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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA/
Versión 2.1/
MODULO 4/
CÁTEDRA DE FÍSICA/
FFYB/
UBA/
Cátedra de Física – FFYB – UBA
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
ESPECTROFOTOMETRÍA
1.- Valores límites de absorbancia y transmitancia
Analizando las ecuaciones anteriores podemos establecer los límites de estos parámetros:
a- Si no hay absorción
It = Io, o sea T = 1 y A = 0
b- Si hay absorción total
It = 0 o sea T = 0 y A =
Luego, T varía entre 1 y 0 T% : varía entre 100% y 0%.
A varía entre 0 e .
En base a esto, los aparatos de medida (fotómetros) poseen ambos tipos de escalas y que
éstas difieren de acuerdo a como hemos definido T y A.
Así la escala de transmitancia % es lineal y abarca de 0 a 100%.
La escala de absorbancia es logarítmica y abarca de 0 a .
En los espectrofotómetros analógicos, cuando las medidas son superiores a 0.500 de
absorbancia, se dificulta la visualización de la escala por disminuir la separación entre
divisiones. Esto sin considerar el cumplimiento de la ley de Lambert - Beer. Por lo tanto, es
aconsejable, para observadores poco experimentados que en dicha zona realicen medidas
de T y luego, calculen (- log T) para obtener las correspondientes absorbancias.
Este inconveniente está perfectamente solucionado en aparatos digitalizados, pero en los
analógicos ésta es la mejor manera de proceder para leer correctamente.
¿Existen desviaciones de la ley?.¿Qué factores las provocan?
Experimentalmente se comprueba que la ley de A. Beer se cumple particularmente cuando la
solución es diluida (C < 0,01 F). No obstante son comunes las desviaciones debidas a factores
de orden físico, químico o instrumental.
La principal causa física de desviación es que la absortividad varía con el índice de
refracción de la solución, lo que se pone en evidencia a concentraciones elevadas.
Como factor de orden químico se puede citar la variación de algunas estructuras en función
de la concentración; como por ejemplo al diluir una solución de dicromato se verifica el
siguiente equilibrio:
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
Cr2O 72 (aq) + H2O (l)
2 HCrO 4 (aq)
2 CrO 24 (aq) + 2 H+ (aq)
Los iones dicromato presentan absorción máxima a
450 nm, en tanto que los iones cromato lo hacen a
375 nm, por lo que al efectuar las diluciones de
soluciones de dicromato se debe mantener el nivel
de acidez a fin de no variar la estructura química.
Análogamente cuando la especie que absorbe
radiaciones es un complejo se debe mantener una
concentración grande de ligante (por ejemplo unas
100 veces mayor).
En lo referente a desviaciones de índole instrumental
debe mencionarse que las radiaciones que llegan a la
cubeta se apartan en mayor o menor grado de la
Desviaciones de la ley de A. Beer
condición de ser “cuasi” monocromáticas, como lo
establece la ley de L. Beer. Cada instrumento, según su
calidad, hace llegar a la cubeta una banda de longitudes de onda, conocida como banda
instrumental; cuanto más estrecha es ésta la desviación que se produce es menor. A
concentraciones elevadas la gráfica se inclina hacia este eje, dando lugar a desviaciones
negativas, que son indeseables pues conducen a un error relativo en concentración cada
vez más grande.
En regla general, cuanto menos monocromática sea la radiación utilizada, más se desvía la
relación entre absorbancia y concentración. En el gráfico de barrido espectral que se
muestra abajo a la izquierda, la banda A muestra poca desviación puesto que la
absortividad no varía en forma considerable con la , en cambio la banda B muestra
marcadas desviaciones; aquí una pequeña variación en produce una marcada variación
en la absorbancia .Ello se vería reflejado en el gráfico de Abs vs concentración que figura a
su derecha.
El hecho que una solución cumpla la ley de Lambert - Beer implica que debemos conocer
su ámbito de validez, para poder aplicarla.
