1.1 terapia génica - DSpace de la Universidad Catolica de Cuenca
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA QUÍMICA, BIOFARMÁCIA, INDUSTRIAS Y PRODUCCIÓN FACULTAD DE BIOFARMÁCIA INFORME DEL CURSO DE GRADUACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACEUTA MONOGRAFÍA DE TERAPIA GÉNICA AUTOR: DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE DIRECTOR: DR. DIEGO ANDRADE CUENCA-ECUADOR 2012 AGRADECIMIENTO “Mi reconocimiento y gratitud” Mi gratitud, principalmente está dirigida al Dios por haberme dado la existencia y permitido llegar al final de la carrera. A la Universidad Católica de Cuenca, de manera especial a la Unidad Académica De Ingeniería Química, Biofarmacia, Industrias y Producción. Autoridades y maestros por haberme recibido en sus aulas y compartido sus conocimientos, los cuales serán un pilar fundamental en mi vida profesional. A mi director de monografía Dr. Diego Andrade, también Ing. Willian Peralta por su acertada dirección y orientación, que supieron proporcionarme para la culminación exitosa de esta investigación bibliográfica. A mis padres por su constante apoyo, amor y comprensión que me brindan en cada instante de mi vida. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página II DEDICATORIA Dedico con mucho cariño principalmente a las personas que más amos que son mis padres, ya que sin su apoyo no hubiera sido posible alcanzar esta meta. Este trabajo es solamente una manera de retribuir su constancia, sacrifico y amor, que día a día me han brindado. A todas y cada una de esas personas que forman parte de mi vida y que siempre han estado en los buenos y malos momentos, impulsándome a seguir, los quiero a todos gracias. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página III ÍNDICE TEMA PÁG. CARÁTULA…………………………………………………………………………………………………………………….I AGRADECIMIENTO……………………………………………………………………………………………………….II DEDICATORIA………………………………………………………………………………………………………………III ÍNDICE………………………………………………………………………………………………………………………...IV OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………………………….VI INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………………………………….VII CAPÍTULO I APECTOS GENERALES 1.1 TERAPIA GÉNICA……………………………………………………………………………………………………1 1.2 ACONTECIMIENTOS HISTÓRICOS DE LA TERAPIA GÉNICA……………………………………..2 1.3 REQUISITOS Y CRITERIOS PARA REALIZAR ESTUDIOS………………………………………………5 1.4 NORMAS PARA RECIBIR TERAPIA GÉNICA……………………………………………………………….6 1.5 CONSIDERACIONES ÉTICAS ANTE LA TERAPIA GENÉTICA………………………………………..7 CAPÍTULO II MODALIDADES Y TIPOS DE TERAPIA GÉNICA MODALIDADES Y TIPOS DE TERAPIA GÉNICA………………………………………………………………12 2.1 TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS GERMINALES………………………………………………………….14 2.2 TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS……………………………………………………………15 2.3 TERAPIA GÉNICA IN VIVO………………………………………………………………………………………16 2.4 TERAPIA GÉNICA EX VIVO……………………………………………………………………………………..18 CAPÍTULO III TRANSFERENCIA GÉNICA 3.1 GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS Y GENES NO INTEGRADROS…………………..22 3.1.1 GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS………………………………………………..22 3.1.2 GENES NO INTEGRADOS…………………………………………………………………………23 3.2 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA………………………………………………………………..24 3.2.1 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA FÍSICO-QUÍMICOS O NO VIRALES…………………………………………………………………………………………………………..24 3.2.1.1 MÉTODOS QUÍMICOS…………………………………………………..............25 3.2.1.2 SISTEMAS FÍSICOS…………………………………………………………………..26 3.2.1.3 VECTORES NO VIRALES…………………………………………………………….28 DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página IV 3.2.2 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA MEDIADA POR VIRUS……………………………29 3.2.2.1 VECTORES RETROVÍRICOS………………………………………………………..31 3.2.2.2 VECTORES ADENOVÍRICOS……………………………………………………….34 3.2.2.3 VECTORES BASADOS EN EL VIRUS DEL HERPES……………………….36 3.2.2.4 VECTORES BASADOS EN EL ADENOVIRUS ASOCIADO……………….37 3.3 MARCAJE CELULAR……………………………………………………………………………………………….38 3.3.1 ESTUDIOS DE MARCAJE………………………………………………………………………….39 CAPÍTULO IV TERAPIA GÉNICA UTILIZADA PARA TRATAR ENFERMEDADES 4.1 ENFERMEDADES GENÉTICAS…………………………………………………………………………………42 4.1.1 INMUNODEFICIENCIA COMBINADA GRAVE o DEFICIENCIA DE ADENOSÍNDESAMINASA………………………………………………………………………………………………….43 4.1.2 ENFERMEDAD DE GAUCHER…………………………………………………………………..45 4.1.3 HIPERCOLESTEROLEMIA………………………………………………………………………..47 4.1.4 FIBROSIS QUÍSTICA………………………………………………………………………………..49 4.1.5 ENFERMEDADES DE COAGULACIÓN Y OTRAS ENFERMEDADES QUE IMPLICAN LA CIRCULACIÓN SANGUÍNEA……………………………………………………………..50 4.2 ENFERMEDADES ADQUIRIDAS………………………………………………………………………………51 4.2.1 TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER………………………………………………………………..51 4.2.2 TERAPIA GÉNICA DE LA INFECCIÓN POR VIH………………………………………….54 CAPÍTULO V ESTADO ACTUAL DE LA TERAPIA GÉNICA 5.1 LOGROS ALCANZADOS EN TERAPIA GÉNICA…………………………………………………………56 5.2 INCONVENIENTES QUE LIMITAN