TFM 2013 Nuria Ferrando - Instituto Universitario del Agua y las

VII Edición del Máster en Gestión Sostenible y
Tecnologías del Agua
Trabajo fin de máster:
Desarrollo y validación de un nuevo
sistema de detección molecular basado en
qPCR de Legionella spp. en muestras
ambientales
Autora: Nuria Ferrando Monllor
Tutor: Pedró José Varó Galvañ
Alicante, Septiembre de 2013
CERTIFICADO
“D. PEDRO JOSÉ VARÓ GALVAÑ, Profesor del Departamento de I.U. AGUA Y
CIENCIAS AMBIENTALES, Certifica que el presente Trabajo Fin de Master
titulado “Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección
molecular basado en qPCR de Legionella spp. en muestras ambientales.”
ha sido realizado en la empresa LABAQUA. S.A bajo mi supervisión, por Dña.
NURIA FERRANDO MONLLOR, y que reúne las condiciones de calidad y rigor
científico para que pueda ser presentado y defendido ante la Comisión
correspondiente”.
Alicante, 16 de septiembre de 2013
Mi más sincero agradecimiento a la empresa
LABAQUA S.A por permitirme realizar este trabajo en
sus instalaciones, y especialmente a Ana, Victoria,
Carlos, Israel, Alicia, Lorena y Jose del Departamento
de Microbiología por su ayuda durante todo el
proyecto, a Carmen por compartir conmigo sus
conocimientos de Biología Molecular y sobre todo a
Adela por guiarme en este trabajo, por su paciencia y
la dedicación de ese tiempo que no tenía.
ÍNDICE
1. RESUMEN…………………………………………………………………………..1
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………..............3
2.1 Importancia de su estudio………………………………………….............3
2.2 Aspectos clínicos……………………………………………………............4
2.2.1 Sintomatología de la enfermedad…………………….....................4
2.2.1.1 Fiebre de Pontiac……………………………………………..4
2.2.1.2 Neumonía por Legionella o enfermedad del
Legionario…………………………………………………......4
2.2.2 Grupos de riesgo……………………………………………………....5
2.2.3 Vías de transmisión…………………………………………..............5
2.2.4 Tratamiento de la neumonía por Legionella pneumophila……......5
2.3 Ecología del microorganismo…………………………………………….…6
2.3.1 El reservorio medioambiental……………………………………….6
2.3.2 Acceso a redes internas y proliferación en ambientes
determinados…………………………………………………….…...6
2.4 Métodos de detección tradicionales……………………………………..…7
2.5 Métodos de detección basados en biología molecular………….…….….9
2.6 Validación de métodos: Normas ISO relacionadas con
Legionella……………………………………………………………………12
2.6.1 Normas ISO para el cultivo de Legionella………………………...13
2.6.2 Normas ISO para la detección por qPCR de Legionella………..13
2.7 Legislación, prevención y control de la legionelosis…………………….13
3. OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO………………………………………..16
4. PROCEDIMIENTO………………………………………………………………..17
4.1 Búsqueda de secuencias específicas de género: Diseño de
cebadores y sondas………………………………………………………..17
4.2 Cultivo de cepas bacterianas………………………………………………19
4.3 Extracción y purificación de DNA………………………………………….23
4.4 Cálculo de la concentración de DNA……………………………………...24
4.5 Condiciones de la reacción de qPCR……………………………………..24
4.6 Diseño y construcción del patrón interno…………………………………27
4.7 Diseño de validación: Parámetros de validación………………………...30
4.8 Procesado de muestras naturales………………………………………...31
4.8.1 Preparación de la muestra…………………………………………...31
4.8.2 Concentración de la muestra………………………………….……..32
4.8.3 Eliminación de inhibidores…………………………………………...33
4.8.4 Amplificación…………………………………………………………..33
5. RESULTADOS…………………………………………………………………….34
5.1 Conceptos estadísticos……………………………………………………..34
5.2 Optimización de las condiciones de amplificación y optimización del
patrón interno………………………………………………………………..35
5.3 Estudio de especificidad, sensibilidad, falsos positivos y falsos
negativos…………………………………………………………………….36
5.4 Límite de detección y límite de cuantificación…………………………...38
5.5 Curva estándar y eficiencia de la reacción……………………………….40
5.6 Reproducibilidad y repetitividad……………………………………………41
5.7 Cuadro resumen de validación…………………………………………….42
5.8 Aplicación del diseño en muestras naturales y comparación con el
método tradicional de cultivo…………………………………………...….43
6. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES……………………………………………….44
7. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………..………….48
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 4.1. Parámetros establecidos en el programa Primer Express para el
diseño de cebadores y sondas para experimentos de detección
mediante sondas TaqMan……………………………………………..18
Tabla 4.2. Cebadores y sonda diseñados para la amplificación específica del
género Legionella por qPCR………………………………………….19
Tabla 4.3. Cepas bacterianas analizadas en este estudio……………….…….20
Tabla 4.4. Temperatura de incubación y medios de cultivo utilizados para el
aislamiento de cepas bacterianas de otros géneros……………….22
Tabla 4.5. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp………25
Tabla 4.6. Programa de la amplificación por qPCR para el análisis de
muestras…………………………………………………………………26
Tabla 4.7. Cebadores para la síntesis del patrón interno……………………….28
Tabla 4.8. Programa de amplificación por PCR para la construcción del patrón
interno……………………………………………………………………28
Tabla 4.9. Reactivos para la amplificación por PCR para la construcción del
patrón interno…………………………………………………………...28
Tabla 4.10. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp……...34
Tabla 5.1. Optimización de la concentración de cebadores…………………...35
Tabla 5.2. Optimización de la concentración de patrón interno (IPC)………...36
Tabla 5.3. Cebadores y sondas diseñados para la amplificación específica del
género Legionella por qPCR…………………………………………36
Tabla 5.4. Generación de los conceptos VP, FP, VN y FN…………………….37
Tabla 5.5. Análisis de la especificidad y la sensibilidad de los cebadores y la
sonda…………………………………………………………………….37
Tabla 5.6. Clasificación de los resultados VP, FP, VN y FN…………………...38
Tabla 5.7. Fórmulas y resultados de la sensibilidad, especificidad, falsos
positivos y falsos negativos de los cebadores y la sonda…….…...38
Tabla 5.8. Límite de detección del método de qPCR…………………………..39
Tabla 5.9. Reproducibilidad y repetitividad del gen rDNA 16S en qPCR……42
Tabla 5.10. Resumen de la validación…………………………………….………42
Tabla 5.11. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo
tradicional y qPCR para muestras de agua de torre de
refrigeración……………………………………………………….……44
Tabla 5.12. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo
tradicional y qPCR para muestras de agua potable…………….….44
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Fotografía en microscopio de barrido de la bacteria Legionella…..3
Figura 2.2. Medio BCYE específico para el cultivo de Legionella……………...8
Figura 2.3. Etapas de la PCR………………………………………………………9
Figura 2.4. Etapas de la electroforesis horizontal en gel de agarosa………...10
Figura 2.5. Etapas para la emisión de fluorescencia en las sondas………….12
Figura 2.6. Esquema de las posibilidades de desarrollo de Legionella a
diferentes temperaturas y en diferentes instalaciones…………...14
Figura 4.1. Estudio de especificidad teórica de Legionella mediante BLAST 17
Figura 4.2. Ejemplo de diseño de cebadores y sondas para la detección de
Legionella, obtenida con el programa Primer Express…………..18
Figura 4.3. Bloque térmico utilizado en este trabajo…………………………...23
Figura 4.4. Bio-espectrofotómetro utilizado en este trabajo…………………..24
Figura 4.5. Reactivos y detector para la qPCR…………………………………25
Figura 4.6. Ejemplo de una curva de reacción…………………………….…...26
Figura 4.7. Perfil térmico y procesos de la amplificación………………….…..27
Figura 4.8. Procedimiento para la preparación del gel de agarosa……….….29
Figura 4.9. Fragmentos híbridos visualizados en el gel de agarosa………....29
Figura 4.10. Diagrama ilustrativo de la construcción de patrones internos…...30
Figura 4.11. Sistema de filtración por membrana………………………………..32
Figura 4.12. Cartucho filtrante Amicon Ultra-15 (Millipore) empleado para la
concentración de muestras biológicas………………………….….32
Figura 4.13. Procedimiento de purificación de DNA……………………………..33
Figura 5.1. Recta de calibrado de Legionella pneumophila……………….…..40
Figura 5.2. Recta estándar del gen rDNA 16S de Legionella spp……………41
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Alineamiento: Término de bioinformática, que consiste en representar y
comparar dos o varias secuencias o cadenas de DNA, RNA o estructuras
primarias de proteínas para destacar sus zonas de similitud, que podrían
indicar relaciones funcionales o evolutivas.
Amplicón: Fragmento de DNA sintetizado mediante técnicas de amplificación.
Cebador: Secuencia corta de ácido nucleico que forma pares de bases
complementarios a una hebra molde y actúa como punto de partida para la
replicación del DNA.
Cepa: En microbiología, variante genética o subtipo de un microorganismo.
Electroforesis en gel: Técnica consistente en la separación de moléculas por
propiedades como el tamaño, forma o punto isoeléctrico según su movilidad en
un campo eléctrico.
Fagocito: Células presentes en la sangre y otros tejidos, capaces de captar
microorganismos y restos celulares, introduciéndolos en su interior para
eliminarlos en un proceso llamado fagocitosis.
Gen ribosómico rDNA 16S: Sección de DNA procariótico encontrado en las
bacterias y arqueas.
G + C: Porcentaje de bases nitrogenadas en una molécula de DNA que son
guanina y citosina.
ISO 17025: Norma internacional, aplicada a las empresas que realizan ensayos
y/o calibraciones. Asegura la calidad de los procesos desarrollados.
Máster Mix: Reactivos de la PCR, que proporciona un ambiente químico
adecuado para una óptima actividad y estabilidad de la DNA polimerasa.
Morbilidad: Dato estadístico, definido como la cantidad de individuos
considerados enfermos y víctimas de una enfermedad en un espacio y tiempo
determinados.
Plásmido: DNA linear o circular de doble cadena que es capaz de replicarse
independientemente del DNA cromosómico.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Técnica de biología molecular
consistente en la amplificación in vitro de múltiples copias de un fragmento de
DNA o RNA específico.
PCR Cuantitativa (qPCR): Variante de la PCR convencional, capaz de
amplificar y cuantificar mediante fluorescencia el producto de amplificación de
DNA en tiempo real.
Taq. Polimerasa: Enzima sintetizada por la bacteria Thermus aquaticus, capaz
de soportar elevadas condiciones de temperatura (95 ºC). Es un tipo de DNA
polimerasa que se utiliza en las técnicas de PCR.
Temperatura de anillamiento (Ta): Temperatura a la cual el cebador se unirá a
la secuencia de DNA molde.
Temperatura de fusión (Tm): Temperatura en la cual la mitad del dúplex de
DNA se disociará y pasará a ser de una sola hebra. Es un indicador de la
estabilidad de la doble cadena.
Serogrupo: Clasificación de un microorganismo según los antígenos que
presenta en su superficie celular.
Sonda: En biología molecular, se trata de un fragmento de DNA de pequeño
tamaño utilizado para detectar la presencia de DNA o RNA de una secuencia
complementaria. En la qPCR se encuentran marcadas mediante fluorescencia.
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
1. RESUMEN
La enfermedad del legionario, caracterizada por presentar severas neumonías,
es una patología causada por la bacteria Legionella, cuyas repercusiones
sanitarias y socioeconómicas han provocado que su vigilancia y control esté en
aumento los últimos años. Encontrándose de forma natural en el medio
ambiente, Legionella puede incorporarse en diversas instalaciones que
requieran agua, causando infecciones debido a la proliferación de la bacteria
en lugares que reúnan las condiciones óptimas para ello. Por este motivo, se
ha llevado a cabo la creación de normas y decretos con el objetivo de prevenir
y controlar los brotes de legionelosis, así como tratamientos para su
erradicación. Esta necesidad de control, requiere del desarrollo de métodos de
detección rápidos y precisos. Durante muchos años el cultivo en medio
selectivo ha sido la técnica más utilizada, pero el elevado tiempo de incubación
debido a la baja tasa de crecimiento de la bacteria, la imposibilidad de detectar
las colonias viables no cultivables y la dificultad de su aislamiento en muestras
con una elevada contaminación, han hecho que se precise de otras
metodologías más rápidas y eficaces. Los avances en el campo de la
tecnología de ácidos nucleicos han permitido la detección de Legionella
utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permitiendo la
amplificación de múltiples copias de un fragmento de DNA o RNA. Sin embargo
surge el problema de ser una técnica cualitativa, que sólo informa de la
presencia o ausencia de la bacteria y no de su cantidad. Es por ello que en
este trabajo, se ha desarrollado y validado un nuevo método de detección de
Legionella en muestras ambientales por la amplificación del gen rDNA 16S
utilizando la metodología de la PCR cuantitativa “a tiempo real” basada en el
empleo de sondas fluorescentes, que nos permitirá conocer la carga bacteriana
presente en las muestras de agua. Para ello se diseñaron cebadores y sondas
que amplificaban simultáneamente un fragmento de 386 pares de bases del
gen rDNA 16S de Legionella y un fragmento recombinante que incluía una
secuencia específica del gen gyrB de Aeromonas hydrophila como control
interno positivo. En el proceso de validación, se analizó la especificidad y la
sensibilidad de los cebadores y sondas, las cuales amplificaron solamente las
cepas de Legionella spp. pero ninguna otra especie bacteriana de las 28 que
se ensayaron. El límite de detección fue establecido en un valor mínimo de 25
copias en 10 µL de muestra y el límite de cuantificación en 32.38 copias. Se
construyó una recta robusta estándar para la cuantificación de las muestras
analizadas y el ensayo mostró un rango lineal de 6-log10 y una eficiencia de la
reacción que obtuvo un valor de 1. Por último la repetitividad presentó unos
valores de coeficiente de variación (CV) en los Ct y número de copias de 1.08%
y 46.08% respectivamente, y la reproducibilidad valores de coeficiente de
variación (CV) de 1.19% y 20.19%. Finalmente para demostrar la validez del
método se realizaron diversos ensayos para comparar los resultados obtenidos
mediante qPCR y empleando el método de cultivo que tradicionalmente se
emplea en el laboratorio. Para ello se analizaron 5 muestras de agua potable y
5 muestras de agua de torre de refrigeración. Todas las muestras que fueron
positivas por la técnica de cultivo tradicional, también fueron positivas por
qPCR, aunque los resultados de esta última técnica fueron más elevados,
1
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
encontrándose la diferencia de 3.82 en el caso de agua potable y de 2.21 en el
caso de aguas de torres de refrigeración.