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La ley de Lambert - Beer no sólo se utiliza para sustancias coloreadas (con absorción en el
visible) sino también para sustancias que absorban en el UV y son a nuestros ojos
“incoloras”.
Errores analíticos en la medida de transmitancia y absorbancia
Sabemos que:
1
a . c . l = - log T = -
ln T
= - 0,434 ln T
2,303
Luego, diferenciando:
dT
a . l . dc = - 0,434
T
Dividiendo m. a m.
a . l . dc
- 0,434 dT / T
=
a.l.c
- log T
Entonces, transformando los diferenciales en
c
—
c
0,434 T
=
T . log T
c / c es una medida del error relativo en la determinación de la concentración
procedente de un error dado en la medida de la transmitancia.
Dando valores y haciendo la representación podemos ver como varía
de T y de A:
c / c en función
En la gráfica se observa que el mínimo error tiene lugar a T cercana a 0,4.
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Por lo tanto en todo el análisis de absorción, para reducir el error al mínimo se deben
buscar las condiciones de absorción para que la medida de A se encuentre en la región
entre 0,1 y 1,0 o bien, para que la T se encuentre respectivamente entre 0,8 y 0,1 (T%
entre 80 y 10%). Esto frecuentemente se consigue por dilución adecuada o apropiada
elección del tamaño de la muestra.
2- Instrumentación
Haciendo un poco de historia el primer método utilizado, conocido con el nombre de
colorimetría, consiste en la comparación visual del color de las disoluciones con una serie
de patrones. Para tal procedimiento, eran empleados frecuentemente tubos de fondo
plano llamados tubos de Nessler. Estos estaban calibrados de manera que se conseguían
un paso de luz uniforme. Frecuentemente servía como fuente de radiación la luz solar
reflejada a través de los fondos de los tubos.
Los métodos colorimétricos visuales presentan varias desventajas: debe utilizarse siempre
un patrón o una serie de patrones; además el ojo no es capaz de componer colores si está
presente en la disolución una segunda sustancia coloreada; finalmente, el ojo no es tan
sensible a pequeñas diferencias en la absorbancia como un dispositivo fotoeléctrico.
Por estas razones surgieron instrumentos tales como el fotocolorímetro de un sólo haz y
luego el de doble haz y por último, los espectrofotómetros de simple y doble haz. Son éstos
dos últimos los de uso cotidiano.
Para comprender el funcionamiento de los distintos métodos instrumentales veamos el
siguiente esquema básico, donde se diagrama en bloques un fotómetro:
Estos elementos son: (A) una fuente estable de energía radiante, (B) una ranura de
entrada, (C) un selector de longitud de onda, (D) una ranura de salida, (E) un dispositivo
para contener la cubeta (donde se coloca la muestra), (F) un detector de energía radiante,
(G) un dispositivo para leer la señal eléctrica generada por el detector.
Así, un fotómetro es el instrumento más sencillo, consistente en un detector fotoeléctrico,
una fuente de luz y cubetas. Para restringir la radiación de la fuente son empleados filtros.
Estos métodos fotométricos están restringidos a la región visible del espectro. Dichos
instrumentos son llamados también colorímetros fotoeléctricos o fotocolorímetros.
Inicialmente se fabricaron fotómetros de un sólo haz y luego los fotómetros de doble haz.
Los segundos presentaron la ventaja de que el haz de luz es dividido por algún medio, y así
una porción pasa por la muestra y se dirige luego al detector, mientras que la otra porción
va a un segundo detector que sirve de referencia dirigido constantemente a la salida de la
lámpara. Así disminuyen apreciablemente las fluctuaciones en la intensidad de luz durante
la medida de transmitancia, a diferencia de los de un sólo haz. Desde el punto de vista
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eléctrico, por su funcionamiento, el fotómetro de doble haz es un circuito potenciométrico,
como lo vemos en la figura siguiente.
