crioconservacion de diversas celulas vegetales.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kInt. Cl. : A01N 3/00
11 Número de publicación:
2 187 664
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ESPAÑA
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 96923280.0
kFecha de presentación: 07.06.1996
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 830 059
kFecha de publicación de la solicitud: 25.03.1998
T3
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k
54 Tı́tulo: Crioconservación de diversas células vegetales.
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73 Titular/es: PHYTON, INC.
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72 Inventor/es: Kadkade, Prakash G.;
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74 Agente: Carpintero López, Francisco
30 Prioridad: 07.06.1995 US 486204
125 Langmuir Lab, 95 Brown Road
Ithaca, NY 14850-1257, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.06.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 187 664 T3
16.06.2003
Aviso:
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Bare, Christopher B.;
Schnabel-Preikstas, Barbara y
Yu, Bin
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 187 664 T3
DESCRIPCION
Crioconservación de diversas células vegetales.
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Antecedentes de la Invención
1. Campo de la Invención
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La presente invención se refiere a procedimientos para la crioconservación de células vegetales y a
procedimientos para la recuperación de células vegetales que se han crioconservado.
2. Descripción de los Antecedentes
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La crioconservación se basa en la reducción y la posterior interrupción de funciones metabólicas de
material biológico almacenado a temperaturas ultrabajas. La conservación criogénica de plantas y de
células vegetales durante perı́odos prolongados sin cambios genéticos y la posterior recuperación de las
células vegetales normales con caracterı́sticas intactas y con capacidad de biosı́ntesis tiene implicaciones
importantes en la reproducción de plantas, en la investigación biomédica y en la ingenierı́a genética. A
la temperatura del nitrógeno lı́quido (-196◦C) cesan casi todas las actividades metabólicas de las células
y las células pueden mantenerse en este estado suspendido pero viable durante perı́odos prolongados.
Las células vegetales se crioconservan para evitar la pérdida por contaminación, para minimizar el
cambio genético en lı́neas celulares continuas y para evitar el envejecimiento y la transformación en lı́neas
celulares finitas. Los procedimientos tradicionales para la conservación de una caracterı́stica vegetal
deseable implican el establecimiento de colonias de plantas en el campo, porque muchas plantas no se
reproducen realmente a partir de semillas. Estos almacenes de plantas en el campo demandan grandes
cantidades de mano de obra y tierra e incurren en altos riesgos de pérdida debido a las condiciones
climáticas, a enfermedades y otros peligros. Una alternativa para una colonia de campo es el establecimiento de una colección in vitro de tejidos vegetales en condiciones de crecimiento normales o limitadas.
Para el almacenamiento a largo plazo, es deseable la eliminación de subcultivos rutinarios debido a los
problemas de mutación, contaminación, costes de mano de obra y riesgos de error humano asociados con
el cultivo de tejidos.
La mayorı́a de los materiales biológicos, incluyendo las plantas, no pueden sobrevivir a la congelación
y descongelación de las temperaturas criogénicas sin agentes y procedimientos crioprotectores. Varios
crioconservantes poseen propiedades que pueden proteger a una célula de los efectos perjudiciales de
la congelación criogénica. La esencia de la crioconservación es efectuar la deshidratación celular y la
concentración del citosol de una manera controlada y mı́nimamente nociva, de forma que se impida o
se minimice la cristalización del hielo en el citosol durante, por ejemplo, una inactivación en nitrógeno
lı́quido.
En los procedimientos de crioconservación convencionales, la deshidratación celular se realiza por
medio de la concentración inducida por congelación del medio de suspensión. Los efectos perjudiciales
de la deshidratación se mitigan por la presencia de agentes crioprotectores. Las muestras, tales como
células y órganos, se equilibran en una solución que contiene un agente de crioconservación tal como
dimetilsulfóxido (DMSO) o etilenglicol. La suspensión se enfrı́a y se siembra con un cristal de hielo a una
temperatura ligeramente por debajo de su punto de congelación. La suspensión se enfrı́a de nuevo a una
velocidad óptima a una temperatura bajo cero intermedia tal como una temperatura comprendida entre
aproximadamente -30◦ C y aproximadamente -40◦C, y finalmente se inactiva en nitrógeno lı́quido.
Aunque es posible la conservación criogénica rutinaria de microorganismos, cigotos y animales derivados de cigotos, la crioconservación de células vegetales está muy lejos de ser habitual y a menudo se
necesitan diferentes protocolos para especies de plantas individuales.
Los árboles del género Taxus producen taxol, un alcaloide diterpenoide aislado originalmente de
la corteza del tejo del Pacı́fico, Taxus brevifolia (M.C. Wani y col., J. Am. Chem. Soc. 93:232527,1971). Ciertos experimentos han demostrado que este compuesto inhibe eficazmente la polimerización
de microtúbulos de células de mamı́fero sin ocasionar una toxicidad indebida y, como tal, es un agente
antitumorigénico eficaz. Ciertos ensayos clı́nicos identificaron el taxol como un agente extremadamente
eficaz contra cánceres refractarios de ovarios, de mama y otros cánceres. Como tal, el taxol es un progreso
en la quimioterapia debido a su mecanismo mas bien único pero básico de acción, que es fundamentalmente
distinto del de los agentes quimioterapéuticos convencionales (L.A. Rowinsky y col., J. Natl. Cancer Instit.
82:1247-59,1990).
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El problema más desalentador en relación con el taxol hasta ahora es el suministro. Se requieren de
tres a seis tejos del Pacı́fico de 100 años para tratar a un paciente, ya que los rendimientos medios de taxol
son bajos (Witherup y col., 1990). La producción de una cantidad de taxol necesaria para tratamiento y
ensayo requerirá la destrucción de decenas de miles de tejos. La población de tejos casi se ha extinguido
por las talas y, según se va reduciendo el número de tejos del Pacı́fico, la investigación médica tiene que
buscar otras formas para suministrar taxol. La utilidad del taxol, ası́ como de otros muchos compuestos
que pueden propagarse o recogerse en células vegetales, ha suscitado un interés en el cultivo de células
de Taxus y de otras células vegetales.
El cultivo de células vegetales por su capacidad biosintética plantea problemas especiales para la tecnologı́a actual. El cultivo prolongado de células vegetales a menudo ocasiona una pérdida de la capacidad
biosintética que presentaban los aislados originales (Dhoot y col., Ann. Bot. 41:943-49, 1977; Barz y
col., Ber. Dtsch. Bot. Ges. 94:1-26, 1981). También se producen alteraciones fenotı́picas que complican
adicionalmente el cultivo celular. Un protocolo para la congelación de células vegetales, especialmente
células de Taxus, es una etapa importante en el desarrollo de procedimientos biosintéticos para la producción de alcaloides vegetales útiles tales como el taxol.
Steponkus (Advances in Low-Temperature Biology, vol 1, 1992) describe la crioconservación de tejidos
vegetales por vitrificación. Se describe que la vitrificación consta de cinco etapas:
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(1) equilibrio de la muestra en una solución que contiene crioprotectores de infiltración, denominándose
esta etapa “etapa de carga”;
(2) deshidratación de la muestra en una solución concentrada que se vitrificará;
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(3) introducción de la muestra en nitrógeno lı́quido;
(4) calentamiento de la muestra;
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(5) dilución de la solución de vitrificación y eliminación del crioprotector del citosol, denominándose
esta etapa “descarga”.
Steponkus enseña que la etapa de deshidratación puede ser la etapa más perjudicial del procedimiento
de vitrificación entero e indica que la deshidratación desestabiliza las membranas.
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Reinhoud y col. (Vitrification of Plant Cell Suspensions, Capı́tulo 12, páginas 113-119, 1995) describe
que la vitrificación es un procedimiento ventajoso para la crioconservación de células, aunque las soluciones de vitrificación parecen ser tóxicas y ciertas cepas requieren un procedimiento elaborado porque se
dañan más fácilmente. El procedimiento elaborado incluye precultivos y pretratamientos.
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En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para crioconservar una célula vegetal que
comprende una combinación de los siguientes tratamientos:
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a. tratar la célula vegetal por liofilización de la célula vegetal, por choque térmico o por pretratamiento
de la célula vegetal con un agente crioprotector y un estabilizador que es un antioxidante, un eliminador
de radicales de oxı́geno, un catión divalente, un inhibidor de etileno (un inhibidor de la acción de etileno
o un inhibidor de la biosı́ntesis de etileno), un compuesto que se intercala en la bicapa lipı́dica de la célula
(por ejemplo, un fosfolı́pido, un glicolı́pido, una glicoproteı́na) o una combinación de los mismos;
b. vitrificar la célula vegetal en una solución de vitrificación;
c. congelar la célula vegetal vitrificada a una temperatura de crioconservación, tal como de aproximadamente -70◦ C a aproximadamente -200◦C o menos.
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Por lo tanto, en una clase de realizaciones, el tratamiento de la célula vegetal comprende el pretratamiento con un agente crioprotector y un estabilizador. Los estabilizadores tales como, por ejemplo,
cationes divalentes, en parte, protegen a las membranas celulares de la ruptura. Los agentes crioprotectores preferidos se seleccionan entre DMSO, propilenglicol, glicerol, polietilenglicol, etilenglicol, butanodiol,
formamida, propanodiol, sorbitol, manitol y mezclas de los mismos. Los estabilizadores preferidos se seleccionan entre glutatión reducido, tetrametilurea, tetrametiltiourea, dimetilformamida, mercaptopropionil
glicina, mercaptoetilamina, selenometionina, tiourea, dimercaptopropanol, ácido ascórbico, cisteı́na, dietilditiocarbamato sódico, tiosulfato sódico, tiosulfato de plata, galato de propilo, espermina, espermidina
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y combinaciones y derivados de los mismos. El estabilizador convenientemente se emplea como una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 mM.
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En algunos procedimientos de esta clase de realizaciones, el tratamiento se realiza a una temperatura
reducida durante un primer perı́odo de tiempo y el agente crioprotector comprende un agente de vitrificación, comprendiendo la etapa de vitrificación incubar la célula vegetal en la solución de vitrificación que
contiene una concentración mayor del agente de vitrificación durante un segundo perı́odo de tiempo. El
primer perı́odo de tiempo convenientemente es de aproximadamente una hora a aproximadamente 7 dı́as,
y el segundo perı́odo de tiempo es convenientemente de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente
2 horas.
La invención incluye procedimientos en los que el pretratamiento con un agente crioprotector y un
catión divalente implica la adición del catión divalente a la solución de vitrificación. También incluye
procedimientos en los que la solución de vitrificación comprende una sustancia seleccionada entre DMSO,
propilenglicol, glicerol, polietilenglicol, etilenglicol, butanodiol, formamida, propanodiol, sorbitol, manitol
y mezclas de los mismos.
La invención incluye procedimientos que comprenden aclimatar la célula vegetal estabilizada a una
temperatura reducida, siendo la temperatura reducida opcionalmente de aproximadamente 1◦ C a aproximadamente 15◦ C. En tales procedimientos, el pretratamiento puede implicar el cultivo de la célula vegetal
en medio que contiene un agente de carga y dicho estabilizador durante una perı́odo comprendido entre
aproximadamente una hora y aproximadamente siete dı́as a aproximadamente la temperatura ambiente.
En la invención también se incluyen procedimientos que comprenden además introducir en la célula vegetal un agente de carga; pudiendo realizarse la carga y la vitrificación de una forma sustancialmente
simultánea. En una realización, las células aclimatadas se cargan con un agente de carga que puede ser el
mismo que el agente de vitrificación y las células cargadas se vitrifican con una solución de vitrificación.
Un segundo aspecto de la invención comprende un procedimiento para recuperar células vegetales
crioconservadas que comprende una combinación de los tratamientos indicados a continuación:
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a) descongelación de las células vegetales crioconservadas a una temperatura por encima del punto de
congelación;
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b) incubación de las células vegetales descongeladas en un medio de crecimiento que contiene un
estabilizador o un agente crioprotector y un estabilizador, siendo el estabilizador un antioxidante, un
eliminador de radicales de oxı́geno, un inhibidor de etileno, un compuesto que se intercala en la bicapa
lipı́dica de la célula (por ejemplo, un esterol, un fosfolı́pido, un glicolı́pido o una glicoproteı́na), un catión
divalente o una mezcla de los mismos; y
c) recuperación de las células vegetales viables.
El agente crioprotector convenientemente es un azúcar y/o un aminoácido y preferiblemente se selecciona entre sorbitol, manitol, sacarosa, trehalosa, prolina y mezclas de los mismos.
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Los procedimientos de recuperación preferidos incluyen además, antes de la etapa (c), la etapa de
retirar el agente crioprotector, tal como por dilución de la mezcla o sedimentación; opcionalmente, la
etapa de eliminación comprende lavados múltiples de células ajustadas osmóticamente con dicho medio de crecimiento que contiene concentraciones decrecientes de dicho agente crioprotector y/o donde el
agente crioprotector se retira después de un perı́odo de tiempo y la incubación de las células vegetales
se continúa en medio de crecimiento y en suspensión. Otra clase de procedimientos de recuperación son
aquellos en los que el inhibidor de etileno es
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(i) un inhibidor de la biosı́ntesis de etileno que opcionalmente se selecciona entre espermidina, espermina, catecol, galato de n-propilo, hidroquinona, ácido ferúlico, alar, feniletilamina, alcohol salicı́lico,
indometacina y combinaciones de los mismos; o
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(ii) un inhibidor de la acción del etileno, siendo dicho inhibidor de la acción de etileno opcionalmente
una sal de plata y seleccionándose opcionalmente la sal de plata entre tiosulfato de plata, nitrato de plata,
cloruro de plata, acetato de plata, fosfato de plata, sulfato de plata, nitrito de plata, y combinaciones de
los mismos.
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Otro aspecto de la invención es un procedimiento para recuperar células vegetales crioconservadas en
suspensión que comprende una combinación de los siguientes tratamientos:
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a) descongelación de las células vegetales crioconservadas a una temperatura por encima del punto de
congelación;
b) incubación de las células vegetales descongeladas en suspensión; y
c) recuperación de las células vegetales viables en suspensión.
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La invención incluye un procedimiento para producir células vegetales viables a partir de las células
crioconservadas o recuperadas por un procedimiento de la invención, y en el que son viables más de
aproximadamente un 50 % de las células vegetales recuperadas, opcionalmente en el que son viables más
de aproximadamente un 70 % de las células vegetales recuperadas o más de aproximadamente un 80 %
de las células vegetales recuperadas. Las células no se alteran genotı́pica o fenotı́picamente de forma
significativa por el procedimiento de crioconservación y tienen una alta proporción de supervivencia.
Descripción de las Figuras
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Figura 1 (A, B y C) Esquemas de diversos protocolos de crioconservación y recuperación.
Figura 2 Rutas biosintéticas de producción de etileno y puntos de inhibición.
Figura 3 Procedimiento para la crioconservación de células de Taxus.
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Figura 4 Aumento de la biomasa en una lı́nea K-1 de cultivo en suspensión de Taxus chinensis.
Figura 5 Cromatogramas de (A) células crioconservadas durante 6 meses en comparación con (B) células
no crioconservadas.
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Figura 6 Cromatogramas de (A) células crioconservadas durante 6 meses en comparación con (B) células
no crioconservadas.
Figura 7 Análisis de transferencia de Southern de la estabilidad genética de células crioconservadas.
Figura 8 Análisis por PCR de la estabilidad genética de células crioconservadas.
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Descripción de la Invención
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Como se incluye y se describe ampliamente en este documento, la presente invención se refiere a
procedimientos para la crioconservación de células vegetales, a procedimientos para la recuperación de
células vegetales crioconservadas y a un procedimiento para producir células vegetales viables que se
hayan recuperado satisfactoriamente de una crioconservación.
