Diapositiva 1

“EFECTO DEL ESTRADIOL EN LA PRODUCCIÓN DE
VITELOGENINA Y SU IMPACTO EN LA CALIDAD
DEL OOCITO EN TILAPIA NILOTICA, Oreochromis
niloticus”
Juan Cristóbal Ortiz Tirado
[email protected]
Introducción
Introducción
(FAO, 2013)
Introducción
•
•
•
•
•
•
Crecimiento rápido
Omnívoro
Cultivo de alta densidad tiene buena supervivencia.
Pez resistente a la manipulación y a malas condiciones
ambientales
Alta fertilidad y posibilidad de reproducción natural
Buena aceptación por parte del consumidor
Reproducción a temprana edad y numerosa
Resultado: sobre población y peces pequeños
(enanismo) = endogamia
Factores ambientales, sociales y nutricionales
•Fecundidad variable
•Tasa de Postura
•Ausencia de desoves
•Calidad del oocito
Melatonina
GnRHs
~
~
CP
~
LHa
hCG
•Propuestas de control:
•Manejo de la Luz ->Fotoperiodos
•Inducción Hormonal -> CP, hCG, GnrHs
Control de luz y reproducción en O. niloticus.
Justificación
Justificación
Tabla N°3. Uso de hormonas en O. niloticus.
Pullin,
1987
Shelton,
1999
Ortiz**,
2000
Herbs,
2002
Aizen,
2006
Levavi,
2006
Levavi,
2010
P. Carpa
hCG
+
+
+
-
-
-
-
­­-
LHa (comercial)
-
+
-
-
-
-
­­-
P. Tilapia
-
-
+
-
-
-
-
Sin hormonas
-
-
-
+
-
-
-
H. R. Tilapia
-
-
-
-
+
+
+
sGnRHa
Desove manual
+
+
+
+
-
-
-
Estradiol
11 KT
DHP
-
-
-
-
+
+
+
Fecundidad absoluta
-
-
+carp
7300
-
-
-
Ovas /día /hembra
-
-
-
20
-
-
-
Eclosión/puesta
-
-
-
608
-
-
-
Nado libre (%)
-
9
-
-
-
-
-
Autor
** Pruebas en carpa espejo, H.R..-hormonas recombinantes, P.- pituitaria
Justificación
Pez de maduración asincrónica
Frecuencia de desoves entre 15 – 20 días
Carrillo et al., 2009
•En tilapia -> no hay estacionalidad FSH y LH,
•Afecta el E2 circulante -> Vtg -> oocito
•La concentración de Vtg circulante
->biomarcador esteroidogénico
-> parámetro de crecimiento ovárico
-> calidad para la reproducción de especies acuáticas
Calidad del Oocito
•Parámetros morfométricos -> diámetro, peso, número oocitos
•Actividad enzimática y transformación de AA -> prostaglandina E2
PROBLEMA
Hipófisis
Gonodotrofinas
17 β estradiol circulante
Hígado
OVARIO
Actividad
COX2/ PGE2
Vitelogenina
Calidad del oocito
HIPOTESIS
“En un modelo de producción acuícola, la estimulación del estradiol circulante
en hembras adultas de Oreochromis niloticus, y su acción en las
concentraciones de vitelogenina, afecta la calidad de los ovocitos en su
morfometría y concentración de prostaglandina E2”.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar las concentraciones de estradiol circulante por acción de estímulos
externos e internos y su efecto en la producción de vitelogenina y calidad de
los ovocitos, durante el período reproductivo de Oreochromis niloticus en un
modelo de producción acuícola.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.
Determinar las variaciones de 17β- estradiol y vitelogenina circulantes,
durante el período reproductivo en tilapia, bajo condiciones normales de
cultivo.
2.
Evaluar el efecto del estradiol puro y pituitaria homóloga de tilapia como
estimulantes externos e internos en las concentraciones de estradiol y
vitelogenina circulante, durante el período reproductivo de tilapia.
3.
Evaluar
la calidad del ovocito por parámetros morfométricos
y
bioquímico-celulares como la prostaglandina E2, bajo condiciones normales
de cultivo, acción del estradiol exógeno y pituitaria homóloga.