Básicamente consta de una lámpara de wolframio, una lente para suministrar un haz de luz
paralelo, las dos células fotovoltaicas, que forman parte del circuito potenciométrico y el
espejo que divide al haz. Así el haz de luz atraviesa por un lado la solución y llega al
detector, mientras que el otro haz es dirigido a un segundo detector: la célula fotovoltaica
de referencia. La intensidad luminosa transmitida en ambos casos es transformada por las
fotovoltaicas en señales eléctricas y la señal de la fotovoltaica proveniente del tubo de
medida es comparada con la señal de la fotovoltaica de referencia, por medio de un
circuito potenciométrico.
Existen otros aparatos denominados espectrofotómetros que no se limitan sólo al visible
sino que abarcan rangos espectrales del UV y de infrarrojo (IR).
Si se usa un filtro como selector de longitud de onda, se dispone sólo de luz
monocromática a longitudes de onda discretas y el instrumento se denomina “fotómetro”.
Si en cambio se dispone de un monocromador (esto es un prisma o una red de difracción)
como selector, el instrumento puede proveer luz monocromática en un intervalo continuo
de longitudes de onda y se denomina “espectrofotómetro”. Lo analizamos en la siguiente
sección.
Una clasificación básica de los instrumentos empleados en fotometría puede ser la
siguiente:
a- Espectrofotómetros
b- Fotómetros a filtro
c- Fotómetros a filtros interferenciales
d- Fotómetros espectrales
Estas distintas categorías, cada cual con su “pro” y su “contra” pueden analizarse en base a
dos características fundamentales:
A- Tipo de emisor
B- Tipo de monocromador
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A- Cuando analizamos el tipo de emisor o fuente de energía radiante tenemos que
considerar dos categorías fundamentales:
I- Emisores discontinuos ( lámpara de descarga gaseosa )
II- Emisores continuos (lámpara incandescente).
I- Con respecto a los emisores discontinuos, donde por lo general se trabaja en el UV, las
lámparas de descarga gaseosa más utilizadas son las de mercurio y cadmio.
Estas lámparas de gases luminosos al presentar determinadas espectrales, proporcionan
un reducido número de
de trabajo. No obstante, aquí no es necesario un sistema
monocromador como en el caso de las lámparas incandescentes, lo que es una ventaja.
Además abarcan una zona del UV donde de realizan una gran cantidad de medidas para
reacciones de tipo enzimático, determinaciones que son fundamentales en análisis clínicos.
II- Entre las lámparas incandescentes la más común es la de tungsteno, que abarca un
espectro de emisión desde 350 nm a 3,5 m.
Como la lámpara de tungsteno emite la mayor parte de su energía en el IR cercano,
frecuentemente se inserta un filtro absorbente de calor entre la lámpara y el
portamuestras en el caso del fotómetro de filtro para poder absorber la mayor parte de la
radiación IR.
Las lámparas incandescentes al proporcionar un espectro continuo, permiten obtener un
amplio rango de de trabajo, muy útil cuando se desea realizar distintas determinaciones.
Requieren de un eficiente sistema de monocromación para seleccionar un determinado
rango de para cada determinación en particular.
Las lámparas de tungsteno se emplean para mediciones en el visible y en el IR cercano,
mientras que para mediciones en el UV se utilizan lámparas de gases luminosos.
B- Monocromadores
Con respecto a los monocromadores, la calidad de monocromación de un aparato es de
vital importancia y en este sistema radica buena parte del precio de un fotómetro. Así, por
ejemplo, en el análisis enzimático y en las técnicas cinéticas en general, se requieren
determinaciones de diferencias de absorbancias generalmente pequeñas, a la óptima,
con gran precisión y veracidad. Por ello es fundamental una buena monocromación.
El grado de monocromaticidad de un filtro o de un monocromador más refinado se
representa mediante la anchura de banda media. Esto se define como la amplitud de
longitud de onda transmitida a la mitad de la transmisión de la punta del filtro o lo que
equivale al intervalo de longitud de onda en la que la transmitancia es la mitad de la
máxima.
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
Otros parámetros de monocromaticidad son: transmitancia a la longitud de onda nominal
y longitud de onda nominal que aparecen señalados en el esquema.
