 10 días de cultivo se agregará un coctel osteogénico que contiene dexametasona,
ácido ascórbico y β-glicerofosfato para inducir la osteogénesis.
Biocompatibilidad
El análisis de biocompatibilidad in vitro del material tiene por objetivo evaluar la
adhesión y proliferación celular y citotoxicidad en los compositos. La adhesión y la
proliferación son comportamientos celulares indicadores de la funcionalidad celular.
Adhesión celular
La adhesión a la superficie es un factor crítico en la respuesta celular, porque determina que células poblaran la superficie, proveyendo un conjunto de células para
la proliferación, que influirá en la morfología y diferenciación de osteoblastos. Para
estudiar el grado de adhesión celular, las células adheridas se desprenderán con tripsina, una enzima que rompe los enlaces entre la membrana celular y la superficie
de crecimiento que permite separar las células de su soporte y entre sí y las células
se contaran utilizando la cámara de Neubauer. El número de células adheridas a la
superficie del polímero se expresará como el porcentaje del total de células que originalmente se sembraron en cada una de las muestras. La adhesión celular se evaluará
a través del recuento de las células que permanezcan en la superficie del composito a
1 y 4 horas de cultivo celular.
Proliferación celular
Para cuantificar la proliferación celular sobre la superficie de los polímeros, se
aplica un método espectrofotométrico utilizando el reactivo azul de Alamar, la cuantificación se hará al día 3, 7, 14 y 21 de cultivo celular. El grado de proliferación se
determinó mediante la medida de absorbancia a longitud de onda de 570 nm correspondiente a la densidad óptica de la forma reducida del reactivo azul de Alamar. Este
reactivo mide la actividad metabólica celular por reacción colorimétrica producida
por el metabolismo de oxido-reducción, el reactivo cambia de color en respuesta a una
reducción química de medio por el crecimiento celular. Cuando las células están en
crecimiento, su actividad metabólica resulta en una reducción del reactivo alamar
Blue (color rojo), mientras que una inhibición de la proliferación celular mantiene al
reactivo en su forma oxidada (azul).
Citotoxicidad
Se evaluará si los monómeros empleados para la síntesis de los distintos biomateriales, son tóxicos para las células osteoblásticas, debido a la posible liberación de
III. Metodología
29
30
componentes nocivos que puedan afectar cuantitativa o cualitativamente al cultivo
celular u ocasionar la muerte de las células que lo constituyen. La citotoxicidad será
evaluada por el ensayo MTT, una sal de tetrazolio que mide la actividad de la enzima
mitocondrial succinato deshidrogenasa en la reducción del compuesto MTT (colorante amarillo pálido, soluble en agua), reducido a un precipitado púrpura de cristales
de formazán en la mitocondria de células vivas (cristales azul violeta, insoluble en
agua). Este ensayo está directamente relacionado con el número de células viables
metabólicamente activas dentro del cultivo, por lo que midiendo el aumento de absorbancia debida a la formación de dicho compuesto se puede monitorizar la viabilidad
y actividad bioquímica de un cultivo. Se cuantificará espectrofotométricamente a 570
nm. Como control positivo se añadirá al medio 0,02%v/v de SDS (dodecil sulfato de
sodio) que es una sustancia tóxica y representa el 100% de mortalidad de las células.
Para el control negativo se usará el medio de cultivo.
Valoración de morfología y calcificación celular
Para evaluar la morfología de los osteoblastos a los 3, 7, 14 y 21 y la calcificación a
los 21 días del cultivo celular, mediante el uso de microscopía electrónica de barrido
SEM (Joel JSM7000F), utilizando los detectores de electrones EDS (espectrómetro
de dispersión de energía) y BSE (detector de retrodispersión de electrones). Las células del cultivo serán fijadas a temperatura ambiente con 1% y 3% de glutaraldehido
(fijador celular) por 1 y 24 horas, respectivamente, posteriormente los matraces que
contengan las células, serán deshidratados secuencialmente utilizando series de etanol de 50, 70, 90, 95 y 100% por 10 minutos cada uno, se dejará secar toda la noche y
se visualizarán por SEM.
Producción de matriz y mineralización
Para investigar la capacidad osteogénica de los compositos se evaluará a los 21
días de cultivo la producción de matriz extracelular y la mineralización, midiendo
la formación de nódulos óseos mineralizados y depósitos de calcio. Esto será realizado, reemplazando el medio de cultivo con 1 ml de medio sin suero, con albúmina al
1%, suplementado con 1,25-dihidroxivitamina D3 (vitamina D3 ®10-9 M (Sigma) y
vitamina K (Konakion ®10­-8 M), para disolver la vitamina D3 se usará etanol. Los
cultivos serán incubados durante 48 horas y posteriormente almacenado a –80 °C
hasta llevar a cabo el ensayo. (Messeguer-Olmo, et al., 2006). Se utilizara la tinción
con rojo de alizarina, después de un tratamiento con vitamina D3. La mineralización
se observará en microscopio invertido (400x) por una coloración roja intensa.
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Análisis de expresión
de marcadores moleculares
Para cuantificar los niveles de expresión de los genes y establecer la asociación de
los genes estimulados en la regeneración tisular, se tomarán células mantenidas en
el control y en los composito, que serán cosechadas en diferentes intervalos de tiempo,
mediante el análisis semicuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Evaluando la actividad de la fosfatasa alcalina al día 7, 14, y 21 del cultivo celular,
además de los perfiles de expresión de mRNA del factor de crecimiento transformante β (TGF-β), osteonectina (SPARC), osteocalcina (BGLAP), sialoproteína (BSP) y
colagenasa tipo 1 (COL1A1). Los niveles de expresión de los genes se normalizaran a
la expresión del gen constitutivo gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
Análisis estadístico
Las mediciones se harán por triplicado expresando la media ± desviación estándar, se hará el análisis de varianza ANOVA para comparar los promedios entre los
grupos. Para evaluar la significancia del efecto de la densidad de la siembra celular
sobre el porcentaje de adhesión celular después del cultivo celular se utilizará el método de t-student, considerando como significativo un valor de p <0,05.
III. Metodología
31
IV. Resultados
L
Morfología de los compositos
a Figura 1 muestra la morfología de los compositos liofilizados y neutralizados, donde se puede apreciar una estructura porosa presente principalmente en los planos profundos del soporte y pequeños poros en la superficie.
A altas magnificaciones se puede ver una estructura poroso con una alta
interconexión (poros <10 µm). Los mesoporos son importantes para proveer un medio
que estabilice las actividades enzimáticas por largos periodos de tiempo (Cooney, et
al., 2008). Al menos 20 % de los poros deben ser más pequeños de 20 µm, debido a que
una estructura porosa de menos de 1 µm de diámetro es importante para la interacción de proteínas y la bioactividad, y estructuras porosas de 1 µm-20 µm para el desarrollo celular, tipos de células atraídas y orientación y direccionalidad del crecimiento
celular (Sánchez-Salcedo, et al., 2008). La Figura 2 muestra este tipo de porosidad
interna en los compositos Quitosana/PLLA/NTC. Aunque otras investigaciones han
tratado de combinar quitosana y un láctido en una mezcla, la morfología muestra
una separación de fase visible microscópicamente entre las sustancias, mostrando
un gran número de pequeñas esferas de láctido dispersas en la matriz continua de
quitosana (Wan, Wu, et al., 2007; Wan, Fang, et al., 2007). En este trabajo no hay una
separación de fase visible entre el láctido y la quitosana.
Las condiciones de proceso son elementales para controlar la separación de fases.
Además, la temperatura de enfriamiento define el tamaño de poro. Se pueden preparar fácilmente soluciones de quitosana del 0.5% al 2.0 wt% c usando ácido acético en
solución acuosa al 1.0 % (v/v) y ser congeladas en un amplio rango de temperaturas
de al menos 10º C. Sin embargo, cuando la quitosana es mezclada con la solución de
PLLA-cloroformo, la temperatura de fusión se restringe. Primeramente, las muestras no pueden ser congeladas usando temperaturas más altas de -70o C debido a
la combinación de las concentraciones y al punto de fusión del cloroformo (-63.5o C).