Las células vegetales cada vez son más útiles para la producción de proteı́nas recombinantes o de productos y agentes quı́micos caracterı́sticos que son especı́ficos para las plantas o para las rutas enzimáticas
de las células vegetales. Las células vegetales, tales como cultivos de callos, pueden mantenerse en un
estado continuo por medio de un subcultivo repetido. Sin embargo, el subcultivo a menudo produce un
aumento de la ploidia, un mayor riesgo de contaminación, una acumulación de mutaciones espontáneas,
una reducción y pérdida del potencial morfogenético, una reducción de la capacidad biosintética para la
formación de productos, una reversión de lı́neas seleccionadas a tipos silvestres, envejecimiento y transformación de lı́neas celulares infinitas y selección no intencionada de fenotipos indeseables. Cada uno
de estos factores puede afectar gravemente a la explotación de sistemas de cultivo de células para la
producción comercial de compuestos valiosos.
Aunque las células de cultivos de tejidos animales se han crioconservado rutinariamente durante muchos años, las técnicas de crioconservación similares para células vegetales han resultado mucho más
difı́ciles. Las células vegetales y, en particular, las células vegetales en cultivo, presentan una serie de
heterogeneidades con respecto a la velocidad de crecimiento, el tiempo de duplicación, el ı́ndice mitótico,
la sincronı́a celular, la relación entre el núcleo y el citoplasma y el grado de vacuolización. Las células
presentes en cualquier cultivo dado también presentan una diversidad de variaciones fisiológicas y morfológicas. Además, las suspensiones de células vegetales y los cultivos de células adherentes requieren
diferentes protocolos para la crioconservación. Además, si se realiza de forma inapropiada, la crioconservación puede inducir muchas mutaciones que está intentando prevenir el procedimiento.
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Sorprendentemente, se ha descubierto que mediante el uso de una serie de etapas y agentes especı́ficos,
pueden crioconservarse y recuperarse satisfactoriamente células vegetales de la mayorı́a de géneros y especies. Estos procedimientos se basan en las observaciones de que una crioconservación satisfactoria de
células vegetales implica la eliminación de cantidades sustanciales de agua de las células y que, en condiciones apropiadas, pueden retirarse cantidades significativas de agua sin afectar seriamente a la viabilidad
celular. Los protocolos de crioconservación desarrollados son muy satisfactorios en el almacenamiento,
mantenimiento y recuperación de células viables de una manera rutinaria y reproducible. Estos protocolos pueden establecerse en operaciones unitarias rutinarias para crear sistemas de almacenamiento de
plasma germinal y sistemas de tratamientos de bancos de células. Además, las células pueden recuperarse
totalmente en suspensión lı́quida, un procedimiento que previamente se consideraba que no era posible
con cultivos vegetales. Los productos recogidos a partir de las células crioconservadas no varı́an significativamente de la célula original o parental, ya que se produce poca o ninguna variación fenotı́pica o
genotı́pica, particularmente con respecto al crecimiento y la viabilidad, la formación de productos y la
proliferación de biomasa celular. Las variaciones se determinan a partir de las alteraciones fenotı́picas o
morfológicas observables o cuantificables. Estas alteraciones se vuelven significativas cuando reducen el
parámetro fenotı́pico en más de un pequeño grado.
Una realización de la invención se refiere a procedimientos para la crioconservación de células vegetales. Estos procedimientos son sorprendentemente reproducibles y aplicables a muchos tipos de células
vegetales. Como tales, serán notablemente útiles para la producción de materiales que requieren patrones
de reproducibilidad gubernamentales u oficiales.
El procedimiento básico implica la eliminación de cantidades sustanciales de agua de la célula por una
combinación de (a) tratamiento de la célula vegetal por liofilización, choque térmico o por pretratamiento
con un agente crioprotector y un estabilizador especificado, (b) vitrificación (que puede ser por etapas
o de una sola dosis) y (c) congelación. El estabilizador es uno más de un antioxidante, un eliminador
de radicales de oxı́geno, un catión divalente, un inhibidor de etileno y un compuesto que se intercala
en la bicapa lipı́dica de la célula. Opcionalmente, el procedimiento incluye etapas de aclimatación en
frı́o, de carga por etapas o de una sola dosis y de descongelación. Es posible una amplia diversidad de
combinaciones de estas etapas y no se requieren necesariamente todas las etapas para conseguir la crioconservación satisfactoria y la recuperación de células vegetales viables que retengan las caracterı́sticas
y las propiedades de crecimiento que las hacen deseables. Algunas de las posibles combinaciones de
las diversas realizaciones de las etapas se representan esquemáticamente en las Figuras 1A, 1B y 1C,
aunque se entiende que estas variaciones son sólo ejemplares. Es más que probable que cada tipo de
planta (por ejemplo, clase, orden, familia, género, especie, subespecie o variedad) tenga su propia serie de
condiciones preferidas que maximicen la recuperación de la crioconservación. A partir de las variaciones
seleccionadas descritas en este documento, pueden determinarse fácilmente parámetros óptimos para la
crioconservación.
Casi cualquier célula vegetal puede crioconservarse y recuperarse satisfactoriamente usando estos procedimientos, incluyendo las gimnospermas y las angiospermas. Los tipos especı́ficos de gimnospermas que
pueden crioconservarse incluyen especies de los géneros Abies (abetos), Cypressus (cipreses), Ginkgo (árbol
de cabello de Venus), Juniperus (enebro), Picea (picea), Pinus (pino), Pseudotsuga (pino de Oregón), Sequoia, Taxus (tejo), Tsuga (cicuta) o Zamia (cı́cada). Algunas de las especies más útiles de Taxus incluyen
T. baccata, T. brevifolia, T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. floridana, T. globosa, T. media,
T. nucifera y T. wallichiana. Las angiospermas que pueden conservarse incluyen células vegetales de
monocotiledóneas y células vegetales de dicotiledóneas. Las células vegetales de monocotiledóneas incluyen una diversidad de especies del género Avena (avena), Cocos (coco), Dioscorea (batata), Hordeum
(cebada), Musa (plátano), Oryza (arroz), Saccharum (caña de azúcar), Sorghum (sorgo), Triticum (trigo)
y Zea (maı́z). Las plantas dicotiledóneas incluyen especies de los géneros Achyrocline, Atropa, Brassica
(mostaza), Berberis, Sophora, Legume, Lupinus, Capsicum, Catharanthus, Conospermum, Datura, Daucus (zanahoria), Digitalis, Echinacea, Eschscholtzia, Glycine (soja), Gossypium (algodón), Hyoscyamus,
Lycopersicum (tomate), Malus (manzana), Medicago (alfalfa), Nicotiana, Panax, Pisum (guisante), Rauvolfia, Ruta, Solanum (patata) y Trichosanthes.
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Las células vegetales pueden ser muestras recién recolectadas del campo tales como acı́culas de crecimiento nuevo, hojas, raı́ces, corteza, tallos, rizomas, células de callos, protoplastos, suspensiones celulares,
órganos o sistemas de órganos, meristemos tales como meristemos apicales, semillas o embriones. Generalmente, las células de un bajo número de pasadas y los cultivos primarios muestran una mayor viabilidad
final en cultivo o tras la recuperación de la crioconservación. Como alternativa, pueden obtenerse células
de muestra a partir de cultivos in vitro establecidos. Los cultivos pueden haberse establecido hace mucho
tiempo o pueden haberse adaptado sólo recientemente a condiciones in vitro de, por ejemplo, temperatu6
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ras especı́ficas, en particular intensidades de luz o medios especiales de crecimiento o de mantenimiento.
Tales células pueden mantenerse como células en suspensión o por crecimiento en medio nutriente semisólido.
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Los cultivos en suspensión pueden proceder de cultivos de callos de una especie de Taxus o de células
crioconservadas descongeladas de una especie de Taxus. Es muy valioso conservar lı́neas celulares primarias de bajo número de pasadas, ya que estos cultivos pueden presentar caracterı́sticas únicas que se
pierden con un tiempo prolongado en cultivo. Muchas de estas lı́neas celulares expresan diterpenoides
tales como el diterpenoide alcaloide taxano, el taxano modificado en cadena lateral con éster, taxol (peso
molecular 853), y una diversidad de modificaciones distintas de taxano (baccatin o 10-desacetilbaccatin).
Las células de Taxus para el cultivo pueden obtenerse a partir de cualquier material vegetal. Pueden
realizarse colecciones a partir de Norteamérica ası́ como otros continentes. El tejido de cualquier parte de
la planta, incluyendo la corteza, el cambium, acı́culas, tallos, semillas, piñas y raı́ces, pueden seleccionarse
y adaptarse para el cultivo celular. Se prefieren las acı́culas y las regiones meristemáticas de las plantas,
especialmente las acı́culas de crecimiento nuevo de uno a tres meses, para iniciar los cultivos celulares.
Por ejemplo, el tejido vegetal seleccionado se esteriliza superficialmente por inmersión en cuatro litros
de una solución al 10 % de lejı́a con 10 gotas de Tween 20 añadidas durante 20 minutos. Se cortan los
explantes de los tejidos hasta tamaños muy pequeños y se cultivan.
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Los cultivos de Taxus tı́picamente presentan variabilidad en la morfologı́a de crecimiento, productividad, perfiles de producto y otras caracterı́sticas. Como las lı́neas celulares individuales varı́an en sus
preferencias por los constituyentes del medio de crecimiento, pueden usarse muchos medios de crecimiento
diferentes para la inducción y proliferación del cultivo celular. Los procedimientos de esterilización, iniciación del crecimiento de callos y crecimiento en suspensión, ası́ como los medios nutrientes adecuados,
son bien conocidos para los especialistas habituales en la técnica.
Los cultivos en suspensión de Taxus son capaces de presentar rápidas velocidades de crecimiento y
altas densidades celulares. Se subcultivan cultivos iniciales de diversas especies de Taxus por transferencia
a medios adecuados que contienen, por ejemplo, macro- y micronutrientes, sales orgánicas y hormonas
de crecimiento. Los cultivos lı́quidos se exponen al aire y preferiblemente se agitan para airear el medio
o puede burbujearse aire en el medio. Los cultivos se mantienen a una temperatura de aproximadamente
20◦C y a un pH comprendido entre aproximadamente 3 y aproximadamente 7, y preferiblemente entre
aproximadamente 4 y aproximadamente 6. Tales cultivos pueden recogerse por eliminación del medio de
crecimiento, por ejemplo, por filtración o centrifugación. Las células con la mayor viabilidad son las que
se encuentran en una fase temprana o en una fase retrasada temprana de crecimiento de división celular
o las que han pasado recientemente a través de la división celular o mitosis. En general, es adecuada para
uso una suspensión celular de 4 a 10 dı́as de una especie de Taxus en medio de crecimiento, preferiblemente suspensiones celulares de 5 a 8 dı́as en medio de crecimiento y, más preferiblemente, suspensiones
celulares de 6-7 dı́as de una especie de Taxus en medio de crecimiento.
A continuación se presenta cada una de las etapas básicas de la crioconservación:
Pretratamiento
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Las células vegetales a crioconservar pueden pretratarse con agentes que aumentan la viabilidad celular
eliminando sustancias perjudiciales secretadas por las células al medio de cultivo durante el crecimiento
o muerte celular. Estos agentes, denominados estabilizadores en este documento, incluyen sustancias
que pueden existir de forma natural o producirse artificialmente y que pueden introducirse directamente
en el medio de cultivo. Los estabilizadores incluyen antioxidantes o agentes quı́micos de eliminación de
radicales que neutralizan los efectos perjudiciales atribuibles a la presencia de especies de oxı́geno activo
y otros radicales libres. Tales sustancias son capaces de dañar las membranas celulares, tanto internas
como externas, de tal forma que se vean seriamente comprometidas la crioconservación y la recuperación.
Si estas sustancias no se retiran o se vuelven ineficaces de otra forma, sus efectos sobre la viabilidad son
acumulativos a lo largo del tiempo limitando gravemente la vida práctica durante el almacenamiento.
Además, cuando las células mueren o se alteran, se liberan sustancias perjudiciales adicionales aumentando el daño y la muerte de las células vecinas.
Los estabilizadores útiles incluyen los agentes quı́micos y compuestos quı́micos que complejan moléculas muy reactivas y perjudiciales tales como los radicales de oxı́geno. Los ejemplos especı́ficos de estos
eliminadores de radicales y antioxidantes incluyen glutatión, 1,1,3,3-tetrametilurea, 1,1,3,3-tetrametil2-tiourea, tiosulfato sódico, tiosulfato de plata, betaı́na, N,N-dimetilformamida, N-(2-mercaptopropio7
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nil)glicina, β-mercaptoetilamina, selenometionina, tiourea, galato de propilo, dimercaptopropanol, ácido
ascórbico, cisteı́na, dietilditiocarbamato sódico, espermina, espermidina, ácido ferúlico, sesamol, resorcinol, MDL-71.897, cadaverina, putrescina, 1,3- y 1,2-diaminopropano, desoxiglucosa, ácido úrico, ácido
salicı́lico, ácido 3- y 4-amino-1,2,4-triazol, ácido benzoico, hidroxilamina y combinaciones y derivados de
tales agentes.
Otro grupo de estabilizadores incluye agentes que impiden o previenen sustancialmente la biosı́ntesis
de etileno y/o la acción del etileno. Ciertos de estos compuestos también tienen propiedades eliminadoras. Los efectos de los inhibidores de etileno son sustanciales cuando la expresión o acción del etileno se
ve afectada suficientemente para aumentar la recuperación celular en el proceso de crioconservación. Es
bien conocido que muchas células vegetales emiten etileno cuando se dañan. El etileno daña a las células
y produce muerte celular. La prevención de la generación de etileno o de la acción de etileno aumentará
adicionalmente la viabilidad celular y la recuperación celular del proceso de crioconservación.
Como se muestra en la Figura 2, hay un gran número de rutas en la biosı́ntesis de etileno y un número
igualmente grande de inhibidores. Por ejemplo, las rutas biosintéticas pueden inhibirse en la conversión de
S-adenosilmetionina (SAM) (ACC sintasa + SAM → ACC), ácido aminociclopropano carboxı́lico (ACC)
(ACC + ACC oxidasa → etileno) y etileno (etileno + etileno oxidasa → CO2 ). En la Tabla 1 se muestran
varios inhibidores biosintéticos que pueden usarse en los procedimientos de la invención.
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También hay un gran número de inhibidores de la acción de etileno. Algunos de estos compuestos se
muestran en la Tabla 2.
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Desde 1976 se sabe que los iones de plata actúan como potentes agentes contra el etileno en diversas
plantas y para mejorar la longevidad de los tejidos vegetales y cultivos celulares. Por ejemplo, la longevidad de los claveles cortados puede aumentarse por pretratamiento con sales de plata. Debido a la
inmovilidad relativa del ion de plata, se considera que un tratamiento basal del tallo es menos eficaz que
un tratamiento de pulverización directa de las flores. Se ha descubierto que la baja movilidad de los iones
de plata aumenta quelando el metal en un complejo aniónico tal como tiosulfato de plata. El tiosulfato
solo ni afecta a la biosı́ntesis de etileno ni inhibe la acción del etileno.
La inhibición de etileno mediada por iones de plata podrı́a explicarse basándose en que la plata sustituye al cobre en el mismo sitio receptor. También se ha propuesto que el cobre es el metal implicado en
las reacciones enzimáticas relacionadas con la biosı́ntesis o la acción del etileno. La similitud de tamaño
entre la plata y el cobre, el hecho de que tengan el mismo estado de oxidación y la capacidad de ambos
metales de formar complejos con el etileno proporciona credibilidad a esta idea.
Las sales de plata, incluyendo el tiosulfato de plata, inhiben la acción del etileno en plantas y en
cultivos de células vegetales, aunque tengan un efecto estimulador destacable sobre su sı́ntesis. El efecto
estimulador de los iones de plata (ingrediente activo del tiosulfato de plata) tanto sobre la biosı́ntesis de
ACC como sobre la biosı́ntesis de etileno sugiere una mayor conversión de ACC en etileno debido a la
mayor actividad de la ACC oxidasa. En la Tabla 3 se muestran algunas de las sales de plata que inhiben
la acción del etileno.