Los parámetros de validación obtenidos demostraron que el método de qPCR
desarrollado en este trabajo era preciso, sensible, y específico para una rápida
cuantificación de Legionella spp. en las muestras de agua.
2
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2. INTRODUCCIÓN
Legionella es una bacteria englobada dentro de la familia Legionellacea. Posee
forma bacilar con un tamaño de 0.3 a 0.9 µm de ancho y de 2 a 20 µm de largo,
que se tiñe débilmente con tinción de Gram (organismo gram negativo). Es
aerobia y con flagelos que favorecen su motilidad. La flagelación puede ser
polar, subpolar y/o lateral, aunque ocasionalmente pueden encontrarse cepas
no móviles. A pesar de que no presenta formas de resistencia (esporas), es
capaz de sobrevivir a un amplio rango de temperaturas, multiplicándose entre
20º C y 45º C, aunque su temperatura óptima de crecimiento se sitúa entre los
35º - 37º C. Es tolerante a pequeñas concentraciones de CO2. En el laboratorio
necesita un medio de cultivo con L-cisteína, carbón activo y α-cetoglutarato. Su
equipo enzimático comprende la presencia de una catalasa, de una citocromo
oxidasa y de una gelatinasa, destacando la ausencia de actividad ureasa y
nitrato reductasa (Moreno, 2002).
Figura 2.1. Fotografía en microscopio de barrido de la bacteria Legionella
La bacteria es llamada así, debido a que se presentó de forma epidémica por
primera vez en la LVIII Convención Anual de la Legión Americana del estado de
Pensilvania, afectando a 221 personas, de la cuales 34 fallecieron.
2.1 Importancia de su estudio
El género Legionella comprende más de 50 especies y más de 70 serogrupos
distintos (García, 2009). De entre ellas, Legionella pneumophila es la que más
se asocia a patologías en humanos, siendo el serogrupo 1 el encontrado con
mayor frecuencia en aislamientos clínicos y de origen ambiental. La bacteria
fue aislada por primera vez en Enero de 1977 por Fraser y Mc.Dade,
bautizándola con el nombre de ‘’pneumophila’’ puesto que en algunos
pacientes se manifestaba en forma de neumonía (Yañez et al., 2005).
La importancia de su estudio es debida a sus implicaciones sanitarias, ya que
es la bacteria causante de neumonías severas, siendo también importantes sus
implicaciones socioeconómicas, ya que puede afectar a grandes colectividades
en forma de brote epidémico, incidiendo sobre múltiples sectores industriales
tales como el turismo, comercio, petroquímica…entre otros (Moreno, 2002).
3
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2.2 Aspectos clínicos
La importancia clínica de L. pneumophila reside en que es el agente patógeno
causal de la legionelosis, que puede presentar dos formas clínicas
fundamentalmente, la fiebre de Pontiac y la neumonía por Legionella o
enfermedad del legionario.
2.2.1 Sintomatología de la enfermedad
2.2.1.1 Fiebre de Pontiac
La fiebre de Pontiac consiste en un cuadro pulmonar no neumónico
caracterizado por fiebre, tos, cefalea, intensas mialgias y síntomas sistémicos
similares a los de la gripe. Presenta un corto periodo de incubación,
apareciendo la sintomatología entre 24 y 48 horas tras la exposición, afecta a
más del 95% de los individuos expuestos y desaparece espontáneamente y sin
secuelas en algunos días (Pascual et al., 1987).
2.2.1.2 Neumonía por Legionella o enfermedad del legionario
La enfermedad del legionario es un cuadro clínico neumónico, con una
importante tasa de morbilidad y mortalidad; sin embargo tiene una menor tasa
de afectación que la fiebre de Pontiac y su periodo de incubación es próximo a
diez días (Bouza, 1984).
En cuanto a síntomas y severidad existen variaciones, pero se puede
establecer un patrón aproximado en el que la enfermedad comienza con
síntomas inespecíficos que incluyen malestar, mialgias, cefalea, sudores,
escalofríos y fiebre. Normalmente en los primeros días aparece la tos que suele
ser seca y posteriormente puede hacerse productiva. El cuadro progresa en 2448 horas y una vez producida la infección, L. pneumophila es fagocitada por los
macrófagos alveolares donde continúa su multiplicación, produciendo una
alveolitis intensa y en algunos casos graves puede dar lugar a una
diseminación hematógena y extensión de las lesiones hacia otros órganos. Los
síntomas extrapulmonares son frecuentes, con fatigas, mialgias y artralgias. Es
frecuente la existencia de molestias torácicas y síntomas gastrointestinales que
incluyen naúseas, diarreas, vómitos y dolor abdominal, pudiendo verse
afectado el sistema nervioso central y dándose en un 50% de los pacientes
estados de confusión mental y delirio (Woodhead & Macfarlane, 1987; Stout &
Yu, 1997; Yu, 2000; Akbas & Yu, 2001; Mülazimoglu & Yu, 2001).
La muerte se produce generalmente por insuficiencia respiratoria progresiva.
La enfermedad no suele dejar secuela a largo plazo en los pacientes que
sobreviven, siendo la recuperación completa normalmente.
Se ha identificado a Legionella micdadei como segundo agente productor de
neumonías severas casi siempre de adquisición nosocomial y que afecta
preferentemente a pacientes con inmunodepresión grave.
4
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2.2.2 Grupos de riesgo
La neumonía por L.pneumophila afecta preferentemente a varones de
avanzada edad (superior a 50 años). En la mayoría de epidemias, la tasa de
ataque por esta bacteria ha sido de 2 a 4 veces superior en hombres que en
mujeres, donde en niños o adolescentes no es una neumonía habitual (Sturm
et al., 1981). Otros factores de riesgo, son el consumo de alcohol, tabaquismo y
la existencia de patologías previas en los individuos infectados, como
inmunodepresión crónica, insuficiencia cardíaca, neoplasia, enfermedad
crónica pulmonar e insuficiencia renal crónica, seguidos de diabetes mellitus y
cirugías previas.
2.2.3 Vías de transmisión
El único medio documentado de diseminación de Legionella es a través del
aire. Su transmisión se produce mediante la formación de aerosoles a partir de
depósitos de agua contaminada, pudiendo estar presente también en el polvo
de tierras removidas. La inhalación y el impacto que producen estas partículas
a nivel del alveolo pulmonar es lo que puede desencadenar la infección. Se
destaca que no se ha descrito transmisión interhumana (Martí Viudes et al.,
1986).
2.2.4 Tratamiento de la neumonía por Legionella pneumophila
A pesar de que L. pneumophila es susceptible in vitro a una amplia gama de
agentes antimicrobianos, los resultados in vivo difieren en muchos casos
debido a la localización intrafagocítica de la bacteria, por lo que los únicos
agentes antimicrobianos que serán clínicamente útiles serán aquellos que
logren altas concentraciones intracelulares.
Sólo se han completado unos pocos estudios para el tratamiento de la
neumonía por Legionella, por lo que la evidencia de las recomendaciones del
tratamiento es limitada (Thornsberry, Baker & Kirven., 1978; Yoo et al., 2004; Yu
et al., 2004). Durante muchos años el tratamiento de elección fue mediante
eritromicina, sin embargo un pequeño estudio clínico demostró que el
tratamiento con fluoroquinolona pefloxacina daba a los pacientes una mayor
tasa de supervivencia que el tratamiento mediante eritromicina (Dournon et al.,
1986; Dournon & Rajagopalan, 1988).
Los nuevos antibióticos macrólidos, tales como claritromicina y azitromicina,
muestran mayor eficacia en la actividad in vitro y una mejor penetración
intracelular y del tejido que la eritromicina, al igual que las quinolonas. Los
antibióticos beta-lactámicos no son eficaces contra la neumonía por Legionella.
Cuando no es posible verificar la enfermedad mediante una prueba diagnóstica
rápida, las personas son tratadas con macrólidos más antibióticos betalactámicos, puesto que un retraso en la aplicación de una terapia apropiada
para la neumonía por L.pneumophila aumenta significativamente la mortalidad
(Stout & Yu, 1997).
5
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2.3 Ecología del microorganismo
2.3.1 Reservorio medioambiental
Legionella se puede encontrar en aguas naturales y artificiales de todo el
mundo y sobrevivir a una amplia gama de condiciones ambientales (Fliermans
et al., 1979). Las bacterias son ácido-tolerantes (pueden soportar la exposición
a pH 2.0 durante periodos cortos) y se han aislado de fuentes ambientales que
van desde un pH de 2.7 a 8.3 (Sheehan et al., 2005). Se ha detectado la
presencia de Legionella en fuentes tan diversas como el agua de las plantas en
los bosques, agua subterránea (Riffard et al., 2001; Brooks et al., 2004) y el
agua de mar (Ortiz-Roque & Hazen, 1987). La bacteria también sobrevive en
fuentes artificiales de agua salada (Heller et al., 1998). Se ha descrito también
que el suelo y el polvo de las tierras removidas puede constituir un reservorio
para la bacteria, originado por las excavaciones o situaciones similares y que
podrían facilitar su difusión. Sin embargo, no se conocen brotes de legionelosis
asociados a ríos, arroyos o lagos, ya que en estos medios naturales Legionella
está presente a muy bajas concentraciones (Moreno, 2002).
2.3.2 Acceso a redes internas y proliferación en ambientes
determinados
Legionella puede incorporarse a la red de distribución de agua potable desde
reservorios acuáticos naturales, sobreviviendo a los tratamientos de cloración
convencionales puesto que es una bacteria con una resistencia elevada.
Ya en la red de agua potable, la bacteria puede colonizar sistemas internos de
agua doméstica u otras instalaciones que requieran la utilización de agua. En
estos sistemas, Legionella puede encontrar un nicho ecológico apropiado,
pudiendo llegar a unas concentraciones que causen casos aislados o brotes
epidémicos.
Numerosos grupos de investigación han centrado sus estudios en la
localización de estos puntos causantes de infecciones, como la red de agua
sanitaria de hospitales, hoteles, gimnasios (Colbourne et al., 1984; Campo, &
Apraiz, 1988; Wadovsky et al., 1982), torres de refrigeración y condensadores
evaporativos de sistemas de aire acondicionado (Witherell et al., 1988) equipos
de climatización, aguas termales, sistemas de riego, fuentes ornamentales
(Moreno., 2002), entre otros.
En el brote epidémico, sin embargo, interfieren además de la presencia del
microorganismo, el organismo huésped y las condiciones del entorno. Es decir,
el incremento en la concentración de Legionella debido a unas óptimas
condiciones ambientales, junto a la virulencia de la cepa, la generación de
aerosoles óptimos y, por último, la presencia de huéspedes susceptibles son
los factores que, interrelacionados, causan la aparición del a enfermedad.
6
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2.4 Métodos de detección tradicionales
Antes del desarrollo de un medio de cultivo que permitiera el crecimiento in
vitro de Legionella (Feeley et al., 1979), ésta sólo podía crecer mediante el
aislamiento en conejillos de indias o huevos de gallina (McDade et al., 1977).
En un principio, también se utilizaba este método para la detección de
muestras ambientales. Sin embargo este método presentaba las desventajas
de ser caro, lento y laborioso, precisando de 2 a 3 semanas para obtener
resultados. Por otro lado, era efectivo por su elevada selectividad.
Posteriormente, esta técnica se sustituyó por el aislamiento en medios de
cultivo selectivos. El primer aislamiento de Legionella spp. fue llevado a cabo
utilizando un agar específico para Legionella que contenía L-cisteína, así como
agar de carbón tamponado y extracto de levadura que contenía α-cetoglutarato
(BCYE). Legionella es una bacteria con altas exigencias en su crecimiento, por
lo que el medio debe contener unas condiciones oṕtimas de pH y temperatura,
así como requerimientos específicos de la bacteria como carbón activo, Lcisteína, hierro y α-cetoglutarato.
El agar BCYE se basa en la modificación de Edelstein a medios anteriores
(Edelstein, 1981; Wadowsky & Yee, 1981; Bopp et al., 1981; Dennis et al.,
1984). En 1979, Feely et al describieron el agar CYE (agar de carbón y extracto
de levadura) como una modificación del agar de Feeley-Gorman,
reemplazando el almidón de este agar por el carbón activado y sustituyendo el
extracto de levadura por hidrolizado de caseína, lo que permitió una mejor
recuperación de L.pneumophila. En 1980, Pasculle hizo saber que el agar CYE
podía mejorarse añadiendo tampón ACES al medio. Un año después Edelstein
aumentó todavía más la sensibilidad del medio añadiendo α-cetoglutarato (Agar
BCYE).
En resumen, el agar BCYE es un medio enriquecido para el aislamiento y
cultivo de las especies de Legionella spp. El extracto de levadura suministra
proteína y otros nutrientes necesarios para favorecer el crecimiento. L-cisteína
es un aminoácido esencial y el pirofosfato férrico soluble es un suplemento de
hierro, ambos se incorporan para satisfacer los requisitos nutritivos específicos
de la bacteria. El α-cetoglutarato se añade para estimular el crecimiento. El
carbón activado descompone el peróxido de hidrógeno, que es un producto
tóxico del metabolismo para las especies de Legionella y también puede
recoger dióxido de carbono, que modificaría la presión superficial. Por último, el
tampón ACES se añade para mantener el pH óptimo, necesario para obtener
un crecimiento adecuado.
7
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 2.2. Medio BCYE específico para el cultivo de Legionella
Aislar Legionella tanto de muestras clínicas como medioambientales, está a
menudo condicionada por la presencia de microbiota acompañante, siendo
distinta en las muestras de aspirados traqueales o de pulmón que en las
muestras de agua. Esta microbiota acompañante está constituida por bacterias
de crecimiento más rápido que Legionella por lo que el éxito en el aislamiento
estará relacionado con la cantidad de estos microorganismos acompañantes.