Si las mezclas no son congeladas inmediatamente después de preparadas, los componentes se precipitan durante el proceso de congelamiento. Por estas razones, se
utilizó hielo seco para evitar estos problemas. Durante los experimentos, se utilizó
33
34
nitrógeno líquido para analizar el efecto de las bajas temperaturas en la porosidad.
Sin embargo, debido a los problemas de la concentración del polímero, el proceso
se ubicó en la región metaestable de bajas concentraciones de polímero y pequeñas
gotas de polímero de la fase rica en polímero se formaron y dispersaron en la matriz
de baja concentración del polímero, lo que resultó que al remover el solvente, se
crearan pequeñas esferas poliméricas. Consecuentemente, no fue posible controlar
la porosidad a través de la temperatura.
La morfología de los soportes, depende de la manera en la cual la separación
entre los solventes y los polímeros tiene lugar. En este sistema, bajo las condiciones descritas, se formó una separación líquido-sólido. El cloroformo es miscible en
ácido acético, pero no en agua. En la mezcla el mayor componente corresponde a
agua, entonces es posible que el agua tenga una gran influencia en la forma de los
cristales. Mientras el cloroformo y el ácido acético se mezclan, a temperaturas de
congelamiento el agua se separa de la quitosana formando cristales alrededor de los
cuales se precipita el polímero. Durante los experimentos, se observó que la solución
ácido acético-agua-cloroformo-polímeros tenía un punto de fusión más alto que la
solución PLLA-cloroformo, debido a que los compositos podían ser congelados a -78º
C mientras que la solución láctido-cloroformo no. Además, el ácido acético causa un
descenso en la temperatura de fusión del agua, lo que provoca que también el gradiente de temperatura y la velocidad de crecimiento de cristales disminuya (Cooney,
et al., 2008). La forma de los cristales definirá el tipo de porosidad y el tamaño de
poro obtenido; es decir, la estructura porosa interna será similar a la geometría de
los cristales del agua cuando hayan sido totalmente sublimados.
En este proceso, es muy importante definir el proceso de separación térmica dominante, para entender cómo crecerán los cristales. Esto es, si el proceso es dominado
por masa o transferencia de calor. En este sentido, ha sido reportado que debajo de
-50o C el proceso dominante para sistemas acuosos de quitosana es transferencia de
calor (Roh & Kwon, 2002; Cooney, et al., 2008). La principal diferencia entre estos
procesos está relacionada con el tipo de porosidad que es producida. Cuando el proceso dominante es transferencia de masa, el crecimiento de los cristales es definido
por procesos difusionales, por lo que el crecimiento será direccionalmente homogéneo y los cristales formarán esferas. Por otro lado, cuando el proceso dominante es
transferencia de calor, el gradiente térmico es grande y si es direccional, la velocidad
difusional de las moléculas de agua de los cristales de hielo será más grande en dirección de los gradientes térmicos. Como resultado de este proceso, el tipo de cristales
serán hojas delgadas en capas de hielo con la dirección del gradiente térmico aplicado. Sin embargo, como se muestra claramente en la Figura 3 f, la porosidad podría
ser alcanzada, pero alargada en la dirección del gradiente térmico.
Por otro lado, también el gradiente térmico afecta la forma de los cristales desde
la superficie hasta partes internas del composito. Usualmente los cristales crecen de
la superficie al centro. Esta idea fue probada, midiendo el tamaño de poros a diferentes profundidades de la superficie al centro. Se encontró un tamaño de poro más
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
uniforme y más grande en el centro que en la superficie como lo muestra la Figura 1
para la quitosana y los compositos quitosana/PLLA.
Es importante recordar que una limitación de este estudio fue que la velocidad de
enfriamiento fue relativamente grande, debido a que las muestras fueron fabricadas
a 40º C aproximadamente, y después de su punto de gelación se congelaron con hielo
seco. Como consecuencia, los cristales fueron de un tamaño muy pequeño, debido a
que la velocidad de congelamiento es inversamente proporcional al tamaño de poro
obtenido (Hsieh, et al., 2007; Yuan, et al., 2009).
IV. Resultados
35
36
Figura 1. Imágenes de SEM de (a) quitosana al 2 % wt% en solución acuosa de ácido
acético al 1% y compositos Ch/PLLA (b) 1% NTC, (c) 2% NTC y (d) 3%NTC en concentraciones 2%/5% en solución acuosa de ácido acético y cloroformo, respectivamente.
a
b
e
c
f
d
g
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Figura 2. Compositos Ch/PLLA (a) 1%NTC y (b) 5%NTC a concentraciones
de 2%/5% en solución acuosa de ácido acético y cloroformo respectivamente.
a
b
Figura 3. Imágenes de SEM de (a, b, c) quitosana al 2 % en solución acuosa de ácido acético y (d, e, f) composito C h/PLLA 1%NTC y (g, h, i) 5% NTC
Ch/PLLA a concentraciones del 2%/6% en solución acuosa de ácido acético y
cloroformo respectivamente en la superficie, con cortes transversales a un
cuarto de la superficie y a una mitad de la superficie.
a
b
c
d
e
f
g
h
i
IV. Resultados
37
El tamaño de poro fue calculado midiéndolos en las imágenes de SEM. Cada soporte fue cortado en tres secciones transversales para observar la superficie, y a un
cuarto y una mitad de distancia de la superficie para analizar los rangos de los tamaños de poros.
La Tabla 1 muestra los tamaños de poros que fueron medidos usando las imágenes de SEM en magnificación original. No se obtuvo un promedio de tamaño de poro,
debido a que la dispersión era muy grande entre ellos.
La forma típica de esponja después de liofilizar a un composito de quitosana y
PLLA se muestra en la Figura 4. La figura muestra un composito redondo obtenido,
pero con un corte en una de sus orillas.
Figura 4. Forma de composito típico de quitosana y PLLA después de la
liofilización.
Tabla 1. Porosidad y distribución del tamaño de poro para los compositos
quitosana/DL PLG con una concentración del 2 % wt % de quitosana en una
solución acuosa de ácido acético y 5 % (%w/v) de DLPLG en cloroformo.
Rango del tamaño de poro (μm)
Composito
(Ch/PLLA)
Quitosana
-
Ch/PLLA/NTC 0.64-57.97
Porosidad
38
Distribución del tamaño de poro
1≤
(μm)
1-5
(μm)
5-10
(μm)
10-50
(μm)
50-100
(μm)
>100
(μm)
0.48-506.03
1.45-279.24 81% 0.00% 13.11% 9.84% 28.69% 15.57% 32.79%
0.70-573.20
0.47-517.95 73% 13.33% 37.33% 4.67% 22.00% 12.00% 10.67%
Análisis de las propiedades mecánicas
Las pruebas de esfuerzo de tensión miden la resistencia de un material a la aplicación de una fuerza estática o gradualmente aplicada. Esta prueba se efectúa aplicando una carga F a una probeta del material con la finalidad de medir el alargamiento
o deformación causado en el material por la aplicación de dicha fuerza (Askeland,
1998). Las pruebas de esfuerzo-deformación a compresión son muy similares a la
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
anterior, excepto que la fuerza es de naturaleza compresiva y la muestra se contrae
en la dirección del esfuerzo. Estas pruebas son utilizadas cuando el material tenga
un comportamiento de deformaciones grandes y permanentes, como son aplicaciones
de manufactura o cuando el material es muy quebradizo a tensión (Callister, 2007)
El esfuerzo de compresión ingenieril (σ) se define como:
σ=
F
Ao
Donde F es la carga aplicada instantánea aplicada perpendicular a la muestra en
newtons (N) y Ao es el área transversal de la muestra antes de que cualquier carga
haya sido aplicada en metros cuadrados (m2). Las unidades del esfuerzo de ingeniería son megapascales (MPa), en el sistema internacional (Callister, 2007).