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Los estabilizadores preferiblemente se incuban con células vegetales antes de la congelación, aunque
también puede ser deseable su presencia durante el proceso de congelación, recuperación, descongelación
y rebrote. Por ejemplo, puede ser más deseable disponer de inhibidores de la biosı́ntesis de etileno y
de inhibidores de la acción de etileno en el medio de cultivo durante la descongelación y rebrote. Las
incubaciones pueden realizarse durante horas o dı́as, ya que los propios agentes generalmente no son
perjudiciales para las células y pueden incluso aumentar la viabilidad. Algunas de las lı́neas de células
vegetales más sensibles pueden requerir tratamientos más prolongados mientras que otras pueden requerir tratamientos más cortos. El perı́odo exacto de incubación puede determinarse fácilmente de forma
empı́rica. Preferiblemente, las células vegetales se cultivan en medio de crecimiento con el estabilizador o
con una combinación de estabilizadores durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10
dı́as, más preferiblemente durante un periodo de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 dı́as e incluso
más preferiblemente durante aproximadamente 3 dı́as. Este perı́odo de tiempo tı́picamente suficiente
para dañar las sustancias presentes en el medio que se desean eliminar o al menos para reducir los niveles
de manera que ya no sean perjudiciales para las células.
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El pretratamiento también puede implicar simplemente la adición de estabilizadores de membrana
tales como compuestos que se intercalan en la bicapa lipı́dica (por ejemplo, esteroles, fosfolı́pidos, glicolı́pidos, glicoproteı́nas) o cationes divalentes en el cultivo celular, la solución de carga y/o la solución
de vitrificación. Los cationes divalentes estabilizan el choque térmico y las proteı́nas de membrana, y
también reducen la repulsión electrostática entre la membrana celular y otras membranas. El magnesio,
el manganeso y el calcio son opciones preferidas, ya que son baratos y son cationes divalentes adquiribles fácilmente, por ejemplo, en forma de CaCl2 , MnCl2 y MgCl2 . El sodio es menos preferido debido
a su toxicidad a cualquier concentración por encima de las concentraciones traza. Las concentraciones
preferidas varı́an de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 30 mM, más preferiblemente, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM y, aún más preferiblemente, a aproximadamente 10 mM
o 15 mM. Además, la presencia de cationes divalentes en el medio reduce las temperaturas de congelación
y permite el paso más rápido de las células a través de los puntos de congelación. La temperatura de
formación de cristales de hielo tanto intercelular como intracelular se reduce después de la congelación
y también durante la descongelación. También pueden ser importantes la presencia de estos agentes
durante la descongelación y el cultivo posterior a la descongelación.
Las incubaciones pueden realizarse en medios lı́quidos o semisólidos tales como medio de crecimiento,
un medio que induce el metabolismo y la proliferación celular, o medio de mantenimiento, un medio que
proporciona un equilibrio de sales y nutrientes sin inducir necesariamente el crecimiento celular. Como
las células se están preparando para la crioconservación, algunas veces es deseable incubarlas en medio de
mantenimiento (un medio de cultivo subóptimo o de crecimiento lento; por ejemplo, con la cuarta parte
de la concentración de sal del medio de crecimiento normal) para reducir los procesos metabólicos de las
células.
El pretratamiento puede realizarse precultivando las células a temperatura ambiente o a temperaturas a las que se cultivan tı́picamente las células vegetales. Preferiblemente, el precultivo se realiza a
aproximadamente la temperatura ambiente (20◦ C) para facilitar la manipulación y porque la mayorı́a de
las células vegetales son bastante estables a temperatura ambiente. Los estabilizadores pueden añadirse
directamente al medio y reponerse cuando sea necesario durante el procedimiento de pretratamiento. Las
concentraciones de estabilizador son particulares para los estabilizadores especı́ficos, pero generalmente
se usan a una concentración comprendida entre aproximadamente 1 µM y aproximadamente 1 mM o,
preferiblemente, a una concentración entre aproximadamente 10 µM y aproximadamente 100 µM, aunque
no serı́a rara una concentración mayor o menor de uno o mas agentes estabilizadores.
Los pretratamientos también pueden implicar la incubación de las células en presencia de uno o más
agentes osmóticos. Los ejemplos de agentes osmóticos útiles incluyen azúcares tales como sacáridos y
derivados de sacárido, amino o iminoácidos tales como prolina y derivados de prolina, o combinaciones de
estos agentes. Algunos de los azúcares y derivados de azúcares más útiles son fructosa, glucosa, maltosa,
manitol, sorbitol, sacarosa y trehalosa. Los agentes osmóticos se utilizan a una concentración que prepara
a las células para la posterior carga, liofilización y/o vitrificación. Las concentraciones pueden variar en
gran medida entre diferentes agentes, pero generalmente están comprendidas entre aproximadamente 50
mM y aproximadamente 2 M. Estas concentraciones pueden conseguirse añadiendo pequeñas cantidades
de los agentes de forma continua o creciente a lo largo del tiempo (por etapas) hasta que se consiga un
nivel deseado. Preferiblemente, la concentración de agentes osmóticos en el medio está comprendida entre
aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,8 M, y más preferiblemente entre aproximadamente 0,2
M y aproximadamente 0,6 M. Como alternativa, el agente osmótico se emplea como una solución acuosa
a una concentración comprendida entre aproximadamente un 1 % y aproximadamente un 10 % en peso.
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Aclimatación al Frı́o
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Durante o algún tiempo después del pretratamiento, las células a crioconservar pueden aclimatarse
a una temperatura reducida con respecto a las temperaturas de cultivo, pero por encima del punto de
congelación. Esto prepara a las células para el procedimiento de crioconservación retrasando significativamente el metabolismo celular y reduciendo el choque de las rápidas transiciones de temperatura a
través de algunos de los cambios de temperatura más crı́ticos. Los intervalos de temperatura crı́ticos son
los intervalos a los que existe el mayor riesgo de lesión celular, por ejemplo, alrededor de las temperaturas
crı́ticas de formación de cristales de hielo. Como saben los especialistas habituales en la técnica, estas
temperaturas varı́an en alguna medida dependiendo de la composición de la solución. Para el agua, el
componente principal de la mayorı́a de los medios de cultivo de células, se produce formación y reformación de cristales de hielo a una temperatura de aproximadamente 0◦ C a aproximadamente -50◦ C.
La aclimatación da como resultado la acumulación de solutos endógenos que reducen el grado de deshidratación celular a cualquier potencial osmótico dado, y contribuye a la estabilización de las proteı́nas
y las membranas durante una deshidratación extrema. Además, la adaptación al frı́o interacciona
sinérgicamente con los agentes de vitrificación y ocasiona alteraciones en la conformación lı́quida de
las membranas celulares, lo cual aumenta la tolerancia tanto a las exclusiones osmóticas como a la deshidratación.
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La aclimatación puede realizarse por etapas o gradualmente. Las etapas pueden ser en incrementos
decrecientes de aproximadamente 0,5◦C a aproximadamente 10◦ C durante un perı́odo de tiempo suficiente para permitir que las células se aclimaten a la temperatura inferior sin que se produzcan lesiones.
El gradiente de temperatura, ya sea gradual o por etapas, se aumenta para que las células pasen a través
de los puntos de congelación tan rápido como sea posible. Las células pueden aclimatarse de forma gradual, por etapas o de manera continua, o pueden aclimatarse rápidamente a la temperatura reducida.
Las técnicas para la aclimatación son bien conocidas para los especialistas habituales e incluyen aclimatadores disponibles en el mercado. La aclimatación gradual comprende la reducción de las temperaturas
de incubación aproximadamente 1◦ C por hora hasta que se consiga la temperatura deseada. La aclimatación gradual es la más útil para las células consideradas más sensibles y difı́ciles de crioconservar. La
aclimatación por etapas comprende poner las células a una temperatura reducida durante un perı́odo de
tiempo, y a una temperatura reducida adicionalmente durante otro perı́odo de tiempo. Estas etapas se
repiten cuando se requiera.
Las células en suspensión pueden estar en una fase de división celular retrasada tardı́a o en una fase
de división celular temprana para conseguir los mayores porcentajes de supervivencia tras la congelación
y descongelación. Las células que no están en estas fases presentan mayores grados de vacuolización y
diferenciación y son de mayor tamaño, aumentando de esta forma el riesgo de lesiones durante la congelación y reduciendo los porcentajes de supervivencia tras la congelación y descongelación.
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Carga
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La carga implica el equilibrio de las células en una solución de uno o más crioprotectores. Los agentes
utilizados durante la carga pueden denominarse agentes de carga. Los agentes de carga útiles pueden
incluir uno o más agentes deshidratantes, agentes de infiltración y agentes no infiltrantes, y agentes
osmóticos. Los agentes adecuados para la carga incluyen agentes que inducen la deshidratación celular
tras la introducción en una suspensión celular. Pueden usarse tanto agentes de infiltración tales como
DMSO y etilenglicol, como una combinación de agentes osmóticos infiltrantes y no infiltrantes tales como
fructosa, sacarosa o glucosa, y sorbitol, manitol o glicerol. Esta etapa aumenta la concentración de solutos del citosol introduciendo concentraciones moderadas de agentes crioprotectores, generalmente a una
concentración entre aproximadamente 0,5 M y aproximadamente 2 M o entre aproximadamente un 5 %
y aproximadamente un 20 % en peso en el citosol. Para minimizar el tiempo requerido para el equilibrio,
la carga normalmente se realiza a aproximadamente la temperatura ambiente, aunque las condiciones
óptimas de temperatura y otras condiciones para la carga preferiblemente equipararán condiciones tales
como el medio, intensidades de la luz y niveles de oxı́geno que mantienen un cultivo de células viables.
En la etapa de carga, pueden añadirse directamente al medio de incubación agentes crioprotectores
individuales o combinaciones de diferentes agentes crioprotectores, de forma continua o por etapas. Algunas veces se desea la carga por etapas para facilitar la liberación del agente de carga en las células,
ya que es algo más suave que la carga de una sola dosis. Los incrementos de tiempo o intervalos entres
las adiciones para la carga por etapas pueden variar de minutos a horas o más, pero preferiblemente son
de aproximadamente uno a aproximadamente diez minutos, más preferiblemente de aproximadamente
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uno a aproximadamente cinco minutos y aún más preferiblemente de aproximadamente uno o aproximadamente dos minutos. El número de adiciones en un procedimiento de carga por etapas tı́picamente
es cualquiera que sea práctico y puede variar de muy pocas a una gran pluralidad. Preferiblemente,
son menos de aproximadamente veinte adiciones, más preferiblemente menos de aproximadamente diez
e incluso más preferiblemente aproximadamente cinco. Los perı́odos de intervalos y los números de intervalos se determinan fácilmente por un especialista habitual en la técnica para un tipo particular de
célula y agente de carga. Las células se incuban en una solución que contiene el agente o agentes de
carga (con cantidades crecientes de forma continua o por etapas de agente de carga) para equilibrar las
concentraciones intracelular y/o extracelular del agente. Los tiempos de incubación varı́an de minutos a
horas según sea práctico. Los efectos protectores de la carga incluyen, en parte, la eliminación de una
cantidad pequeña pero significativa de agua de la célula. Esto prepara a la célula para la vitrificación
y/o liofilización posterior minimizando el choque de una pérdida de agua intracelular repentina.
Después de la carga, el medio de crecimiento que contiene el agente crioprotector puede retirarse o,
si el siguiente agente (agente de vitrificación) que se va a utilizar es el mismo o es un agente similar, el
agente de carga puede mantenerse y simplemente puede aumentarse la concentración para la vitrificación.
Vitrificación
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Las células a crioconservar se vitrifican después del pretratamiento, carga y/o liofilización. Hay varias
ventajas de los procedimientos de vitrificación. Al impedir la formación de cristales de hielo en el sistema,
se elimina la necesidad de optimizar la serie compleja de variables que conducen a la formación de hielo.
Además, las muestras pueden sumergirse directamente en nitrógeno lı́quido, el procedimiento no requiere
el amplio equipo requerido para la refrigeración controlada. El procedimiento de vitrificación también
ofrece el mayor potencial para el desarrollo de procedimientos de crioconservación para tejidos y órganos
complejos que se componen de varios tipos de células diferentes.
Los procedimientos de vitrificación implican una deshidratación osmótica gradual o por etapas de
las células o muestras antes de su inactivación en nitrógeno lı́quido. En procedimientos de vitrificación,
la deshidratación celular se realiza por exposición directa a soluciones concentradas antes de la refrigeración en nitrógeno lı́quido. La exposición puede ser gradual, añadiendo cantidades continuamente
crecientes de la solución de vitrificación a las células, o por etapas, donde se añaden cantidades crecientes
durante un perı́odo de tiempo establecido. Los incrementos de tiempo o intervalos entre las adiciones
para la vitrificación por etapas pueden variar de minutos a horas o más, pero preferiblemente son de
aproximadamente uno a aproximadamente diez minutos, más preferiblemente de aproximadamente uno
a aproximadamente cinco minutos y aún más preferiblemente aproximadamente uno o aproximadamente
2 minutos. El número de adiciones en un procedimiento de vitrificación por etapas tı́picamente es cualquiera que sea práctico y puede variar de muy pocos a una gran pluralidad. Preferiblemente, se realizan
menos de aproximadamente 20 adiciones, más preferiblemente menos de aproximadamente 10 e incluso
más preferiblemente aproximadamente 5. Los perı́odos de los intervalos y el número de intervalos se determinan fácilmente por un especialista habitual en la técnica para un tipo particular de célula y agente
de vitrificación. Las células se incuban en una solución que contiene el agente o agentes de vitrificación
(con cantidades crecientes continuamente o por etapas) para equilibrar las concentraciones intracelulares
y/o extracelulares del agente cuando se desee. Los tiempos de incubación varı́an de minutos a horas,
según sea práctico. En condiciones ideales, las células u órganos pueden enfriarse a velocidades extremadamente rápidas sin experimentar la formación de hielo intercelular o intracelular. Como resultado, se
evitan todos los factores que afectan a la formación de hielo y hay varias ventajas prácticas de los procedimientos de vitrificación en comparación con los procedimientos de crioconservación convencionales.
La vitrificación ofrece el mayor potencial de creación de procedimientos de crioconservación para tejidos
y órganos complejos. Al impedir una formación significativa de hielo en el sistema, el procedimiento de
vitrificación es operativamente más complejo que los procedimientos de crioconservación convencionales.
Además, la vitrificación permite el uso de velocidades de refrigeración ultrarrápidas para evitar los problemas de sensibilidad al enfriamiento de algunas muestras. No se requiere ningún equipo especializado
ni caro para controlar las velocidades de refrigeración.
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La vitrificación es un procedimiento criogénico en el que un citosol muy concentrado se super-enfrı́a
para formar un vidrio sólido metaestable sin cristalización sustancial. La mayor dificultad en la crioconservación de cualquier célula es la formación de cristales de hielo intracelulares tanto durante la
congelación como durante la descongelación. Una formación de cristales de hielo excesiva conducirá a la
muerte celular debido a la rotura de las membranas celulares y de los orgánulos. Un procedimiento para
impedir la formación de cristales de hielo es congelar las células rápidamente de tal forma que los cristales
de hielo formados no sean suficientemente grandes como para originar un daño significativo. Cuando una
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célula con un bajo contenido de agua se congela rápidamente, se vitrifica. La vitrificación por congelación rápida no es posible con células tales como células vegetales que contienen un alto contenido de
agua. Para vitrificar células con un alto contenido de agua, se necesitan agentes que reducen el punto de
congelación e inhibidores de los cristales de hielo además de una congelación rápida para la vitrificación.