Cuanto más elevado sea su número, al tener un crecimiento más rápido, habrá
mayor probabilidad de enmascarar el crecimiento de Legionella. Por ello, surge
la necesidad de suplementar los medios de cultivo con antibióticos y otros
agentes selectivos para reducir la cantidad de esta flora acompañante.
Además, se ha propuesto el pretratamiento de la muestra mediante lavado
ácido (Bopp et al., 1981) o el tratamiento con calor (Dennis et al., 1984).
En 1993 Kusnetsov et al. realizaron un estudio para comparar la eficacia de
aislamiento de los tres medios de cultivo más utilizados hasta esa fecha: el
medio BCYE-α (Edelstein,1981), el medio Modified Wadowsky Yee (MWY)
(Wadowsky-Yee,1981) y el medio Cefalotina, Colistina, Vancomicina y
Cicloheximida (CCVC) (Bopp et al.,1981). Se concluyó que el medio BCYE-α
suplementado con glicina, vancomicina, polimixina B y cicloheximida (GVPC),
propuesto por Dennis et al. (1984), podía sustituir por su mayor selectividad a
los demás medios ensayados. Además, se recomendó la concentración de las
muestras medioambientales y la descontaminación de estas por tratamiento
ácido para obtener un mayor rendimiento en su aislamiento.
A pesar de la selectividad de esta técnica, se han detectado algunos
inconvenientes, como el prolongado tiempo de espera para la obtención de
resultados (de 10 a 14 días), la imposibilidad de detectar las bacterias viables
no cultivables, la necesidad de tomar precauciones con las muestras para
asegurar la viabilidad de los microorganismos y la dificultad para aislar la
bacteria en muestras con elevada contaminación microbiana.
8
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2.5 Métodos de detección basados en biología molecular
Para solucionar los inconvenientes descritos en el aislamiento por cultivo y
aprovechando la tecnología de los ácidos nucleicos, se han ido desarrollando
diversos métodos de hibridación de DNA que emplean sondas específicas
marcadas enzimática o isotópicamente (VanKetel et al., 1984; Grimont et al.,
1985; Engleberg et al., 1986).
Con el fin de aumentar la sensibilidad de las técnicas de hibridación, se
comenzó a aplicar la técnica de amplificación de ácidos nucleicos mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica con una gran sensibilidad,
especificidad y versatilidad. La PCR es una técnica que fue desarrollada por
Kary Mullis a mediados de los años 80 (Mullis & Falloona, 1987). Consiste en la
amplificación in vitro de múltiples copias de un fragmento de DNA o RNA
específico. Se basa en la actividad de la enzima DNA polimerasa
termorresistente (Taq polimerasa) que es capaz de sintetizar una cadena de
DNA complementaria a otra ya existente.
Para amplificar DNA se requieren dos oligonucleótidos iniciadores, también
conocidos como cebadores homólogos, pues su secuencia es complementaria
a una región iniciadora específica del DNA. El proceso consta de tres etapas:
desnaturalización por calor del DNA en presencia de los cebadores, hibridación
de éstos con el DNA, y síntesis de nuevas cadenas gracias a la colaboración
de la DNA polimerasa.
Figura 2.3. Etapas de la PCR
9
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
El ciclo puede repetirse de nuevo, empleando esta vez las nuevas hebras como
molde. De este modo se da lugar a un incremento exponencial del número de
copias del fragmento de DNA amplificado, que puede detectarse más tarde por
hibridación con una sonda de DNA, en un proceso de separación de moléculas
por aplicación de una diferencia de potencial eléctrico conocido como
electroforesis horizontal en gel de agarosa.
Figura 2.4. Etapas de la electroforesis horizontal en gel de agarosa (Molecular
Station.com)
A pesar de las ventajas que ofrece la PCR convencional, presenta dos
inconvenientes principales. Uno es la posibilidad de obtener falsos resultados
negativos en muestras ambientales por la presencia de ácidos húmicos,
fúlvicos y metales que actúan como inhibidores. El segundo es que la PCR
convencional consiste en un ensayo cualitativo, que informa solamente de la
presencia o la ausencia del microorganismo (Yañez et al., 2005). Se han
descrito varios métodos que permiten obtener DNA purificado carente de
inhibidores, como la rápida filtración en gel para eliminar las sustancias
húmicas (Abbaszadegan et al., 1993), filtración a través de resinas queladas de
intercambio iónico para eliminar iones metálicos (Hurt et al,. 2001; Tsai et al.,
1993) o la adición de polivinilpirrolidona para eliminar los polifenoles (Koonjul et
al., 1999), entre otros. También se ha descrito otro método para solucionar el
problema de la inhibición de la PCR consistente en la inclusión de un patrón
interno, siendo un fragmento de DNA que se amplifica con el mismo juego de
cebadores que el fragmento diana, pero con un tamaño diferente a este (Kolk
et al., 1994).
Esta técnica, ha sido aplicada por varios autores para la detección de
Legionella spp. y L. pneumophila. Engleberg et al. secuenciaron por primera
vez en 1988 un fragmento de 650 pares de bases perteneciente al gen
10
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
potenciador de la infectividad de macrófagos (mip) de L. pneumophila. Los
amplificados de dicho gen, se detectaron mediante la hibridación con sondas
marcadas enzimáticamente e isotópicamente (Starnbach et al., 1989;
Mahbubani et al., 1990).
En 1992 Mahbubani fue capaz de detectar de 10 a 100 bacterias de múltiples
especies de Legionella por PCR en 100 – 1000 mL de muestras de agua.
La tecnología de la PCR fluorescente (PCR en ‘’tiempo real’’) basada en
sondas, ha llevado al desarrollo del ensayo de forma cuantitativa. En la PCR, el
producto que se genera se marca con un fluorocromo “reporter”, y la cantidad
de luz fluorescente que se libera durante la amplificación será directamente
proporcional a la cantidad del producto sintetizado, estimándose el número
inicial de copias a partir de la acumulación del producto en la fase exponencial,
lo que le otorga una elevada precisión y exactitud en la cuantificación.
Los fluorocromos o fluoróforos con los que se marca el producto de PCR, son
componentes de una molécula que hacen que esta sea fluorescente. Es un
grupo funcional de la molécula que absorberá energía de una longitud de onda
específica y conducirá al fluoróforo a un estado excitado. Al volver de este
estado al fundamental, se emitirá una luz a una energía más baja (mayor
longitud de onda) que a la que fue captada.
Existen compuestos fluorescentes como el SYBR Green (Morrison et al., 1998)
que se intercalan en el DNA de doble cadena sintetizado. Son muy sensibles,
pero su señal no es dependiente del amplicón, por lo que dímeros de
cebadores y otros artefactos de PCR pueden conducir a falsos resultados
positivos. Para hacer frente a este problema, se utilizan métodos más
específicos de detección por PCR en ‘’tiempo real’’ (qPCR), como las sondas
complementarias a las reacciones que se hibridan con el amplicón de una
forma dependiente de la secuencia. (VanGuilder et al., 2008; Mackay et al.,
2004). Estas sondas de DNA están marcadas comúnmente por dos
fluorocromos, uno de alta energía (Reporter) en 3', y otro de baja energía
(Quencher) en 5', como por ejemplo en las sondas TaqMan (Lee et al., 1993).
Esta sonda hibridará cerca del molde de PCR para permitir la detección por
FRET (Fluorescense resonance energy transfer). En las sondas TaqMan no
hibridadas, la señal del fluoróforo estará inhibida por el ''quencher' debido a su
cercanía y emitirá una señal de fondo baja. Cuando la Taq polimerasa digiera la
sonda por la actividad exonucleasa (3' → 5') producirá que el fluorocromo se
libere en el extremo 5' de la acción del ''quencher'' y empiece a emitir
fluorescencia. De esta manera, durante los ciclos de PCR, la cantidad de
fluorescencia se irá acumulando e indicará la concentración de DNA obtenido
(Hanami T., et al (2013).
11
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 2.5. Etapas para la emisión de fluorescencia en las sondas
En ocasiones, cuando no hay suficiente secuencia diana para hibridar con la
sonda TaqMan, se ha sintetizado una modificación de esta denominada sonda
TaqMan-MGB, que son más cortas y pueden hibridarse con un número menor
de pares de bases (13 – 18 pb). Estas sondas no poseen ''quencher'' sino un
brazo extensible de DNA que al estar cerca del fluoróforo lo cubrirá inhibiendo
la fluorescencia, por este motivo no emite fluorescencia basal. Es capaz de
aumentar la temperatura de fusión (Tm) de la sonda por su habilidad de unión al
surco pequeño.
Varios autores han realizado detecciones de Legionella spp. y L.pneumophila
utilizando la tecnología de qPCR. Rantakokko & Jalava (2001) y Wilson et al.,
(2003) emplearon la qPCR para detectar DNA de Legionella spp. y
L.pneumophila respectivamente, en muestras respiratorias y Yáñez et al.,
(2005) detectaron DNA de L.pneumophila en muestras ambientales.
2.6 Validación de métodos: Normas ISO relacionadas con Legionella.
La ISO (International Standarization Organization) es la entidad internacional
encargada de favorecer la normalización en el mundo. Tienen valor indicativo y
de guía, y la finalidad principal de sus normas es orientar, coordinar, simplificar
y unificar los usos para conseguir menores costes y mayor efectividad.
12
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
2.6.1 Normas ISO para el cultivo de Legionella
En el campo de Legionella, encontramos la norma internacional ISO 11731:
1998 que describe un método de cultivo para el aislamiento de los organismos
de Legionella y para su recuento en muestras ambientales. En esta norma se
encuentran las pautas a seguir desde la preparación de los medios de cultivo,
toma y transporte de muestras, aparatos y material, procedimiento de análisis y
expresión de los resultados, tomando especial atención en la temperatura del
agua y en la naturaleza, volumen o masa y tiempo de transporte de la muestra.
Este método es aplicable a toda clase de muestras, comprendiendo aguas
potables, industriales, naturales y materiales asociados tales como sedimentos,
depósitos y lodos.
Una variante de esta norma es ISO 11731-2: 2004 centrada solamente en
aguas con bajas densidades bacterianas, puesto que un crecimiento excesivo
de otras colonias puede inhibir el crecimiento de Legionella. Especifica un
método de control para la detección y recuento de esta en aguas destinadas al
consumo humano y aguas de baño tratadas.
2.6.2 Norma ISO para la detección por qPCR de Legionella.
La norma ISO/TS 12869 describe el método para la detección y cuantificación
de Legionella spp. y Legionella pneumophila en muestras de agua utilizando la
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Esta norma
especifica los requisitos generales, requisitos metodológicos y los requisitos de
control de calidad. Está destinada a la investigación bacteriológica de todos los
tipos de agua (aguas potables, aguas industriales…). En resumen, esta norma
ISO ofrece las pautas para validar un método de detección y cuantificación de
Legionella spp y L. pneumophila mediante qPCR.
2.7 Legislación, prevención y control de la legionelosis
Legionella forma parte de ríos, estanques y lagos, y desde estos reservorios
naturales es capaz de colonizar los sistemas de abastecimiento de las
ciudades a través de la red de distribución del agua, incorporándose a los
sistemas de agua sanitaria (fría o caliente) u otros sistemas que requieren agua
para su funcionamiento como las torres de refrigeración. Si estas instalaciones
están mal diseñadas, no se mantienen o el mantenimiento es inadecuado, se
favorece el estancamiento del agua y la acumulación de nutrientes y, si la
temperatura es adecuada (entre 20 y 45º C), Legionella será capaz de
multiplicarse hasta alcanzar la dosis infectiva para el ser humano.
Los lugares donde puede encontrarse más fácilmente son los circuitos de
distribución de agua caliente sanitaria (grifos, cabezales de ducha, sifones,
tramos ciegos, etc.), sistemas de climatización y torres de refrigeración, aguas
termales de centros de rehabilitación y recreo, equipos médicos de
aerosolterapia, y fuentes decorativas. Si existe en la instalación un mecanismo
de producción de aerosoles, la bacteria se dispersa por el aire pudiendo
penetrar por inhalación en el aparato respiratorio. La supervivencia y
13
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
multiplicación de la bacteria en estos sistemas se relaciona, además de con la
existencia de una temperatura óptima para su desarrollo, con la presencia de
lodos, materiales de corrosión y otros microorganismos (amebas, algas y otras
bacterias), que le sirven de sustrato y le ofrecen una cierta protección frente a
los tratamientos de desinfección del agua que, habitualmente, consisten en la
elevación de la temperatura y en el uso de desinfectantes químicos. En la
figura 1.7.1 se muestra la relación entre las temperaturas de diseño de
diferentes equipos, el estado de desarrollo de la bacteria y la probabilidad del
riesgo de multiplicación asociado a los diferentes equipos. Según este
esquema, los focos de contaminación más probables son: las torres de
refrigeración, los cabezales de las duchas y los jacuzzis, dado que sus
temperaturas habituales de trabajo coinciden con las de máxima multiplicación
de la bacteria.
Figura 2.6. Esquema de las posibilidades de desarrollo de Legionella a diferentes
temperaturas y en diferentes instalaciones
Por ello, se hace necesaria la existencia de unas medidas de prevención y
control. Estas medidas se conocen como preventivas cuando van destinadas a
mantener la concentración de la bacteria dentro de unos límites previamente
establecidos como aceptables, o como de erradicación si el brote ya se ha
iniciado.
A pesar de la existencia de Legionella en el medio acuático natural, nunca se
ha descrito un caso o brote de esta proveniencia debido a su baja
concentración. Es en los ambientes creados por el hombre donde se hace
necesario el control de la bacteria, habiendo normas en multitud de países
14
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
destinadas a este fin. Estas medidas contemplan dos fases de actuación, por
una parte durante el montaje y diseño de los sistemas y por otra durante la fase
de explotación de las instalaciones, mediante un mantenimiento adecuado. En
España existe una norma UNE (100-030-94), sobre "Prevención de la
Legionella en instalaciones y edificios", además de legislaciones de
comunidades autónomas en las que se encuentran procedimientos explícitos.