Por otro lado, la deformación ingenieril (ε)se define como:
ε=
li - lo
lo
=
∆l
lo
En donde lo es la longitud original antes de que cualquier carga haya sido aplicada, li es la longitud instantánea. ∆l es la deformación o cambio de longitud en un instante. La deformación usualmente se expresa como un porcentaje (Callister, 2007).
El módulo está íntimamente ligado con la energía de enlace de los átomos. Una
pendiente muy acentuada o abrupta indica que se requieren grandes fuerzas para
separar a los átomos y hacer que el material se deforme elásticamente. El módulo
es una medida de la rigidez del material. Un material rígido, con un alto módulo de
elasticidad, conserva su tamaño y forma incluso al ser sometido a una carga en la
región elástica (Askeland, 1998).
Para el análisis de las pruebas mecánicas se utilizó un instrumento RSA III (Rheometrics System Analyses) TA en modo estático. Cada muestra fue colocada en el
plato inferior, mientras que el superior fue puesto sobre la muestra para darle una
ligera compresión y ser asegurada en el lugar. Las gráficas esfuerzo-deformación
fueron obtenidas a través de este procedimiento.
El análisis de esfuerzo de compresión fue efectuado a 37º C a una velocidad de deformación de 0.005 mm/s. Los compositos fueron cortados en piezas circulares con 25 mm
de diámetro y alrededor de 10.0 mm de espesor. Al menos dos muestras de cada composición fueron medidas y los resultados fueron promediados. El modulo de compresión
fue definido como el modulo lineal inicial, que da la elasticidad inherente del material,
y el esfuerzo de compresión a una deformación del 10 % fue registrado como σ10.
Para la realización de este estudio, se utilizó un instrumento de análisis mecánicodinámico (DMA). Las técnicas DMA son un útil complemento para los métodos mi-
IV. Resultados
39
40
croscópicos para morfología y las investigaciones de microestructura para los polímeros compuestos (Liu, et al., 2004).
El PLA, incluyendo Poli(D,L,láctido) (PDLLA) y Poli(L,láctido) (PLLA) tiene altas
propiedades mecánicas con una completa biodegradabilidad y biocompatibilidad que
los hacen adecuados para utilizarse en aplicaciones biomédicas, de agricultura y empaque. No obstante, la fragilidad y rigidez del PLA restringen su uso. El comportamiento
cristalino de este material influencia las propiedades mecánicas de estas sustancias.
Por ejemplo, las propiedades mecánicas del PDLLA restringen su aplicación en la regeneración de nervios, debido a que es más rígido y quebradizo que los tejidos nerviosos.
Las propiedades mecánicas a compresión de los soportes porosos utilizados en ingeniería tisular son de particular importancia debido a que están ligados a una persistencia en la forma y durabilidad en aplicaciones prácticas. La Figura 5 muestra las curvas
esfuerzo-deformación para la quitosana y los compositos Ch/PLLA/NTC. La información obtenida de estas curvas es mostrada en la Tabla No. 2. El composito conteniendo
10% de NTC mostró un módulo grande indicando que es un material más resistente
que el composito Ch/PLLA y los compositos conteniendo menores porcentajes de NTC.
Figura 5. Gráfica esfuerzo-deformación para los compositos Ch/PLLA/NTC.
Con el aumento de contenido de NTC en los compositos Ch/PLLA/NTC, el módulo
elástico varía desde 42232 hasta 109574 Pa Estos resultados muestran que las propiedades mecánicas de la quitosana, en cuanto a la regeneración de hueso, son mejoradas con la mezcla de Ch/PLLA/NTC La mezcla con el menor módulo elástico fue la
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Ch/PLLA/2%NTC, pero incluso así fue más alto que el de la Ch/PLLA. Estos resultados muestran que los compositos podrían ser útiles para la ingeniería tisular.
Tabla No. 2 Propiedades mecánicas de los compositos Ch/PLLA/NTC
Composito
Módulo elástico
(E) (Pa)
Ch/PLLA
Ch/PLLA/2%NTC
Ch/PLLA/5%NTC
Ch/PLLA/10%NTC
30,562
44,250
42,232
109,574
Esfuerzo de
compresión (Pa)
5.89 x 105
7.28 x 105
6.68 x 105
7.33 x 105
Deformación al
esfuerzo máximo %
22.985
21.542
20.239
10.247
σ10 (Pa)
1.77 x 105
1.07 x 105
1.73 x 105
7.33 x 105
Resultados de análisis génicos
Caracterización morfológica de los osteoblastos aislados
Para la caracterización morfológica de osteoblastos, se observaron los platos petri
que contenían los resultados del aislamiento en un microscopio de fase invertida.
Inicialmente, la célula flota en la solución de cultivo y posteriormente se hunde y
se extiende. Después de 24 h, muchas células se han adherido al fondo del plato de
cultivo, mostrando su forma de triángulo o polígono (Figura 5). Cuando las células
son confluentes, pueden crecer juntas y sobreponerse formando nódulos semejantes
a una piedrita. Después de 2 semanas, con el depósito de calcio y colágeno, los nódulos de las células se vuelven fotosensibles (Alberts, 2002). De igual manera, en las
imágenes se pudo apreciar al núcleo celular con citoplasma que muestra las clásicas
extensiones de estas células denominadas filopodios.
Figura 5. Caracterización morfológica de los osteoblastos de cráneo de
Rattus Norvegicus Albina obtenidos por cultivo primario a 40X.
a
b
IV. Resultados
41
42
A través del uso de la fosfatasa alcalina, se pudo constatar de la misma manera
que los osteoblastos se estaban diferenciando, adquiriendo un color amarillo muy
oscuro al reaccionar con el reactivo al detectar la presencia de la enzima. Esto se
puede ver en la Figura 6. A través del uso de este indicador, se observó la membrana
celular, con un color más oscuro.
Figura 6. La figura muestra los osteoblastos que han iniciado su proceso
de diferenciación a osteocitos (puntos de un amarillo oscuro que tiende a
café) a los 14 días de cultivo. Las imágenes fueron tomadas a 10X.
a
b
c
De igual manera, a través del uso del reactivo denominado rojo de alizarin, se
pudo verificar la existencia de nódulos de calcificaciones a los 21 días de cultivo de los
osteoblastos, lo que indica que algunos de ellos ya se encontraban en fase de mineralización de la matriz extracelular. Estos resultados se pueden ver en la Figura 7. En
esta figura es posible observar nódulos muy rojos que indican la existencia de calcio.
Mientras la parte a y b muestran las calcificaciones existentes en los cultivos a los 21
días, a una mayor ampliación (Figura 7c) se pueden ver las mismas calcificaciones,
así como la manera en que las células se van uniendo con pequeñas fibras de colágeno, empezando formar la matriz extracelular.
Figura 7. Calcificación en los cultivos primarios de osteoblastos. Las imágenes a y b se muestran a 10X y la c a 40X.
a
b
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Es importante mencionar, que con el propósito de inducir la mineralización, los
medios de cultivo fueron enriquecidos con β-glicerol fosfato y ácido ascórbico (Ciapetti, 2003). Se sabe que aunque haya cultivos en donde la mineralización ya esté
presente, el β-glicerol fosfato no sólo la induce, sino que la acelera (Anagnostou, et
al., 1996). No obstante, el rol exacto de los fosfatos inorgánicos no se conoce hasta el
momento (Ciapetti, 2003).
Otro de los métodos utilizados para la caracterización morfológica de los osteoblastos, fue a través del uso del microscopio electrónico de barrido (SEM). Este procedimiento permitió confirmar tanto la existencia de los osteoblastos, como de las calcificaciones producidas por los mismos (Figura 8). De igual manera, este procedimiento
permitió observar la morfología de las células individuales (Figura 9 ). La Figura 9
también muestra la morfología de los osteoblastos en los platos de cultivo en diferentes
tiempos.