EL ÉXITO DE LA TERAPIA GÉNICA……………………….57 5.3 PERSPECTIVAS FUTURAS………………………………………………………………………………………59 5.4 CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GÉNICA……………………………………………………………..61 CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………………………….63 BIBLIOGRAFÍA DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página V OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Realizar una investigación de aspectos varios sobre el tema “Terapia Génica”, mediante un análisis minucioso de los mismos, para lograr una visión global del contenido, el mismo que pueda servir de guía y base para investigaciones futuras, y despertar el deseo de continuar con nuevas exploraciones sobre el tema planteado. OBJETIVOS ESPECIFÍCOS Explorar aspectos generales acerca de la Terapia Génica. Diferenciar las modalidades y tipos de Terapia Génica. Describir de manera detallada como se realiza la Transferencia génica. Conocer las distintas enfermedades en las que es posible el uso de Terapia Génica como alternativa para curarlas. Evaluar el estado actual en el que se encuentra la Terapia Génica. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página VI INTRODUCCIÓN Actualmente se están utilizando métodos para transferir genes a células de mamíferos, desarrollados originalmente como herramientas de investigación, para tratar enfermedades genéticas, un proceso denominado Terapia Génica. Durante más de dos décadas, se han usado productos génicos como la insulina para el tratamiento terapéutico de enfermedades genéticas. La terapia génica lleva a este proceso un paso más adelante y persigue modificar el genoma de las células somáticas trasfiriendo copias normales de genes para que produzcan cantidades adecuadas del producto génico normal, cuya acción corregirá la enfermedad genética. Las células pueden ser modificadas ex vivo para su administración posterior, o bien in vivo mediante productos de terapia génica administrados directamente a los sujetos. Podemos decir que la terapia génica se encuentra en un estado embrionario y aún no es una realidad en la práctica clínica. No obstante, el número de protocolos de terapia génica que son operativos crece de manera notable cada año. Con respecto a las enfermedades sobre las que se trata de ejercer un efecto terapéutico, los estudios clínicos de terapia génica fundamentalmente se orientan al tratamiento del cáncer, de enfermedades monogénicas, enfermedades vasculares y el sida. Conforme mejore la tecnología de la transferencia y se entiendan mejor las características biológicas causantes de los procesos patológicos, será posible incorporar plenamente la terapia génica en la práctica clínica para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades humanas. A pesar de que la terapia génica no está cien por ciento desarrollada y todavía sigue en fases de investigación, el presente tema recopila información valiosa, la misma que sirve de base para averiguaciones futuras y despierte el deseo de extender nuevas investigaciones acerca de la Terapia Génica. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página VII CAPÍTULO I APECTOS GENERALES UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 1.1 TERAPIA GÉNICA La terapia génica consiste en la inserción de copias funcionales ausentes en el genoma de un individuo. Se realiza en las células y tejidos con el objetivo de tratar una enfermedad. La técnica todavía está en desarrollo, motivo por el cual su aplicación se desarrolla principalmente dentro de ensayos clínicos controlados, y para el tratamiento de enfermedades severas, bien de tipo hereditario o adquirido. La terapia génica se sustenta en la práctica fármaco-quirúrgica de la medicina y se define como la aplicación de principios genéticos para el tratamiento de enfermedades humanas (Wolf y Lederberg, 1994). Concretamente el término terapia génica unifica los principios de la farmacología con los de la genética, pues implica claramente el empleo de ácidos nucleicos como el agente farmacológico para el tratamiento de estados patológicos, con esto la terapia génica persigue modificar el genoma de las células somáticas transfiriendo copias normales de genes para que produzcan cantidades adecuadas del producto génico normal, cuya acción corregiría la enfermedad genética. La estrategia general que se utiliza para la terapia génica no es más que una extensión de la “técnica de selección clonal” por complementación funcional. Primero, la función ausente en el organismo receptor como consecuencia de la presencia de un gen defectuoso se introduce en un vector; luego, este vector se inserta en uno de los cromosomas receptáculos y genera un organismo transgénico que se ha "curado" genéticamente. Esta técnica tiene un enorme potencial en los seres humanos porque nos ofrece la esperanza de corregir los desórdenes genéticos. Aunque dentro de unos años será posible mediante la terapia génica reparar los errores que existen en un gen y causan la