Por otro lado, a raíz de los grandes brotes de legionelosis ocurridos en nuestro
país en los últimos años, se aprobó el Real Decreto 865/2003, del 4 de julio,
por el que se establecen los criterios higiénico-sanitarios para la prevención y
control de la legionelosis. Este decreto es aplicable a sistemas de agua caliente
sanitaria, sistema de agua fría de consumo humano, torres de refrigeración,
condensadores evaporativos, equipos de terapia respiratoria, humidificadores y
humectadores, conductos de aire acondicionado, piscinas climatizadas,
instalaciones termales, fuentes ornamentales, sistemas de riego por aspersión,
sistemas de agua contra incendios, elementos de refrigeración por
aerosolización al aire libre y otros aparatos que acumulen agua y puedan
producir aerosoles. En este Real decreto el método de referencia para el
aislamiento de Legionella en muestras ambientales es el cultivo.
Asimismo, muchos países han producido directivas o guías para el control de la
legionelosis en las torres de refrigeración. Esto es debido a que las torres de
refrigeración están relacionadas con muchos casos de la enfermedad del
legionario, ya que son un excelente amplificador y diseminador de Legionella
(Miller et al., 1979; Breiman et al., 1990; lkedo et al., 1986), debido a que
reúnen una serie de condiciones apropiadas para ello, como son la elevada
temperatura del agua (28-38°C, sobre todo en verano), la humedad, el
incremento en la tensión de oxígeno en las superficies agua-aire y la
acumulación de nutrientes.
En España, la norma UNE 100-030-94 y el Real Decreto 909/2001 también
establecen una serie de acciones relativas a las torres de refrigeración, que en
líneas generales consisten en situar estos aparatos en lugares aislados, lejos
de zonas frecuentadas, colocándolos a sotavento en relación con los vientos
predominantes en la zona de emplazamiento. Con el objetivo de facilitar la
limpieza, los componentes serán de fácil acceso, sus superficies interiores lisas
y resistentes a altas concentraciones de cloro. Además se recomienda la
inspección periódica de las torres para comprobar su estado respecto al
crecimiento de algas, deterioro de los materiales, daño de los componentes,
efectos de corrosión y correcto funcionamiento de motores y bombas, y un
sistema permanente de tratamiento por medio de agentes biocidas.
Por otro lado, las medidas de erradicación comprenden una acción coordinada
de biocidas junto con choques térmicos para lograr una descontaminación
selectiva de L. pneumophila. Comúnmente, la hipercloración es el método
elegido para, junto con un aumento controlado de la temperatura, erradicar la
bacteria de la fuente de contaminación. El problema al que nos enfrentamos
empleando este método es la elevada corrosión, que provoca importantes
pérdidas económicas en maquinaria, a pesar de que estos ya se eligen
sabiendo que, en caso de contaminación por esta bacteria, habrá que
15
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
enfrentarse a la posibilidad de la corrosión. Es por ello que se están intentando
desarrollar otros métodos que puedan actuar de la misma manera, pero sin
ofrecer el inconveniente corrosivo. Estos son la luz ultravioleta, el peróxido de
hidrógeno y el ozono.
Estudios efectuados hasta la fecha señalan que, en principio, los más
adecuados podrían ser el ozono y el peróxido de hidrógeno (Domingue et al.,
1988). Se comparó el efecto biocida del ozono, peróxido de hidrógeno y cloro
sobre suspensiones de L. pneumophila a diferentes pH y temperaturas, y el
ozono resultó ser el biocida más potente, produciendo la muerte del 99% de las
bacterias después de una exposición de 5 min a una concentración de ozono
de 0,1-0,3 mg/L. La acción del ozono no se vio afectada en ningún momento ni
por cambios en el pH o la temperatura, siendo necesario incubar durante 30 y 5
min para obtener una reducción comparable de L. pneumophila después del
tratamiento con 0,3 y con 0,4 mg/L de cloro. En el caso del peróxido de
hidrógeno, se necesitó incubar con 1.000 mg/L durante 30 min para obtener un
resultado similar al ozono, aunque presentó, sin embargo, una mayor acción
residual.
A la vista de estos resultados, tanto el ozono como el peróxido de hidrógeno
son una alternativa segura al empleo de cloro, ya que sus productos de
descomposición (oxígeno y agua) son inocuos. Además, el peróxido de
hidrógeno presenta la ventaja de su mayor acción residual.
Por otro lado, en estudios anteriores de Muraca et al., (1987), se comparó la
eficacia del ozono (1-2 mg/L), luz ultravioleta, e hipercloración (4-6 mg/L) con la
elevación de la temperatura (50-60°C) para erradicar L. pneumophila. Los
cuatro métodos empleados resultaron eficaces en la eliminación de la bacteria,
pero la luz ultravioleta y la elevación de la temperatura fueron más rápidos.
En cualquier caso, la aplicación de estos métodos estudiados in vitro a
sistemas de distribución de agua in vivo es un gran paso y, como cualquier otro
estudio in vitro, el resultado de dicha aplicación aún no se conoce.
3. OBJETO Y ALCANCE DEL TRABAJO
La incidencia de Legionella sobre la salud pública, y su repercusión económica,
hace necesario disponer de métodos de detección rápidos y sensibles. Las
legislaciones vigentes en los distintos países, incluyen el aislamiento en
medios de cultivo selectivos (BCYE-α) para detectar y cuantificar la presencia
de esta bacteria en muestras ambientales. Sin embargo, esta técnica presenta
los inconvenientes de necesitar tiempos largos de incubación debido a la baja
tasa de crecimiento de la bacteria, la imposibilidad de detectar las bacterias
viables no cultivables y la dificultad de su aislamiento en muestras
contaminadas con grandes concentraciones de microorganismos. El uso de la
PCR para su detección fue un gran avance para solventar los problemas del
cultivo, aunque seguía presentando inconvenientes como ser una técnica
cualitativa, que sólo informaba de la presencia o ausencia del microorganismo
y no de la cantidad. La aplicación de la qPCR para la detección y cuantificación
16
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
de Legionella solventa muchos de los problemas de las dos técnicas anteriores.
Durante la última década se han publicado muchos artículos científicos
basados en qPCR para la detección de este microorganismo, pero la mayoría
de estudios no están adecuadamente validados para poder ser implementados
en un laboratorio de diagnóstico ambiental acreditado bajo la norma ISO
17025. Es por ello que el objetivo de este estudio será la validación de un
método de detección y cuantificación de Legionella, empleando qPCR.
4. PROCEDIMIENTO
4.1 Búsqueda de secuencias específicas de género: Diseño de cebadores y
sondas.
En la primera fase del proyecto se llevó a cabo la búsqueda de regiones o
genes específicos de Legionella, que servirían como diana de amplificación
utilizando qPCR. Para ello, se realizó una revisión bibliográfica a través de
servicios
de
búsqueda
especializados
como
Pubmed
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) y Scirus (http://www.scirus.com/srsapp/). Para
la obtención de secuencias de nucleótidos se empleó la base de datos
biológicos GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information).
Se seleccionaron como dianas específicas de Legionella secuencias del gen
DNA ribosómico 16S (rDNA 16S) y se realizaron múltiples alineamientos
empleando programas informáticos como el ClustalW disponible en el enlace
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) del European Bioinformatics Institute.
Se trataba de buscar una región común en todo el género que a la vez fuera
distinta al resto de microorganismos. Esto se consiguió comparando las zonas
conservadas del género con toda la base de datos utilizando el programa
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul,1997), disponible en la
página web (www.ncbi.nlm.nih.gov), del NCBI. (Fig. 4.1.)
17
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 4.1. Estudio de especificidad teórica de Legionella mediante BLAST
Finalmente, los cebadores y las sondas fueron analizados empleando un
software específico, el Primer Express (Applied Biosystems) para garantizar
que cumplieran con los requerimientos específicos para trabajar en qPCR.
Figura 4.2. Ejemplo de diseño de cebadores y sondas para la detección de Legionella,
obtenida con el programa Primer Express
En la Tabla 4.1 se muestran los parámetros establecidos por el programa:
Tabla 4.1. Parámetros establecidos en el programa Primer Express para el diseño de
cebadores y sondas para experimentos de detección mediante sondas TaqMan.
Cebadores
Parámetro
Tm mínima
Tm máxima
Diferencia máxima entre Tm de cebadores
%G+C mínimo
%G+C máximo
Longitud mínima
Longitud máxima
Longitud óptima
18
Valor
58 ºC
60 ºC
2
30
80
9 nt
40 nt
20 nt
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Sonda
Amplicón
Parámetro
Tm mínima
Tm máxima
%G+C mínimo
%G+C máximo
Longitud mínima
Longitud máxima
Valor
68 ºC
70 ºC
30
80
13 nt
30 nt
Parámetro
Tm mínima
Tm máxima
Longitud mínima
Longitud máxima
Valor
68 ºC
70 ºC
13 nt
30 nt
Los oligonucleótidos amplificaron una porción de 386 pb (451-837) del gen
rDNA 16S. Los cebadores y la sonda como resultado de este estudio aparecen
en la siguiente tabla que fue descrita por Jonas et al. (1995):
Tabla 4.2. Cebadores y sonda diseñados para la amplificación específica del género
Legionella por qPCR.
Código
Secuencia (5' → 3')
16S1-A
CCAACAGCTAGTTGACATCG
16S2-A
AGGGTTGATAGGTTAAGAGC
16S1-S
AGTGGCGAAGGCGGCTACCT-FAM
Todos los cebadores diseñados en este trabajo fueron sintetizados por SigmaAldrich.
Una vez diseñados los cebadores y sonda para la detección de Legionella, y
comprobada su especificidad teórica, se realizaron ensayos de especificidad
experimental mediante qPCR con el mayor número de microorganismos
posibles relacionados evolutivamente con Legionella y muy especialmente con
todos aquellos que pudieran encontrarse en las muestras ambientales a
analizar. También se sometieron a estudio el mayor número de especies de
Legionella posibles, para comprobar la especificidad en la detección de los
cebadores. Para detectar esto último, se procedió a construir un patrón interno
que se explicará más adelante.
4.2 Cultivo de cepas bacterianas
Las cepas empleadas en los estudios de especificidad tanto de Legionella
como de otros géneros bacterianos aparecen en la Tabla 4.3. Las cepas de
Legionella se hicieron crecer en Buffered Charcoal Yeast Extract, conteniendo
19
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
un 0.1% de α-cetoglutarato, ajustado a un pH 6.9 con KOH y suplementado
(por litro) con 0.4 gramos de L-cisteína y 0.25 gramos de pirofosfato férrico
(BCYE-α). Para el aislamiento de Legionella de muestras ambientales se utilizó
medio GVPC. Se trata del medio BCYE suplementado con 3 g de glicina, 1 mg
de vancomicina, 50.000 IU de polimixina B y 80 mg de cicloheximida, que son
añadidos a 1 litro de medio BCYE. Las placas inoculadas se incubaron a 37ºC
en una atmósfera humidificada conteniendo un 5% de dióxido de carbono.
Tabla 4.3. Cepas bacterianas analizadas en este estudio
Organismo
Identificación de cepa
Fuente
Legionella parisiensis
NCTC 11983
Colección
Legionella tucsonensis
NCTC 12439
Colección
Legionella pansingensis
NCTC 12830
Colección
Legionella maceachernii
NCTC 11982
Colección
Legionella wadsworthii
NCTC 11532
Colección
Legionella adeladensis
NCTC 12735
Colección
Legionella birmininghamensis
NCTC 12437
Colección
Legionella jordanis
NCTC 11533
Colección
Legionella longbeacheae
NCTC 11530
Colección
Legionella israeliensis
NCTC 12010
Colección
Legionella gormanii
NCTC 11401
Colección
Legionella feeleii
NCTC 12022
Colección
Legionella anisa
NCTC 1974
Colección
Legionella cherrii
NCTC 1976
Colección
Legionella bozemanii
NCTC 11360
Colección
Legionella micdadei
NCTC 11371
Colección
Legionella pneumophila
ATCC 43736
Colección
Legionella pneumophila
ATCC 43130
Colección
Legionella pneumophila
ATCC 35251
Colección
Legionella pneumophila
ATCC 35251
Colección
Legionella spp.
L6242
Ambiental
Legionella spp.
L5762
Ambiental
20
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Legionella spp.
L5623
Ambiental
Legionella spp.
L5344
Ambiental
Legionella spp.
L5173
Ambiental
Legionella spp.
L5143
Ambiental
Legionella spp.
L5103
Ambiental
Legionella spp.
L4831
Ambiental
Legionella spp.
L4696
Ambiental
Aeromononas hydrophila
CECT 839
Colección
Alcaligenes faecalis
CECT928
Bacillus subtillis
CECT4522
Burkholderia cepacia
CECT4137
Candida albicans
CECT 1001
Citrobacter freundii
CECT 401
Clostridium perfringens
CECT 376
Enterobacter aerogenes
CECT4078
Enterococcus faecium
CECT410
Escherichia coli
CECT 434
Klebsiella oxytoca
CECT 860
Listeria monocytogenes
CECT 4031
Micrococcus luteus
CECT 4057
Proteus vulgaris
CECT165
Pseudomonas sp. V226
Ambiental
Pseudomonas sp. V236
Ambiental
Pseudomonas sp. V233
Ambiental
Pseudomonas aeruginosa
CECT108
Pseudomonas fluorescens
CECT378T
Pseudomonas putida
CECT 324
21
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Salmonella enterica
CECT409
Serratia marcescens
CECT 846
Shigella flexneri
CECT 585
Staphylococcus aureus
CECT82
Stenotrophomonas maltophila
CECT 115
Yersinia enterocolítica
CECT 754
Las cepas del resto de géneros bacterianos se hicieron crecer en los medios y
las temperaturas que aparecen resumidos en la Tabla 4.4.
Tabla 4.4. Temperatura de incubación y medios de cultivo utilizados para el
aislamiento de cepas bacterianas de otros géneros
Especie
Medio de cultivo
Tº de incubación (ºC)
Aeromononas hydrophila
Agar soja y tripticaseína
(TSA)
28º
Agar nutritivo (AN) +
MnSO4
37º
Agar LB
37º
TSA
37º
Agar glucosado Sabouraud
37º
Tergitol
37º
Clostridium perfringens
Peptona levadura y glucosa
(PYG)
37º
Enterobacter aerogenes
Tergitol
30º-37º
AN o agar sangre
37º
TSA, McConkey
37º
Tergitol
37º
Agar sangre
30º-35º
Alcaligenes faecalis
Bacillus subtillis
Burkholderia cepacia
Candida albicans
Citrobacter freundii
Enterococcus faecium
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Listeria monocytogenes
22
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Micrococcus luteus
TSA
25º-30º
Agar McConkey
37º
Pseudomonas spp.