Figura 8. Células individuales observadas en microscopio electrónico de
barrido (SEM).
IV. Resultados
43
44
Figura 9. Imágenes de los cultivos en platos de cultivo de los osteoblastos
a a) y b) 3 días, c) y d) 7 días, e) y f) 14 días y g) y h) 21 días.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Curva patrón
45
Para medir la proliferación se utilizó una curva de calibración a 570nm; explicando con un 95.29% de coeficiente de correlación, las concentraciones de osteoblastos
en el biomaterial, por una relación lineal con la absorbancia obtenida en la lectura.
En la tabla 1 y figura 1 se representa la recta patrón para cuantificar el número de
células proliferadas.
Tabla 1. Lectura espectrofotométrica a longitud de onda de 570 nm, del
pozo en blanco y a diferentes concentraciones celulares (Benchmark Plus,
Microplate spectrophotometer).
Blanco
0.902
0.902
0.902
Promedio
0.902
100,000 células
1.05
0.986
0.953
0.996333
200,000 células
1.046
1.031
0.976
1.017667
300,000 células
1.123
1.088
1.062
1.091
500,000 células
1.133
1.137
1.113
1.127667
1´000,000 células
1.251
1.247
1.246
1.2485
1´500,000 células
1.375
1.278
1.249
1.3065
Figura 1. Recta patrón, en el eje de las Y observamos la absorbancia a
570nm y en el eje de las X el número de células sembradas.
1.4
Recta patrón
1.2
1
y= 2E-07x + 0.997
R2=0.952
0.8
0.6
Absorbancia
0.4
Lineal
(absorbancia)
0.2
0
0
500 000
1000 000
1500 000
2000 000
IV. Resultados
Adhesión celular
46
El cálculo de células adheridas se llevó a cabo determinado la media del conteo celular en la cámara de Neubauer bajo visión microscópica a 1 y 4 horas de cultivo celular y desarrollando la formula: 10,000 x 0.4 ml (FD) x células contadas (tabla 2, figura
2). Encontrando un porcentaje de adhesión en composito con 1% de NTC de 29.4% y
9.6% respectivamente, para 2% de NTC una adhesión de 13.1% y 13.8%, para 5% de
NTC 11.2% y 15.6%, para 10% de NTC células adheridas 14.47% y 19.8%, mientras
que para el grupo control la adhesión fue de 12.8% y 8.13% respectivamente.
Tabla 2. Porcentaje de adhesión celular en los diferentes compositos a
una hora y cuatro horas de incubación, evaluado por el método de tripsina
y contabilizado bajo visión microscópica en cámara de Neubauer.
Tiempo de cultivo celular
Biomaterial
1 hora
4 horas
1% NTC
29.4
9.6
2% NTC
13.1
13.8
5% NTC
11.2
15.6
10% NTC
14.47
19.8
Quitosana
12.8
8.13
Figura 2. En el eje de las x se observa el biomaterial conteniendo diferentes concentraciones en peso de NTC y del control con quitosana. En el eje de
las Y el porcentaje de proliferación celular a 1 y 4 horas de cultivo celular,
* p <0.05
Adhesión celular
Porcentaje de adhesión
35
30
25
*
20
15
1 hora
4 horas
10
5
0
1%NTC
2%NTC
5%NTC
10%NTC
Quitosana
Biomateriales
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Proliferación
47
Para el cálculo de la cantidad de células proliferadas en los compositos y en el control a los 3, 7, 14 y 21 días, se reportan los resultados obtenidos por cuadriplicado y el
promedio de cantidad celular obtenida por la lectura de absorbancia y utilizando los
datos de la curva patrón x = 2E-07x + 0.9975 (tabla 3-6).
Tabla 3. Observamos la lectura espectrofotométrica a 570 nm (Benchmark
Plus. Microplate spectrophotometer) de las células cultivadas sembradas
en los biomateriales y en el control, a los 3 días del cultivo. En el último recuadro se establece el promedio de la lectura.
Proliferación a los 3 días de cultivo celular
Promedio
1%
759501
753378
946691
956313.6
853970.9
2%
751629
724512
1465400
735884
919356.3
5%
635291
657159
644913
637915
643819.5
10%
591555
560065
583682.8
506707.5
560502.6
Control
692148
684275.6
480465.9
617796.9
618671.6
Tabla 4. Observamos la lectura espectrofotométrica a 570 nm (Benchmark
Plus. Microplate spectrophotometer) de las células cultivadas sembradas
en los biomateriales y en el control, a los 7 días del cultivo. En el último recuadro se establece el promedio de la lectura.
Proliferación a los 7 días de cultivo celular
Promedio
1%
3152500
3232500
3302500
3237500
3231250
2%
3027500
3312500
3187500
3452500
3245000
5%
2872500
3412500
3582500
4027500
3473750
10%
3077500
3097500
3027500
3232500
3108750
Control
2077500
2322500
2697500
2427500
2381250
IV. Resultados
48
Tabla 5. Lectura espectrofotométrica a 570 nm (Benchmark Plus. Microplate spectrophotometer) a los 14 días del cultivo celular en biomaterial y
control. En el último recuadro se establece el promedio de la lectura.
Proliferación a los 14 días de cultivo celular
Promedio
1%
3447500
3222500
3567500
4407500
3661250
2%
4167500
5882500
4392500
4832500
4818750
5%
4762500
4682500
4997500
5622500
5016250
10%
3097500
4477500
4492500
5002500
4267500
Control
4002500
4362500
5172500
6212500
4937500
Tabla 6. Lectura espectrofotométrica a 570 nm (Benchmark Plus. Microplate spectrophotometer) a los 21 días del cultivo celular en biomaterial y
del control. En el último recuadro se establece el promedio de la lectura.
Proliferación a los 21 días de cultivo celular
Promedio
1%
697396.4
701770
705268.9
621295.8
681432.8
2%
621295.8
614298
599427.8
619546.4
613642
5%
676403.2
616922.2
616047.5
556566.5
616484.8
10%
563564.3
563564.3
571436.8
566188.4
566188.4
Control
622170.5
657159.3
657159.3
600302.5
634197.9
En la tabla 7 se observa el promedio de proliferación celular para cada uno de los
biomateriales y del control a los 3, 7, 14 y 21 días de cultivo, encontrando para el
composito con 1% de NTC una proliferación celular de 853,970.9, 3'231,250, 3'661,250
y 681,432.8 células respectivamente, para el composito de 2% la proliferación obtenida fue de 919,356.3, 3'245,000, 4,818,750 y 613,642, para el composito con 5% de
NTC las células proliferadas fueron 643,819.5, 3'473,750, 5'016,250 y 616,484.8, para
el composito con 10% de NTC la proliferación celular fue de 560,502.6, 3'108,750,
4'267,500 y 566,188.4 mientras que para el control de quitosana la proliferación fue
de 618,671.6, 2'381,250, 4'937,500 y 634,179.9.
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Tabla 7. Mediante el uso de la ecuación de la recta observamos la cantidad promedio de células proliferadas a los 3, 7, 14 y 21 días de cultivo celular, en los diferentes
composito y en el control de acuerdo a la formula desarrollada x = 2E-07x + 0.9975
Número de Células
Biomaterial
3 días de cultivo
7 días de cultivo
14 días de cultivo
21 días de cultivo
1%
853,970.9
3´231,250
3´661,250
681,432.8
2%
919,356.3
3´245,000
4´818,750
613,642
5%
643,819.5
3´473,750
5´016,250
616,484.8
10%
560,502.6
3´108,750
4´267,500
566,188.4
Quitosana
618,671.6
2´381,250
4´937,500
634,197.9
Utilizando la curva de calibración a 570nm y explicando con un coeficiente de
correlación de 95.29%, encontramos que todos los biomateriales mostraron una tendencia creciente de proliferación celular (figura 3), con una velocidad de proliferación
mayor entre el día 7 y 14 de cultivo del biomaterial con 2% y 5% de NTC, sin embargo
los compositos con 1% y 10% de NTC tuvieron una proliferación baja al día 14 del
bioensayo con respecto al control. El soporte conteniendo 5% de NTC obtuvo una proliferación mayor que el control a los 3, 7 y 14 días de cultivo celular. A los 21 días del
ensayo se observó una disminución significativa de la velocidad de proliferación siendo similares tanto en el control como en los biomateriales con diferentes porcentajes
en peso de NTC, esto es coincidente cuando el osteoblasto termina su diferenciación
y se convierte en osteocito el cual es incapaz de seguir proliferando.