Así, la anchura de banda media es una medida de la pureza espectral de un
monocromador.
Para determinar la absorción o emisión de energía es necesario que se puedan aislar las
deseadas y excluir el resto de la fuente de energía radiante. Existen numerosas vías para
llevar a cabo este fin, veamos los dispositivos más utilizados:
I- Filtros
II- Prismas
III- Redes de difracción
I- Filtros: el dispositivo más sencillo es un filtro que generalmente está compuesto de un
metal disuelto o suspendido en vidrio. Por ejemplo, las sales de cromo darán en el vidrio un
color rojo, y las sales de cobalto darán un color azul.
Un filtro de vidrio no es realmente un monocromador, ya que transmite una escala
relativamente amplia de .
Distintos tipos de filtros:
- Filtros de vidrio: su uso está muy extendido porque son perfectamente adecuados para
numerosos fines, los más empleados tienen una anchura de banda media de alrededor de
50 nm y un transmitancia % máxima del 20%.
Existen tres tipos de filtros de vidrio:
a- de paso de banda ancha
b- de delimitación neta de perfil puntiagudo
c- de paso de banda estrecha. Estos últimos se componen casi siempre de dos o más filtros
de perfil neto, con la intención de quitar la mayor cantidad de radiaciones no deseadas. Así
se puede usar un filtro neto para producir un filtro de paso de banda estrecha. Veamos los
distintos tipos en el esquema siguiente:
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
Distintos tipos de filtros de vidrio: a- de paso de banda ancha, b- de delimitación neta de
perfil puntiagudo, c- de paso de banda estrecha
- Filtros de interferencia: otro tipo de filtro de paso de banda estrecha es el filtro de
interferencia que se compone de un emparedado de dos piezas medio plateadas de vidrio,
con un material dieléctrico entre ambas capas plateadas (ver figura). El principio es el
mismo que subyace en el juego de colores de una pompa de jabón, o sea la interferencia.
Cuando la luz blanca choca contra la fina película, es en parte reflejada en la superficie del
frente de la película mientras que la que penetra en ella es reflejada por la superficie
interior. Éste último rayo ha viajado más que el primero, una distancia igual a dos veces el
espesor de la película. Si al salir, este segundo rayo está en fase con el primero, la
intensidad resultante será duplicada, mientras que si se encuentra fuera de fase, la
intensidad resultante es el resultado de la destrucción de uno por el otro y no veremos luz.
Por lo tanto, cuando la luz blanca choca contra la película parte será aumentada y otra
será disminuida, formándose colores que vemos en una pompa. Así, volviendo al filtro, es
el grosor de la capa dieléctrica quien determina la que pasará a través de ella. Solamente
las que sean múltiplos de éste grosor, estarán en fase, y por lo tanto, emergerán.
Cualquier otra quedará bloqueada debido a las ”diferencias de fase” existentes y no será
transmitida.
Estos filtros tienen una anchura de banda media muy estrecha de 5 a 10 nm. Se emplean
principalmente en fotometría de llama o en autoanalizadores. La máxima transmitancia es
del 40 al 60%.
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- Filtros de interferencia de múltiples capas: Están constituidos por sucesivas intercalándose
capas de alto índice de refracción y de bajo índice de refracción. Con éstos se obtiene un
ancho de banda de 1 a 1,5 nm y una transmitancia del 70%.
- Cuñas de interferencia: Consisten en un par de placas especulares, transparentes,
separadas, en parte, por una capa de un material dieléctrico en forma de cuña. La longitud
de las placeas es de 50 a 200 mm. La radiación varía de forma continua. Si se escoge la
posición lineal adecuada a lo largo de la cuña, puede aislarse un ancho de banda de unos
20 nm.
II - Prismas:
Utilizan la refracción o desviación de la energía radiante para separar las distintas
longitudes de onda emitidas por fuentes de energía radiante como la lámpara de tungsteno
y las presentan como un espectro del que pueden seleccionarse las longitudes de onda
deseadas.