Una célula vitrificada de manera apropiada forma un sólido amorfo congelado transparente que consta de
cristales de hielo demasiado pequeños como para difractar la luz. Si una célula vitrificada se deja calentar
a aproximadamente -40◦C, puede experimentar una desvitrificación. En la desvitrificación, los cristales
de hielo aumentan y se consolidan en un proceso que generalmente es perjudicial para la supervivencia
celular. Las soluciones de vitrificación aumentan la vitrificación de células tras la congelación o retrasan
la desvitrificación tras la descongelación.
La mayorı́a de las soluciones de crioconservación pueden transformar el material objeto en un vidrio
o en un material parecido a un vidrio siempre que las velocidades de refrigeración sean suficientemente
rápidas como para prevenir la nucleación y el crecimiento de los cristales de hielo, dependiendo la velocidad de refrigeración crı́tica de la concentración de soluto. De forma similar, puede realizarse una
vitrificación de las células si el citosol se concentra suficientemente. En procedimientos de crioconservación, esto se consigue deshidratando las células en soluciones extremadamente concentradas antes de
la inactivación en nitrógeno lı́quido. En el procedimiento de crioconservación, el citosol se conserva al
nivel requerido para la vitrificación poniendo las muestras en una solución concentrada de un crioprotector tal como el agente de vitrificación. Se prefieren concentraciones tales como de aproximadamente
4 M a aproximadamente 10 M, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 % en peso.
Esto produce una deshidratación extrema de las células de la muestra. Las soluciones superiores a 7
M tı́picamente retiran más del 90 % del agua osmóticamente activa de las células; sin embargo, pueden
determinarse empı́ricamente las concentraciones precisas para cada agente. Los agentes de vitrificación
que pueden usarse incluyen DMSO, propilenglicol, glicerol, polietilenglicol, etilenglicol, butanodiol, formamida, propanodiol y mezclas de estas sustancias.
Las soluciones de vitrificación adecuadas incluyen medio de cultivo con DMSO (1-50 %), propilenglicol
(aproximadamente 5-25 %), glicerol (aproximadamente 0-50 %), PEG-8000 (aproximadamente 5-20 %),
etilenglicol (aproximadamente 10-75 %), etilenglicol/sorbitol (de aproximadamente un 60/20 por ciento
en peso a aproximadamente un 10/60 por ciento en peso), y etilenglicol/sorbitol (aproximadamente un
40/30 por ciento en peso). Se prefiere el etilenglicol/sorbitol y puede emplearse a concentraciones de, por
ejemplo, 50/30 %, 45/35 %, 40/40 %, 40/30 %, 30/50 % y, preferiblemente, 30/40 %. Tales soluciones de
vitrificación pueden utilizarse a temperaturas de aproximadamente 1◦ C a aproximadamente 8◦C, preferiblemente a una temperatura de 2◦ C a 6◦C, y más preferiblemente a aproximadamente 4◦C.
Para minimizar las consecuencias perjudiciales de la exposición a las soluciones de vitrificación, puede
realizarse una deshidratación a una temperatura de aproximadamente 0◦ C a aproximadamente 4◦C, con
un tiempo de exposición tan breve como sea posible. En estas condiciones, no hay una entrada apreciable
de crioconservación adicional en las muestras, debido a la diferencia en el coeficiente de permeabilidad
para el agua y los solutos. Como resultado, las muestras permanecen contraı́das y el aumento en la
concentración citosólica requerido para la vitrificación se consigue por deshidratación. Sin embargo, no
siempre se requiere un equilibrio (carga) de las células con crioprotectores para conseguir una vitrificación
satisfactoria de células u órganos vegetales. Por ejemplo, en algunos casos, el precultivo con agentes de
carga consigue los mismos fines que la etapa de carga.
En los casos en los que se requiere la carga, principalmente sirve para prevenir la desestabilización
inducida por la deshidratación de las membranas celulares y posiblemente de las proteı́nas. Sin embargo,
en ausencia de una etapa de carga, puede haber menos supervivencia de las células después de las etapas
de deshidratación y de refrigeración/calentamiento. De esta forma, el etilenglicol intracelular u otros
crioprotectores durante la etapa de carga no sólo favorece la vitrificación de las células durante la refrigeración, sino que también protege a las células contra las lesiones durante la etapa de deshidratación.
Liofilización
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Con la liofilización se pretende reducir el contenido de agua de las células antes de la crioconservación
por evaporación al vacı́o. La liofilización elimina aproximadamente el 60 % del agua de las células y, en
combinación con la vitrificación, puede eliminar hasta aproximadamente el 95 %. La evaporación al vacı́o
implica poner las células en un medio con una presión de aire reducida. Dependiendo de la velocidad de
eliminación de agua deseada, la presión ambiental reducida que funciona a temperaturas comprendidas
entre aproximadamente -30◦ C y -50◦C puede ser de 100 torr, 1 torr, 0,01 torr o menos. En condiciones
de presión reducida, la velocidad de evaporación de agua se aumenta de tal forma que durante una noche
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pueda eliminarse hasta un 65 % del agua de una célula. En las condiciones óptimas, la eliminación de
agua puede realizarse en pocas horas o menos. La pérdida de calor durante la evaporación mantiene a las
células en un estado refrigerado. Por medio de un ajuste cuidadoso del nivel de vacı́o, las células pueden
mantenerse a una temperatura de aclimatación frı́a durante el procedimiento de evaporación al vacı́o.
Un vacı́o fuerte, aunque permite una rápida eliminación de agua, expone a las células al riesgo de congelación. La congelación puede controlarse aplicando calor a las células directamente o ajustando el nivel
de vacı́o. Cuando las células se ponen inicialmente en la cámara de evaporación, puede aplicarse un alto
vacı́o porque el calor residual de las células prevendrá la congelación. Según procede la deshidratación
y se reduce la temperatura de la célula, puede reducirse el vacı́o o puede aplicarse calentamiento para
prevenir la congelación. Las células semisecas pueden tener una tendencia a dispersarse en una cámara
de evaporación. Esta tendencia es especialmente alta al final del tratamiento, cuando se deja que entre de
nuevo una corriente de aire en la cámara. Si la corriente de aire se aproxima a las células semisecas, puede
hacer que las células se transporten por el aire y se produzca una contaminación cruzada de las muestras.
Para impedir tales alteraciones, puede realizarse una refrigeración evaporativa en una centrı́fuga de vacı́o
en la que las células están encerradas en un tubo por una fuerza centrı́fuga mientras se secan. La cantidad
de agua eliminada en el proceso puede controlarse periódicamente tomando mediciones del peso seco de
las células. Cuando se haya retirado la cantidad de agua deseada, puede añadirse directamente la solución
de vitrificación a las células semisecas durante un perı́odo de tiempo previo a la congelación directa en
nitrógeno lı́quido.
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Congelación
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Las células vegetales, que pueden haberse pretratado, cargado, vitrificado y/o liofilizado, se conservan
por congelación a temperaturas de crioconservación. La etapa de congelación debe ser suficientemente
rápida como para prevenir la formación de cristales de hielo grandes que son perjudiciales para la supervivencia de las células. Las células pueden congelarse directamente, es decir ponerse en contacto
directamente con un agente que ya esté a la temperatura de crioconservación. Los métodos directos
incluyen goteo, pulverización, inyección o vertido de las células directamente en fluido a temperatura
criogénica, tal como nitrógeno lı́quido o helio lı́quido; por ejemplo, en una clase de procedimientos, se
congelan y se almacenan células vegetales vitrificadas y liofilizadas a la temperatura de crioconservación
inactivando las células en nitrógeno lı́quido. Las células también pueden ponerse en contacto directamente con un sólido enfriado, tal como un bloque de acero congelado con nitrógeno lı́quido. El fluido
criogénico también puede verterse directamente en un recipiente de células. El procedimiento directo
también incluye poner en contacto las células con gases, incluyendo aire, a una temperatura criogénica.
Después puede insuflarse directamente una corriente de gas criogénica de nitrógeno o helio o burbujearse
en la suspensión de células.
Los procedimientos indirectos implican poner las células en un recipiente y poner en contacto el recipiente con un sólido, lı́quido o gas a temperatura criogénica. Los recipientes apropiados incluyen, por
ejemplo, viales de plástico, viales de vidrio o ampollas que están diseñados para soportar temperaturas
criogénicas. Los recipientes para los métodos de congelación indirectos no tienen que ser impermeables
al aire o a los lı́quidos. Por ejemplo, son adecuadas una bolsa de plástico o papel de aluminio. Además,
el recipiente no necesariamente tiene que ser capaz de soportar las temperaturas criogénicas. También
puede usarse un vial de plástico que se agriete, pero que permanezca sustancialmente intacto a temperaturas criogénicas. Las células también pueden congelarse poniendo una muestra de células en un lado
de una lámina metálica mientras que el otro lado de la lámina entra en contacto con un gas, sólido o
lı́quido a temperatura criogénica. La congelación debe ser suficientemente rápida como para inhibir la
formación de cristales de hielo. El tiempo de congelación debe ser de aproximadamente 5 minutos, 4 minutos, 3 minutos, 2 minutos, un minuto o menos. El tiempo de congelación crı́tico debe medirse a partir
del marco de referencia de una sola célula. Por ejemplo, pueden requerirse 10 minutos para verter una
muestra grande de células en nitrógeno lı́quido, sin embargo, la célula individual se congela rápidamente
por este procedimiento.
Descongelación
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Otra realización de la invención se refiere a procedimientos para descongelar células crioconservadas.
La descongelación y recuperación apropiadas son esenciales para la supervivencia de las células y para
la recuperación de las células en un estado sustancialmente igual al estado en el que se congelaron originalmente. Como la temperatura de las células crioconservadas aumenta durante la descongelación, se
consolidan cristales de hielo pequeños y aumentan de tamaño en un proceso denominado desvitrificación.
Los cristales de hielo intracelulares grandes generalmente son perjudiciales para la supervivencia celular.
Para prevenir la desvitrificación, las células crioconservadas deben descongelarse tan rápido como sea
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posible. La velocidad de calentamiento puede ser de al menos aproximadamente 30◦ C por minuto a 60◦C
por minuto. También pueden usarse velocidades de calentamiento más rápidas, de 90◦ C por minuto,
de 140◦C por minuto a 200◦ C por minuto o mayores. Aunque se desea un calentamiento rápido, las
células vegetales tienen una capacidad reducida de sobrevivir a temperaturas de incubación significativamente por encima de la temperatura ambiente. Para prevenir un sobrecalentamiento, la temperatura de
la célula debe controlarse cuidadosamente. Puede emplearse cualquier procedimiento de calentamiento
incluyendo conducción, convección, radiación, radiaciones electromagnéticas o combinaciones de las mismas. Los procedimientos de conducción implican la inmersión en baños de agua, la colocación en bloques
de calor o la colocación directa en una llama. Los métodos de convección implican el uso de una pistola
térmica o un horno. Los procedimientos de radiación implican, por ejemplo, lámparas de calor u hornos
tales como hornos de convección o de radiación. La radiación electromagnética implica el uso de hornos de microondas y dispositivos similares. Algunos dispositivos pueden calentar por una combinación
de procedimientos. Por ejemplo, un horno calienta por convección y por radiación. El calentamiento
debe terminarse tan pronto como las células y las soluciones circundantes estén en forma lı́quida, lo cual
debe ocurrir por encima de 0◦C. Las células crioconservadas a menudo se congelan en presencia de uno
o más agentes que reducen el punto de congelación. Cuando están presentes estos agentes, las células
congeladas pueden licuar a una temperatura inferior a 0◦ C, tal como a aproximadamente -10◦C, -20◦ C,
-30◦C o -40◦C. La descongelación de las células crioconservadas puede terminarse a cualquiera de estas
temperaturas o a una temperatura por encima de 0◦ C.
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Post-Descongelación
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La dilución de la solución de vitrificación y la eliminación del crioconservante de las células, que se
denomina descarga, debe realizarse tan rápido como sea posible y tan pronto como sea posible después
de la descongelación de la muestra de células crioconservadas. Debido a las altas concentraciones intracelulares de crioconservante, se prefiere realizar la dilución del medio de suspensión mientras se minimiza
la expansión osmótica. Por lo tanto, la dilución del medio de suspensión y la salida del crioconservante
del interior de la muestra normalmente se realiza por dilución en un medio hipertónico o en una dilución
por etapas.
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Las células descongeladas pueden aclimatarse gradualmente a condiciones de crecimiento para maximizar la supervivencia. Los agentes de vitrificación pueden ser citotóxicos, citostáticos o mutagénicos,
y deben retirarse de las células descongeladas a una velocidad que no perjudique a las células. Pueden
usarse varios procedimientos de eliminación tales como resuspensión y centrifugación, diálisis, lavado en
serie, biocorrección y neutralización con agentes quı́micos, o radiación electromagnética. La rápida eliminación de algunas soluciones de vitrificación y agentes osmóticos puede aumentar las tensiones celulares
y la muerte celular y, por lo tanto, es posible que la etapa de eliminación tenga que ser gradual. Las
velocidades de eliminación pueden controlarse por lavado en serie con soluciones que contienen menos
agentes osmóticos o de vitrificación. Otro procedimiento para reducir la velocidad de eliminación incluye
diálisis con membranas menos permeables, y crecimiento seriado en medios semisólidos o lı́quidos que
contienen cada vez menos concentraciones de agentes de vitrificación. Otros procedimientos incluyen diluciones graduales, diálisis, biocorrección, neutralización y fragmentación catalı́tica del agente criogénico.
Pueden realizarse tratamientos de descongelación y de pos-descongelación en presencia de estabilizadores para asegurar la supervivencia y minimizar las lesiones genéticas y celulares. El estabilizador
es un antioxidante, un eliminador de radicales de oxı́geno, un inhibidor de etileno, un catión divalente
(por ejemplo, calcio, magnesio o manganeso) o una mezcla de los mismos, y reduce, elimina o neutraliza
los agentes perjudiciales que se producen por la crioconservación. Tales agentes perjudiciales incluyen
radicales libres, oxidantes y etileno. Algunos de estos agentes tienen múltiples propiedades y son muy
útiles a este respecto. Las velocidades de supervivencia y de rebrote sorprendentemente aumentan con la
adición de estabilizadores durante las etapas de descongelación y post-descongelación. Los estabilizadores particularmente preferidos se seleccionan entre glutatión reducido, tetrametilurea, tetrametiltiourea,
dimetilformamida, mercaptopropionil glicina, mercaptoetilamina, selenometionina, tiourea, dimercaptopropanol, tiosulfato sódico, tiosulfato de plata, ácido ascórbico, cisteı́na, dietilditiocarbamato sódico,
espermina, espermidina, galato de propilo y combinaciones y derivados de los mismos.
Las células pueden volverse a cultivar en un medio adecuado después de que los niveles de agentes
osmóticos o de vitrificación se hayan reducido hasta un nivel aceptable. Un procedimiento para el rebrote
implica poner las células descongeladas en medio de crecimiento semisólido, tal como placas de Agar,
hasta que se forme un callo. Las células pueden recuperarse del callo y cultivarse en un cultivo lı́quido.
Como alternativa, las células del callo pueden inducirse para desarrollar brotes y raı́ces poniéndolas en un
medio semisólido que contenga las hormonas apropiadas. Las células de callo con brotes y raı́ces pueden
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aclimatarse gradualmente al crecimiento en un sustrato estéril en un invernadero hasta que se desarrolle
una planta. La planta de invernadero puede aclimatarse al crecimiento en el exterior de un invernadero
en su medio natural.
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Como alternativa, una célula puede descongelarse y volverse a cultivar sin el uso de medios semisólidos.
Es decir, después de la eliminación de los agentes osmóticos y de vitrificación, las células pueden ponerse
directamente en un medio lı́quido para el rebrote. De esta manera, la invención incluye procedimientos
para recuperar células vegetales en suspensión, en los que se incuban células vegetales descongeladas en
suspensión lı́quida y las células viables se recuperan en un medio lı́quido sin necesidad de un cultivo sólido
o semisólido.
La inclusión de una o más de las variaciones descritas en este documento puede aumentar sustancialmente la recuperación celular después de la crioconservación de una diversidad de tipos celulares.