enfermedad, los objetivos actuales son más modestos. En primer lugar, la terapia génica trata de complementar o sustituir el defecto en la función de un gen defectuoso introduciendo otra copia normal de éste en las células. Por otra parte, en otras situaciones lo que se intenta es lo contrario, es decir, inhibir o bloquear el funcionamiento de aquellos genes cuya intervención contribuye al desarrollo de la enfermedad (por ejemplo los oncogenes que intervienen en el cáncer o los genes de virus que son necesarios para que estos se multipliquen en las células). Por último, existen otras posibilidades de acción de la terapia génica en la que lo que se busca no es suplir o inactivar la función de un gen, sino introducir la información DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 1 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA que permita a la célula sintetizar una proteína que tenga un efecto terapéutico nuevo. Este es el caso de la transferencia de genes para estimular el sistema inmune para que actúe frente a tumores o enfermedades infecciosas, con ello acelere la reparación de heridas, fracturas o se produzcan nuevos vasos sanguíneos, etc. 1.2 ACONTECIMIENTOS HISTÓRICOS DE LA TERAPIA GÉNICA Desde el descubrimiento de las enzimas de restricción en el año de 1970 por Arber y Hamilton se sentaron las bases para transferir genes entre diferentes células u organismos, inclusive pertenecientes a diferentes especies. En 1978 se realizó la primera hormona recombinante insertando el gen de la insulina en una bacteria E. coli. Desde ese momento se fortalecieron los conocimientos necesarios para transferir genes a células humanas con el fin de alterar el fenotipo patológico y generar una nueva forma terapéutica. La primera transferencia se realizó en el año de 1989 en un paciente que padecía una enfermedad hereditaria denominada inmunodeficiencia combinada grave. Aunque no se encontraron efectos clínicos se explicitó que tampoco había efectos mortales como muchos apocalípticamente habían pronosticado. En 1990 se trató con terapia génica un paciente que padecía de la deficiencia de la enzima adenosina-desaminasa (ADA) presentando infecciones bacterianas repetitivas. Aunque la mejoría fue temporal, con este ensayo se comprobó que la terapia génica tenía posibilidades terapéuticas reales. En Enero de 1989 los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos aprobaban el protocolo clínico presentado por los doctores Anderson, Blaese y Rosenberg para insertar un gen extraño en las células del sistema inmunitario de pacientes de cáncer. Aunque tal protocolo no representaba una terapia génica, sin embargo las técnicas utilizadas eran idénticas a las requeridas para la terapia génica verdadera. En palabras del Dr. Anderson, ello significaba realmente que la tecnología para insertar genes en humanos había llegado. De hecho, poco después, en Septiembre de 1990, se aprobaba el primer ensayo clínico de auténtica terapia génica a los doctores Blaese, Anderson y colaboradores: se trataba de introducir el gen que codifica para la enzima adenosin-desaminasa (ADA) en DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 2 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA niños que padecen una inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Son los llamados “niños burbuja”. Poco tiempo después (Febrero 1991) se autorizó también el mismo tipo de Terapia génica en Italia (Dr. Bordignon y colabores en el Hospital San Raffaele de Milán). En 1995 ambos grupos de investigación publicaban los resultados de su experimentación clínica poniendo de manifiesto la eficacia de la técnica de Terapia génica ex vivo en los “niños burbuja”. FIGRGURA 1 Ashanti de Silva fue la primera paciente que recibió la terapia génica ex vivo para combatir la inmunodeficiencia combinada severa (SCID-ADA) cuando tenía cuatro años de edad. Pasó de ser una “niña burbuja” a vivir con una calidad de vida normal. (En la imagen, Ashanti a la edad de 9 años). FUENTE: http://hablemosdeciencia.wordpress.com/2012/04/24/el-futuro-de-la-terapia-genica/ Sin embargo, el apoyo a la terapia fue cuestionado cuando algunos niños tratados para SCID desarrollaron leucemia. Las pruebas clínicas se interrumpieron temporalmente en el 2002, a causa del impacto que supuso el caso de “Jesse Gelsinger”, la primera persona reconocida públicamente como fallecida a causa de la terapia génica. Existe una bibliografía numerosa sobre el tema, y es destacable el informe que la FDA (Food and Drug Administration: Agencia de Alimentos y Medicamentos o Agencia de Drogas y Alimentos), emitió señalando el conflicto de intereses de algunos de los médicos implicados en el caso así como los fallos en el procedimiento. En el año 2002, cuatro ensayos en marcha de terapia génica se paralizaron al desarrollarse en un niño tratado una enfermedad similar a la leucemia. Posteriormente, tras una revisión de los procedimientos, se reanudaron los proyectos