Las longitudes de onda más cortas son desviadas o se refractan en grado menor que las
longitudes de onda más largas. Esto produce un espectro no lineal, con una acumulación
relativa de las longitudes de onda más largas. Además un prisma produce un espectro
curvo. Estas dos características inherentes al prisma requieren unos dispositivos ópticos y
mecánicos relativamente complejos para seleccionar una posición espectral dada con una
anchura de banda relativamente pequeña.
Al no ser lineal el espectro producido, para certificar la calibración de las longitudes de
onda se deben controlar por lo menos tres diferentes, cuando se realiza en control de
centro de banda.
En general se utilizan prismas de vidrio flint para visible y de sílice para UV.
III - Redes de difracción
Estas redes separan la mezcla de longitudes de onda por difracción.
¿Qué es una red de difracción? Es una superficie limpia y pulida, ópticamente plana, en la
que se han grabado, con un instrumento de diamante, un gran número de surcos paralelos
y muy próximos entre sí (donde se producirán las difracciones), pudiendo variar estos de
pocos centenares a varios cientos por pulgada, dependiendo de la zona de trabajo. Cuantas
más líneas o surcos por pulgada haya, mayor será la dispersión de la red. Como esta red es
muy cara se producen réplicas que se hacen a partir de una red patrón mediante un
proceso de moldeado con una resina líquida que mantiene, de forma casi perfecta la
exactitud óptica de la red original en una superficie limpia de dicha resina.
¿Y qué es la difracción? Es el proceso por el cual un haz paralelo de radiación “se curva”
cuando pasa por un obstáculo puntiagudo o a través de una abertura estrecha.
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Una red de difracción se basa en el
principio de que los rayos de luz se
desvían alrededor de un ángulo agudo,
dependiendo del grado de inclinación, la
longitud de onda obtenida. Por lo tanto
se produce una gran cantidad de finos
espectros, uno por cada línea de red que
se ilumine con un rayo constituido por
muchas longitudes de onda. A
medida
que las longitudes de onda después de
pasados los ángulos, emergen, dan lugar
a la formación de frentes de ondas;
donde se corten éstos, las longitudes de
onda en fase se refuerzan entre sí y las
que no están en fase se agotan y
Red plana de difracción
desaparecen, dejando un despliegue
uniforme de longitudes de onda bien dispuestas. La anchura de banda media oscila entre
35 y 0,5 nm en las redes. Estas redes producen un espectro lineal a diferencia de los
prismas, por ello cuando se realiza el control de centro de banda deben controlarse sólo
dos longitudes de onda.
Dentro de las redes de difracción están las Redes holográficas: se basan en el uso del rayo
láser. Los rayos procedentes de un par de láseres idénticos, inciden con ángulos con
ángulos apropiados, sobre una superficie vidriada recubierta con un material fotorresistor.
Las franjas de interferencias resultantes de los dos rayos sensibilizan al fotorresistor de
manera que éste pueda disolverse, dejando una estructura de surcos que pueden
recubrirse con aluminio u otra sustancia reflectora para dar lugar a una red de reflexión.
Éstas redes son baratas y son utilizadas en los aparatos actuales, generalmente se trabaja
con copias de excelente fidelidad, con respecto de la patrón.
Las redes de difracción presentan un serio inconveniente: la luz parásita..
¿Y que es la luz parásita? Podemos definirla como la energía radiante de las longitudes de
onda no deseadas que alcanzan al detector, es decir, es la radiación electromagnética “de
longitud de onda distinta” a la seleccionada por el monocromador que llega al detector,
pasando o no por la muestra. O sea, es luz de “distinto color” que la nominal.