Estos procedimientos previenen problemas asociados con la toxicidad debida a los crioprotectores, la
acumulación de etileno, la acción de etileno sobre dianas especı́ficas incluyendo los receptores asociados
a la membrana, la inestabilidad de las membranas y la salida a través de las membranas. A partir de
los procedimientos descritos en este documento, se han identificado combinaciones particulares de etapas
como combinaciones óptimas para ciertos tipos celulares. Por ejemplo, las células de tomate, patata y
tabaco responden bien a la crioconservación usando la carga por etapas y/o vitrificación con cationes
divalentes (Protocolos 10, 12, 13, 14).
En la Figura 3 se representa esquemáticamente un procedimiento para realizar la crioconservación
de células vegetales, por ejemplo, células de Taxus que producen taxol. En resumen, una célula de callo
desarrollada a partir de un aislado primario o de un cultivo celular se adapta para el cultivo en medio de
crecimiento lı́quido. Después de haber ajustado las células al cultivo lı́quido, se transfieren a un medio de
crecimiento de pretratamiento que contiene un agente osmótico y un estabilizador durante un periodo de
24 a 72 horas. Las células precultivadas posteriormente se aclimatan al frı́o por incubación del cultivo de
pretratamiento a 4◦ C durante un perı́odo de 1 a 4 horas. Después de la aclimatación al frı́o, las células
se transfieren a un vial de centrı́fuga y se someten a una centrifugación suave que sedimenta las células
sin dañarlas. El sobrenadante, que comprende el medio de pretratamiento con agentes osmóticos y el
estabilizador, se aspira del sedimento celular y se deshecha. Al sedimento celular se le añade una solución
preenfriada, que comprende un estabilizador y un agente de vitrificación, y las células se resuspenden
suavemente. Después de 3 minutos de tratamiento con la solución de vitrificación, las células se ponen en
almacenamiento criogénico por inmersión del vial que contiene las células en nitrógeno lı́quido. Las células
conservadas criogénicamente se almacenan en nitrógeno lı́quido durante un perı́odo de aproximadamente
30 minutos a muchos años. Para revivir las células, el vial que contiene las células crioconservadas se
transfiere rápidamente desde nitrógeno lı́quido a un baño de agua a 40◦C. El vial se retira del baño a 40◦C
cuando los contenidos se licuan. Una alı́cuota de las células descongeladas se inspecciona para comprobar
la viabilidad inmediata por análisis de exclusión de colorante. Las demás células se lavan por una serie
de medios de crecimiento frı́os que contienen un estabilizador y concentraciones progresivamente menores
de agentes osmóticos. Después de haber retirado suficientes agentes osmóticos y de vitrificación de las
células por lavados seriados, las células se transfieren directamente al cultivo lı́quido. Como alternativa,
las células se ponen en un papel de cultivo en placas y se transfieren a una serie de medios semisólidos
con un estabilizador y una cantidad decreciente de agentes osmóticos y de vitrificación. Este cultivo en
serie se continúa hasta que las células se han ajustado al crecimiento en medio semisólido en ausencia de
soluciones osmóticas y de vitrificación.
En las Figuras 1A, 1B y 1C se describen otros procedimientos de crioconservación de células. Como
puede verse en esta representación esquemática, se prefieren varias variaciones. Por ejemplo, en la etapa
1, la biomasa de células se precultiva en medio lı́quido que contiene agente osmótico (sacarosa, sorbitol o
manitol con intervalos de concentración de 0,06 M a 0,80 M) durante 1 a 6 dı́as. En la etapa 2, se realiza
la carga por etapas. La biomasa de células precultivadas se carga con crioprotectores (20 % de solución
de vitrificación (V2N) que contiene etilenglicol/sorbitol a una concentración de 40/30 por ciento en peso
en medio de cultivo nutriente o 20 % de solución de vitrificación (VS3) que contiene un 30 % (p/v) de
glicerol, un 15 % (p/v) de etilenglicol y un 15 % (p/v) de dimetilsulfóxido en medio de cultivo nutriente
o en solución sacarosa 0,4 M (pH 5,6 a 5,8). La biomasa celular en lı́quido se mezcla suavemente y se
incuba en hielo o con refrigeración a 0◦ C-4◦ C durante cinco minutos. Inmediatamente después de esta
etapa, se aumenta por etapas la concentración de crioprotectores en el lı́quido añadiendo cinco veces
solución de vitrificación al 100 % congelada (V2N o VS3) a intervalos de un minuto, hasta que se alcance
la concentración final de la solución de vitrificación al 65 %. El tiempo total usado para esta etapa de
carga e incubación a 0-4◦ C es de diez minutos. La mezcla (biomasa de células + solución de vitrificación)
se centrifuga durante hasta cinco minutos (de uno a cinco minutos) a 100xg y se deshecha el sobrenadante.
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Como alternativa, en la etapa 2, la carga puede realizarse en una sola etapa. La biomasa de células
precultivadas se carga con crioprotectores (65 % de una solución de vitrificación - V2N que contiene etilenglicol/sorbitol a una concentración del 40/30 por ciento en peso en medio de cultivo nutriente; o un
65 % de una solución de vitrificación - VN3 que contiene un 30 % (p/v) de glicerol, un 15 % (p/v) de
etilenglicol y un 15 % (p/v) de DMSO en medio de cultivo nutriente; o en solución de sacarosa 0,4 M
(pH 5,6-5,8)). La biomasa de células en el lı́quido que contiene crioprotectores se mezcla suavemente y
se incuba en hielo o se refrigera a 0◦C-4◦ C durante diez minutos.
Como alternativa, la carga puede realizarse por etapas o en una sola etapa con crioprotectores que
contienen uno o más estabilizadores de membrana. Todas las membranas biológicas tienen una estructura
general común. Son conjuntos de moléculas lipı́dicas y proteicas mantenidas juntas por interacciones no
covalentes. Los lı́pidos se disponen como una bicapa, que proporciona la estructura básica de la membrana
y sirve como una barrera relativamente impermeable para el flujo de la mayorı́a de las moléculas solubles
en agua. Las moléculas proteicas están dentro de la bicapa lipı́dica y modulan las diversas funciones de
la membrana. Algunas sirven para transportar moléculas especı́ficas hacia el interior o el exterior de la
célula, tales como, por ejemplo, proteı́nas de canales tales como proteı́nas de canales pasivos, proteı́nas
de soporte y proteı́nas implicadas en el transporte activo. Otras son enzimas que catalizan reacciones
asociadas a la membrana, y otras sirven como enlaces estructurales entre el citoesqueleto de las células y
la matriz extracelular, y/o como receptores para recibir señales quı́micas de transducción desde el medio
celular.
Ciertas especies y lı́neas de células vegetales son reacias a protocolos de crioconservación previamente
establecidos, en parte debido a su sensibilidad al tipo y concentración de crioprotectores. Hay al menos
dos causas potenciales de desestabilización de membrana, la toxicidad quı́mica de los crioprotectores
usados en las etapas de carga y la deshidratación extrema resultante de la exposición a las soluciones
concentradas (por ejemplo, vitrificación). Otros factores tales como la formación de hielo durante la
refrigeración o el calentamiento, y la alteración mecánica de las células debida a la ruptura del vidrio
también pueden contribuir a la desestabilización de las membranas.
La deshidratación severa resultante de la exposición a soluciones concentradas de crioprotectores
puede producir transiciones estructurales en una serie diversa de moléculas biológicas que incluyen lı́pidos,
proteı́nas y ácidos nucleicos. En estas condiciones, se producen varias alteraciones en la ultraestructura
de la membrana plasmática y de otras membranas celulares. Estos cambios incluyen la formación de un
dominio particulado en la membrana plasmática que ocasiona la eliminación de agua que está asociada
con las regiones hidrófilas de los componentes proteicos y lipı́dicos de las membranas. Como alternativa,
también puede producirse desestabilización al entrar en contacto las membranas de las células vegetales
con un compuesto crioprotector de permeabilización (es decir, un compuesto que fluidiza una proteı́na de
canal dentro de una membrana de célula vegetal). La carga y/o la vitrificación por etapas puede minimizar la desestabilización de la membrana resultante de una deshidratación severa. Por medio de la carga
por etapas también pueden minimizarse otras caracterı́sticas relacionadas con los cambios sustanciales
en el volumen celular, la permeabilidad de la membrana plasmática, etc.
El tratamiento de choque térmico también estabilizará las membranas y las proteı́nas. Después de
precultivar la biomasa celular con agentes osmóticos, no es necesario un tratamiento de choque térmico
antes de cargar las células con crioprotectores. Sin embargo, se requiere un tratamiento de choque térmico
cuando la biomasa celular no se ha precultivado con agentes osmóticos. Además, es importante cargar
las células con una solución de vitrificación (crioprotectores) que contenga cationes divalentes (CaCl2 ,
MnCl2 o MgCl2 ; a 5 mM-20mM) (por ejemplo, Protocolos 11 y 12). El tratamiento de choque térmico
normalmente se realiza después del precultivo de la biomasa celular. Tiende a mejorar la supervivencia de
las células después de la crioconservación en una proporción de aproximadamente un 20 % a aproximadamente un 40 %. Este procedimiento implica la incubación de las células o la biomasa celular (precultivada
o no precultivada) en un agitador de baño de agua a una temperatura de aproximadamente 37◦C durante
un perı́odo de hasta aproximadamente cuatro horas. Después de este tratamiento, las células en medio
lı́quido (con o sin agente osmótico) se transfieren a temperatura ambiente (de 23 a 25◦ C) durante un
perı́odo de hasta cuatro horas antes de usarse para la crioconservación (etapa de carga).
Se sabe que el tratamiento de choque térmico induce la sı́ntesis de novo de ciertas proteı́nas (proteı́nas
de choque térmico) que se supone que están implicadas en la adaptación a las condiciones adversas. Las
células sometidas a choque térmico que no se han precultivado con un agente osmótico no sobreviven a la
congelación. El choque término induce la tolerancia a la exposición aumentando bruscamente la concentración de agentes osmóticos en las células que resultan de la congelación por medio de la formación de
proteı́nas de choque térmico que estabilizan las proteı́nas y las membranas. El choque térmico se realiza
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cultivando las células en un baño de agua a una temperatura comprendida entre aproximadamente 31◦C
y aproximadamente 45◦C, preferiblemente entre aproximadamente 33◦ C y aproximadamente 40◦ C y más
preferiblemente a aproximadamente 37◦ C. El cultivo se realiza durante un periodo de algunos minutos
a algunas horas, preferiblemente de aproximadamente una hora a aproximadamente seis horas y más
preferiblemente de aproximadamente dos horas a aproximadamente cuatro horas.
En la solución de vitrificación también pueden incluirse cationes divalentes tales como CaCl2 , MnCl2 o
MgCl2 antes de la exposición de las células a las temperaturas del LN2 . Los cationes divalentes incluidos
en las soluciones de vitrificación parecen estabilizar las membranas de las células vegetales y las proteı́nas
de choque térmico. Los cationes divalentes estabilizan las membranas celulares reduciendo la repulsión
electrostática entre centros iónicos en la membrana. Además, los cationes divalentes también pueden
prevenir la nucleación del hielo durante la congelación y descongelación. También pueden estabilizar
eficazmente las membranas de las células vegetales otros compuestos tales como esteroles, fosfolı́pidos,
glicolı́pidos o glicoproteı́nas que se intercalan en la bicapa lipı́dica de las membranas. Estos compuestos
pueden sustituir a los cationes divalentes en la estabilización de las membranas de las células vegetales
y/o proteı́nas de choque térmico.
El procedimiento para la carga por etapas de biomasa celular precultivada o no precultivada (con o
sin tratamiento de choque térmico a 37◦ C durante hasta cuatro horas) con crioprotectores es el mismo
que el que se ha indicado anteriormente, con la excepción de que las soluciones de vitrificación (V2N
o VS3) contenı́an los cationes divalentes estabilizadores de la membrana (por ejemplo, CaCl2, MnCl2 o
MgCl2 ) a una concentración que variaba de 5 mM a 20 mM.
En la etapa 3, la etapa de vitrificación puede ser por etapas. Las células o la biomasa celular obtenida
de esta forma después de la carga y la centrifugación se tratan adicionalmente con solución de vitrificación
(V2N o VS3) por etapas. Esta etapa normalmente implica la transferencia de biomasa celular después
de la centrifugación a un criovial enfriado, y la adición de una solución de vitrificación concentrada (al
100 %) a intervalos de un minuto durante el perı́odo de incubación de tres minutos a 0◦C. Al final del
perı́odo de incubación, el contenido (células + solución de vitrificación) de un criovial se mezcla suavemente antes de introducirse en LN2 . Como alternativa, la vitrificación puede realizarse en una solo etapa.
Las células o la biomasa celular obtenidas de esta forma después de la carga y la centrifugación se tratan
adicionalmente con solución de vitrificación (al 100 %). Esta etapa normalmente implica la transferencia
de biomasa celular después de la centrifugación a un criovial enfriado, y la adición de una solución de
vitrificación concentrada (al 100 %). El contenido de un criovial se mezcla suavemente y se incuba durante
tres minutos a 0◦ C antes de introducirse en LN2 . Como alternativa, la vitrificación puede realizarse por
etapas o en una etapa con crioprotectores que contienen cationes divalentes tales como CaCl2 o MgCl2 .
El procedimiento para la vitrificación de la biomasa celular cargada con crioprotectores es el mismo
que se ha indicado anteriormente, con la excepción de que la solución de vitrificación concentrada (V2N
o VS3) contiene los cationes divalentes estabilizadores de la membrana (CaCl2 o MgCl2 ) a una concentración que varı́a de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM.
La congelación de las células generalmente se realiza rápidamente en crioviales en LN2 o por medio de
la transferencia rápida de crioviales que contienen células en la solución de vitrificación a un recipiente
de almacenamiento que contiene nitrógeno lı́quido (LN2 ).
La descongelación implica un calentamiento rápido (por ejemplo, de aproximadamente 20 segundos
a aproximadamente 45 segundos) de los crioviales que contienen biomasa celular o células congeladas en
un baño de agua fijado a 40◦C o 60◦ C. La post-descongelación implica la transferencia inmediata de la
biomasa celular licuada en crioviales a un tubo de centrı́fuga estéril que contiene medio nutriente lı́quido
con un agente osmótico (sacarosa, sorbitol o manitol; intervalo de concentraciones 1 M a 2 M) y un inhibidor de etileno o un inhibidor de la acción de etileno (tiosulfato de plata; intervalo de concentraciones
de aproximadamente 5 µM a aproximadamente 20 µM). El contenido se mezcla suavemente y se incuba
en un agitador (120 rpm) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto va seguido de centrifugación
y de la transferencia de las células en un sedimento a dos capas de papel de filtro estéril puestas sobre
un papel secante (para ayudar a eliminar el exceso de humedad de las células o de la biomasa celular).
Las células o la biomasa celular se incuba durante dos minutos. Después de este perı́odo de incubación,
el papel de filtro superior con las células se transfiere secuencialmente a un medio nutriente sólido que
contiene el agente osmótico sacarosa a una concentración reducida de 0,8 M a 0,1 M (para conseguir el
ajuste osmótico de las células). En cada etapa, las células sobre el papel de filtro se incuban durante
un periodo de 0,5 horas a 1 hora y finalmente se transfieren a un medio nutriente sólido normal sin la
presencia de ningún agente osmótico adicional. Esta etapa (sin ningún agente osmótico adicional en un
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medio nutriente normal) de incubación se repite después de 24 horas de incubación en la oscuridad a
25◦C.