en marcha. En el año 2003, Un equipo de investigadores de la universidad de California, en Los Ángeles, insertó genes en un cerebro utilizando liposomas recubiertos de un polímero llamado polietilen glicol (PEG). La transferencia de genes en este órgano es un logro significativo porque los vectores virales son demasiado grandes para cruzar la “barrera DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 3 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA hematoencefálica”. Este método tiene el potencial para el tratamiento de la enfermedad del Parkinson. También la interferencia por ARN se planteó en éste año para tratar la enfermedad de Huntington. En el año 2006, Científicos del NIH (Institutos Nacionales de la Salud), tratan exitosamente un Melanoma metastásico en dos pacientes, utilizando células T para atacar a las células cancerosas. Este estudio constituye la primera demostración de que la terapia génica puede ser efectivamente un tratamiento contra el cáncer. En Marzo del 2006 un grupo internacional de científicos anunció el uso exitoso de la terapia génica para el tratamiento de dos pacientes adultos contagiados por una enfermedad que afecta a las células mieloides. El estudio, publicado en Nature Medicine, es pionero en mostrar que la terapia génica puede curar enfermedades del sistema mieloide. En mayo del 2006, un equipo de científicos dirigidos por el Dr. Luigi Naldini y el Dr. Brian Brown del Instituto de San Raffaele Telethon para la Terapia Génica (HSR-TIGET) en Milán, informaron del desarrollo de una forma de prevenir que el sistema inmune pueda rechazar la entrada de genes. Los investigadores del Dr. Naldini observaron que se podía utilizar la función natural de los micro-RNA para desactivar selectivamente los genes terapéuticos en las células del sistema inmunológico. Este trabajo tiene implicaciones importantes para el tratamiento de la hemofilia y otras enfermedades genéticas. En Noviembre del mismo año, Preston Nix de la Universidad de Pensilvania informó sobre VRX496, una inmunoterapia para el tratamiento del HIV que utiliza un vector lentiviral para transportar un DNA antisentido contra la envuelta del HIV. Fue la primera terapia con un vector lentiviral aprobada por la FDA para ensayos clínicos El 1 de mayo del 2007, el hospital Moorfields Eye y la universidad College London´s Institute of Ophthalmology anunciaron el primer ensayo de terapia génica para la enfermedad hereditaria de retina. La primera operación se llevó a cabo en un varón británico de 23 años de edad, Robert Johnson, a principios de este año. La Amaurosis congénita de Leber es una enfermedad hereditaria que causa la ceguera por mutaciones en el gen RPE65. Se investigó la transfección subretiniana por el virus recombinante adeno-asociado llevando el gen RPE65, y se encontraron resultados positivos. Los pacientes mostraron cierto incremento de la visión, y no se presentaron efectos secundarios aparentes. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 4 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA En el año 2008, investigadores de la Universidad de Míchigan en Ann Arbor (Estados Unidos) desarrollaron una terapia genética que ralentiza y recupera las encías ante el avance de la enfermedad periodontal, la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Los investigadores descubrieron una forma de ayudar a ciertas células utilizando un virus inactivado para producir más cantidad de una proteína denominada receptor TNF (factor de necrosis tumoral). Este factor se encuentra en bajas cantidades en los pacientes con periodontitis. La proteína administrada permite disminuir los niveles excesivos de TNF (factor de necrosis tumoral), un compuesto que empeora la destrucción ósea inflamatoria en pacientes que sufren de artritis, deterioro articular y periodontitis. Los resultados del trabajo mostraron que entre el 60% y el 80% de los tejidos periodontales se libraban de la destrucción al utilizar la terapia génica. En Septiembre de 2009, se publicó en Nature que unos investigadores de la Universidad de Washington y la Universidad de Florida fueron capaces de proporcionar visión tricromática a monos ardilla usando terapia génica. En noviembre de ese mismo año, la revista Science publicó resultados alentadores sobre el uso de terapia génica en una enfermedad muy grave del cerebro, la adrenoleucodistrofia, usando un vector retroviral para el tratamiento. En la actualidad, se sigue investigando y desarrollando las distintas técnicas de Terapia Génica. Compañías farmacéuticas y centros de investigación de Europa, Estados Unidos y Japón ya han apostado a esta nueva posibilidad. De hecho, a principios de los 90 se incluía a grandes compañías como Sandoz, Cib, Geigy y Rhone Poulenc Rorer. En 1992, el mercado correspondiente fue estimado en 1,2 billones de dólares. Estimaciones más recientes. 