METODOLOGIA
Actividad Biológica de Pituitaria Homóloga de tilapia
Detección de grupo de reproductores en proceso de trabajo
Material Biológico:
• Grupo de reproductores en
condiciones normales de
producción
Signos:
• Saludables
• Consumo normal de alimento
• Pápila genital dilatada
• Embriones en la boca
Factores ambientales:
• Verificación de estacionalidad
y ambiente ideal para
reproducción en la región
(Temperatura, Luz, pluviosidad
Oxígeno, salinidad)
3. Material Biológico
Oreochromis niloticus ( Línea Chitralada)
– Peso: 319 g/unidad
– CV < 10%
Tamaño de la muestra:
• Nivel de significación α =0,05
• Potencia del 90 %, β =0,10
– Grupo 1: 12 hembras
– Grupo 2: 12 hembras
– Grupo 3: 12 hembras
– (1 ♀:1♂)
• Sangre:
–
•
250 uL cada 5 días
Ovocitos :
–
–
500 mg tejido ovárico
~ 40 ovocitos invididuo
Pruebas experimentales -17 β estradiol y vitelogenina
Verificación y marcaje de Reproductores
Aclimatación
Pruebas
(25 días)
Control
Estradiol exógeno
Pituitaria homologa
(1 ♀:1♂)
(1 ♀:1♂)
(1 ♀:1♂)
300 µl SF
5μg/g (300 µl)
5μg/g (300 µl )
Técnicas usadas:
• Estradiol , Testosterona y Prostaglandina E2
– ELISA
– Curvas de calibración de la prueba.
– Detección de variación intra e inter –ensayo
• Vitelogenina
–
–
–
–
Cromatografía de intercambio iónico
Perfil de proteína SDS -PAGE
Western Blot (anti vtg de dorada )
Análisis por densitometría optica ( Image J)
• Actividad COX
• Morfometría oocito
– diámetro de los oocito-estereomicroscópio
– Peso del ovario/oocitos – balanza analítica
– Simetría del oocito en vitelogénesis y post vitelogénesis – histología
clásica
Análisis Estadístico:
ANOVA de 1 vía
*Shapiro Wilk
*Levene
*Tukey
Cuando los datos no cumplieron estas normas
* Kruskall – Wallis
* Test de Dunn /Mann – Whitney
Paquete estadístico
– InfoStat
– Graph Pad Prism 5
•
diferencias significativas -> si p<0,05.
Instalaciones de la Empresa Productora Tilapia, Provincia del Guayas – Ecuador.
Empresa Santa Priscila
Taura II
Piscinas de Reproducción O niloticus
Área de Reproducción
Instalación de unidades experimentales
Estanquería de 7 ton de capacidad
• Manejo de reproductores para el experimento
RESULTADOS
•
•
•
•
CONDICIONES AMBIENTALES
VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES
DETECCIÓN VTG
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA
Parámetros ambientales: Temperatura
31,95 ± 1,57 °C.
29,78 ± 1,04 °C.
Pluviosidad
Luminosidad
RESULTADOS
•
•
•
•
CONDICIONES AMBIENTALES
VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES
DETECCIÓN DE VTG
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA
a) Grupo de Reproductores : Diciembre 2012-Marzo 2013
Relación Longitud gónada vs masa gonadal
Relación ovocitos vs masa gonadal
RESULTADOS
•
•
•
•
CONDICIONES AMBIENTALES
VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES
DETECCIÓN DE VTG
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA
Detección de vitelogenina circulante en tilapia
Aumento de las concentraciones de Vtg circulante en machos
SDS –PAGE al 8%. Muestras: 1.- marcador de proteína 10-250 kDa; 2,3,4,5.- plasma de
hembras 311 y 316; 6.- plasma humano; 7 plasma de macho; 8.- plasma de macho tratado
con pituitaria; 9.- plasma de macho tratado con estradiol puro.
Detección de vitelogenina circulante en tilapia
Validación del anticuerpo para Vtg de tilapia
Western Blot en muestras no purificadas, con anticuerpos primarios de conejo anti – vtg de
dorada y marcador de proteína (10-250 kDa). Muestras: A, B, C. D: plasma de hembras
maduras, E: Control (plasma humano), F: plasma macho O. niloticus. H: plasma de macho O.
niloticus con estradiol.
Detección de vitelogenina de tilapia
Detección de Vtg por western blot, con anticuerpo primarios de anti – Vtg de dorada y
marcador de proteína (10-250 kDa), en plasma pre - purificado de O. niloticus. Muestra
312. A: día 1. B: día 5. C: día 10. D: día 15. E: día 20. F: día 25, H: macho normal
RESULTADOS
•
•
•
•
CONDICIONES AMBIENTALES
VERIFICACION GRUPO DE REPRODUCTORES
DETECCIÓN DE VTG
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE PITUITARIA DE TILAPIA
Actividad Biológica de pituitaria de tilapia
y carpa en células de Leydig de cobayo
***
2000
Testosterona (pg/mL)
**
1500
1000
500
0
Control
Tilapia
Carpa
Pituitaria (2,5 mg/mL)
*muestra una diferencia significativa
Actividad biológica de pituitaria de tilapia
y carpa en células foliculares de trucha arco iris.