Figura 3. Proliferación celular a 3, 7, 14 y 21 días de cultivo celular. En el eje de
las X se observan el biomaterial con diferentes concentraciones en peso de NTC y el
grupo control con quitosana, en el eje de las Y la cantidad de células proliferadas.
* p<0.05
3d
7d
14d
21d
6000 000
Número de células
5000 000
*
4000 000
*
*
*
3000 000
2000 000
1000 000
*
0
1%
2%
5%
Composito
IV. Resultados
10%
quitosana
49
50
Cebadores estandarizados
La figura 4 representa los productos de amplificación de PCR para cada uno de los
genes estandarizados, observando la amplificación de una sola banda, indicando que
el cebador es especifico.
Figura 4. Productos de amplificación por PCR. Observando una banda
amplificada para cada gen, demostrando que los cebadores son especificos
para cada uno de ellos: GADPH, fosfatasa alcalina, osteonectina osteocalcina, colagenasa tipo 1 (Col1), sialoproteína y factor de crecimiento transformante β1 (TGF- β1)
Expresión génica
Para los análisis de expresión génica hasta el momento se ha obtenido el RNA de
los osteoblastos en el día 0 y de aquellos cultivados en los biomateriales y en el control a diferentes días del cultivo celular, utilizando el método de Trizol modificado.
La tabla 8 muestra la concentración y calidad de RNA obtenido mediante lectura de
absorbancia a 260/280 nm.
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Tabla 8. Extracción de RNA de las células cultivadas en el biomaterial del
control, se muestran los valores obtenidos mediante lectura de absorbancia
en nanodrop (Thermo Scientific).
Biomaterial
Concentración
RNA
A260
A280
260/280
DIA 3
Quitosana/PLLA + NTC 1%
259 ng/μL
6.476
3.954
1.64
Quitosana/PLLA + NTC 2%
98.4 ng/μL
2.461
1.573
1.56
Quitosana/PLLA + NTC 5%
158.3 ng/μL
3.958
2.445
1.62
Quitosana/PLLA +NTC 10%
50.7 ng/μL
1.267
0.83
1.53
Control
363.1 ng/μL
9.078
6.174
1.47
DIA 7
Quitosana/PLLA + NTC 1%
58.7 ng/μL
1.468
0.979
1.5
Quitosana/PLLA + NTC 2%
153.1 ng/μL
3.827
2.367
1.62
Quitosana/PLLA +NTC 5%
35.1 ng/μL
0.877
0.583
1.5
Quitosana/PLLA + NTC 10%
140.1 ng/μL
3.502
2.172
1.61
Control
124.7 ng/μL
3.119
1.962
1.59
DIA 14
Quitosana/PLLA + NTC 1%
22.6 ng/μL
0.566
0.353
1.6
Quitosana/PLLA + NTC 2%
6.1 ng/μL
0.153
0.103
1.49
Quitosana/PLLA + NTC 5%
252.1 ng/μL
6.304
3.542
1.78
Quitosana/PLLA + NTC 10%
297 ng/μL
7.424
4.212
1.76
Control
293.1 ng/μL
7.327
5.1
1.44
3.713
2.045
1.82
DIA 0
Osteoblasto
148.5 ng/μL
Análisis estadísticos
Todos los ensayos realizados se repitieron al menos tres veces, los datos obtenidos
fueron analizados en el paquete estadístico Minitab 16 para Windows XP. Los resultados de las variables analizadas se expresaron como la media ± desviación estándar
y las diferencias estadísticas entre los cuatro grupos estudiados y del control se evaluaron mediante el uso de la prueba de t-Student, tomando como valor significativo
una p <0.05.
IV. Resultados
51
52
Adhesión celular
Para el análisis de adhesión celular se realizó la prueba de t-student de muestras
independientes, evaluando la diferencia de las medias de 1 y de 4 horas de cultivo
celular por biomaterial comparados con el control, no encontrando diferencias estadísticamente significativas a 1 hora de cultivo celular, obteniendo un valor de p>0.05,
sin embargo a las 4 horas de cultivo celular el composito con 1% de NTC obtuvo un
porcentaje de adhesión mayor con respecto al control con un valor de p 0.038 (tabla
11). Para analizar la proliferación celular de forma independiente para cada uno de
los biomateriales y del control, se aplicó la prueba de t-Student de muestras pareadas
a 1 y 4 horas, encontrando una diferencia significativa en el composito con quitosana/
PLLA y 10% de NTC con un valor de p 0.008, mientras que para los demás biomateriales incluyendo al control no hubo significancia estadística p>0.05 (tabla 12).
Tabla 11. Análisis estadístico t-student para dos muestras independientes asumiendo varianzas iguales, realizado en el programa Minitab 16 para
Windows XP, evaluando la adhesión celular a 1 y 4 horas de cultivo en cada
uno de los biomateriales comparados con el control de quitosana tomando
como significativo un valor de p < 0.05.
BIOMATERIAL
Hora de
cultivo
celular
Prueba de t para dos
muestras independientes
Diferencia
de la Media
95% IC de
confianza
Valor de t
Grados de
libertad
Valor de p
Quitosana/PLLA + 1% NTC
1
-16.6
(-118.8 a 85.5)
-0.7
2
0.557
Quitosana/PLLA + 2% NTC
1
-0.27
(-27.02 a 26.49)
-0.03
3
0.977
Quitosana/PLLA + 5% NTC
1
1.6
(-14.64 a 17.84)
0.31
3
0.774
Quitosana/PLLA + 10% NTC
1
-1.67
(-17.67 a 14.34)
-0.33
3
0.762
Quitosana/PLLA + 1% NTC
4
-1.47
(-17.13 a 14.19)
-0.4
2
0.726
Quitosana/PLLA + 2% NTC
4
-5.67
(-22.27 a 10.93)
-1.47
2
0.28
Quitosana/PLLA + 5% NTC
4
-7.47
(-26.46 a 11.53)
-1.69
2
0.233
Quitosana/PLLA + 10% NTC
4
-11.67
(-22.17 a -1.17)
-3.54
3
0.038
Tabla 12. Análisis estadístico t-student de muestras pareadas asumiendo
varianzas iguales, realizado en el programa Minitab 16 para Windows XP,
evaluando la adhesión celular a 1 y 4 horas de cultivo en cada uno de los
biomateriales, tomando como significativo un valor de p < 0.05.
Prueba de t pareada
BIOMATERIAL
Diferencia de
la Media
Desviación
estándar
Error estándar
de la media
Valor de t
Valor de p
Quitosana/PLLA + 1% NTC
19.8
34.8
20.1
0.99
0.786
Quitosana/PLLA + 2% NTC
-0.73
13.57
7.83
-0.09
0.467
Quitosana/PLLA + 5% NTC
-4.4
3.12
1.8
-2.44
0.067
Quitosana/PLLA + 10% NTC
-5.333
1.172
0.677
-7.88
0.008
Quitosana
4.67
7.72
4.46
1.05
0.798
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Proliferación celular
53
Para evaluar si las diferencias entre los valores medios obtenidos eran estadísticamente significativas con respecto al control a 3, 7, 14 y 21 días de cultivo celular, se
calculo la t de Student para dos muestras independientes asumiendo varianzas iguales
(tabla 13). El composito con 1% de NTC fue el único que mostró un valor significativamente diferente con respecto al control a los 3 días de cultivo celular (p<0.05), a los 7
días de cultivo celular todos los biomateriales con los diferentes concentraciones de NTC
mostraron una proliferación significativamente mayor que el control, sin embargo a los
21 días del cultivo celular la proliferación celular no tuvo diferencias significativas.