1.3 REQUISITOS Y CRITERIOS PARA REALIZAR ESTUDIOS Indudablemente la meta de los estudios que involucran la terapia génica como alternativa terapéutica es la posibilidad de la utilización en la clínica. Para ello se requiere cumplir una serie de requisitos que justifiquen estos medios y que se mencionan a continuación: La patología no debe tener en la actualidad un tratamiento efectivo para su cura. Para llegar a una propuesta terapéutica sólida y científicamente viable, se requiere de una fuerte inversión en recursos humanos y económicos por un tiempo prolongado. Esto hace que el costo de una o varias líneas de investigación que conduzcan a la propuesta de alternativas terapéuticas DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 5 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA para determinada patología sea elevada. La inversión de estos recursos debe ser justificada cuidadosamente y, por ello, es conveniente que la patología constituya un problema de salud pública que no cuente con cura actualmente. Se debe conocer en lo posible los detalles del efecto involucrado a nivel molecular. Es evidente que si se pretende intervenir a nivel molecular, es indispensable contar con el conocimiento detallado del efecto, o los efectos. Se debe tener un sustento científico sólido que justifique la intervención a nivel molecular. Para llegar a la aplicación clínica de la terapia génica, se debe contar con amplia y sólida evidencia científica que demuestre que la intervención a nivel molecular podría resultar en la mejoría de la salud el paciente, o en la resolución del problema en cuestión. Esto se hace evidente mediante la publicación de artículos científicos que forman el marco teórico que respalda la intervención molecular. Los protocolos establecidos internacionalmente requieren de una secuencia lógica que incluye desde la comprobación de cambios celulares fenotípicos in vitro, generados por el ácido nucleico terapéutico en cuestión, así como la comprobación de los efectos terapéuticos en modelos animales, la caracterización toxicológica del procedimiento, hasta llegar finalmente a la propuesta de su aplicación en protocolos clínicos. 1.4 NORMAS PARA RECIBIR TERAPIA GÉNICA Las normas para recibir terapia génica están bien establecidas e incluyen varios requisitos: El gen debe estar aislado y estar disponible para la transferencia, normalmente por clonación. Debe haber un medio efectivo para la transferencia del gen. Por el momento, muchos ensayos utilizan vectores retrovíricos, aunque también se emplean otros métodos, como los vectores adenovíricos y las técnicas físicas y químicas. El tejido diana debe ser accesible para la transferencia genética. La primera generación de procesos de terapia génica utiliza glóbulos blancos o sus precursores como tejido diana. No debe haber ninguna forma de terapia efectiva disponible, y la terapia génica no debe dañar al paciente. Actualmente se están tratando varias enfermedades hereditarias con terapia génica, como la inmunodeficiencia combinada grave (SCDI, del inglés severe combined DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 6 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA inmunodeficiency), la hipercolesterolemia familiar, la fibrosis quística y la distrofia muscular, y se están desarrollando procesos para tratar otras enfermedades. 1.5 CONSIDERACIONES ÉTICAS ANTE LA TERAPIA GENÉTICA Desde el punto de vista ético se pueden hacer las siguientes consideraciones en relación con la Terapia Génica: 1. La TG sólo debería ser aplicada para tratar pacientes con determinadas enfermedades genéticas raras y no como instrumento de un programa social eugenésico que tratara de mejorar el acervo génico humano. La TG, por tanto, no incluye la estimulación genética de características tales como el comportamiento, la inteligencia o el aspecto físico. 2. La TG sólo se debería intentar cuando no hay otras alternativas terapéuticas o cuando, habiéndolas, suponen un mayor riesgo o una menor acción beneficiosa. 3. La aplicación de la TG a una enfermedad humana debería requerir la evidencia de que es segura, beneficiosa, técnicamente posible y éticamente aceptable. 4. La TG de células somáticas para el tratamiento de enfermedades graves puede considerarse ética, pues puede ser apoyada por los principios fundamentales de autonomía, beneficencia y justicia. 5. El tratamiento de células somáticas por medio de la TG no presenta problemas éticos diferentes a los de cualquier otro tipo de terapia experimental tales como la utilización de nuevos fármacos o de técnicas quirúrgicas novedosas. “Friedmann (1989) señalaba que, como sucede con cualquier nuevo procedimiento que se intenta aplicar en medicina, los estudios terapéuticos de la TG se llevarán a cabo sin un conocimiento completo siempre que el peso de las necesidades clínicas supere al de las imperfecciones e incertidumbres técnicas. De hecho el equilibro entre el daño incierto y los beneficios deseados ha sido examinado y ponderado desde instancias religiosas, éticas y del interés público, llegándose a la conclusión unánime de que los estudios y aplicación de la manipulación genética somática realizada con fines terapéuticos deben proseguir”. 