17β estradiol (pg/mL)
5000
*
4000
3000
2000
1000
0
Control
Tilapia
Carpa
Pituitaria (2,5 mg/mL)
*muestra una diferencia significativa
Actividad Biológica de pituitaria de tilapia y
carpa en células foliculares de tilapia
17β estradiol (pg/mL)
4000
*
***
3000
2000
1000
0
Plas. Macho Ovario
Tilapia
Carpa
Pituitaria (2,5 mg/mL)
*muestra una diferencia significativa
RESULTADOS
• DETECCION DE E2 CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO
REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA
• DETECCION DE VTG CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO
REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA
• INTERACCIONES
Comportamiento del E2 circulante en el ciclo reproductivo de
O. niloticus
c
E2 (ng/mL)
25,00
ab
bc
bc
bc
20,00
15,00
a
10,00
5,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
Días
Control
Estradiol
Hipófisis
25,00
RESULTADOS
• DETECCION DE E2 CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO
REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA
• DETECCION DE VTG CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO
REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA
• INTERACCIONES
Comportamiento de la Vtg en el ciclo reproductivo de O.
niloticus
6,00
Vtg (mg/mL)
5,50
5,00
4,50
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
Días
Control
Estradiol
Hipófisis
25,00
RESULTADOS
• DETECCION DE E2 CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO
REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA
• DETECCION DE VTG CIRCULANTE DURANTE EL PERIODO
REPRODUCTIVO DE TILAPIA NILOTICA
• INTERACCIONES
Comportamiento de Estradiol y vitelogenina circulante en plasma, bajo
condiciones normales de cultivo.
8
6
20
4
10
2
0
0
1
5
10
Días
15
20
25
Estradiol
Vitelogenina
Vitelogenina (mg/mL)
17 β estradiol (ng/mL)
30
Comportamiento de E2y Vtg circulante en plasma, bajo acción del
estradiol exógeno.
8
6
20
4
10
2
0
0
1
5
10
15
20
25
Días
Estradiol
Vitelogenina
Vitelogenina (mg/mL)
17 β estradiol (ng/mL)
30
Comportamiento de E2y Vtg circulante en plasma, bajo la acción de
pituitaria homóloga.
8
6
20
4
10
2
0
Vitelogenina (mg/mL)
17 β estradiol (ng/mL)
30
0
1
5
10
15
Días
20
25
Estradiol
Vitelogenina
RESULTADOS
• PARAMETROS MORFOMÉTRICOS
• ACTIVIDAD COX Y PG´S
Parámetros morfométricos de hembras adultas de
Oreochromis niloticus.
Control
Estradiol
Hipófisis
♀=12
♀=12
♀=12
319,±38ª
316±41a
313±44ª
27±1ª
26 ± 1a
26 ± 1ª
Longitud cefálica (cm)
6,7±0,5
6,7±0,5
6,8±0,5
Ancho total (cm)
7,7±0,6
7,7±0,6
7,9±0,6
Índice de Condición (cm)
1,7±0,3a
1,6±0,08a
1,6±0,1a
Tratamientos
Peso (g)
Longitud Total (cm)
Parámetros reproductivos de hembras adultas
de Oreochromis niloticus
Tratamientos
Parámetros
IGS (%)
Control (♀=12)
Estradiol (♀=12)
Hipófisis (♀=12)
Media±SD CV (%) Media±SD CV (%) Media±SD CV (%)
2,4±1,2
51,5
2,8±1,3
46,4
3,5±1,6
46,4
3,0±1
33,0
2,8±1,4
52,5
2,7±1,4
52,8
Ovocitos /g hembra
8,1±3,3ª
36,5
12,5±6,6ab
52,8
15,7±5,8b
36,8
Ovocito (mm3)
19±12,0
62,9
20,5±10,1
49,4
22,8±12,2
53,4
Ovocito (mg)
Diámetro ovocito- eje mayor (mm)
Estadios de desarrollo y simetría de los ovocitos en O. niloticus
2.0
**
*
1.5
1.0
0.5
0.0
Estradiol
Control
Hipófisis
100
> 2 mm
< 1,6 - 1,9 >
< 0,7 - 0,9 >
80
%
60
40
20
0
Estradiol
Control
Hipófisis
Ovocito mm (eje mayor)
RESULTADOS
• PARAMETROS MORFOMÉTRICOS
• ACTIVIDAD COX Y PG´S
Actividad COX y Prostaglandina E2
0,60
1,20
0,50
0,50
0,80
0,60
0,40
0,34
0,78
0,29
0,701
0,40
0,20
0,40
0,37
0,30
0,319
0,305
0,20
0,10
0,00
0,00
CONTROL
Actividad total
ESTRADIOL
Actividad COX1
Actividad COX2
PITUITARIA
prostaglandinas
PGE2 (ng/mg)
COX uM /min / mL
1,00
CONCLUSIONES
• Bajo condiciones normales de cultivo, la dinámica de secreción
de E2 y Vtg circulante, generan una interacción inversa con un
índice de correlación bajo entre las dos variables y afectando los
parámetros reproductivos (fecundidad y morfometría de los
ovocitos) durante el ciclo reproductivo de tilapia.