Cetrimida
30º-37º
Salmonella enterica
Agar McConkey
37º
Serratia marcescens
TSA
20º-35º
Agar McConkey
37º
TSA
35º
Agar McConkey
35º
TSA
28º
Proteus vulgaris
Shigella flexneri
Staphylococcus aureus
Stenotrophomonas
maltophila
Yersinia enterocolítica
4.3 Extracción y purificación de DNA
Las colonias bacterianas procedentes de los cultivos, se resuspendieron en
200 µl de la resina Chelex 100 al 20% (Laboratorios Bio-Rad, Richmond, CA).
El DNA fue extraído mediante choque térmico, realizando tres ciclos
alternativos de 10 min de congelación a – 70 ºC y descongelación en un bloque
térmico a 94ºC.
Figura 4.3. Bloque térmico utilizado en este trabajo
Los restos celulares fueron eliminados por centrifugación a 10.000xg durante 1
min. La cantidad de DNA en las muestras se midió espectrofotométricamente
por triplicado a 260 nm (Eppendorf, Biophotometer plus), que es la longitud de
onda a la que absorben los ácidos nucleicos, y se comprobó la pureza del DNA
mediante la relación A260/A280 de acuerdo con Maniatis et al., (1982). Las
proteínas absorben a una longitud de onda de 280 nm, y una relación A260/A280
de 1.8 o superior indica que el DNA es puro. Una relación inferior a 1.6 significa
que en la muestra hay presencia de proteínas contaminantes o trazas de
fenoles.
23
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 4.4. Bio-espectrofotómetro utilizado en este trabajo
4.4 Cálculo de la concentración de DNA
El número de copias de la secuencia de rDNA 16 S se calculó asumiendo una
masa molecular media de 660 Da para 1 pb de DNA de doble cadena (PCR
Applications Manual, 2nd ed., Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany,
1999). El cálculo fue efectuado utilizando la siguiente ecuación:
Las masa media del genoma de L. pneumophila se calculó a partir del tamaño
medio del genoma, que se asume que es 3.9 Mb (Bender et al., 1990). Según
este dato y teniendo en cuenta el número de Avogadro, una unidad genómica
de Legionella equivale a 3.73 x 10-15 g.
4.5 Condiciones de la reacción de qPCR.
La reacción de amplificación fue realizada en placas ópticas de 96 pocillos
usando un volumen total de 25 µl. La mezcla de reacción contenía 1x TaqMan
universal PCR master mix (Lif Tecnologies) que contenía Buffer de PCR,
deoxynucleótidos Trifosfatos [dNTPs], AmpliTaq Gold polimerasa, 6-carboxy-xrhodamina [ROX], Amp Erase uracil N-glycosilase [UNG], MgCl2, 100 µM de
cada uno de los cebadores y 50 µM de la sonda. La sonda específica para
Legionella que se empleó era una sonda TaqMan MGB marcada con FAM
(Carboxyfluorescein) como fluorocromo. FAM presenta una longitud de onda de
excitación de 495 nm y una de emisión a 515 nm.
24
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 4.5. Reactivos y detector para la qPCR
Para realizarla, se preparó en cada pocillo la mezcla de la reacción según la
siguiente composición por muestra:
Tabla 4.5. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp.
Reactivos
Volumen / Reacción (µl)
AgPath-ID Master Mix
12.5
Cebador LegF (100µM)
0.125
Cebador LegR (100µM)
0.125
Sonda Leg (50µM)
0.125
Taq Polimerasa
1
Agua
1.125
15µl / reacción
Las reacciones de amplificación se realizaron utilizando el detector de
secuencias ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). Este sistema permite la
cuantificación de los productos de PCR en ‘’tiempo real’’, detectado por el
incremento en la señal de fluorescencia por una actividad nucleasa – 5' durante
el proceso de amplificación. En la figura 4.6 se representa un ejemplo de la
curva de reacción.
25
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Umbral o
Threshold
Línea base
Valor de Ct
Figura 4.6. Ejemplo de una curva de reacción
En la curva se ven reflejados tres conceptos:
Línea base: Representa los ciclos iniciales de la qPCR, donde no hay
cambios significativos en la señal de fluorescencia. Determina la
fluorescencia basal.
Umbral o Threshold: Nivel situado en la región exponencial de la gráfica
de amplificación, situado por encima de la línea base y que determina el
nivel de fluorescencia significativamente superior a la fluorescencia
basal. Se emplea para la determinación de los Ct.
El ciclo umbral (Ct): Ciclo en el cual la fluorescencia de la muestra
aumenta por encima de un umbral definido, y es inversamente
proporcional a la cantidad inicial de ácidos nucleicos. El umbral (Ct) para
cada reacción se representa frente al log10 de la cantidad inicial de DNA
para generar una curva estándar.
Se utilizó un pocillo de la placa óptica por muestra, donde se añadieron 15 µl
de la mezcla de reacción y 10 µl de la muestra, previamente preparada en el
apartado 4.3. Las condiciones de la amplificación se muestran en la Tabla 4.6.
Tabla 4.6. Programa de la amplificación por qPCR para el análisis de muestras.
Nº de ciclos
Temperatura (ºC) Tiempo (min.)
1
50
2
1
95
10
95
0.15
60
1
40
26
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
En la siguiente figura se ilustra el perfil térmico de la amplificación junto con el
proceso asociado a cada fase:
1. Se produce la 2. Activación de Taq y 3. Desnaturalización 4. Anillamiento y
activación de
desnaturalización de
del dsDNA
extensión de
UNG
UNG
cebadores.
Figura 4.7. Perfil térmico y procesos de la amplificación
4.6 Diseño y construcción del patrón interno
Uno de los problemas principales que se plantean en el desarrollo de sistemas
de detección de microorganismos basados en la amplificación enzimática de
DNA a partir de muestras de orígenes diversos, es la variabilidad observada
como consecuencia de la presencia en la matriz de sustancias que interfieren
en la reacción, pudiendo originar falsos negativos. Para evitar esos posibles
errores en la interpretación de los resultados, es necesaria la inclusión en el
diseño de un patrón interno (IPC) que permita discernir una ausencia de
microorganismos de una reacción inhibida (Kolk et al., 1994).
En este trabajo se realizó la construcción de un patrón interno para el diseño
propuesto con la finalidad de controlar en todo momento la presencia de
inhibidores en las muestras a analizar, eliminando así falsos negativos. Estos
patrones internos amplifican con los mismos cebadores, de una forma
simultánea con el DNA diana, empleando para ello un molde de DNA
recombinante.
Para la construcción del patrón interno se utilizó un fragmento del gen gyrB de
Aeromonas hydrophila (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT 839). Se
sintetizaron cebadores híbridos para gyrB y para el DNA diana del
microorganismo a detectar de forma que el amplicón resultante de la reacción
de PCR convencional es un fragmento del gen gyrB de A.hydrophila (de 161
pb) flanqueado a ambos extremos por secuencias de los genes diana. Las
secuencias de los cebadores para construir el patrón interno se indican en la
Tabla 4.7.
27
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Tabla 4.7. Cebadores para la síntesis del patrón interno
Código
Secuencia (5' → 3')
16S1-A-gyrBF
AGGGTTGATAGGTTAAGAGCcaaggcgttc
gtcgaatacc
16S2-A-gyrBR:
CCAACAGCTAGTTGACATCGgctgcggaat
gttgttggt
* Mayúscula Legionella 16S rDNA , Minúscula parte de la girasa de A. hydrophila.
Los componentes y las condiciones de la reacción de amplificación por PCR
para la construcción del patrón interno se muestran en las siguientes tablas:
Tabla 4.8. Programa de amplificación por PCR para la construcción del patrón interno.
Número de ciclos
Temperatura (ºC)
Tiempo (seg.)
10
94
30
10
60
30
10
72
60
35
94
30
1
72
420
Tabla 4.9. Reactivos para la amplificación por PCR para la construcción del patrón
interno.
Reactivos
Volumen / Reacción (µl)
PCR buffer 10X
4
MgCl12 (1.5 mM)
1.2
dNTPs (20 µM)
0.3
Cebador Forward (500 nM)
0.2
Cebador Reverse (500 nM)
0.2
Taq polimerasa
0.2
H2O
31.9
38 µl / reacción
28
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
A continuación, se verificó el tamaño de los fragmentos de PCR híbridos (gyrB
– diana), mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa (Pronodisa al
1.8%), utilizándose como patrón de peso molecular pBR322-DNA/Hae III.
Figura 4.8. Procedimiento para la preparación del gel de agarosa
Tras preparar el gel (incluyendo el bromuro de etidio para su visualización
posterior), se añadió a cada pocillo, 5 µL de tampón de carga + 10 µL de
muestra y se efectuó la electroforesis a un voltaje de 4-5 V/cm. Por último se
visualizó sobre un analizador de imagen.
Figura 4.9. Fragmentos híbridos visualizados en el gel de agarosa
Seguidamente, los fragmentos de PCR híbridos (gyrB – diana), una vez
verificado su tamaño mediante electroforesis en gel, se purificaron con el
sistema GenElute PCR (SigmaAldrich) y se clonaron en un vector plasmídico
(pCR2.1, de 3.9 Kb) mediante el sistema comercial para clonar productos de
PCR TOPO-TA cloning kit (Invitrogen). Se transformó una cepa de Escherichia
coli, y se llevó a cabo la selección de clones conteniendo el inserto de patrón
interno en presencia de antibiótico (ampicilina) y X-Gal. De los clones
seleccionados, se purificó el DNA plasmídico en todos los casos mediante el
método de lisis alcalina empleando columnas comerciales (Sigma- Aldrich).
29
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 4.10. Diagrama ilustrativo de la construcción de patrones internos.
Para emplear el patrón interno en qPCR, se diseñó una sonda TaqMan
marcada con el fluoróforo VIC específica de la región del gen gyrB empleada.
Esta misma sonda se empleó para todos los microorganismos diana (pero el
plásmido recombinante era distinto para cada uno de ellos). El fluoróforo VIC
presenta unas longitudes de onda de excitación y de emisión de 538 y 554
respectivamente y como inhibidor o ''quencher'' TAMRA. Esta sonda presentó
una buena combinación con la sonda de Legionella marcada con FAM, ya que
las longitudes de onda de los dos fluoróforos estaban muy alejadas.
Las concentraciones de DNA de patrón interno se ajustaron empíricamente con
el fin de minimizar la competición en la amplificación del DNA diana y el patrón
interno.
4.7 Diseño de validación: Parámetros de validación
Una validación consiste en un procedimiento para evaluar las características de
un proceso de medida y verificar que esas características cumplen una serie de
requisitos preestablecidos. La validación de los métodos empleados en un
laboratorio de diagnóstico ambiental es necesaria ya que es necesario
demostrar que los métodos empleados funcionan de forma correcta. Además la
validación de los métodos es obligatoria cuando el laboratorio está acreditado
por ENAC bajo la norma ISO 17025: Evaluación de la conformidad. Requisitos
generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración.
Para un correcto proceso de validación, hay una serie de parámetros que es
necesario calcular con los resultados obtenidos:
Límite de detección experimental: En el caso de métodos moleculares, se
calcula teniendo en cuenta la concentración más baja de unidades genómicas
que pueden ser detectadas con la probabilidad del 100%.
Límite de cuantificación: Se calcula como tres veces la desviación estándar en
el límite de detección.
30
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Sensibilidad/Especificidad: Se define respectivamente como la fracción total
del número de resultados positivos asignados correctamente y la fracción de
resultados negativos asignados correctamente con el método analizado.
Falsos positivos/Falsos negativos: Definidos como el número de resultados
positivos asignados de forma errónea y el número de resultados negativos
asignados de forma errónea, respectivamente.
Linealidad: Se define como el grado de ajuste de los puntos experimentales a
una recta.
Eficiencia de la reacción (E): Se trata de un valor relacionado con la pendiente
de la reacción de amplificación. Se calcula mediante la fórmula E = (101/pendiente
) – 1. Una eficiencia del 100% genera pendientes de – 3.32 y tiene
una eficiencia de 1. Las reacciones con diferentes niveles
de
eficiencia
pueden afectar a los Ct y generar curvas con pendientes variables.
Repetitividad/Reproducibilidad: Se define repetitividad como el grado de
concordancia de los resultados obtenidos al ejecutar el método de ensayo
repetidas veces por el mismo analista y bajo las mismas condiciones.
Reproducibilidad, en cambio, consiste en el grado de concordancia de los
resultados obtenidos al ejecutar el método de ensayo repetidas veces por dos
analistas independientes.
4.8 Procesado de muestras reales
4.8.1 Preparación de la muestra
Para preparar muestras inoculadas, se hizo crecer L. pneumophila NCTC
11192 (National Collection of Type Cultures,England) durante tres días en
medio BCYE-α. Pasado ese tiempo, se recogió la biomasa y se resuspendió en
10 mL de agua estéril. Se realizaron diluciones seriadas en base 10, añadiendo
a 45 mL de agua estéril, 5 mL de la dilución anterior y por último se empleó la
técnica de filtración por membrana con las diluciones 10-6, 10-7 y 10-8, que
contenían 810, 81 y 8 copias/mL de L. pneumophila respectivamente. Se filtró
1 mL de cada dilución mediante filtros de membrana estéril de éster de celulosa
de 0.45 µm de tamaño de poro y 47 mm de diámetro (Millipore, MZHAWG),
transfiriendo la membrana sobre el medio de cultivo BCYE-α contenido en una
placa Petri e incubándola a las condiciones óptimas para Legionella descritas
anteriormente.
31
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Figura 4.11. Sistema de filtración por membrana
Para este estudio se analizaron muestras de agua potable y muestras de agua
de torres de refrigeración. Como control positivo, se añadieron 2 mL de las
diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 (conteniendo 81000, 8100 y 810 copias/mL
respectivamente) a 1L de agua corriente y 2 mL de las mismas diluciones para
medio litro de agua de torres de refrigeración. Como control negativo se
utilizaron 50 mL de agua estéril que se procesaron de la misma manera que las
muestras a analizar.