6. Como se indicaba en el punto 1, la intención de la TG es corregir defectos genéticos desde un punto de vista terapéutico. Por tanto, ¿cuál sería la valoración ética del uso de una TG cuyo fin no fuera terapéutico sino el de estimular o perfeccionar DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 7 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA fenotipos normales? Algunos autores consideran que esta ingeniería perfectiva (enhancement engineering) podría tener connotaciones eugenésicas. Por el momento, el ejemplo más obvio que se podría utilizar es el de transferir el gen de la hormona de crecimiento de algún determinado animal a un niño normal con la intención de que aumentara su crecimiento. Con cierta ironía podríamos pensar que, quizá, a algunos padres les gustaría tener un jugador de baloncesto en la familia. El Dr. W. French Anderson (1989) consideraba que es necesario establecer una línea de separación entre la terapia génica y la ingeniería perfectiva. Su razonamiento se basa en que la TG somática se considera ética porque está apoyada por el principio fundamental de beneficencia, siendo por tanto un bien moral, mientras que la ingeniería perfectiva puede no ser un bien moral cuando su aplicación perjudica, en vez de contribuir, a la dignidad del hombre. Traspasar esa línea de separación significaría que valores humanos que nuestra sociedad considera importantes para la dignidad del hombre podrían verse amenazados principalmente en dos aspectos: 1) el riesgo médico, y 2) la precariedad moral: 1. Introducir un gen en las células de un individuo para que sinteticen más cantidad de un producto ya existente puede afectar negativamente a muchos otros procesos bioquímicos. Una cosa es corregir un defecto en el genoma de un individuo (TG) y otra insertar un gen con la intención de mejorar o alterar selectivamente una característica pero con el riesgo de poner en peligro el equilibrio metabólico global del individuo. Es decir, en la ingeniería perfectiva los riesgos aumentarían mientras que los beneficios serían considerablemente menos claros. 2. Desde el punto de vista de la precariedad moral, hay que tener en cuenta que la aplicación de la ingeniería perfectiva implicaría una triple problemática: ¿cómo determinar qué genes se deberían transferir? ¿Cómo determinar a quién hacer la transferencia génica? ¿Cómo impedir la discriminación contra los individuos que reciban o no el gen? A las consideraciones anteriores habría que añadir el hecho cierto de que una vez que se hubiera autorizado y empezado la ingeniería perfectiva sería muy difícil detener el proceso, colocándonos posiblemente en un plano inclinado resbaladizo muy peligroso. 7. Una variante de la ingeniería perfectiva sería intentar alterar o mejorar caracteres humanos complejos tales como la personalidad, la inteligencia, etc. que resultan de la interacción de muchos genes y de circunstancias ambientales (ingeniería genética eugenésica). Aunque por tratarse de caracteres poligénicos no hay posibilidad real de aplicar una terapia génica, no está de más dejar constancia de la valoración ética negativa de tal ingeniería genética eugenésica. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 8 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 8. Así como la TG somática ha sido ampliamente aceptada por la comunidad científica y positivamente valorada desde el punto de vista ético, la terapia génica germinal se enfrenta, por un lado, con obstáculos técnicos y, por otro, con disparidad de criterios respecto a su valoración ética. El papel potencial de la manipulación de la línea germinal para la prevención de enfermedades genéticas es mucho menos claro que el de la modificación somática. La TG germinal plantea cuestiones problemáticas como son la propagación de efectos impredecibles en las generaciones futuras o los efectos a largo plazo que pudieran cambiar las características genéticas de las poblaciones humanas (esto último en el supuesto no muy probable de que la utilización de la TG germinal llegara a “socializarse” a gran escala. En el momento presente, dado que la TG germinal está llena de incertidumbres técnicas y éticas, no debería llevarse a cabo. Sin embargo, algunos autores defienden que la TG germinal sería éticamente válida si se cumplen algunas condiciones, tales como : 1. Que hubiera experiencia previa en la TG somática que estableciera claramente la efectividad y seguridad del tratamiento de células somáticas, 2. Que existiera estudios adecuados en modelos animales que aseguraran la reproducibilidad, factibilidad y seguridad de la TG germinal utilizando los mismos vectores de transferencia génica y procedimientos que se utilizarían en seres humanos, y 3. Debería haber un conocimiento y aceptación de la técnica por parte