• La administración de E2 y pituitaria homóloga generan una tasa
diferente de metabolización del estradiol circulante, permitiendo
un cambio en la dinámica de secreción de la vitelogenina
circulante durante los primeros días del ciclo reproductivo de
tilapia, afectando positivamente parámetros reproductivos
(fecundidad, morfometría de los ovocitos y peso de los ovarios).
• La acción de pituitaria homóloga de tilapia origina respuestas
diferentes en cultivos celulares de tres modelos animales,
produciendo información relevante para su aplicación en
pruebas in vivo y haciéndola competitiva con hormonas
comerciales.
• La concentración de prostaglandina E2, actividad COX-1, COX2, se ven afectados por la acción de E2 y pituitaria homóloga.
En este sentido la PGE es componente funcional para la
ovulación, desove y su interacción con receptores de
membrana en la embriogénesis.
Agradecimientos
• Al Laboratorio de hormonas y receptores de la
Universidad de Chile y Programa de Doctorado en
Acuacultura : Universidad de Chile, Católica del Norte
y Católica de Valparaíso.
• A la SENESCYT
• A la Universidad de la Fuerzas Armadas - ESPE
Gracias
Interacción E2 y Vtg bajo condiciones normales de cultivo.
Estradiol
Vitelogenina
Rango (unidades)
40
30
20
10
30
20
10
0
0
1
10
5
15
Días
Días
30
Rango (unidades)
Rango (unidades)
40
25
20
15
20
25
Días
Interacción E2 y Vtg bajo acción de estradiol exógeno.
Estradiol
45
Rango (unidades)
Vitelogenina
40
30
20
10
40
35
30
25
20
0
10
5
1
15
Días
Días
50
Rango (unidades)
Rango (unidades)
50
45
40
35
30
25
20
25
Días
Interacción E2 y Vtg bajo la acción de pituitaria homóloga.
Estradiol
50
Rango (unidades)
Vitelogenina
40
20
0
1
40
30
20
10
0
5
10
Días
15
Días
50
Rango (unidades)
Rango (unidades)
60
45
40
35
30
20
25
Días
Comportamiento de 11 keto - testosterona durante el período
reproductivo de machos de tilapia.
Comportamiento del estradiol y testosterona (ng/mL)
(Biswas et al .,2005)
Índice Gonodosomático
Volumen del oviducto (mm3)
Resumen
Strain
GMT
(O. niloticus
and O.
mossambicus)
Evaluations
Produced by FishGen using limited materials of GIFT as its
base, the YY males technique is available worldwide through
efficient partnership with hatcheries selling GMT (Genetically
Male Tilapia), a chromosome manipulation technique, not a
GMO fish. Very poor field performance so far.
Red tilapias
(Oreochromis
spp.)
Result of a mutation of one single dominant red O.
mossambicus, the initial dominant red color was spread in
several tilapia species, so today there are no pure red
materials available. It is salinity tolerant due to mossambicus
blood, and some countries like Jamaica, Colombia and
Thailand prefer this color. Poor breeding and grow-out
performances when compared to niloticus.
Several hybrids (tri and tetra-hybrids, too) of Nile, Aureus,
Hornorum, and Mossambicus are used especially to yield
monosex population or cold/brackish water
resistance/survival.
Hybrids
(several
crosses)
Strain
Chitralada
(O. niloticus)
GIFT
(O. niloticus)
(Ponzoni et al; 2010)
GST
(O. niloticus)
Introducción
(Zimmerman, 2007)
Evaluations
Developed in Thailand, this strain of O. niloticus is the most
successful Nile in Latin America due to proper adaptation and
successful breeding programs, but it has also some significant
role in South East Asia where it also has very good field
performance results when compared to other Niles.