4.8.2 Concentración de la muestra
Se filtró la totalidad de la muestra a través de una membrana filtrante de
policarbonato de 47 mm de diámetro y 0.45 µm de tamaño de poro (Millipore,
GTTP). A continuación se colocó la membrana en un tubo de plástico estéril al
que se le añadieron 12 mL de agua estéril, agitándose en vortex durante 2 min.
La suspensión se transfirió a un cartucho filtrante Amicon Ultra-15 (Millipore
Molsheim, Francia) y se concentró la muestra por centrifugación a 20.000 xg en
centrífuga (Beckman, Avanti J-25), durante 20 min. Transcurrido ese tiempo, se
procedió a efectuar la lisis bacteriana del sedimento obtenido procediendo de la
misma forma que en el apartado 4.3.
Figura 4.12. Cartucho filtrante Amicon Ultra-15 (Millipore) empleado para la
concentración de muestras biológicas.
32
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
4.8.3 Eliminación de inhibidores
En el caso de las muestras de agua potable no fue necesario pero en la
mayoría de casos de aguas de torres de refrigeración, al tratarse de muestras
con una elevada contaminación, es conveniente realizar un tratamiento de
purificación del DNA previo a la reacción de PCR para eliminar los inhibidores
que puedan estar presentes en la muestra (materia orgánica como ácidos
fúlvicos y húmicos y metales). Para ello, se utilizó el Kit de Preparación de
Muestras de Aguas “sucias” (Ielab), basado en una etapa de lisis celular
seguido de una etapa de purificación del DNA mediante una columna de
exclusión molecular.
Figura 4.13. Procedimiento de purificación de DNA
4.8.4 Amplificación
Una vez extraído y purificado el DNA, para la amplificación por qPCR, se
procedió del mismo modo que en el apartado 4.5 con la salvedad que el patrón
interno ya estaría añadido a la mezcla de reacción. La actualización de los
reactivos y volúmenes se muestran en la siguiente Tabla 4.10.
33
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Tabla 4.10. Mezcla de reacción para la amplificación de Legionella spp.
Reactivos
Volumen / Reacción (µl)
AgPath-ID Master Mix
12.5
Cebador LegF (100µM)
0.125
Cebador LegR (100µM)
0.125
Sonda Leg (50µM)
0.125
Sonda PI (50µM)
0.125
DNA PI
1
Taq Polimerasa
1
15µl / reacción
5. RESULTADOS
5.1 Conceptos estadísticos
Con el objetivo de facilitar la comprensión de los resultados, se describirán
brevemente algunos conceptos estadísticos convenientes.
Promedio (Χ): Cantidad o valor medio que resulta de dividir la suma de
todos los valores entre el número de estos.
Desviación típica (S): Es una medida de dispersión, que informa como
de alejados se encuentran los datos alrededor de la media.
Desviación estándar relativa (RSD): Es la relación entre la desviación
típica y su media.
Coeficiente de variación (CV): Es el valor de RSD expresado en
porcentaje. Un porcentaje bajo indica que la dispersión de los datos es
pequeña.
Los parámetros y cálculos realizados están basados en las normas ISO/TS
12869: Detección y cuantificación de Legionella spp. y L. pneumophila en
muestras de agua utilizando la qPCR, ISO 17025: Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración e ISO 13843:
Orientación sobre la validación de métodos microbiológicos, entre otras.
34
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
5.2 Optimización de las condiciones de amplificación y optimización del patrón
interno
Para conseguir la concentración óptima de trabajo de los cebadores diseñados,
se realizó un batería de ensayos con distintas concentraciones de cada uno de
los cebadores empleando una concentración fija de DNA patrón, 6 pg de DNA
de L.pneumophila NCTC 11192 (National Collection of Type Cultures, England).
Estos ensayos permitieron determinar la concentración de cebadores que
proporcionaban los menores valores de Ct y la mayor intensidad de
fluorescencia. Las concentraciones de cebadores ensayadas fueron de 300 a
900 nM. El resto de parámetros permaneció constante, incluyendo la
temperatura de anillamiento y la concentración de la sonda TaqMan-MGB (que
siempre se emplea una concentración por exceso de 250 nM). Los valores
obtenidos de Ct, en todos los ensayos, fueron aproximadamente los mismos
con todas las combinaciones, por lo que se utilizó la menor concentración (300
nM) de cada cebador.
Tabla 5.1. Optimización de la concentración de cebadores
Reverse
300 nM
500 nM
900 nM
23.40
22.21
21.89
22.13
22.07
21.75
22.09
21.76
21.90
21.71
21.69
21.65
21.43
21.43
21.56
21.57
21.58
21.43
21.61
21.46
21.47
21.75
21.77
21.35
21.79
21.37
21.41
Forward
300 nM
500 nM
900 nM
La concentración del patrón interno positivo se optimizó para minimizar la
competencia con la diana de Legionella spp. Se combinaron diluciones
seriadas en base 10 del patrón interno positivo con diferentes concentraciones
de DNA de Legionella spp. y se realizó la amplificación con los cebadores
16S1-A y 16S2-A. La concentración en la que ya no se observó competencia
con la diana de Legionella, fue la que se seleccionó para utilizar en todas las
35
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
reacciones de amplificación, fue la que contenía 38 copias del patrón interno
positivo. Los resultados se muestran en la Tabla 5.2.
Tabla 5.2. Optimización de la concentración de patrón interno (IPC)
Nº de copias
rDNA 16S de
Legionella spp.
Ct de las sondas del gen rDNA 16S y del IPC al número de copias
de IPC indicado.
380
38
0
IPC
rDNA 16S
IPC
rDNA 16S
IPC
rDNA 16S
1000
35.48
30.79
37.55
30.83
-
30.68
100
36.22
34.18
36.19
32.71
-
32.67
10
34.09
36.70
35.64
36.34
-
35.11
0
34.19
-
34.40
-
-
-
Las regiones seleccionadas fueron analizadas en el programa Primer Express
(Life Technologies) con el fin de que cumplieran los requisitos impuestos por la
qPCR. Los cebadores y sondas incluyendo el patrón interno aparecen en la
Tabla 5.3.
Tabla 5.3. Cebadores y sondas diseñados para la amplificación específica del género
Legionella por qPCR.
Código
Secuencia (5' → 3')
16S1-A
CCAACAGCTAGTTGACATCG
16S2-A
AGGGTTGATAGGTTAAGAGC
16S1-S
AGTGGCGAAGGCGGCTACCT-FAM
gyrB-S
AACAAGACCCCGATCCACCCGAAG-VIC
5.3 Estudio de especificidad, sensibilidad, falsos positivos y falsos negativos
Los cebadores y la sonda fueron diseñados en una región conservada para
todo el género Legionella del gen rDNA 16S. Para verificar su especificidad las
secuencias de los cebadores y las sondas fueron comparadas con todas las
36
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
secuencias depositadas en las bases de datos de nucleótidos del GenBank
(NCBI) empleando la aplicación BLAST. Los alineamientos obtenidos
demostraron que las regiones eran específicas del género Legionella, ya que
en ninguno de los alineamientos aparecían secuencias de otros
microorganismos. Además, el programa calculó la significancia estadística de
las coincidencias (Altschul et al.,1990). Con este estudio se demostró la
especificidad teórica de los cebadores y la sonda diseñados.
La especificidad experimental de los cebadores y de la sonda se realizó
probando el diseño desarrollado con las especies enumeradas en la Tabla 4.3.
Con todos los datos obtenidos en estos experimentos se calcularon los
siguientes parámetros (Tabla 5.4): verdadero positivo (VP), falso positivo (FP),
verdadero negativo (VN) y falso negativo (FN), tal y como aparece en la norma
ISO/TR: 13843.
Tabla 5.4. Generación de los conceptos VP, FP, VN y FN.
Patrón de referencia
Prueba
Positivo
Negativo
Positivo
Verdadero positivo (a)
Falso positivo (b)
Negativo
Falso negativo (c)
Verdadero negativo (d)
El concepto de verdadero positivo se define como la proporción de muestras
positivas que contienen el microorganismo. Por el contrario, verdadero negativo
se define como la proporción de muestras negativas que no contienen el
microorganismo.
El set de cebadores y la sonda amplificaron todas las cepas de Legionella spp.
pero ninguna otra bacteria analizada en este trabajo (Tabla 5.5).
Tabla 5.5. Análisis de la especificidad y la sensibilidad de los cebadores y la sonda
Legionella spp.
Otros géneros
Amplifica
+
-
No amplifica
-
+
A continuación, a partir de los resultados obtenidos en la tabla anterior y, según
lo descrito en la Tabla 5.4. se obtuvo la siguiente clasificación final:
37
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Tabla 5.6. Clasificación de los resultados VP, FP, VN y FN
Clasificación
Total
a
1
b
0
c
0
d
1
2
Total
Finalmente, a partir de las fórmulas específicas, se calcularon los valores de
sensibilidad, especificidad, falsos positivos y falsos negativos (Tabla 5.7)
siguiendo la norma ISO/TR: 13843.
Tabla 5.7. Fórmulas y resultados de la sensibilidad, especificidad, falsos positivos y
falsos negativos de los cebadores y la sonda
Parámetro
Fórmula
Resultado
Sensibilidad
a/(a+b)
1
Especificidad
d/ (d+c)
1
Falsos positivos
c/(a+c)
0
Falsos negativos
b/(b+d)
0
Los resultados demostraron que los cebadores y la sonda analizados, poseían
una elevada sensibilidad y especificidad para la detección de Legionella spp.
no encontrándose falsos positivos ni falsos negativos en las cepas analizadas
en este trabajo.
5.4 Límite de detección y límite de cuantificación
Para calcular el límite de detección del método de qPCR se utilizaron
concentraciones bajas de DNA de L. pneumophila NCTC 11192 (National
Collection of Type Cultures,): 10 réplicas de 100 copias, 10 réplicas de 50
copias, 10 réplicas de 25 copias y 10 réplicas de 10 copias.
Los resultados mostraron que las réplicas que contenían 100, 50, y 25 copias
se detectaron en el 100% de los casos, mientras que las réplicas de 10 copias
tan sólo se detectaron en un 50%. Por otro lado, se observó una marcada
38
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
disminución entre el número de copias inicial y el número de copias detectadas
en las cuatro concentraciones. Por lo tanto, puesto que el límite de detección
experimental se define como la concentración más baja de unidades
genómicas que pueden ser detectadas con la probabilidad del 100%, en este
método, la concentración más baja se situaría en el límite de 25 copias.
Tabla 5.8. Límite de detección del método de qPCR
100
X
Detección (%)
50
25
10
Ct
Copias
Ct
Copias
Ct
Copias
Ct
Copias
29.38
85.26
31.49
19.78
33.24
5.86
34.69
0.1
30.01
55.08
32.50
9.78
32.69
8.58
34.80
1.99
29.63
71.68
32.02
13.64
32.19
12.14
-
-
29.35
87.05
31.62
18.01
34.09
3.25
35.19
1.52
30.56
37.61
31.92
14.62
32.18
12.23
-
-
29.69
68.76
32.56
9.47
33.19
6.07
-
-
30.44
40.87
31.52
19.35
32.58
9.26
-
-
30.07
52.83
32.20
12.06
33.45
5.07
34.91
1.83
29.86
61.11
31.64
17.79
34.24
2.93
-
-
31.19
24.30
32.68
8.67
33.20
6.02
34.48
2.49
30.02
58.45
32.01
22.30
33.14
7.14
34.84
1.59
100
100
100
50
Debido a la baja reproducibilidad que se obtiene a bajas concentraciones, el
límite de cuantificación fue calculado a partir de la desviación estándar de los
valores de los Ct en el límite de detección, es decir, la desviación estándar
obtenida en los Ct de 25 copias de concentración. Por esta razón, cuando a la
media del valor de los Ct a esa concentración se le incrementó 3 veces el valor
de la desviación estándar, el nuevo valor de Ct resultó en 30.77. Por lo tanto, de
39
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
acuerdo con la curva estándar, el número de copias calculadas fue de 32.38, lo
que indicaba que la cuantificación es posible por encima de este límite.
5.5 Curva estándar y eficiencia de la reacción.
En qPCR cuantificar es sinónimo de determinar el número de copias de un gen
diana presente en una muestra, para ello es necesario utilizar una recta patrón.
Esta se obtuvo mediante la preparación de diluciones seriadas en base 10 de
dos concentraciones conocidas de DNA de L.pneumophila. En el gráfico de
amplificación de una serie de diluciones, el valor de Ct es inversamente
proporcional a la concentración del DNA diana inicial. (Figura 5.1).
Puesto que el número inicial de copias del gen diana en una muestra
desconocida se determina interpolando su valor de Ct en la ecuación de la
recta patrón obtenida, es necesario que esta sea lo suficientemente precisa
para utilizarla en distintas reacciones. Es por ello, que el uso de una recta
patrón obtenida a partir de una única reacción no es recomendable puesto que
no refleja las variaciones que se pueden producir durante la amplificación,
como alteraciones en la temperatura (afectando al anillamiento y/o
desnaturalización) o análisis de concentraciones diferentes producidas por
errores en el pipeteo, entre otras.
Para solucionar este problema, se llevaron a cabo 6 experimentos diferentes de
amplificación por triplicado, obteniendo un total de 120 puntos para la
elaboración de una recta más robusta y por tanto más precisa al incluir los
factores de variación.
Figura 5.1. Recta de calibrado de Legionella pneumophila
Al finalizar la amplificación, se realizó un análisis de regresión lineal,
enfrentando en un gráfico los valores obtenidos de los Ct frente al logaritmo del
número de copias del gen rDNA 16S, obteniendo una recta robusta con un
coeficiente de correlación (r) de -0.990 (R2=0.980). La ecuación resultante de la
40
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
curva de regresión obtenida fue Ct = - 3.32 log10 [número de copias] + 35.79,
teniendo un rango lineal de 6-log10. Por último, la eficiencia de la reacción se
determinó a partir de la pendiente de la porción lineal de la recta robusta,
utilizando la fórmula E = (10-1/pendiente) – 1 y resultando en una eficiencia de
1.00. Esta eficiencia coincide con el valor del máximo teórico (1.00), que indica
que la cantidad del producto de amplificación se duplica en cada ciclo.