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Como alternativa, las células obtenidas como un sedimento después de la descongelación pueden lavarse rápidamente con un medio lı́quido que contenga un agente osmótico (sacarosa, sorbitol o manitol;
intervalo de concentraciones: 1 M a 2 M). Esto normalmente se realiza por incubación de la biomasa celular durante un periodo de dos a cinco minutos en medio nutriente lı́quido que contiene agente osmótico
y por centrifugación a 100xg durante un periodo de uno a tres minutos. Esta etapa se repite una vez
más antes de la incubación de la biomasa celular durante 30 minutos en medio nutriente lı́quido que
contiene agente osmótico e inhibidor de etileno o inhibidor de la acción de etileno (tiosulfato de plata a
una concentración de 5 µM a 20 µM).
Normalmente, puede verse un nuevo crecimiento de callo después de una semana. Cuando se aumenta
el nuevo crecimiento de biomasa celular, las células de callo se retiran del papel de filtro y se transfieren
directamente a un medio nutriente sólido normal. Después de que haya tenido lugar un crecimiento suficiente (normalmente después de dos a tres semanas), se inicia una suspensión celular en medio lı́quido a
partir de callos establecidos.
Otra realización de la invención se refiere a células vegetales que se han crioconservado por los procedimientos descritos anteriormente. Las células pueden ser de cualquiera de los géneros o especies descritos
o puede ser cualquier célula a la que puedan aplicarse los procedimientos de crioconservación. Las células
crioconservadas pueden mantenerse a temperaturas apropiadas para el crio-almacenamiento. Preferiblemente, las células se mantienen en nitrógeno lı́quido (aproximadamente a -196◦ C), argón lı́quido, helio
lı́quido o hidrógeno lı́quido. Estas temperaturas serán las más apropiadas para el almacenamiento a largo
plazo de las células y, además, pueden minimizarse las variaciones de temperatura. El almacenamiento a
largo plazo puede durar meses y, preferiblemente, muchos años sin que se produzca una pérdida significativa de viabilidad celular tras la recuperación. Como la invención también se refiere a procedimientos
eficaces para la recuperación de células crioconservadas, pueden perderse porciones relativamente grandes
de muestras celulares sin que se pierda la muestra entera. Las células o las plantas pueden propagarse a
partir de las células que quedan. También puede desearse un almacenamiento a corto plazo, tal como un
almacenamiento durante menos de algunos meses, en el que pueden usarse temperaturas de almacenamiento de -150◦C, -100◦C o incluso de -50◦C. Para mantener tales temperaturas puede usarse hielo seco
(dióxido de carbono) y refrigeradores comerciales.
Otra realización de la invención se refiere a plantas y células vegetales que se han hecho revivir por
los procedimientos de recuperación de la crioconservación descritos anteriormente. Estas células también
pueden ser de cualquiera de los géneros o especies descritos en este documento o un género o especie al que
se hayan aplicado los procedimientos de crio-recuperación. Las células pueden ser las células originales
que se crioconservaron o células que han proliferado a partir de tales células. Una planta, a diferencia
de un cultivo celular homogéneo, es una colección diversa de células conectadas que poseen funciones
interrelacionadas.
Otra realización de la invención se refiere a procedimientos y kits para el transporte y la descongelación
de células crioconservadas. Las células crioconservadas por este método pueden almacenarse en un
depósito central para la recuperación posterior. Para aumentar la seguridad contra una pérdida accidental,
cada lı́nea celular congelada puede almacenarse en varias localizaciones. Durante la recuperación, un
criovial que contiene las células crioconservadas puede transportarse en un recipiente adecuado hasta
el receptor. Son recipientes adecuados los que pueden mantener la temperatura de crioconservación
durante el transporte. Todas las células pueden transportarse a temperaturas suficientemente bajas
como para conseguir un almacenamiento a largo plazo con agentes de crioconservación portátiles tales
como nitrógeno lı́quido. Las células destinadas a una descongelación inmediata pueden transportarse en
hielo seco para reducir el coste. Un kit para la recuperación de células de un depósito puede incluir un
vial de células crioconservadas, suficiente medio con las concentraciones apropiadas de agentes osmóticos,
soluciones de vitrificación y estabilizadores para los lavados en serie. Como alternativa, en lugar o además
de la solución de lavado, las células pueden transportarse con una pluralidad de medios de crecimiento
semisólidos que comprenden un estabilizador y cantidades decrecientes de soluciones osmóticas y de
vitrificación. Después de la descongelación, las células se lavan y se usan inmediatamente o pueden
ponerse en el medio semisólido para retirar gradualmente los agentes de vitrificación y osmóticos. El kit
de transporte puede incluir además reactivos para un ensayo de viabilidad posterior a la descongelación
y una muestra de ADN de referencia para comparar con el ADN de las células descongeladas para
determinar la estabilidad genética.
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Los siguientes experimentos se ofrecen para ilustrar realizaciones de la invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos
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Ejemplo 1
Iniciación y Proliferación de Callos
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Se recogieron acı́culas de Taxus a partir de plantas silvestres y cultivadas. El material vegetal se lavó
en solución de jabón diluida, se aclaró abundantemente con agua destilada y se esterilizó superficialmente
en una solución clorosa (hipoclorito al 1 %, pH 7) durante 10 minutos. En condiciones estériles, el material
se aclaró 3 veces con agua destilada estéril. Las acı́culas se cortaron en una solución de polivinilpirrolidona
(PVP) al 1 % con 10 mg/l de ácido ascórbico. Las acı́culas se pusieron con el extremo cortado en medio
E semisólido y se incubaron a 24◦C ± 1◦ C en la oscuridad. Los cultivos se controlaron diariamente
y se desecharon los que tenı́an signos de microorganismos contaminantes. Se observó una formación
sustancial de callos y los callos se separaron del explante en 20 dı́as y se pusieron en los diversos medios
de proliferación de callos indicados en la Tabla 4. Se transfirieron callos de Taxus chinensis a medio
D (Tabla 4). Este procedimiento produjo la inducción de callos en más del 90 % de los explantes. Se
usó el mismo procedimiento satisfactoriamente para iniciar cultivos de T. brevifolia, T. canadensis, T.
cuspidata, T. baccata, T. globosa, T. floridana, T. wallichiana, T. media y T. chinensis. Los callos
retirados del explante se cultivaron a 24◦ C en la oscuridad. Se transfirieron partes sanas de los callos
a medio nuevo cada 10 dı́as. A continuación se indican los medios de crecimiento y de mantenimiento
preferidos para la invención:
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Ejemplo 2
Inicio de la Suspensión y Crecimiento de Células Suspendidas
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Un gramo de material de callo se inoculó asépticamente en un matraz Erlenmeyer de 125 ml que
contenı́a 25 ml de medio lı́quido (Tabla 4). El matraz se cubrió con una tapa de espuma de silicona y
se puso en un agitador giratorio a 120 rpm a 24◦ C en la oscuridad. Se formaron cultivos en suspensión
en aproximadamente 3-10 dı́as. El medio cambiado se inició por filtración de succión del contenido del
matraz a través de un embudo Buchner que contenı́a un filtro miracloth y resuspensión de toda la biomasa
en medio nuevo. Semanalmente, se transfirieron de uno a dos gramos de células a un matraz de 125 ml
que contenı́a 25 ml de medio nuevo. En la Tabla 5 se indican las velocidades de crecimiento tı́picas y las
densidades celulares conseguidas en cultivos en suspensión de especies representativas.
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En la Figura 4 se representó el aumento de la biomasa (peso fresco y seco) con el tiempo para la
lı́nea K-1 de T. chinensis. La velocidad máxima de crecimiento se determinó midiendo la pendiente en
los puntos de aumento de biomasa más rápido. Los cultivos celulares de T. chinensis con un tiempo
de duplicación máximo de 2,5 dı́as tienen una velocidad de crecimiento significativamente mayor que la
indicada previamente para los cultivos en suspensión de especies de Taxus. Los cultivos de Taxus tı́picos
tienen tiempos de duplicación de aproximadamente 7-12 dı́as.
El cultivo de células a alta densidad maximiza la productividad del proceso de cultivo de células.
Mientras que los cultivos previos de T. brevifolia tienen una densidad celular menor de 1 gramo de peso
seco por litro (Christian y col., 1991), los cultivos en suspensión de T. chinensis pueden alcanzar densidades de hasta 8-20 gramos de peso seco por litro después de 18 dı́as de crecimiento. La viabilidad
celular se determinó por tinción con diacetato de fluoresceı́na al 0,05 % (FDA) en acetona (J.M Whidholm, Stain Technol 47:189-94, 1972) seguido de recuento del número de células con fluoresceı́na verde
tras la excitación con luz azul en un microscopio de fluorescencia. La viabilidad celular fue mayor del
90 % a lo largo de toda la fase de crecimiento.
Ejemplo 3
Viabilidad de Células de Taxus Después del Precultivo con Manitol
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Se recogieron cultivos de suspensión de 6 a 7 dı́as de células de Taxus y se resuspendieron en medio
de crecimiento nuevo que contenı́a manitol 0,16 M, manitol 0,22 M, manitol 0,33 M o manitol 0,44 M.
Después de 3 dı́as de incubación en medio de crecimiento con manitol, las células se aclimataron al
frı́o a 4◦ C durante 3 horas. Las células aclimatadas se recogieron y transfirieron a crioviales de 4 ml que
contenı́an una solución de vitrificación frı́a del 40/30 % en peso de etilenglicol/sorbitol en medio. Los
viales se incubaron a 4◦ C durante 3 minutos y se congelaron por inmersión en nitrógeno lı́quido. Los
viales se mantuvieron en nitrógeno lı́quido durante al menos 10 minutos antes del uso en los experimentos
de descongelación.
Se retiraron viales de células congeladas del almacenamiento en nitrógeno lı́quido y se agitaron a 40◦C
hasta que el contenido se licuó (1-2 minutos). Las células licuadas después se lavaron de 5 a 6 veces con
medio estéril que contenı́a sorbitol 1 M, 3 veces con medio que contenı́a sorbitol 0,5 M, 3 veces con medio
de sorbitol 0,1 M y 3 veces con medio sin sorbitol. El lavado se realizó por resuspensión de las células
en medio de lavado, centrifugación a 50 x g durante 2 minutos y aspiración del medio de lavado del
sedimento celular. La viabilidad celular se determinó inmediatamente después de la descongelación. A
continuación se presenta el resumen de múltiples experimentos.
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Ejemplo 4
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Viabilidad de Células de Taxus Después del Precultivo con Sorbitol
Se descongelaron células de Taxus congeladas y se suspendieron en medio de crecimiento nuevo que
contenı́a sorbitol a 0,15 M, 0,22 M, 0,33 M, 0,44 M y 0,80 M. La viabilidad celular se determinó inmediatamente después de la descongelación. A continuación se presenta un resumen de los resultados de los
ensayos múltiples:
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Ejemplo 5
Viabilidad de Taxus Después de un Precultivo con Sacarosa
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Se recogieron suspensiones celulares de seis a siete dı́as en medio de crecimiento y la biomasa celular
se resuspendió en medio de crecimiento nuevo que contenı́a sacarosa 0,06 M, 0,12 M, 0,15 M, 0,29 M y
0,58 M. Las células se crioconservaron, se congelaron, se descongelaron y se ajustaron osmóticamente de
acuerdo con esto. La viabilidad celular se determinó inmediatamente después de la descongelación. En
la Tabla 8 se indica un resumen de los resultados de múltiples experimentos:
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Ejemplo 6
Efectos de los Agentes Osmóticos sobre la Supervivencia de Células de Taxus
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Se evaluaron diversos agentes osmóticos en medio de crecimiento para determinar sus efectos sobre
la supervivencia de células de especies de Taxus precultivadas con los agentes, después del perı́odo de
precultivo y después de descongelar las suspensiones de células de Taxus crioprotegidas y congeladas.
Se precultivaron células de suspensiones de cultivos celulares de tres dı́as en medio de crecimiento que
contenı́a diversos agentes osmóticos antes de la crioprotección. Las células crioprotegidas se congelaron y
se almacenaron en nitrógeno lı́quido durante un mı́nimo de una hora. Se realizaron ensayos de viabilidad
al final del perı́odo de precultivo (control) e inmediatamente después de descongelar las células crioprotegidas y congeladas.
Los cultivos celulares pretratados con manitol en medio de crecimiento presentaban el mayor porcentaje de viabilidad tras la descongelación después de la crioprotección y congelación en comparación con
la viabilidad observada usando los otros agentes osmóticos.
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Ejemplo 7
Efecto de Agentes Osmóticos y Crioprotectores sobre la Viabilidad de Taxus
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Se recogieron células de cultivos en suspensión de Taxus (KS1A) y se precultivaron con diversos agentes
osmóticos en el medio. Los agentes osmóticos ensayados incluyen trehalosa, prolina, sorbitol (0,15 M0,8 M), sacarosa (2-20 %) y manitol (0,16 M). La viabilidad se evaluó para cada suspensión celular al
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final del perı́odo de precultivo e inmediatamente después de la descongelación. El rebrote se evaluó
después del ajuste osmótico posterior a la descongelación. Las soluciones de vitrificación usadas fueron
etilenglicol/sorbitol/pectina y etilenglicol/sorbitol al 40/30 % en peso en medio de cultivo. Los resultados
se resumen en la Tabla 10. Se observaron los mayores porcentajes de viabilidad y el rebrote más riguroso
cuando se usó manitol para el precultivo y cuando se usó etilenglicol/sorbitol como crioprotectores en la
solución de vitrificación.
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Ejemplo 8
El Efecto de la Longitud del Precultivo sobre la Supervivencia
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Se recogieron células de Taxus del cultivo celular y la biomasa se resuspendió en medio de crecimiento
que contenı́a manitol a una concentración del 3 % durante un dı́a o tres dı́as a temperatura ambiente. Las
células cargadas se incubaron a 4◦ C durante 3 horas y se transfirieron a crioviales de 4 ml que contenı́an
solución de vitrificación frı́a que comprendı́a un 40/30 % en peso de etilenglicol/sorbitol en medio de
cultivo. Los viales se incubaron a 4◦C durante tres minutos y se congelaron por inmersión en nitrógeno
lı́quido. Las células contenidas en los viales se mantuvieron en nitrógeno lı́quido durante al menos 10
minutos.
Se descongelaron células crioconservadas y se determinó su viabilidad por procedimientos de tinción
con FDA y azul de trı́pano. Las células precultivadas con manitol durante tres dı́as presentaron una
disponibilidad después de la descongelación significativamente mayor que las células que no se habı́an
precultivado en medio que contenı́a manitol.
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Ejemplo 9
Efecto de Etilenglicol/Sorbitol sobre la Viabilidad de Células de Taxus Descongeladas
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Se trataron suspensiones celulares de seis a siete dı́as de la lı́nea celular KS1A de especies de Taxus
con manitol al 3 % durante tres dı́as a temperatura ambiente. Las células cargadas se aclimataron al frı́o
incubando los matraces a 4◦C durante 3 horas. Las células aclimatadas al frı́o se transfirieron a crioviales
de 4 ml y se añadió solución de vitrificación frı́a a cada criovial y se mezcló. Después de la vitrificación
a 4◦ C durante tres minutos, las células se congelaron por inmersión en nitrógeno lı́quido. Los viales se
mantuvieron en nitrógeno lı́quido durante al menos 10 minutos.
Las células crioconservadas se descongelaron transfiriendo los viales desde nitrógeno lı́quido y
agitándolos en un baño de agua a 40◦ C durante 1-2 minutos. La viabilidad después de la descongelación se determinó por el ensayo de tinción con FDA.
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Se realizaron diez ensayos que evaluaban las suspensiones celulares de la lı́nea celular KS1A de especies
de Taxus con diferentes concentraciones de etilenglicol/sorbitol. Los resultados se resumen en la Tabla
12. Las suspensiones celulares congeladas en la solución de vitrificación que contenı́a etilenglicol/sorbitol
a una concentración del 40/30 % en peso presentaron el mayor porcentaje de viabilidad después de la
descongelación ası́ como el rebrote más vigoroso en comparación con las células vitrificadas usando otras
concentraciones de etilenglicol/sorbitol.