de la sociedad. Aquí podríamos citar como relevantes las posturas de moralistas como Klaus Demmer y Manuel Cuyás para quienes “el que la intervención tenga lugar en células somáticas o en las germinales no implicará diferencia alguna esencial” cuando el beneficio sea cierto. Hay autores como Friedmann, decidido defensor de la TG germinal, que consideran que podría ser necio y prematuro tomar una postura severa en contra de ella, sugiriendo que la necesidad de un control eficaz de la enfermedad o de impedir el daño de la misma en las primeras etapas del desarrollo o la inaccesibilidad de las células a corregir por la TG somática podrían eventualmente justificar la TG germinal. Este último caso sería, por ejemplo, el de las células del cerebro implicadas en enfermedades hereditarias del sistema nervioso central. Una intervención temprana (terapia génica de embrión) que afectara a todas las células del futuro organismo, incluyendo las células germinales, podría ser el único medio disponible para tratar células o tejidos que, de otra manera, no sería posible reparar genéticamente después del nacimiento. Por su parte, Walters (1986) salía en defensa de la TG germinal frente a la TG somática con la siguiente argumentación: Si la TG somática llega a curar con éxito enfermedades monogénicas recesivas de alta incidencia (por ejemplo, anemia falciforme, talasemia, fibrosis quística, etc.), las personas genéticamente enfermas pero fenotípicamente sanas (porque su defecto genético ha sido corregido por la introducción del gen en las células somáticas adecuadas) transmitirán a sus descendientes el gen deletéreo puesto que sus células germinales no habrán sido corregidas por la terapia génica. Desde el punto de vista de la genética de poblaciones humanas, las personas curadas por la TG somática DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 9 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA constituyen un nuevo grupo de individuos homocigotos portadores de una enfermedad genética que, al transmitir sus genes defectuosos a sus descendientes, contribuyen a aumentar la proporción de genes deletéreos en las poblaciones humanas, deteriorando su acervo génico desde el punto de vista evolutivo. Conviene indicar aquí que esta situación no es nueva en las poblaciones humanas actuales donde la curación mediante fármacos de las enfermedades genéticas permite que las personas genéticamente enfermas pero curadas (genotípicamente enfermas, fenotípicamente sanas) puedan transmitir sus genes deletéreos a sus descendientes. La conclusión es obvia: con el avance de la medicina y la farmacología ha descendido drásticamente la tasa de mortandad por enfermedades genéticas a la vez que ha aumentado también drásticamente en la población humana la frecuencia de genes causantes de tales enfermedades. No obstante, como decía Thiessen, “la retención de estos errores genéticos es un precio pequeño que hay que pagar si el defecto es fácilmente corregido a nivel de población”. En el apartado anterior se ha hecho referencia a la terapia génica de embrión en contraposición a la TG somática normal también denominada terapia génica de paciente que se entiende aplicada en individuos ya nacidos independientemente de que sean en edad infantil, juvenil o adulta. La introducción de genes en la línea germinal se ha llevado a cabo con éxito en diversas especies animales de laboratorio y domésticas inyectando directamente el ADN en los pronúcleos de los cigotos. Sin embargo, este método, que constituiría una terapia génica de embrión puesto que el gen insertado se reproduciría en todas las células del embrión y del futuro individuo adulto (incluyendo, obviamente, la línea germinal), no parece de utilidad en la TG humana puesto que en la mayoría de los casos no podría saberse a priori si dicho cigoto era portador de determinada enfermedad genética. A este respecto, Williamson (1982) criticaba irónicamente la utilidad de la TG de embrión en los siguientes términos: “¿Es necesaria? Para llevar a cabo la TG en un embrión temprano se debe estar seguro de que está afectado por la enfermedad y podría pensarse que los padres, una vez realizada la diagnosis prenatal, preferirían empezar una nueva concepción que considerar la posibilidad de una manipulación genética del embrión. La perspectiva de la TG de embrión me parece a mí -continúa Williamson- una forma ridícula de terapia clínica para una pareja (ambos heterocigotos portadores de la enfermedad) que tiene una probabilidad del 75% de tener un hijo normal (o incluso del 100% si aceptan la diagnosis prenatal y son partidarios del aborto) utilizando los métodos más populares, aceptables y divertidos de procrear que han estado en boga durante muchos años sin la ayuda o el consejo de los biólogos moleculares”. Desde el punto de vista ético es evidente que la TG de embrión lleva añadida toda la problemática que supone la manipulación de embriones. 