Reacciones con diferentes eficiencias afectarán a los Ct y producirán rectas de
calibrado con distintas pendientes (Bustin et al., 2009).
Figura 5.2. Recta estándar del gen rDNA 16S de Legionella spp.
5.6 Reproducibilidad y repetitividad
La reproducibilidad y la repetitividad son términos de la validación, que tienen
como objetivo la normalización de un método de ensayo.
La repetitividad determina la proximidad entre los resultados de mediciones
sucesivas, efectuadas en las mismas condiciones. Se incluye el mismo
procedimiento de medición, mismo analista, instrumentos, lugar y repeticiones
dentro de un periodo corto de tiempo (Llamosa et al., 2007).
La reproducibilidad en cambio, refleja la proximidad entre los resultados de las
mediciones pero efectuadas bajo condiciones de medición diferentes. Estos
cambios incluyen el analista, instrumentos, lugar, condiciones de uso y tiempo,
entre otros. Sus resultados determinarán si se podrá llevar a cabo el mismo
procedimiento obteniendo resultados similares.
Para elaborar una evaluación de las variaciones que se producen en los
múltiples ensayos, tanto durante (intra-ensayo) como entre ellos (inter-ensayo),
se llevó a cabo la preparación de diluciones seriadas en base 10 de un DNA
diana y se efectuó el ensayo con 6 concentraciones de DNA de Legionella
realizando el experimento dos veces, una por cada analista. Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla 5.9.
41
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Tabla 5.9. Reproducibilidad y repetitividad del gen rDNA 16S en PCR cuantitativa.
Coeficiente de variación (%)
Nº de copias
Intra-ensayo
Inter-ensayo
Ct
Nº de copias
Ct
Nº de copias
1235000
0.42
5.2
0.67
8.2
123500
1.4
19.22
1.84
25.32
12350
1.06
18.07
1.28
23.07
1235
0.83
15.79
0.76
14.1
123.5
1.68
33.61
1.52
30.59
12.35
0.45
11.41
0.35
8.36
El coeficiente de variación para los Ct fue 1.08% en el estudio intra-ensayo
(repetitividad) y 1.19% en el estudio inter-ensayo (reproducibilidad). En
contraste, cuando las variaciones del intra- y el inter-ensayo fueron calculadas
teniendo en cuenta el número de copias del DNA diana, los valores fueron
46.08% y 20.19% respectivamente, que es superior que los valores de Ct. Por
otro lado, las diferencias se encontraron para ambos (intra- e inter-ensayo), en
las muestras que contenían elevados y bajos números de copias: cuando el
número de copias disminuía, el valor del coeficiente de variación aumentaba.
5.7 Cuadro resumen de validación
En la siguiente tabla (Tabla 5.10) se muestra un resumen de todos los
resultados de la validación del método de qPCR:
Tabla 5.10. Resumen de la validación
Microorganismo
Legionella spp.
Proceso
Amplificación por qPCR con cebadores y
sonda específicos.
42
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Control de la amplificación
Interno (competitivo con la diana en la misma
reacción)
Parámetros de validación
Especificidad
Legionella spp.
Analizado con 29 cepas de Legionella spp. y
28 cepas de diferentes géneros
Falsos positivos/ Falsos negativos No detectados
Linealidad
Rango de 6-log10
Eficiencia de la reacción
1
Límite de detección (LOD)
25 copias (100%)
Límite de cuantificación (LOQ)
32.38 copias (100%)
Repetitividad / Reproducibilidad
Repetitividad: (Ct) 1.08%
(DNA) 46.08%
Reproducibilidad: (Ct) 1.19%
(DNA) 20.19%
5.8 Aplicación del diseño en muestras naturales y comparación con el método
tradicional de cultivo.
Para acabar la validación, el método fue ensayado en muestras naturales. La
detección de Legionella. spp mediante qPCR fue utilizada para analizar 5
muestras de agua potable y 5 muestras de agua de torre de refrigeración.
Todas las muestras fueron procesadas en paralelo para la técnica tradicional,
aislamiento de Legionella spp. mediante cultivo y qPCR. Todas las muestras
ensayadas dieron resultados positivos para los dos métodos. En todos los
casos los resultados obtenidos empleando qPCR (ug) fueron más altos que los
obtenidos mediante cultivo (CFU). La media de la diferencia encontrada entre
cultivo de qPCR para muestras de agua potable fue de 3.82 y en el caso de
aguas de torres de refrigeración fue 2.21 (Tabla 5.11).
43
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Tabla 5.11. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo tradicional y
qPCR para muestras de agua de torre de refrigeración
Cultivo (ufc/L)
qPCR (UG/L)
3.86
4.08
2.86
3.66
4.86
5.05
3.86
4.21
2.86
3.51
Ʃ= 18.29
Ʃ=20.50
Tabla 5.12. Comparación de la detección de Legionella spp. por cultivo tradicional y
qPCR para muestras de agua potable
Cultivo (ufc/L)
qPCR (UG/L)
4.86
5.66
3.86
4.73
4.86
5.57
3.86
4.66
2.86
3.49
Ʃ=20.29
Ʃ=24.11
6. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La amplificación de ácidos nucleicos por PCR y más recientemente por qPCR
ha demostrado que es capaz de detectar la presencia de las especies de
Legionella en muestras ambientales, solucionando los problemas que presenta
el aislamiento mediante cultivo como la rapidez y la sensibilidad (Ballard et al.,
2000; Hayden et al., 2001; Rantakokko-Jalava et al., 2001; Wellinghausen et
44
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
al., 2001). Sin embargo, todos los trabajos de este campo describen el diseño
de sondas y cebadores y ninguno de ellos presenta una validación completa
del sistema incluyendo amplios estudios de especificidad y sobretodo
aplicaciones en muestras naturales. Esto hace que estas metodologías sean
complicadas de implementar en laboratorios de rutina ya que para que una
nueva metodología pueda ser implementada es necesario realizar una
validación completa y sobretodo es muy importante realizar ensayos
comparativos dónde el método alternativo se compare con el método que se
utiliza habitualmente en el laboratorio y que suele ser el que está aceptado en
todas las legislaciones y normas. Es necesario demostrar que el método
alternativo que se propone es igual o mejor que el empleado habitualmente.
En este trabajo se ha validado un método de qPCR en el gen rDNA 16 S para
la detección y cuantificación de Legionella spp. .
La especificidad de los cebadores y la sonda MGB fue confirmada llevando a
cabo múltiples búsquedas en bases de datos de nucleótidos y analizando 29
especies de Legionella spp. y 28 especies de otros géneros evolutivamente
relacionados o comúnmente presentes en muestras ambientales.
Se construyó una recta estándar de DNA de L. pneumophila empleando la
tecnología de qPCR, ya que para conocer el número de copias del gen de
interés en una muestra desconocida es necesario interpolar el valor de los Ct
obtenidos con una recta estándar. Sin embargo, una recta obtenida a partir de
una sola reacción no resultaría viable al no incluir los posibles errores durante
la preparación y amplificación. Es por ello, que la recta se generó a partir de
una amplia gama de concentraciones que se analizaron por triplicado y se
repitieron varias veces, obteniendo un total de 120 puntos. De esta manera, se
proporcionó un método fácil, rápido y barato de cuantificar DNA de una manera
precisa y reproducible por esta metodología.
El límite de detección en el ensayo fue de 25 copias del DNA diana, siendo
comparable con otros autores que obtuvieron límites de detección similares
como Wilson et al. (2003) que detectaron 10 copias del DNA de L.pneumophila
y Yañez et al., (2005) que detectaron 6.73 copias. Este valor del límite de
detección resultó óptimo ya que indicaba que el método era capaz de detectar
especies de Legionella presentes en muestras ambientales aunque estuvieran
en bajas concentraciones.
La reproducibilidad de este método de qPCR se evaluó empleando los valores
del coeficiente de variación de varios intra- e inter-ensayos. El coeficiente de
variación se calculó para los Ct, así como también para el número de copias.
Sin embargo, a causa de la naturaleza exponencial de la amplificación de
qPCR, la concentración y los Ct tienen una relación logarítmica-lineal, lo que
45
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
ocasiona que los coeficientes de variación esperados para los Ct sean inferiores
a los de las concentraciones.
Una vez que se calcularon todos los parámetros de validación se realizó un
pequeño estudio de la aplicación del método desarrollado en muestras
ambientales y sus resultados se compararon con el método aplicado
tradicionalmente en el laboratorio. Los resultados obtenidos indicaron que los
datos de qPCR siempre eran más elevados que los obtenidos por cultivo. Estos
resultados son normales ya que cuando se realiza la amplificación de DNA
estamos detectando el total de células que hay en una muestra: estamos
detectando el DNA de las células vivas, de las células muertas y de las células
que son viables y no cultivables, en el caso del cultivo sólo se detectan las
células que son capaces de crecer en el medio de cultivo (viables cultivables).
Además en el caso de Legionella, las tasas de recuperación del cultivo son
normalmente bajas (70-60% de la población cultivable) debido a los requisitos
específicos de crecimiento, crecimiento excesivo de otras bacterias (que
enmascaran el crecimiento de Legionella) y la pérdida de Legionella por daños
ocasionados durante la preparación de la muestra. Por estos motivos, el
número de células calculadas por qPCR será siempre mayor que el número de
CFU de los cultivos (Huijsdens et al., 2002; Wellinghausen et al., 2001). Sin
embargo, este método presenta la limitación de no poder diferenciar las células
muertas de las células vivas que son las causantes de la enfermedad, hecho
que impide obtener una información precisa de la población infectiva. Es
conveniente apuntar, que en este trabajo se efectuó el análisis de 10 muestras
solamente y que para hacer un buen estudio de correlación entre dos métodos
y obtener unos resultados reproducibles, es recomendable analizar un mínimo
de 70-80 muestras.
Las muestras ambientales contienen generalmente la presencia de inhibidores
de la qPCR tales como, metales pesados y materia orgánica. Se han descrito
diferentes métodos de purificación de DNA (Abbaszadegan et al., 1993; Hurt et
al., 2003; Koonjul et al., 1999; Tsai et al.,1993), que han intentado eliminar
estos inhibidores, pero a pesar de sus ventajas, en algunas muestras
problemáticas se continúan detectando inhibiciones. Por esta razón, el uso en
la qPCR de un control positivo interno es muy importante para controlar la
presencia de esos inhibidores en las muestras, pudiendo así evaluar la posible
presencia de falsos resultados negativos. En este trabajo, se ha desarrollado
un método de qPCR que utiliza los mismos cebadores para la amplificación del
gen rDNA 16 S de Legionella y para el control positivo interno. Este método ha
sido utilizado por autores como Kolk et al. (1994) que utilizaron como control
positivo interno una cepa de Mycobacterium smegmatis en su estudio para la
detección de la secuencia IS6110 de Mycobacterium tuberculosis o Yañez et al.
(2005) que emplearon la bacteria Aeromonas hydrophila en su estudio de
46
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
detección del fragmento del gen dotA de L.pneumophila. Este método tiene la
ventaja de una rápida detección tanto del DNA diana como de un posible
inhibidor mientras se mantiene la sensibilidad del ensayo de qPCR.
En los últimos años, los métodos de PCR se están ya incluyendo en las normas
ISO, favoreciendo la normalización de métodos oficiales para su uso en
laboratorios de diagnóstico. Estos métodos de referencia han sido
exhaustivamente estudiados y describen de forma clara y exacta la realización
del ensayo. Como ya se ha descrito, el uso de métodos alternativos al método
de referencia está permitido, aunque para ello es indispensable desarrollar un
protocolo de validación exhaustivo así como comparar que sus resultados son
equivalentes o mejores que el método de referencia.
Las conclusiones de este trabajo se pueden resumir en 4:
1. Se ha diseñado y validado un método de qPCR para la detección y
cuantificación de qPCR.
2. Los parámetros de validación obtenidos indican que el método puede ser
aplicado para la detección y cuantificación de Legionella spp. en
muestras ambientales.
3. Como ya se había demostrado en trabajos anteriores se presenta como
un método más rápido (5-6 horas) frente al método tradicional empleado
(14 días para obtener resultados por cultivo) y con mayor sensibilidad y
especificidad.
4. Los resultados obtenidos en muestras reales indican que los recuentos
empleando qPCR siempre son superiores ya que la información que
ofrece proviene de la amplificación del DNA de células viables, viables
no cultivables y células muertas. Por ello es necesario el desarrollo de
un método que pueda informar de la presencia de células vivas que son
las que indican la presencia de células infectivas.
47
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
7. BIBLIOGRAFÍA
Abbaszadegan, M., M. S. Huber., C. P. Gerba, and I. L. Pepper., 1993.
Detection of enteroviruses in groundwater with the polymerase chain
reaction. Appl. Environ. Microbiol. 59:1318–1324.
Akbas, E., Yu, V., 2001. Legionnaires’ disease and pneumonia: beware
the temptation to underestimate this “exotic” cause of infection
Postgraduate Medicine, 109(5):135–147.
Ballard, A. I., N. K., Fry, L., Chan, S., B. Surman., J. V. Lee., T. G.
Harrison., K. J. Towner., 2000. Detection of Legionella pneumophila
using a realtime PCR hybridization assay. J. Clin. Microbiol. 38:4215–
4218.
Bender, L., M. Ott., R. Marre., J. Hacker., 1990. Genome analysis of
Legionella ssp. by orthogonal field alternation gel electrophoresis
(OFAGE). FEMS Microbiol. Lett. 60:253–257.
Bopp, C.A., Sumner, J.W., Morris, G.K., Wells, J.G., 1981. Isolation of
Legionella spp. from environmental water samples by low-pH treatment
and use of a selective medium. J.Clin.Microbiol ., 13 :714-719 .
Bouza, E., Rodriguez-Creixems, M., 1984. Legionnaries' disease in
Spain. In: Legionella proceedings of 2nd International Symposium,
ed.Thornsberry, C., Balows, A., Feely, J., y Jacubowsky, W. Washington
DC. Am. Soc. Microbiol ., 15-17.