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Ejemplo 10
Efectos de Crioprotectores sobre la Supervivencia de Células de Taxus Después del Almacenamiento a
-196◦ C
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Se recogieron células cultivadas de Taxus y se resuspendieron en medio de crecimiento nuevo que
contenı́a manitol al 3 % durante 3 dı́as. Las células se aclimataron al frı́o durante 3 horas y se transfirieron
a crioviales que contenı́an solución de vitrificación. Las suspensiones celulares se congelaron por inmersión
en nitrógeno lı́quido. Las células congeladas en nitrógeno lı́quido se descongelaron agitando los crioviales
en un baño de agua a 40◦ C durante 1-2 minutos. Las células congeladas con etilenglicol como crioprotector
tienen la mayor viabilidad.
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Ejemplo 11
Viabilidad de Células de Taxus en Función de la Biomasa en la Solución de Vitrificación
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Se recogieron suspensiones celulares de seis a siete dı́as de la lı́nea celular KS1A de especies de Taxus,
se resuspendieron en medio nuevo que contenı́a manitol al 3 % y se incubaron durante tres dı́as a temperatura ambiente. Después de la aclimatación al frı́o a 4◦ C durante 3 horas, las células se transfirieron
a crioviales de 4 ml que contenı́an un 40/30 % en peso de etilenglicol/sorbitol en medio de cultivo. Los
viales se incubaron a 4◦ C durante 3 minutos y se congelaron por inmersión en nitrógeno lı́quido. Los
viales se mantuvieron en nitrógeno lı́quido durante al menos 10 minutos antes de la descongelación.
Se observó el mayor porcentaje de viabilidad cuando la cantidad de biomasa celular/solución de
vitrificación era de 167 mg/ml. También se observó una viabilidad aceptable cuando la relación de
biomasa celular/solución de vitrificación era de 143, 200 y 250 mg/ml.
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Ejemplo 12
Efectos de Diferentes Etapas del Procedimiento sobre la Viabilidad Celular de Taxus
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Se evaluaron diferentes etapas del procedimiento para determinar las etapas que ocasionarı́an el mayor
porcentaje de viabilidad después de la descongelación. Se crioconservaron células con y sin crioprotectores,
con y sin pretratamientos osmóticos, con y sin tratamiento de frı́o y con y sin vitrificación.
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En el primer ensayo, se congelaron cultivos de células de Taxus de seis a siete dı́as con y sin crioprotectores. En el segundo ensayo, las células se congelaron con y sin un tratamiento con solución de
vitrificación de etilenglicol/sorbitol del 40/30 % en peso. En el tercer ensayo, las células se vitrificaron
y se congelaron con y sin un pretratamiento que comprendı́a una incubación de 3 dı́as en un medio de
crecimiento con un 3 % de manitol. En el cuarto ensayo, las células se pretrataron, se vitrificaron y se
congelaron con o sin aclimatación al frı́o.
Para cada ensayo, los ensayos de viabilidad se realizaron inmediatamente después de la descongelación. Las células precultivadas con medio de crecimiento que contenı́a un 3 % de manitol durante 3
dı́as a temperatura ambiente, seguido de un tratamiento de frı́o de 2-4 horas antes de la crioprotección,
presentaron el mayor porcentaje de viabilidad. También se observó una viabilidad adecuada en células
precultivadas durante 3 dı́as en medio que contenı́a un 3 % de manitol y sometidas a crioprotección sin
un tratamiento de frı́o previo, y en células precultivadas en medio de crecimiento durante 3 dı́as y precultivadas en medio que contenı́a manitol durante 24 horas seguido de un tratamiento de frı́o de 2 a 4
horas antes de la crioprotección.
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Las células se ensayaron de nuevo en ensayos de viabilidad usando las etapas indicadas, realizadas de
acuerdo con los procedimientos descritos en este documento.
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Ejemplo 13
Viabilidad Celular y Crecimiento Antes y Después de la Crioconservación
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Se evaluaron las siguientes lı́neas celulares de especies de Taxus para determinar la viabilidad celular
y el rebrote después de la crioconservación: KS1A; KEIR; 647; 1224; 12-6; 12-14; y 12-20.
Se recogieron suspensiones celulares de seis a siete dı́as de cada lı́nea celular y la biomasa se resuspendió en medio de crecimiento nuevo que contenı́a un 3 % de manitol. Las células se incubaron durante
3 dı́as a temperatura ambiente y posteriormente las suspensiones celulares cargadas se incubaron a 4◦C
durante 3 horas. Las células aclimatadas al frı́o se transfirieron a crioviales de 4 ml que contenı́an una
solución de vitrificación frı́a de etilenglicol/sorbitol al 40/30 % en peso. La solución de vitrificación y las
células se mezclaron suavemente y los viales se incubaron a 40◦C durante 3 minutos. Posteriormente, las
suspensiones celulares se congelaron por inmersión en nitrógeno lı́quido durante al menos 10 minutos.
Después de la congelación, las células se descongelaron transfiriendo los viales congelados desde
nitrógeno lı́quido a un baño de agua a 40◦ C durante 1-2 minutos. La viabilidad celular después de
la descongelación se determinó por el ensayo de tinción con FDA. Las células se lavaron 5-6 veces con
medio de sorbitol 1 M estéril y se resuspendieron en medio nuevo 1 M.
Después, las suspensiones celulares sin crioprotectores tóxicos se filtraron por separado usando un
embudo Buchner y un papel de filtro Whatmann 541 en condiciones estériles. Para cada suspensión
celular, el filtro con las células se depositó sobre medio de crecimiento semisólido que contenı́a sorbitol
0,5 M y se equilibró durante 30 minutos a temperatura ambiente. El papel que contenı́a las células se
transfirió a medio de crecimiento sólido que contenı́a sorbitol 0,1 M y se incubó durante 24 horas. El
papel con las células se transfirió a medio de crecimiento semisólido sin sorbitol y se incubó durante 24
horas a temperatura ambiente. El filtro que contenı́a las células después se transfirió de nuevo a medio de
crecimiento semisólido nuevo sin sorbitol y se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas más. El
crecimiento de células de callo en el medio nutriente semisólido fue evidente después de aproximadamente
2-3 semanas. Posteriormente, se iniciaron suspensiones celulares en medio de crecimiento lı́quido a partir
de los callos.
Como puede verse en la Tabla 17 indicada a continuación, todas la lı́neas celulares evaluadas presentaron una viabilidad aceptable después de la descongelación y crecimiento de recuperación.
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Ejemplo 14
Crecimiento y Formación de Productos de Células de Taxus Después de la Crioconservación
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Se crioconservaron y se descongelaron suspensiones de células de seis a siete dı́as de la lı́nea celular
KS1A de Taxus. Las células se precultivaron con manitol al 3 % en medio de crecimiento durante 3
dı́as y se usaron etilenglicol/sorbitol al 40/30 % en peso como crioprotectores. Se evaluó el tiempo de
duplicación del crecimiento y la formación del producto antes y después de la congelación y descongelación.
El rendimiento del producto se controló después de 5 dı́as de crecimiento en suspensión. El contenido de
ADN nuclear de las células se controló por citometrı́a de flujo y se descubrió que era de aproximadamente
22,7 pg/núcleo antes y de 22,9 pg/núcleo después de la crioconservación. La crioconservación no afectaba
a la producción del producto.
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Ejemplo 15
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Crecimiento y Formación de Producto en Células de Taxus Después de la Crioconservación
Se crioconservaron lı́neas de células de especies de Taxus y posteriormente se descongelaron y se
sometieron a un ajuste osmótico posterior a la descongelación. El crecimiento y la formación del producto
se determinaron después del establecimiento de suspensiones celulares en cultivo lı́quido. El crecimiento
refleja el tiempo medio de duplicación de suspensiones celulares en dı́as después de que se establecieran
en medio de crecimiento. La formación del producto se determinó después de 14 dı́as de crecimiento en
suspensión. Los resultados se indican en la Tabla 19.
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La Figura 5 ilustra cromatogramas de la fracción extracelular en el dı́a 20 a partir de la lı́nea celular
1224 de especies de Taxus donde (A) representa la suspensión de células de control que no se crioconservó
y (B) representa la suspensión celular regenerada después de la crioconservación, congelación, almacenamiento durante seis meses, descongelación y ajuste osmótico después de la descongelación. El pico
1 es 10-desacetilbaccatin; el pico 2 es 9-dihidrobaccatin III, el pico 3 es baccatin III; el pico 4 es 9dihidro-13-acetilbaccatin III; el pico 5 es taxol; el pico 6 es 2-benzoil-2-desacetilbaccatin y el pico 7 es
2-benzoil-2-desacetil-1-hidroxibaccatin I.
La figura 6 ilustra cromatogramas de la fracción extracelular en el dı́a 20 a partir de la lı́nea 203 de
especies de Taxus donde (A) representa la suspensión de células de control que no se crioconservó y (B)
representa la suspensión de células regeneradas después de la crioconservación, congelación, almacenamiento durante tres meses, descongelación y ajuste osmótico después de la descongelación. El pico 1 es
10-desacetilbaccatin; el pico 2 es 9-dihidrobaccatin III, el pico 3 es baccatin III; el pico 4 es 9-dihidro-13acetilbaccatin III; el pico 5 es taxol y el pico 6 es 2-benzoil-2-desacetilbaccatin. Como puede verse en las
Figuras 5 y 6, el perfil de formación del producto es sustancialmente igual en la suspensión de células de
control y en la suspensión de células regeneradas.
Ejemplo 16
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Estabilidad Genética de Células Crioconservadas y No Crioconservadas
Se establecieron lı́neas celulares a partir de un solo árbol Taxus chinensis var. mairer. Una de estas
lı́neas celulares establecidas se cultivó, se crioconservó durante 1 año y se descongeló. Se realizó un
análisis genético sobre las células del árbol original y sobre las células crioconservadas para determinar
si la crioconservación habı́a afectado a la estabilidad genética de las células. En resumen, se extrajeron
10 µg de ADN total de cada lı́nea celular, se digirieron cuatro veces con endonucleasa de restricción
y se fraccionaron en tamaños por electroforesis en gel de agarosa. El ADN fraccionado se transfirió a
un soporte sólido de nitrocelulosa y se hibridó con una sonda de ácido nucleico radiomarcada, sonda
minisatélite 33.6 de Jeffrey. Esta sonda de región hipervariable muestra diferentes modelos de bandeo a
partir del ADN de cuatro árboles distintos en las calles 1-4 de la Figura 7. Por el contrario, el aislado
inicial (calle A), las células cultivadas durante 1 año (calle B) y las células crioconservadas durante 1 año
(calle C) fueron genéticamente idénticas a las células aisladas del mismo árbol 1 año después (calles D y
E). La crioconservación no produjo ninguna mutación detectable por este análisis.
Ejemplo 17
Estabilidad de Células de Taxus Crioconservadas
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Para determinar si la duración de la crioconservación tenı́a algún efecto sobre la estabilidad genética,
se congelaron lı́neas de células de Taxus 1224 durante una hora a 6 meses y se analizaron con respecto a
su estabilidad genética. Se extrajo ADN de cultivos viables desarrollados descongelados y reestablecidos
a partir de estas células crioconservadas. Una región polimórfica de 3,1 kb del genoma que contenı́a ADN
ribosómico nuclear codificante y no codificante se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa y
se digirió con endonucleasa DpnII. El ADN digerido se clasificó por tamaños usando electroforesis en gel
y se visualizó después de tinción con bromuro de etidio. Los resultados del análisis se muestran en la
Figura 8. La lı́nea celular original y una lı́nea celular no crioconservada se analizaron en la calles C y
D respectivamente. Dos lı́neas celulares no relacionadas establecidas a partir de árboles no relacionados
muestran un modelo de digestión diferente. Por el contrario, no se detectó ninguna mutación genética en
las células crioconservadas durante una hora (calle E), un dı́a (calle G), una semana (calle G), un mes
(calle H) o 6 meses (calle I y J). Los modelos de bandeo de estas células crioconservadas y no crioconservadas fueron idénticos (calles C a J).
Ejemplo 18
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Crioconservación de Lı́neas Celulares de Tomate
Para una crioconservación satisfactoria de lı́neas celulares de tomate, se añadieron gradualmente
soluciones de carga y de vitrificación por etapas para reducir el choque osmótico. Las soluciones de
carga y de vitrificación comprendı́an un 30 % (p/v) de glicerol, un 15 % (p/v) de etilenglicol y un 15 %
(p/v) de dimetilsulfóxido. Sin adición gradual, las células no crecı́an rápidamente después del perı́odo
de recuperación posterior a la descongelación. Se examinaron el efecto de la viabilidad después de la
descongelación y el rebrote de recuperación y los resultados se muestran en la Tabla 20.
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(-) = sin rebrote de recuperación de callos
(+) = ligero rebrote de recuperación de callos
(++) = rebrote de recuperación de callos moderado
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(+++) = rebrote de recuperación de callos vigoroso
Se obtuvo la mayor viabilidad (supervivencia de las células) cuando las células se precultivaron durante
tres dı́as en medio nutriente lı́quido que contenı́a sacarosa 0,5 M o sorbitol 0,3 M, al 65 % y 70 % respectivamente. Estas condiciones de precultivo también soportaron el crecimiento vigoroso de las células
después de la descongelación de las suspensiones celulares. La crioconservación satisfactoria también
dependı́a del perı́odo de precultivo y de la concentración del agente osmótico. Al prolongar el perı́odo de
precultivo a diez dı́as y aumentar las concentraciones de agentes osmóticos a más de 0,8 M no aumentó
la viabilidad de las células. Sin el precultivo, las células no sobrevivı́an a las temperaturas del LN2 con
los procedimientos de carga de una etapa o por etapas y adición de solución de vitrificación.
La viabilidad y la recuperación de rebrote se potenció adicionalmente exponiendo las células precultivadas a un tratamiento de choque térmico durante hasta cuatro horas, y por la adición de cationes
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divalentes (CaCl2 , MgCl2 ). Esta estrategia también se ha usado satisfactoriamente en la crioconservación
de lı́neas celulares derivadas de especies de Lupinus, Sophora, Conospermum, Nicotiana y Solanum ası́
como de las lı́neas celulares recalcitrantes derivadas de diversas especies de Taxus tales como Taxus chinensis. En muchos casos, el rebrote de lı́neas celulares de estas especies vegetales fue macroscópicamente
visible de 3 a 4 dı́as después de la plantación, en comparación con 6 a 10 dı́as con procedimientos de
vitrificación y carga de una etapa. El lavado después de la descongelación de la biomasa celular con medio
lı́quido que contenı́a inhibidores de la acción de etileno o inhibidores de la biosı́ntesis de etileno mejoró
adicionalmente la calidad de las lı́neas celulares recuperadas. Se consiguieron porcentajes de viabilidad
del 90 % consistentemente y se observaron velocidades de crecimiento más rápidas después de haber establecido suspensiones celulares de estas lı́neas.