Tabla 13. Análisis estadístico t-student de muestras independientes asumiendo varianzas iguales, realizado en el programa Minitab 16 para Windows XP, evaluando la proliferación celular a 3, 7, 14 y 21 días de cultivo en
cada uno de los biomateriales comparados con el control, tomando como
significativo un valor de p < 0.05.
Prueba de t para la igualdad de medias
Día de
cultivo
celular
Biomaterial
Media
Desviación
estándar
Error
estándar
de la
media
95% de intervalo
de confianza de la
diferencia
Límite
inferior
Límite
superior
Valor de t
Grados
Valor de
de
p 2 colas
libertad
3
Quitosana/PLLA
853971
+ 1% NTC
112716
56358
-235299
-84823
-3.15
5
0.013
Quitosana/PLLA
919356
+ 2% NTC
364199
182099
-300685
143101
-1.59
3
0.105
Quitosana/PLLA
643820
+ 5% NTC
9776
4888
-25148
90724
-0.51
3
0.322
Quitosana/PLLA
560503
+ 10% NTC
38278
19139
58169
181954
1.11
3
0.825
7
Quitosana/PLLA
3231250
+ 1% NTC
61424
30712
-850000
-539282
-6.44
3
0.004
Quitosana/PLLA
3245000
+ 2% NTC
180947
90473
-863750
-547224
-5.5
5
0.001
Quitosana/PLLA
3473750
+ 5% NTC
477395
238698
-1092500
-514673
-4.03
4
0.008
Quitosana/PLLA
3108750
+ 10% NTC
87595
43798
-727500
-408211
-5.36
3
0.006
14
Quitosana/PLLA
3661250
+ 1% NTC
517645
258822
1276250
2458347
2.3
4
0.959
Quitosana/PLLA
4818750
+ 2% NTC
761045
380523
118750
1369497
0.19
5
0.572
Quitosana/PLLA
5016250
+ 5% NTC
425703
212851
-78750
1060903
-0.15
4
0.445
(continúa...)
IV. Resultados
54
Prueba de t para la igualdad de medias
Día de
cultivo
celular
Biomaterial
Media
Desviación
estándar
Error
estándar
de la
media
95% de intervalo
de confianza de la
diferencia
Límite
inferior
Límite
superior
Valor de t
Grados
Valor de
de
p 2 colas
libertad
Quitosana/PLLA
4267500
+ 10% NTC
817282
408641
670000
1956262
1.05
5
0.829
21
Quitosana/PLLA
681433
+ 1% NTC
40220
20110
-47235
2127
-1.93
5
0.056
Quitosana/PLLA
613642
+ 2% NTC
9932
4966
20556
55488
1.38
3
0.87
Quitosana/PLLA
616485
+ 5% NTC
48924
24462
17713
77787
0.63
4
0.718
Quitosana/PLLA
566188
+ 10% NTC
3711
1856
68009
101217
4.82
3
0.991
Discusión
El composito con 1% de NTC favoreció la adhesión de los osteoblastos en la primera hora de cultivo celular, aunque estadísticamente no fue significativo, sin embargo, la proliferación a los 3 y 7 días de cultivo celular fue significativamente mayor.
Por otro lado, todos los soportes conteniendo diferentes porcentajes en peso de NTC,
mostraron una proliferación significativamente mayor al séptimo día comparados
con el control, datos coincidentes con los reportados por Chor y cols. (Chor, 2010), a
los 14 días del ensayo el composito con 1% de NTC fue el material con menos células
proliferadas sin establecer significancia estadística, esta disminución nos lleva a pensar que, quizá debido a la fuerte adhesión de los osteoblastos a la superficie pierden
movilidad, lo que dificultaría su expansión ocasionando una proliferación más lenta,
o que la extracción de las células se vería dificultada por la fuerte fijación entre las
células y la superficie o que la técnica empleada para la extracción de los osteoblastos, mediante el uso de tripsina, no sería lo suficientemente efectiva en este caso para
llevar a cabo la desunión célula-superficie (Pino, 2008).
Por otro lado a los 21 días de cultivo celular se observa una disminución en la
proliferación celular en todos los biomateriales incluyendo al control sin diferencias
significativas entre cada uno de ellos, ésta disminución de la velocidad de proliferación celular se explica porque las células han alcanzado la confluencia, dejan de
proliferar para entrar en la etapa de diferenciación y el osteoblasto queda atrapado
en la matriz extracelular mineralizada, diferenciándose a osteocito (Kierszenbaum,
2008) , esto es coincidente con estudios previos reportados en la literatura analizando la proliferación osteoblástica en biomaterial de ácido poliláctico (Navarro-Toro,
2005); y en ensayos con biofilmes con nanotubos de carbono cultivados en células
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
mesenquimales (Chor, 2010), el autor observó una disminución en la proliferación
de 61% y 75% con respecto al biomaterial y a su control al día 21 de cultivo celular.
En esta última observación se requiere confirmar el fenotipo osteoblástico mediante
los análisis de expresión génica, en búsqueda de un incremento en la expresión de
osteocalcina, lo que sugeriría que la matriz extracelular contribuye al cese de la proliferación celular (Owen, 1990) este análisis de expresión génica en nuestro estudio
aún está en proceso experimental. Por otro lado, en un estudio realizado por Meike
(Meike, 2010) evaluando la proliferación de osteoblastos en un biomaterial compuestos de ácido poliláctico, microhidroxiapatita y nanotubos de carbono con porcentajes
en peso del 1% al 10%, encontró que la mejor opción para inducir la proliferación
celular se encontraba en los compositos con 1% de NTC, esto es coincidente con los
resultados obtenidos en nuestro ensayo. Narita y cols., reporta que los NTC inhiben
la resorción del hueso in vivo, sugiriendo que NTC tienen efectos benéficos en el hueso cuando se usa como biomaterial (Narita, 2009). Finalmente los nanocompuestos
se han propuesto para mejorar las propiedades funcionales y estructurales de los polímeros abriendo una perspectiva para aplicaciones biomédicas (Armentano, 2010),
hasta el momento hemos encontrado que los biomateriales sujetos a ensayo permiten
la proliferación osteoblástica significativamente mayor al día 14 de cultivo celular,
para después empezar el proceso de diferenciación a osteocito, dato que aún falta por
sustentarlo mediante análisis de expresión génica. Finalmente, se puede observar
una tendencia proliferativa y de diferenciación de los osteoblastos.
IV. Resultados
55
V. Conclusiones
L
as propiedades mecánicas de la quitosana/PLLA son mejoradas con la adición de pequeñas cantidades de nanotubos de carbono y que la morfología
entrecruzada presenta tamaños de poros adecuados para la adhesión y proliferación celular. El análisis de proliferación osteoblástica muestra una
proliferación mayor a los 14 días de cultivo.
Hasta el momento hemos encontrado que los biomateriales sujetos a ensayo permiten la proliferación osteoblástica significativamente mayor al día 14 de cultivo
celular, para después empezar el proceso de diferenciación a osteocito, dato que aún
falta por sustentarlo mediante análisis de expresión génica. Finalmente, se puede
observar una tendencia proliferativa y de diferenciación de los osteoblastos.
57
Referencias
Abarrategi A., Gutiérrez M.C., Moreno-Vicente, C., Hortigüela M.J., Ramos V., López-Lacomba J.L., Ferrer M.L., del Monte F. (2008). Multiwall carbon nanotube
scaffolds for tissue engineering purposes. Biomater 29: 94-102
Armentano I., Dottori M., Fortunati E., Matioli S., Kenny J.M. (2010). Byodegradable polymer matrix nanocomposites for tissue engineering: A review. Polymer
degradation and stability (95):2126-2146.