Breiman, RF., Cozen, W., Fields, B.S., Mastro, T.D., Carr, S.J., Spika,
J.S., Mascola, L., 1990. Role of air sampling in investigation of an
outbreak of Legionnanires' disease associated with exposure to aerosols
from an evaporative condenser. J. Infect . Dis., 161 :1 .257-1 .261 .
Brooks, T., Osicki, R., Springthorpe, V., Saltar, S., 2004. Detection and
identification of Legionella species from groundwaters. Journal of
Toxicology and Environmental Health, Part A, 67:1845–1859.
Bustin, S.A., Benes, V., Garson, J.A., Hellemans, J., Huggett, J.,
Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Plaffl, MW., Shipley, GL.,
Vandesompete, J., Wittwer, C.T., 2009. The MIQE guidelines: minimum
information for publication of quantitative real-time PCR experiments.
Clin Chem. 55: 611-22.
Campo, A.M., Apraiz, D., 1988. Epidemiological study of the Legionella
pneumophila presence in potable water in Alicante . Aqua, 3:116-119 .
Colbourne, J.S., Pratt, D .J., Smith, M .G., Fisher Hoch, S.P., Harper,
D., 1984 . Water fittings as sources of Legionella pneumophila in a
hospital plumbing system. Lancet: 1:210-213.
48
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Dennis, P .J., Barlett, C.L., Bright, A.E., 1984. Comparison of isolation
methods for Legionella spp. in Legionella proceedings of the second
International Simposium, ed. Thomsberry, E., Balows, A., Feeley, J.C. y
Jacubowski, W., pp. 294-296 . American Society for Microbiology.
Washington D.C.
Domingue, E., Tyndall, L., Mayberry, W.R., Pancorbo, O.C., 1988.
Effects of three oxidizing biocides on Legionella pneumophila serogroup
1. Appl.Environ.Mïcrobiol., 54:741-747 .
Dournon, E., Rajagopalan, P., 1988. Comparison of spiramycin and
erythromycin in the treatment of experimental guinea pig legionellosis. J
Antimicrob Chemother 22 Suppl B: 69–72.
Dournon, E., Rajagopalan, P., Vilde, JL., Pocidalo, JJ., 1986. Efficacy
of pefloxacin in comparison with erythromycin in the treatment of
experimental guinea pig legionellosis. J Antimicrob Chemother 17 Suppl
B: 41–48.
Edelstein, P.H., 1981. Improved semiselective medium for isolation of
Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental
specimens. Journal of Clinical Microbiology, 14:298-303.
Engleberg, N.C., Pearlman, E., Diyon, D., Eisenstein, R.I., 1986.
Antibodies isolated using cloning surface antigens recognize
antigenically related molecules in Legionella pneumophila and other
Legionella species. J. Immunol., 136:1 .415-1 .417.
Engleberg, N.C., Cianciotto, N., Smith, J., Eisenstein, B.I., 1988.
Cloning and expression of Legionella pneumophila antigens in
Eschetrichia coli. Infect . Immun., 44:222-227 .
Feeley, J.C., Gibson, R.J., Gorman, G.W., Langford, N.C., Rasheed,
J.K., Mackel, D.C., Baine, W.R., 1979. Charcoal yeast extract agar:
primary isolation medium for Legionella pneumophila. J.Clin. Microbiol.
10:437-441 .
Fliermans, C.B., Cherry, W.B., Orrison, L.H., Thacker, L., 1979.
Isolation of Legionella pneumophila from nonepidemic related aquatic
habitats. Appl. Environ. Microbiol ., 37: 1 .239- 1 .242 .
Garcia-Nuñez, Marian., 2009. Colonización citopatogenicidad y
persistencia de Legionella spp. en agua sanitaria hospitalaria. Dirigida
por Sabria, M. y Pedro-Botet M. Tesis doctoral. Universitat Autònoma de
Barcelona. Departament de Medicina.
Grimont, P.A.D., Grimont, F., Desplaces, N., Tchen, P., 1985. DNA
probe specific for. Legionella pneumophila . J .Clin.Microbiol., 2:431-437.
49
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Hanami, T., Delobel, D., Kanamori, H., Tanaka, Y., Kimura, Y., et al.
2013. Eprobe Mediated Real-Time PCR Monitoring and Melting Curve
Analysis. PLoS ONE 8(8): e70942. doi:10.1371/journal.pone.0070942.
Hayden, R. T., J. R. Uhl., X. Quian., M. K. Hopkins., M. C. Aubry., A.
H. Limper., R. V. Lloyd., F. R. Cockerill., 2001. Direct detection of
Legionella species from bronchoalveolar lavage and open lung biopsy
specimens: comparison of LightCycler PCR, in situ hybridization, direct
fluorescence antigen detection, and culture. J. Clin. Microbiol. 37:2618–
2626.
Heller, Höller, Süßmut., Gundermann., 1998. Effect of salt
concentration and temperature on survival of Legionella pneumophila.
Letters in Applied Microbiology, 26: 64–68.
Hurt, R. A., X, Qiu., L. Wu., Y. Roh., A. V. Palumbo., J. M. Tiedje., J.
Zhou., 2001. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and
sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67:4495–4503.
Huijsdens, X. W., R. K. Linskens., M. Mak., S. G. Meuwissen., C. M.
Vandenbroucke-Grauls., P. H. Savelkoul., 2002. Quantification of
bacteria adherent to gastrointestinal mucosa by real-time PCR. J. Clin.
Microbiol. 40:4423–4427.
Ikedo, M., Yabuuchi, E., 1986. Ecological studies of Legionella species.
Viable counts of Legionella pneumophila in cooling tower water. Microbiol
.Inmunol., 30:413-423 .
Jonas, D., A. Rosenbaum., S. Weyrich., S. Bhakdi., 1995. Enzymelinked immunoassay for detection of PCR-amplified DNA of legionellae in
bronchoalveolar fluid. J. Clin. Microbiol. 33:1247-1252.
Kolk, A. H. J., G. T. Noordhoek., O. De Leeuw., S. Kuijper., J. D. A.
Van Embden., 1994. Mycobacterium smegmatis strain for detection of
Mycobacterium tuberculosis by PCR used as internal control for inhibition
of amplification and for quantitation of bacteria. J. Clin. Microbiol.
32:1354-1356.
Koonjul, P. K., W.F. Brandt., J. M. Farrant., G. G. Lindsey., 1999.
Inclusion of polyvinylpyrrolidone in the polymerase chain reaction
reverses the inhibitory effects of polyphenolic contamination of RNA.
Nucleic Acids Res. 27:915–916.
Kusnetsov, J.M., Martikainem, P.J., Jousimies-Somer, H.R.,
Vaisiinem, M.L., Tulkki, A.I., Ahonn, H.E., Nevaleinem, A.I., 1993.
Physical, chemical and microbiological water characteristics associated
with the occurrence of Legionella in cooling tower systems. Water
Research, 27: 85-90.
50
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Lee, L.G., Connell, C.R., Bloch, W., 1993. Allelic discrimination by nicktranslation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Res 21: 3761–
3766.
Llamosa, l., Meza, L., Botero, M., 2007.Estudio de repetibilidad y
reproducibilidad utilizando el método de promedios y rangos para el
aseguramiento de la calidad de los resultados de calibración de acuerdo
con la norma técnica NTC-ISO/IEC: 17025. Scientia et Technica Vol. 35.
Mackay, I.M., Arden, K.E., Nitsche, A., 2004. Real-time Fluorescent
PCR Techniques to Study Microbial–Host Interactions. Methods in
Microbiology 34: 255–33.
Mahbubani, M.H., Bej, A,K., Miller, R., Haff, L., Dicesare, J., Atlas,
R.M., 1990. Detection of L. pneumophila with polymerase chain reaction
and gene probe methods. Mol. Cell. Probes, 4:175-187.
Mahbubani, M.H., 1992. Applications of the PCR in environmental
microbiology. PCR methods and applications, 1:151-159 .
Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., 1982. Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory. Cold Spring Harbor,
N.Y.
Martí Viudes, M., Ribas Soler, F.
Oromi Durich, J., 1986.
Legionelosis: una visión global. Medicina Integral. Volumen 8. Número 6
McDade JE., Shepard CC., Fraser DW., Tsai TR., Redus MA., Dowdle
WR., 1977. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and
demonstration of its role in other respiratory disease. N Engl J med., 22:
1197-203
Miller, A.C., 1979. Early clinical differentiation between Legionnaires'
disease and other sporadic pneumonias. Ann. Intern. Med., 94:526-528
Moreno, Camacho, C., 2002. Evaluación de nuevos métodos de
detección, subtipificación y erradicación de L. pneumophila. Dirigida por
Vicente Catalán. Tesis doctoral. Universidad de Alicante. Facultad de
Ciencias
Morrison, T.B., Weis, J.J., Wittwer, C.T., 1998. Quantification of lowcopy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during
amplification. Biotechniques 24: 954–958, 960, 962.
Mülazimoglu, L., Yu, V.L., 2001. Can Legionnaires’ disease be
diagnosed by clinical criteria? A critical review. Chest, 120(4):1049–1053
51
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Mullis, K.B., Falloona, F.A., 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via
a polymerase catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol., 155:335-350 .
Muraca, P., Stout, J.E., Yu, V.L., 1987. Comparative assessment of
chlorine, heat, ozone, and UV light for killing Legionella pneumophila
within a model plumbing system. Appl. Environ. Microbiol. 53: 447-453.
Ortiz-Roque, C.M., Hazen, T.C., 1987. Abundance and distribution
ofLegionellaceae in Puerto Rican waters. Appl . Environ. Microbiol ., 53:
2.231-2.236.
Pascual, J.M., Redón, J., Borrás, R., Vila, B., Bertolón, V., López
Campos, V., Belda, A., Michavila, J., Garcia de Lomas, J., 1987.
Neumonía por Legionella pneumophila. Características clínicas de 52
casos. Med. Clin ., 89:489-493.
Pasculle, A.W., Feeley, J.C., Gibson, R.J., Cordes, L.G., Myerowitz,
R.L., Patton, C.M., Gorman, G.W., Carmack, C.L., Ezzell, J.W.,
Dowling, J.N., 1980. Pittsburgh pneumonia agent: direct isolation from
human lung tissue. J Infec Dis. 141:727-732.
Rantakokko-Jalava, K., J. Jalava., 2001. Development of conventional
and real-time PCR assays for detection of Legionella DNA respiratory
specimens. J. Clin. Microbiol. 39:2904–2910.
Riffard, S., Douglass, S., Brooks, T., Springthorpe, S., 2001.
Occurrence of Legionella in groundwater an ecological study. Water
Science & Technology.
Sheehan, K.B., Henson, J.M., Ferris, M.J., 2005. Legionella species
diversity in an acidic biofilm community in Yellowstone National Park.
Appl Environ Microbiol 71: 507–11.
Starnbach, M.N., Falkow, S., Tomkins, L.S., 1989. Species-specific
detection of L.pneumophila in water by DNA amplification and
hybridization. J. Clin. Microbiol ., 27:1 .257-1 .261.
Stout, J.E., Yu, V.L., 1997. Current concepts: Legionelosis. N Engl J
Med; 337: 682-687.
Sturm, R., Stanek, J.L., Mayers, J.P., Wilkinson, H.W., Cottrill, C.M.,
Towin, R.B., 1981. Enfermedad de los legionarios en pediatria:
diagnóstico por inmunofluorescencia directa del esputo. Pediatries (ed.
Esp.). Vol. 12. N° 4
Thornsberry, C., Baker, C.N., Kirven, L.A., 1978. In vitro activity of
antimicrobial agents on Legionnaires disease bacterium. Antimicrob
Agents Chemother. Jan;13(1):78–80.
52
Desarrollo y validación de un nuevo sistema de detección molecular basado en qPCR
de Legionella spp. en muestras ambientales
Tsai, Y. L., C. J. Palmer. L. R. Sangermano., 1993. Detection of
Escherichia coli in sewage and sludge by polymerase chain reaction.
Appl. Environ. Microbiol. 59:353–357.
VanGuilder, H.D., Vrana, K.E., Freeman, W.M., 2008. Twenty-five years
of quantitative PCR for gene expression analysis. Biotechniques 44:
619–626.
Van Ketel, R.J., Schegget, J., Zanen, H.C., 1984. Molecular
epidemiology of Legionella pneumophila serogroup. J. Clin. Microbiol.
20:362-364 .
Wadowsky, R.M., Yee, R.B., 1981. Glycine-containing selective medium
for isolation of Legionellaceae from environmental specimens. Appl.
Environ.Microbiol. 5:768-72.
Wellinghausen, N., C. Frost., R. Marre., 2001. Detection of Legionellae
in hospital water samples by quantitative real-time LightCycler PCR.
Appl. Environ. Microbiol. 67:3985–3993.
Wilson, D. A., B. Yen-Lieberman., U. Reischl., S. M. Gordon., G.
Procop., 2003. Detection of Legionella pneumophila by real-time PCR
for the mip gene. J. Clin. Microbiol. 41:3327–3330.
Witherell, L.E., Duncan, R.W., Stone, KM., Stratton, L.J., Orciari, L.,
Kappel, S., J. llson, D.A., 1988. Investigation of Legionella pneumophila
in drinking water. Research and Technology.
Woodhead, M.A., Macfarlane, J.T., 1987. Comparative clinical and
laboratory features of Legionella with pneumococcal and Mycoplasma
pneumonias. British Journal of Diseases of the Chest, 81:133–139.
Yañez, M.A., Carrasco-Serrano, C., Barbera, V.M., Catalán, V., 2005.
Quantitative Detection of Legionella pneumophila in Water Samples by
Immunomagnetic Purification and Real-Time PCR Amplification of the
dotA Gene. Appl Environ Microbiol. 2005;13:3433–3441.
Yoo, B.K., Triller, D.M., Yong, C.S., Lodise, T.P., 2004. Gemifloxacin: a
new fluoroquinolone approved for treatment of respiratory infections.
Annals of Pharmacotherapy, 38:1226–1235.
Yu, V.L., 2000. Legionella pneumophila (Legionnaires’ disease). In:
Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and practice of
infectious diseases,Philadelphia, Churchill Livingston, 2424–2435.
Yu, V.L., Greenberg, R.N., Zadeikis, N., Stoul, J.E., 2004. Levofloxacin
efficacy in the treatment of community-acquired legionellosis. Chest,
125:2135–2139.
53