Ejemplo 19
Influencia del Tratamiento Después de la Descongelación con Inhibidor de Etileno
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35
La biomasa celular en crioviales se descongeló por calentamiento rápido durante 20 segundos a 45 segundos en un baño de agua establecido a 40◦ C-60◦C. Inmediatamente después de esta etapa, la biomasa
celular licuada en crioviales se transfirió a una centrı́fuga estéril que contenı́a medio nutriente lı́quido
con un agente osmótico (sacarosa, sorbitol o manitol) a concentraciones que variaban de 1-2 mM, y un
inhibidor de etileno a concentraciones que variaban de 2 µM - 20 µM. El contenido se mezcló suavemente
y se incubó en un agitador (velocidad establecida a 120 rpm) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Esto se continuó por centrifugación y transferencia de las células en un sedimento a dos capas de papel de
filtro estéril puestas sobre un papel secante (para ayudar a la eliminación del exceso de humedad de las
células o la biomasa celular). Las células o la biomasa celular se incubó durante aproximadamente 2 minutos. Después de esta incubación, el papel de filtro superior con las células se transfirió secuencialmente
a un medio nutriente sólido que contenı́a un agente osmótico a una concentración reducida de sacarosa
que variaba de 0,8 M a 0,1 M (para conseguir el ajuste osmótico de las células). En cada etapa, las células
en un papel de filtro se incubaron durante 0,5-1 hora y finalmente se transfirieron a un medio nutriente
sólido normal sin presencia de ningún agente osmótico adicional. Esta etapa se repitió dos veces durante
el perı́odo de 24 horas, seguido de la incubación de la biomasa celular en la oscuridad a 25◦ C durante
2-3 semanas realizando las transferencias una vez por semana. Cuando aumentó el nuevo crecimiento
de biomasa celular, las células de callo se retiraron del papel de filtro y se transfirieron directamente
sobre un medio nutriente sólido normal. Después de producirse un crecimiento suficiente, se inició una
suspensión celular en medio lı́quido a partir de callos establecidos. Se realizaron observaciones sobre la
viabilidad de las células a diferentes tiempos después de la descongelación, pero generalmente se anotó la
observación más importante. Las células en el papel de filtro se transfirieron a un medio sólido normal sin
presencia de ningún agente osmótico adicional. Se observó la velocidad de recuperación de crecimiento
celular durante las 3 primeras semanas de incubación de toda la biomasa sobre un filtro en la oscuridad
a 25◦ C.
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También fue útil un procedimiento alternativo relacionado con el tratamiento posterior a la descongelación de las células o la biomas celular. Este procedimiento inicialmente implicó el lavado de las células
rápidamente con un medio lı́quido que contenı́a un agente osmótico (sacarosa, sorbitol o manitol) a una
concentración que variaba de 1 a 2 M sin inhibidor de etileno. Esto se realizó por incubación de la biomasa
celular durante 2-5 minutos en medio nutriente lı́quido que contenı́a una agente osmótico y centrifugación
a 100 g durante 1-3 minutos. Esta etapa se repitió dos veces para eliminar los crioprotectores tóxicos
de la solución de vitrificación, seguido de incubación de la biomasa celular durante 30 minutos en medio
nutriente lı́quido que contenı́a un agente osmótico y un inhibidor de etileno (intervalo de concentraciones:
2-30 µM).
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Los inhibidores de etileno son sustancias que interfieren con la producción, el metabolismo o la acción
del etileno. Pueden clasificarse adicionalmente como antagonistas de la biosı́ntesis de etileno y antagonistas de la acción de etileno. Los agonistas de la biosı́ntesis de etileno son compuestos que interfieren
con la ruta biosintética para producir etileno. Los ejemplos de enzimas de esta ruta biosintética que
se inhiben incluyen ACC sintasa, ACC oxidasa y etileno oxidasa. Los ejemplos de antagonistas de la
biosı́ntesis de etileno incluyen ácido α-aminoisobutı́rico, ácido acetilsalicı́lico, metiloxivinilglicina, ácido
aminooxiacético y similares. Los ejemplos de antagonistas de la acción de etileno incluyen compuestos que contienen plata, complejos de plata o iones de plata, dióxido de carbono, 1-metilciclopropeno,
2,5-norbornadieno, trans-cicloocteno, cisbuteno, diazociclopentadieno y similares. Las sales de plata adecuadas incluyen nitrato de plata, tiosulfato de plata, fosfato de plata, benzoato de plata, sulfato de plata,
sal de plata de ácido toluenosulfónico, cloruro de plata, óxido de plata, acetato de plata, pentafluoropropionato de plata, cianato de plata, sal de plata de ácido láctico, hexafluoropropionato de plata, cianato de
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plata, sal de plata de ácido láctico, hexafluorofosfato de plata, nitrito de plata y sal de triplata de ácido
cı́trico. En las Tablas 1 y 2 se muestran ejemplos ilustrativos del aumento de la biosı́ntesis de taxano por
una diversidad de sales de plata.
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Las condiciones experimentales constaban de medio nutriente lı́quido que contenı́a 1,25 M de un agente
osmótico y la concentración apropiada de SLTS. El agente osmótico era sacarosa, sorbitol o manitol. Las
condiciones de control constaban de medio nutriente lı́quido que contenı́a 1,25 M de un agente osmótico
pero sin SLTS. Los resultados se muestran en la Tabla 21 e indican el grado de crecimiento de células de
callo y el porcentaje de recuperación.
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(+) = Rebrote de recuperación moderado con crecimiento celular visible en dos semanas
(++) = Rebrote de recuperación vigoroso con crecimiento celular visible en 6-10 dı́as
(+++) = Rebrote de recuperación vigoroso con crecimiento celular visible en 3-4 dı́as
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El tratamiento después de la descongelación de las células con medio lı́quido que contenı́a inhibidor
de etileno mejoró consistentemente la viabilidad y el porcentaje de crecimiento de las lı́neas celulares
recuperadas. El tiosulfato de plata a concentraciones que variaban de 4 µM a 10 µM fue más eficaz que
a 2 µM y 20 µM para aumentar las velocidades de crecimiento de las lı́neas celulares recuperadas. Se
consiguieron porcentajes de viabilidad de hasta un 90 % dependiendo de la lı́nea celular usada. El medio
lı́quido para el tratamiento después de la descongelación que contenı́a SLTS a 8 µM y 10 µM promovió
el crecimiento celular mucho más vigorosamente, y el crecimiento celular fue visible macroscópicamente
3-4 dı́as después de cultivar las células en medio nutriente sin agente osmótico ni inhibidor de etileno.
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REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para crioconservar una célula vegetal, que comprende una combinación de los
siguientes tratamientos:
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a. tratar la célula vegetal por liofilización de la célula vegetal, por choque térmico o por pretratamiento
de la célula vegetal con un agente crioprotector y un estabilizador que es un antioxidante, un eliminador
de radicales de oxı́geno, un catión divalente, un inhibidor de etileno, un compuesto que se intercala en la
bicapa lipı́dica de la célula (por ejemplo, un esterol, fosfolı́pido, un glicolı́pido o una glicoproteı́na) o una
combinación de los mismos;
b. vitrificar la célula vegetal en una solución de vitrificación; y
c. congelar la célula vegetal vitrificada a una temperatura de crioconservación.
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2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:
(i) el tratamiento comprende el pretratamiento con un agente crioprotector y un estabilizador y el agente
crioprotector comprende una sustancia seleccionada entre el grupo compuesto por DMSO, propilenglicol,
glicerol, polietilenglicol, etilenglicol, butanodiol, formamida, propanodiol, sorbitol, manitol y mezclas de
los mismos; o
(ii) la solución de vitrificación comprende una sustancia seleccionada entre dicho grupo.
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3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende
el pretratamiento con un agente crioprotector y un estabilizador seleccionado entre glutatión reducido,
tetrametilurea, tetrametiltiourea, dimetilformamida, mercaptopropionil glicina, mercaptoetilamina, selenometionina, tiourea, dimercaptopropanol, ácido ascórbico, cisteı́na, dietilditiocarbamato sódico, tiosulfato sódico, tiosulfato de plata, galato de propilo, espermina, espermidina y combinaciones y derivados
de los mismos.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende el
pretratamiento con un agente crioprotector y un estabilizador, o el procedimiento de la reivindicación 3
en el que el estabilizador se emplea como una solución acuosa a una concentración de aproximadamente
1 µM a aproximadamente 10 mM.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el tratamiento comprende
el pretratamiento con un agente crioprotector y un estabilizador, o el procedimiento de la reivindicación
3 o la reivindicación 4 en el que el tratamiento se realiza a una temperatura reducida durante un primer
periodo de tiempo y el agente crioprotector comprende un agente de vitrificación, y donde la etapa de
vitrificación comprende la incubación de la célula vegetal en la solución de vitrificación que contiene una
mayor concentración del agente de vitrificación durante un segundo periodo de tiempo.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el primer periodo de tiempo es de aproximadamente una hora a aproximadamente 7 dı́as y/o el segundo periodo de tiempo es de aproximadamente 30
minutos a aproximadamente 2 horas.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la liofilización o el choque térmico va precedido
por el cultivo de la célula con un agente osmótico, comprendiendo opcionalmente el agente osmótico
fructosa, glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, trehalosa y/o prolina.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además cargar la célula
vegetal con un agente de carga antes de su congelación.
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9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la carga y la vitrificación se realizan de una forma
sustancialmente simultánea.
10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 4 a 9, en el que el pretratamiento
con un agente crioprotector y un catión divalente implica la adición del catión divalente en la solución de
vitrificación.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además la etapa de
aclimatar la célula vegetal estabilizada a una temperatura reducida, siendo opcionalmente la temperatura
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reducida de aproximadamente 1◦ C a aproximadamente 15◦ C.
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12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el pretratamiento implica el cultivo de dicha
célula vegetal en medio que contiene un agente de carga y dicho estabilizador durante un periodo comprendido entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 7 dı́as a aproximadamente la temperatura
ambiente.
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13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 ó 12, o de las reivindicaciones 10 u
11 cuando son dependientes de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que el agente de carga es un azúcar,
un aminoácido o una combinación de los mismos, comprendiendo opcionalmente el azúcar uno o más
azúcares seleccionados entre fructosa, glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, sacarosa, trehalosa y derivados
de los mismos.
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14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la carga y/o la vitrificación se realizan (i) en una sola etapa o (ii) en una pluralidad de etapas, comprendiendo opcionalmente
la pluralidad de etapas la adición de un agente crioprotector a la célula vegetal cinco veces a intervalos
de un minuto.
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15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la célula vegetal es una
célula de gimnosperma, o es una célula de angiosperma que es una célula de una planta monocotiledónea
o una célula de una planta dicotiledónea, seleccionándose opcionalmente la célula de la planta monocotiledónea entre el grupo compuesto por especies de los géneros Avena, Cocos, Dioscorea, Hordeum, Musa,
Oryza, Saccharum, Sorghum, Triticum y Zea.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la célula de planta dicotiledónea se selecciona
entre el grupo compuesto por especies de los géneros Achyrocline, Atropa, Brassica, Berberis, Capsicum,
Catharanthus, Conospermum, Datura, Daucus, Digitalis, Echinacea, Eschscholtzia, Glycine, Gossypium,
Hyoscyamus, Legume, Lupinus, Lycopersicum, Malus, Medicago, Nicotiana, Panax, Pisum, Rauvolfia,
Ruta, Solanum, Sophora y Trichosanthes, y la gimnosperma es una especie de Abies, Cypressus, Ginkgo,
Juniperus, Picea, Pinus, Pseudotsuga, Sequoia, Taxus, Tsuga o Zamia.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la especie de Taxus es T. baccata, T. brevifolia,
T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. floridana, T. globosa, T. media, T. nucifera o T. wallichiana.
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18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la célula vegetal se obtiene a partir de nuevas acı́culas en crecimiento, corteza, hojas, tallo, raı́ces, rizoma, células de callos,
protoplastos, suspensiones celulares, meristemos, semillas o embriones.
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19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que más de aproximadamente
un 50 % de las células vegetales crioconservadas por el procedimiento son capaces de recuperarse en un
estado viable y opcionalmente más de un 70 % o más de un 80 % de tales células vegetales son capaces
de recuperarse en un estado viable.
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20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dichas células no se alteran genética o fenotı́picamente de forma significativa por la crioconservación.
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21. El procedimiento de la reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que las células vegetales son
de una especie de Taxus, expresando opcionalmente la célula de Taxus un diterpenoide, particularmente
taxol.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que la expresión de dicho diterpenoide no se altera
significativamente por la crioconservación.
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23. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende formar un banco de
células germinales de las células vegetales crioconservadas, siendo capaces más de aproximadamente un
50 % de las células vegetales de recuperarse en un estado viable y siendo capaces opcionalmente más de
un 70 % o más de un 80 % de las células vegetales de recuperarse en un estado viable.
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24. Un procedimiento para recuperar células vegetales crioconservadas que comprende una combinación de los siguientes tratamientos:
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a) descongelar las células vegetales crioconservadas a una temperatura por encima del punto de congelación;
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b) incubar las células vegetales descongeladas en un medio de crecimiento que contiene un estabilizador o un agente crioprotector y un estabilizador, siendo el estabilizador un antioxidante, un eliminador
de radicales de oxı́geno, un inhibidor de etileno, un compuesto que se intercala en la bicapa lipı́dica de la
célula (por ejemplo, un esterol, un fosfolı́pido, un glicolı́pido o una glicoproteı́na), un catión divalente o
una mezcla de los mismos; y
c) recuperar las células vegetales viables.
25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el agente crioprotector es
(i) un azúcar, un aminoácido o una mezcla de los mismos; o
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(ii) se selecciona entre sorbitol, manitol, sacarosa, trehalosa, prolina y mezclas de los mismos.
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26. El procedimiento de la reivindicación 24 o la reivindicación 25, que incluye además, antes de la
etapa (c), la etapa de retirar el agente crioprotector, y opcionalmente donde la etapa de eliminación
comprende múltiples lavados de células ajustadas osmóticamente con dicho medio de crecimiento que
contiene concentraciones decrecientes de dicho agente crioprotector y/o donde el agente crioprotector se
retira después de un periodo de tiempo y la incubación de las células vegetales se continúa en medio de
crecimiento y en suspensión.
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27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que el inhibidor de etileno es
(i) un inhibidor de la biosı́ntesis de etileno, que opcionalmente se selecciona entre espermidina, espermina, catecol, galato de n-propilo, hidroquinona, ácido ferúlico, alar, feniletilamina, alcohol salicı́lico,
indometacina y combinaciones de los mismos; o
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(ii) un inhibidor de la acción del etileno, siendo dicho inhibidor de la acción del etileno opcionalmente una
sal de plata, y seleccionándose opcionalmente la sal de plata entre tiosulfato de plata, nitrato de plata,
cloruro de plata, acetato de plata, fosfato de plata, sulfato de plata, nitrito de plata y combinaciones de
los mismos.
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28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el que el catión divalente es
calcio, magnesio o manganeso.
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29. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que el estabilizador se selecciona entre glutatión reducido, tetrametilurea, tetrametiltiourea, dimetilformamida, mercaptopropionil
glicina, mercaptoetilamina, selenometionina, tiourea, dimercaptopropanol, tiosulfato sódico, tiosulfato de
plata, ácido ascórbico, cisteı́na, dietilditiocarbamato sódico, espermina, espermidina, galato de propilo y
combinaciones y derivados de los mismos.
30. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en el que la incubación y la recuperación se realizan en un medio lı́quido.
31. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en el que la incubación se realiza
en un medio semisólido.
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32. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en el que las células vegetales
descongeladas se incuban en suspensión y las células vegetales viables se recuperan en suspensión.
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33. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 32, en el que las células vegetales
recuperadas se transfieren a un medio semisólido.
34. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33, en el que las células vegetales
viables recuperadas expresan un diterpenoide y la expresión del diterpenoide no se altera significativamente por crioconservación, y/o donde son viables más de un 50 % de las células vegetales recuperadas, y
opcionalmente donde son viables más de aproximadamente un 70 % de las células vegetales recuperadas
o son viables más de aproximadamente un 80 % de las células vegetales recuperadas.
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35. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34, que comprende además la etapa de
crioconservar las células vegetales de acuerdo con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 18.
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36. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 35, en el que son viables más de aproximadamente un 50 % de las células vegetales recuperadas, y opcionalmente en el que son viables más de
aproximadamente un 70 % o en el que son viables más de aproximadamente un 80 %.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que las células vegetales son una especie de Taxus
y/o están en suspensión.
38. Un procedimiento para producir un producto vegetal, que comprende:
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A) realizar el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y recuperar una célula vegetal
viable, o realizar el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 35;
B) propagar las células o plantas a partir de las células viables resultantes; y
C) recoger un producto vegetal producido por el material propagado.
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39. El uso del procedimiento de la reivindicación 38 para producir un diterpenoide, siendo opcionalmente el diterpenoide un taxol para uso quimioterapéutico.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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