La principal causa de luz parásita es originada en el monocromador, por difracción de la luz
incidente por suciedad o por imperfecciones en las superficies la red de difracción que es
el tipo de monocromador donde aparece con mayor intensidad pues presentan miles de
superficies ópticas a diferencia de los prismas que tienen pocas caras y por lo tanto el
porcentaje de luz parásita resulta ser mucho menor. En general el porcentual de luz
parásita es mayor en los extremos del espectro visible. Así el efecto tiene más importancia
alrededor de los 400 nm (que es la zona más sensible) y de los 700 nm. Habría, debido al
fenómeno de difracción que permite obtener los espectros del visible en las redes de
difracción, una “superposición de extremos” de longitud de onda. Podríamos explicarlo
como la aparición de unos pocos fotones rojos en la zona de fotones azules y viceversa, en
la zona de fotones rojos aparecen unos pocos fotones azules.
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Una forma de disminuir la luz parásita consiste en el uso de un monocromador doble,
pasando el rayo a través de dos monocromadores en serie se logra la disminución del
efecto, por ello se utilizan los “prefiltros” en algunos aparatos.
Las redes holográficas, debido a su mayor perfección en la forma y dimensiones de las
líneas, dan espectros con menor radiación parásita.
Una vez analizados la fuente y el sistema de monocromación del equipo, los otros
componentes son:
c- Tubos de lectura
También denominados cubetas; se pueden considerar dos tipos: cuadradas y redondas.
Cuadradas: Éstas tienen la ventaja de tener las caras ópticas plano-paralelas y una vía
luminosa constante. Carecen generalmente de aberraciones ópticas tales como el efecto
de la lente y los errores variables de refracción. Las hay de cuarzo, que son muy caras y de
plástico que son más económicas pero que se pueden rayar con más facilidad. Igualmente,
para trabajar en el UV se utilizan las de cuarzo, pues el plástico absorbe.
Redondas: son muy usada puesto que son baratas (con respecto a las de cuarzo) y
adecuadas para la mayoría de los fines en análisis clínicos. Por su forma tiene errores
variables de refracción y reflexión como una lente, además, el espesor en general no es
uniforme y presentan una superficie irregular por no estar pulida. Por lo cual lo más
aconsejable es usar siempre un mismo tubo y orientarlo siempre de la misma forma.
Por otra parte, las cubetas se ofrecen tres versiones: normal, semimicro y micro. Esto
posibilita el uso de volúmenes de lectura que van desde 3 ml hasta sólo 50 l. Debe tenerse
en cuenta que el volumen mínimo de lectura depende no sólo del tipo de cubeta usada,
sino también de la ubicación y tamaño de la rendija por donde el aparato emite el haz de
luz.
d- Portacubetas:
Hay equipos que tienen portacubetas para sólo una cubeta o tubo de medida; otros tienen
tres portacubetas para poder leer siempre contra blanco y testigo, o bien dos muestras
sucesivas.
También existen equipos que permiten regular la temperatura a la que se realizan las
determinaciones. Hay además aparatos que presentan la posibilidad de termostatización a
través de un sistema de tubos por donde circula agua; o temostatización en seco por medio
de un sistema “Peltier”. Este sistema es fundamental en análisis clínicos para
determinaciones enzimáticas.
e- Tipo de lectura y salidas accesorias:
La lectura de absorbancia o transmitancia % se realizaba tradicionalmente en forma
analógica (instrumento a aguja). Para lograr una mejor lectura en los equipos analógicos,
entre ambas escalas hay un espejo, para que al hacer la medida se evite el error de paralaje
(no se debe apreciar sombra de la aguja).
Los espectrofotómetros actuales tienen salida digital bajo tres formatos: Absorbancia,
Transmitancia o concentración.
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
También hay aparatos provistos de conexiones o interfases para PC, impresora,
graficadora, etc.
f – Detectores
La energía electromagnética puede detectarse transformándola en energía eléctrica. Para
llevar a cabo dicho mecanismo se utiliza un transformador de energía, este puede ser una
celda fotovoltaica, un tubo fotoemisor o un detector de estado sólido.
Las celdas fotovoltaicas no requieren de una fuente externa de voltaje, sino que se basan
en el paso de electrones internos para producir una corriente en un circuito externo. Son
sensibles entre los 400 y 800 nm. Son más sensibles para las longitudes de onda mayores y
las fallas se perciben en las longitudes de onda más cortas. Estas células tienden a perder
cierto grado de sensibilidad en los primeros 5 a 10 minutos de la operación, y después
quedan bastante estables, a medida que alcanzan el equilibrio térmico.