Askeland, D. (1998). Ciencia e ingeniería de los materiales. International Thomson
Editores. Pp. 552.
Bokobza L. (2008). Multiwall carbon nanotube elastomeric composites: A review.
Polymer 48: 4907-4920
Chen D., Zhao M., Mundy GR. (2004). Bone morphogenetic proteins. Growth Factors
2004 Dec; 22(4):233-41
Chor Y.T., Haingang G., Wen S.L., Haiyang Y., Hua Q.L., Boon Ch.H., Hosea T., y
cols. (2010). Cellular behavior of human mesenchymal stem cells cultured on
single-walled carbon nanotube film. Carbon (48):1095-1104
Cooney, M. J., Lau, C., Windmeisser, M., Liaw, B. Y., Klotzbach, T., & Minteer, S. D.
(2008). Design of chitosan gel pore structure: towards enzyme catalyzed flowthrough electrodes. Journal of Materials Chemistry. 18: 667
Ducy P., Zhang R., Geoffroy V., Ridall A.L., Karsenty G. (1997). Cbfa1/Osf2: a transcriptional activator of Osteoblast differentiation. Cell. 89(5): 747-754.
Estrada C., Paz A.C., López L.E. (2006). Ingeniería de tejido óseo: Consideraciones
básicas. Revista EIA, 5: 93-100.
Feng X., Liao G., He W., Sun Q., Jian X., Du J. (2009). Preparation and Characterization of Functionalized Carbon Nanotubes/Poly(phthalazinone ether sulfone
ketone)s Composites. Polymer Composites, 30: 365-373
59
60
Fernández-Tresguerres Hernández-Gil I., Alobera Gracia M.A., del Canto Pingarón
M., Blanco Jerez L. (2006). Bases fisiológicas de la regeneración ósea I. Histología y fisiología del tejido óseo. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 11: E47-51
Fernández-Tresguerres Hernández-Gil I., Alobera Gracia M.A., del Canto Pingarón
M., Blanco Jerez L. (2006). Bases fisiológicas de la regeneración ósea II. El proceso de remodelado. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2006; 11:E151-7
Garzón Alvarado D.A., Roa Garzón M.A., Cortés Rodríguez C.L. (2004). Análisis por
elementos finitos del proceso de regeneración ósea: Editorial Universidad Nacional de Colombia. Bogotá, Colombia. 252 páginas.
Gopalan A.I., Lee K.P., Santhosh P., Kim K.S., Nho Y.C. (2006). Different types of
molecular interactions in carbon nanotube/conducting polymer composites – A
close analysis. Compos Sci Technology 67: 900–905
Gutiérrez H. (2010). Establecimiento de un método de cultivo celular primario de
osteoblastos a partir de calvaria de rata (rattus norvegicus). Tesis de Licenciatura en Química. Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de
Ciudad Juárez.
He L., Liu B., Xipeng G., Xie G., Liao S., Quan D., Cai D., Lu J., Ramakrishna S.
(2009). Microstructure and properties of nano-fibrous PCL-b-PLLA scaffolds for
cartilage tissue engineering. Eur Cell Mater. 18: 63-74
Hidaka Y., Ito M., Mori K., Yagasaki H., Kafrawy A. H. (1999). Histopathological and
immunohistochemical studies of membranes of deacetylated chitin derivatives
implanted over rat calvaria. J Biomed Mater Res. 46(3): 418-423.
Hsieh, C., Tsai, S., Ho, M., Wang, D., Liu, C., Tseng, H., Hsieh, H.J. (2007). Analysis of freeze-gelation and cross-linking processes for preparing porous chitosan
scaffolds. Carbohydrate Polymers. 67:124-132.
Iijima S. (1991). Helical microtubules of graphitic carbon. Nature 354: 56–58
Jayakumar R., Divya Rani V.V., Shalumon K.T., P.T. Sudheesh Kumar P.T., Nair
S.V., Furuike T., Tamura H. (2009) Bioactive and osteoblast cell attachment
studies of novel α- and β-chitin membranes for tissue-engineering applications.
. Int. J. Biol. Macromol 45(3): 260-4
Jones G. L., Motta A., Marshall M.J., El Haj A.J., Cartmell S.H. (2009). Osteoblast:
Osteoclast co-cultures on silk fibroin, chitosan and PLLA films. Biomaterials.
29: 5376 – 84
Kierszenbaum A. (2008). Histología y biología celular. Elsevier España. 2da. Edición.
671 páginas
Kim I.Y., Seo S.J., Moon H.S., Yoo M.K., Park I.Y., Kim B.C., Cho C.S. (2008). Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol Adv
26(1): 1-21
Kumar R., Prakash K.H., Cheang P., Gower L., Khor K.A. (2008). Chitosan-mediated
crystallization and assembly of hydroxyapatite nanoparticles into hybrid nanostructured films. J. R. Soc. Interface. 5(21): 427–439
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Lapunzina P., Aglan M., Temtamy S., Caparrós-Martín J.A., Valencia M., Letón M.,
Martínez-Glez V., Elhossini R., Amr K., Vilaboa N., Ruiz-Perez V.L. (2010).
Identification of a Frameshift Mutation in Osterix in a Patient with Recessive
Osteogenesis Imperfecta. Am. J. Hum. Genet. 87: 1-5, 2010.
Larena A., Cácres D.A., De la Piedra C., Montero M., Vicario C., Fuentes A., Ibarzábal
A., Bernabéu E., Ribelles P. (2004). Preparación de biomateriales basados en
quitosano y estudios como portadores de osteoblastos en cultivo. Patología del
aparato locomotor, 2005; 3 (1): 55-63
Lee J.T. Tsang W.H., Chow K.L. (2011). Simple modifications to standard Trizol
Protocol allow high-yield RNA extraction from cells on resorbable materials.
JBNB, 2011 (2):41-48
Li, H. J. Lu, W. G. Li, J. J. Bai, X. D. and Gu, C. Z (2005). Multichannel Ballistic
Transport in Multiwall Carbon Nanotubes. Phys Rev Lett. 2005 Aug 19; 95 (8):
086601
Liu Y., Chen W., Chang Y. (2009). Preparation and properties of chitosan/carbon nanotube nanocomposites using poly(styrene sulfonic acid)-modified CNTs. Carbohydrate Polymers 76: 232–238
Loos J., Grossiord N., Koning C.E., Regev O. (2007). On the fate of carbon nanotubes:
Morphological characterizations. Compos Scie Technology 67(5): 783-788.
Manjubala I., Ponomarev I., Wilke I., Jandt K.D. (2007). Growth of Osteoblast-Like
Cells on Biomimetic Apatite-Coated Chitosan Scaffolds. J Biomed Mater Res B:
Appl Biomater. 84(1): 7-16.
Martel-Estrada, S.A., Martínez-Pérez C.A., Chacón-Nava J.G., García-Casillas P.E.,
Olivas–Armendáriz I. (2010). In vitro bioactivity of chitosan/poly (D,L-lactideco-glycolide) composites. Materials Letters 65 (2010) 137–141
Martel-Estrada S.A., Martínez-Pérez C.A., Chacón-Nava J.G., García-Casillas P.E.,
Olivas-Armendariz I. (2010). Synthesis and thermo-physical properties of chitosan/poly(dl-lactide-co-glycolide) composites prepared by thermally induced
phase separation. Carbohydrate Polymers 81 (2010) 775–783
Meike V.Z., Walboomers X.F., Brannvall M., Olalde B., Jurado M.J. Alava J.I. Jansen J.A. (2010). Genetic profiling of osteoblast-like cells cultured on a novel
bone reconstructive material, consisting of poly-L-lactide, carbon nanotubes
and microhydroxyapatite, in the presence of bone morphogenetic protein-2.