Originally developed in Philippines by Akvaforsk, GIFT strain is
now available in most tilapia countries with very good field
performance. This is why it is the main O. niloticus cultured in
South East Asia (also hybridized with Aureus in China).
Several breeding programs of this successful strain have
developed worldwide by Akvaforsk and others.
Produced by GenoMar ASA using GIFT population as its base,
is being sold today in limited parts of the world (China,
Indonesia, Thailand, Brazil, and the Philippines) where
partners and GenoMar integrations are located. Fully owned
genetic material, limited sales. Very good field performance.
Introducción
Reproducción a temprana edad y numerosa
• Desarrollo gonadal: 20-25g.
• Desoves : 3- 10 veces/año (max. 11 veces)
• Pez asincrónico de incubación bucal
Resultado: sobre población y peces pequeños
(enanismo) = endogamia
•Tasa de postura – hembras
•Fecundidad
•Ciclo reproductivo /ambiente
•Relaciones sociales
El Sayed, 2003; 2005
1. Relación: Postura de hembras adultas/masa corporal
Suárez et al; 2013
2. Relación: Fecundidad/masa corporal
Suárez et al; 2013
Estévez, 1995;
Córdova, 2004
Ortiz et al., 2000
Fecundidad
Peso ♀
(g)
Fecundidad
Ovocitos ♀
O. mossambicus
25 ... 1200
O. aureus
Especie
100 ... 2500
Diámetro
ovocitos
(mm)
1.8 ... 2.5
Peso
ovocitos
(mg)
2.3 ... 6.4
Privisencev, 1991
70 ... 850
250 ... 2200
2.0 ... 2.5
2.5 ... 6.9
Privisencev, 1991
O. niloticus
117 - 177
678
2.5
2.3 -4
Ridha & Cruz ,2000
O.niloticus
296.82
523
-
-
Fessehaye et al., 2006
O.niloticus
180
500 - 3000
-
-
Ponzonni et al., 2010
Tilapia de la
Florida
90 ... 420
380 ... 1400
2.1 ... 2.6
2.1 ... 6.5
Privisencev, 1991
T. macrocephala
80 ... 350
200 ... 600
2.5 ... 3.0
6.0 ... 7.5
Privisencev, 1991
T. mariae
70 ... 280
1200 ... 5000
1.0 ... 1.4
1.1
Privisencev, 1991
T. zilli
29…419
5000
1.
1…3
Coward & Bromage ,2000
1.8
Autor
3. Relación Ciclo reproductivo: temperatura
Suárez et al; 2013
Boroiller et al., 1987
Síntesis de esteroides sexuales
Carrillo et al., 2009
Nagahama et al., 1995
Reproducción a temprana edad y numerosa
•
Jerarquización social
– Poligamia
– Poliándrismo
Resultado: sobre población y peces pequeños
(enanismo) = endogamia
Efecto endogámico del 3% por generación (Fessehaye et al., 2006)
Espermiación – Paternidad múltiple
PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENETICO
Neira, 2010
PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO
GENETICO
Problemas en cruzas individuales y grupales
1.
2.
3.
4.
Ausencia marcada de desoves
Falta de Sincronización de puestas
Baja fecundidad relativa
Bajo stock de alevines viables para la
evaluación de líneas.
Neira, 2010; Ponzoni, 2010; Powell,2010; Muñoz Cueto, 2010; Reyes; 2011
Justificación
Control de la Reproducción
– Luz
– Hormonas
C/subunidad α /FSH β /LH β es codificada por un gen
diferente y difiere en sus secuencia de aminoácidos y
conservación filogenética .
En Salmónidos y Perciformes la estructura primaria es
diferente en FSH β.
•Ausencia 3era Cys conservada y presencia de una cisteína
adicional en la terminal N.
•Modificaciones de carbohidratos en sitios específicos de N –
terminal y ausencia de un segundo sitio de N –glicosidación.
Ulloa - Aguirre., 2001
Aizen et al., 2007
Factores próximos:
• Temperatura
• Salinidad
• Oxígeno
• Estructura social
• Alimentación
Silva, 2010
Factores últimos:
• Temperatura + alimento
• Estructura social
Discusión
Control
Programa de Mejoramiento
*
1400
Control
Estradiol
Hipófisis
20
1000
*
800
40
*
30
10
20
10
m
)
g)
(m
ito
vo
c
O
O
vo
c
ito
he
m
/g
ito
s
vo
c
O
(m
br
a
)
(%
S
IG
/g
vo
s
H
ue
vo
s
H
ue
he
m
he
m
br
a
br
a
ur
a
st
3
0
0
Po
Rango (unidades)
1200