Los tubos fotoemisores están conectados a una fuente de suministro de energía externa. La
principal característica es que son de elevada sensibilidad con bajos niveles de energía.
Los detectores de estado sólido están constituidos por materiales semiconductores. Son
muy sensibles y trabajan en un rango muy amplio de longitudes de onda: desde los 330 a
los 990 nm. Son muy pequeños, baratos y no presentan los habituales problemas en
presencia de humedad que tienen los fototubos; tampoco necesitan una estabilización
prolongada para realizar las primeras lecturas. Son los que se utilizan en los aparatos
actuales.
g- Rendijas
Las rendijas de un monocromador juegan un papel importante para determinar las
características de funcionamiento y calidad del monocromador.
Has dos rendijas: la de entrada y la de salida. La rendija de entrada sirve como fuente de
radiación; enfoca la luz sobre la red de difracción o prisma sobre la cual puede ser
dispersada con un mínimo de luz directa. La rendija de salida, determina el ancho de banda
de la luz que será seleccionada del espectro de dispersión. Aumentando el ancho de la
rendija de salida, el ancho de banda de la luz emergente se hace más amplio, con lo cual
aumenta la intensidad de la energía pero disminuye la pureza espectral. En los
monocromadores de red de difracción, en general las dos rendijas tienen el mismo ancho.
Por el contrario, los monocromadores a prisma, tienen ranura de salida variable. Existe una
relación entre la resolución del monocromador y el ancho de las rendijas.
Instrumentos espectrofotométricos empleando radiación ultravioleta y visible:
En el comercio se encuentran varios espectrofotómetros que operan en la región visible del
espectro, algunos de éstos pueden ser usados también en la región del UV, equipados con
óptica de cuarzo y fototubos sensibles a esta radiación. Dentro de estos instrumentos hay
una gran variedad, que no sólo depende de la región de longitudes de onda que cubren
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
sino también de la calidad de los componentes, de las características de manejo y del
costo.
Estos espectrofotómetros pueden ser de haz simple o de doble haz. En los
espectrofotómetros de doble haz , el haz de luz se bifurca mediante un espejo y atraviesa
simultáneamente la cubeta del blanco y de la muestra (tienen dos cubetas de lectura
simultánea), lo que implica que cualquier alteración en el voltaje incidirá de igual manera
sobre ambas cubetas evitando los errores debido a fluctuaciones del voltaje. Como
ejemplos del simple haz se encuentran el Jenway 6300, el Metrolab junior y 325 y como
espectrofotómetros de doble haz se encuentra el Shimadzu.
Veamos ahora un esquema básico de un espectrofotómetro de simple haz que trabaja
entre 350 y 650 nm.
El sistema monocromador consiste en una red de difracción, lentes y un par de rendijas
fijas. Debido a que la red produce una dispersión que es independiente de la longitud de
onda, se obtiene una anchura de banda constante de 20 nm a lo largo de toda la región en
que opera.
Esquema interno de un Jenway 6300
El instrumento emplea un sólo fototubo. Su salida es amplificada y utilizada para mover el
indicador de un medidor calibrado en términos de T y A.
Para seleccionar la longitud de onda con la cual se va a trabajar se varía la posición de la
red por medio de un brazo que sale del selector de longitudes de onda, pasando la
elegida por la ranura de salida.
La luz monocromática obtenida atraviesa el tubo que contiene la muestra e incide en el
fototubo. Allí la energía luminosa es convertida en una señal eléctrica amplificada.
Cuando se saca la muestra del instrumento cae automáticamente un oclusor en el camino
de la luz que impide que la luz llegue al fototubo cuando no hay muestra. Justamente, este
mecanismo se usa para determinar el 0% de transmitancia. Mediante un obturador
mecánico se procede a un “apantallamiento” del detector. Esto es, una placa de metal tapa
al detector impidiendo la llegada de luz a éste y consecuentemente se obtiene una lectura
de 0% de transmitancia o infinito de absorbancia.