Acta Biomaterialia (6):4352-4360
Narita N., Kobayashi Y., Nakamura H., Maeda K., Ishihara A., Mizoguchi T., Usui
Y., y cols. (2009). Multiwalled carbon nanotubes specifically inhibit osteoclast
differentiation and function. Nano Lett (4):1406-13
Navarro-Toro M.E. (2005). Desarrollo y caracterización de materiales biodegradables
para regeneración ósea. Memoria de tesis presentada para optar al grado de
Doctor en Ciencias. Especialidad Ingeniería Química por la Universitat Politécnica de Catalunya
Referencias
61
62
Nolla J. (1997). Enfermedades óseas, Sociedad Española de Reumatología. Elsevier
España, 1997, 453 páginas
Okada S., Ito H, Nagai A., Komotori J., Imai H. (2010). Adhesion of osteoblast-like
cells on nanostructured hydroxyapatite. Acta Biomater 6(2): 591–7
Olivas-Armendáriz I., García-Casillas P., Martínez-Villafañe A., Martínez-Pérez C.
(2010). Chitosan/MWCNT composites prepared by termal induced phase separation. J alloys compounds 495(2): 592-595
Owen T.A., Aronow M., Shalhoub V., Barone L.M., Wilming L., Tassinari M.S., y
cols. (1990). Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro:
reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix.
J. Cell Physiol 143(3):420-30
Parada Quinayá D.C., Estupiñan Durán H.A., Peña Ballesteros D.Y., Vásquez Quintero C., Laverde Cataño D. (2009). Obtención, electrodeposición y caracterización
de un recubrimiento polimérico bioabsorbible a partir de acido L-láctico para aplicaciones biomédicas. Ingeniare. Revista Chilena de Ingeniería 17(3): 365-374.
Peris J.L., Prat J., Dejoz R., Comin M., Atienza C., Barreda J.S., Roger I., Reig C.,
Vera P. (1996). Proteínas morfogenéticas óseas (BMPs): Efecto de la proteína
osteogénica-1 (OP-1/BMP-7) en la condrogénesis y osteogénesis. Rev Esp Cir
Osteoart 1996; 31:37-48
Pino M.J. (2008). Estudio nanométrico de biocompatibilidad y adhesividad celular
a biomateriales utilizados en cirugía ortopédica. Tesis Doctoral, Universidad
Santiago de Compostela.
Prezioso V.R. (2006). en “General Notes on Primer Design in PCR”. Encyclopedia
(2006) 2: 022012-37 Ed. H.G. Griffin and A. M. Griffin CRC Press, Boca Raton.
Ramanathan T., Liu H., Brinson L.C. (2005). Functionalized SWNT/Polymer Nanocomposites for Dramatic Property Improvement. J Polym Sci 43: 2269-2279
Riera-Espinoza G. (2009). Epidemiología de la osteoporosis en Latino América. Salud
Publica Mex 2009;51 supl 1:S52-S55
Rincón M., Rodríguez A., Londoño M.A., Echavarría A. (2007). Fabricación y caracterización de una matriz tridimensional de hidroxiapatita macroporosa para
aplicación en ingeniería de tejidos óseos. Revista EIA, 7: 87-95.
Rivas-Martínez M., Román Ganzer J., Cosme Huertas M.L. (2007). Informe de vigilancia tecnológica Madrid. Aplicaciones actuales y futuras de los nanotubos de
carbono. Edita Fundación Madrid para el conocimiento Velázquez, 76. E-28001
Madrid.
Rivera J.A., Riaño C.H., Echavarría A., Monsalve P.A., Alzate G.J., Restrepo L.F.,
Jaramillo C.D. (2004). Injertos óseos - Nueva alternativa. Fase III. Obtención,
caracterización y evaluación de Hidroxiapatita Sintética y el compuesto de Hidroxiapatita Sintética porosa – Proteínas Morfogenéticas Óseas en un modelo
experimental Lapino. Rev Col Cienc Pec 17(1): 20-28
Síntesis y caracterización de compositos de quitosana y/o dlplg
reforzados con nanotubos de carbono para su aplicación en ingeniería tisular
Roh, I. & Kwon, I. (2002). Fabrication of a pure porous chitosan bead matrix: influences of phase separation on the microstructure. Journal of biomaterials Science
Polymer Edition. 13: 769-782.
Ross M., Wojciech P. (2007). Histología, Texto y atlas color con biología celular y molecular. Editorial medica panamericana. 5ª. Edición, 992 páginas.
Sahithi K., Swetha M., Ramasamy K., Srinivasan N., Selvamurugan N. (2010). Polymeric composites containing carbon nanotubes for bone tissue engineering. Int.
J. Biol. Macromol 46: 281-283
Sánchez-Salcedo, S., Nieto, A., & Vallet-Regí, M. 2008. Hydroxyapatite/β-tricalcium
phosphate/agarose macroporous scaffolds for bone tissue engineering. Chemical Engineering Journal. 137: 62-71
Stevens A., Lowe J. (2006). Histología humana. Sistema musculo esquelético. Editorial Elsevier España S.A. 3ra. Edición. Madrid, España. 464 páginas
Tsigkou O., Jones J.R., Polak J.M., Stevens M.M. (2009). Differentiation of fetal osteoblasts and formation of mineralized bone nodules by 45S5 Bioglass conditioned medium in the absence of osteogenic supplements. Biomaterials 30 (2009)
3542–3550.
Vachiraroj N., Ratanavaraporn J., Damrongsakkul S, Pichyangkura R., Banaprasert T., Kanokpanont S. A comparison of Thai silk fibroin-based and chitosanbased materials on in vitro biocompatibility for bone substitutes. Int. J. Biol.
Macromol 45(5): 470-477
Wan, Y., Fang, Y., Wu, H., & Cao, X. (2007). Porous polylactide/chitosan scaffolds for
tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 80A(4),
776-789.
Wan, Y., Wu, H., Yu, A., Wen, D. (2006). Biodegradable Polylactide-Chitosan Blend
Membranes. Biomacromolecules. 7: 1362-1372.
Wang G., Meng F., Ding C., Chu P.K. Liu X. (2010). Microstructure, bioactivity and
osteoblast behavior of monoclinic zirconia coating with nanostructured surface.
Acta Biomater 3: 990–1000.
Xie H., Liu B., Yuan Z., Shen J. Cheng R. (2004). Cure Kinetics of carbon nanotube/
tetrafunctional epoxy nanocomposites by isothermal differential scanning calorimetry. J. Polym Sci Part B: Polym Phys 42: 3701-3712
Yamaguchi A., Komori T., Suda T. (2000). Regulation of Osteoblast Differentiation
Mediated by Bone Morphogenetic Proteins, Hedgehogs, and Cbfa1. Endocr Rev.
21(4): 393-411
Yamaguchi A., Komori T., Suda T. (2000). Regulation of Osteoblast Differentiation
Mediated by Bone Morphogenetic Proteins, Hedgehogs, and Cbfa1. Endocr Rev.
21(4): 393-411
Yélamos J., Ramírez P., Parrilla P. (2000). Animales modificados genéticamente
como donantes de órganos en xenotrasplante. Med Clin 114: 342-8
Referencias
63
Yilgor P., Sousa R.A., Reis R.L., Hasirci N., Hasirci V. (2010). Effect of scaffold architecture and BMP-2/BMP-7 delivery on in vitro bone regeneration. J Mater Sci:
Mater Med doi: 10.1007/s10856-010-4150-1.
Yuan, N.-Y., Lin, Y.-A., Ho, M.-H., Wang, D.-M., Lai, J.-Y., & Hsieh, H.-J. (2009).
Effects of the cooling mode on the structure and strength of porous scaffolds
made of chitosan, alginate, and carboxymethyl cellulose by the freeze-gelation
method. Carbohydrate Polymers. 78: 349-356.