En ausencia de radiación muchos detectores presentan una pequeña “corriente oscura”,
por lo tanto, el ajuste de 0% de transmitancia se produce mediante la aplicación de una
señal opuesta de tal magnitud, que dé una lectura de cero en la escala. Ello se logra con la
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perilla de cero T. Si por medio de la correspondiente perilla “control de cero” no puede
llevarse a cero de transmitancia, ello significa que entra luz por algún lado al aparato, y se
detecta mediante el dosaje de luz espúiea
Ahora bien, cada aparato tiene su sistema para colocar el 0% de transmitancia: en el
Spectronic 20, se mueve la perilla “control de cero” sin ningún tubo dentro del aparato y
con la tapa del porta tubo cerrada; en el Metrolab junior, de cubeta redonda, se procede
de igual manera, y en los Metrolab 325, de cubeta cuadrada, el sistema oclusor opera con
la tapa semiabierta, lo que asegura que el oclusor cubra el detector totalmente. Existe otra
perilla: la perilla “control de luz” que sirve para colocar el 100% de T o el cero de
absorbancia.
Para que la lectura directa en el aparato se realice en T es básico realizar éstos dos ajustes:
0 y 100% de T.
En los espectrofotómetros Jenway estos controles se realizan oprimiendo las teclas
correspondientes.
3. - ¿Cómo se puede conocer, mediante espectrofotometría, la concentración de un soluto
en una solución?
- Lo primero que se debe hacer es buscar una longitud de onda para la cual el valor de Abs
resulte óptimo. Como la Abs cambia con la longitud de onda, se debe realizar lo que se
conoce como barrido espectral, a fin de determinar la mejor longitud de onda de trabajo.
Por lo tanto, si mediante un dispositivo adecuado, se hace incidir sobre una solución de la
sustancia cuya concentración se quiere determinar, pequeñas bandas seleccionadas dentro
de un intervalo dado de longitudes de onda se obtienen diversos valores de absorbancia.
La gráfica del conjunto de valores de Abs de una
sustancia a diferentes longitudes de onda constituye
una curva característica conocida como barrido
espectral.
Las longitudes de onda que corresponden a los
máximos de absorbancia son las más adecuadas para
las determinaciones cuantitativas ya que en estas
condiciones se alcanza:
-
mayor sensibilidad.
límite de detección más bajo.
menor error en las mediciones
Se habla de longitud de onda óptima de trabajo, y no necesariamente ésta debe
corresponder a la de máxima Abs. Ello se debe a que hay que evitar hacer mediciones en
zonas donde pequeñas variaciones de longitud de onda provoquen grandes cambios en las
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ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA 2. 1 / M4 / FÍSICA
Abs, ya que un pequeño error en la selección de la longitud de onda puede causar un error
grande en la lectura de la Abs o del % de T.
En base a esto, a veces se prefiere sacrificar la sensibilidad pero asegurarnos que pequeñas
variaciones en la longitud de onda no modifican apreciablemente la absortividad.
Para cada longitud de onda llevar el aparato a 100% de transmitancia con el blanco.
- Una vez establecida la longitud de onda óptima de trabajo, para poder calcular la
concentración de una sustancia, se debe conocer si la misma cumple o no con la ley de
Lambert-Beer, y si lo hace, en que rango de valores de concentración.
Para comprobar entonces el comportamiento lineal hay que preparar soluciones de
diferentes concentraciones, y obtener los valores de Abs correspondientes, trabajando
siempre a la longitud de onda previamente seleccionada.
Luego se confecciona un gráfico de Abs = f (cc) y se observa si existe relación lineal entre
estas variables, y en que rango se verifica.
- Finalmente se podrá obtener el valor de concentración de la solución incógnita a partir
del dato de la Abs de la solución, por interpolación en el gráfico, dentro del rango de
linealidad.
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