9. La Declaración Universal de la UNESCO sobre el Genoma Humano y los Derechos Humanos (1997) en su Artículo 24 invita al Comité Internacional de Bioética de la UNESCO a la identificación de prácticas que pueden ir en contra de la dignidad humana, como las intervenciones en la línea germinal, en clara alusión, sin duda, a la TG germinal. Por su parte, el Convenio relativo a los Derechos Humanos y la DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 10 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Biomedicina (Convenio Europeo de Bioética) de 1997 establece en su Artículo 13 que “únicamente podrá efectuarse una intervención que tenga por objeto modificar el genoma humano por razones preventivas, diagnósticas o terapéuticas y sólo cuando no tenga por finalidad la introducción de una modificación en el genoma de la descendencia”. Por tanto, queda prohibida la TG germinal. En el presente contexto es interesante volver a mencionar que los NIH obtuvieron en Estados Unidos en 1995 la patente de la técnica de TG somática ex vivo puesta a punto en 1990 por los Dres. Anderson, Blaese y Rosenberg. En cambio, la técnica de TG germinal no correrá, posiblemente, la misma suerte. De hecho, en la Directiva del Parlamento Europeo y del Consejo, relativa a la protección jurídica de las invenciones biotecnológicas aprobada en Julio de 1998, se consideran no patentables los “procedimientos de modificación de la identidad genética germinal del ser humano” (Art. 6.2.b) por considerar su explotación “contraria al orden público o a la moralidad” (Art. 6.1). DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 11 CAPÍTULO II MODALIDADES Y TIPOS DE TERAPIA GÉNICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA MODALIDADES Y TIPOS DE TERAPIA GÉNICA En la actualidad, la dotación genética de una célula puede ser modificada mediante la introducción de un gen normal en el organismo diana que sustituya al gen defectuoso en su función; es lo que se denomina terapia génica, lo que se puede definir como el conjunto de técnicas que permiten vehiculizar secuencias de ADN o de ARN al interior de células diana, con objeto de modular la expresión de determinadas proteínas que se encuentran alteradas, revirtiendo así el trastorno biológico que ello produce. MODALIDADES Y TIPOS DE TERAPIA GÉNICA Modalidades Estrategia aplicada En función del tipo celular diana 2.1 TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS GERMINALES 2.2 TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS 2.3 TERAPIA GÉNICA IN VIVO 2.4 TERAPIA GÉNICA EX VIVO CUADRO 1.- Modalidades y tipos de terapia génica. Fuente: Creado por la autora. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página12 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA CÉLULAS DIANA Las células diana se seleccionan en función del tipo de tejido en el que deba expresarse el gen introducido, y deben ser además células con una vida media larga, puesto que no tiene sentido transformar células que vayan a morir a los pocos días. Igualmente, se debe tener en cuenta si la célula diana es una célula en división o quiescente, porque determinados vectores virales, como los retrovirus, sólo infectan a células en división. En función de estas consideraciones, las células diana ideales serían las células madre, puesto que la inserción de un gen en ellas produciría un efecto a largo plazo. Debido a la experiencia en trasplante de médula ósea, una de las dianas celulares más trabajadas son las células madre hematopoyéticas. La terapia génica en estas células es técnicamente posible y es un tejido muy adecuado para la transferencia ex vivo. Otras dianas celulares con las que se ha trabajado son: Linfocitos: son células de larga vida media y fácil acceso (se encuentran en la sangre periférica). Constituyen un blanco para terapias ex vivo de melanomas e inmunodeficiencias. Epitelio respiratorio: son células de división muy lenta y en ellas no es posible la transferencia ex vivo, pero sí su transformación mediante adenovirus y lipoplexes. Hepatocitos: su transformación en posible tanto ex vivo (es factible cultivar las células y trasplantarlas por la circulación portal) como in vivo (se están desarrollando receptores proteicos específicos de hepatocitos). Fibroblastos dérmicos: son células de fácil acceso y cultivo, y pueden transformarse tanto ex vivo como in vivo, pero suelen tener efectos transitorios. Células musculares: pueden transformarse mediante inyección in vivo de ADN y también mediante adenovirus, pero con un éxito muy limitado en este último caso. En función del tipo celular diana, existen dos modalidades de terapia génica: DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página13 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 2.1 TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS GERMINALES Es aquella dirigida a modificar la dotación genética de las células implicadas en la formación de óvulos y espermatozoides y, por tanto, transmisible a la descendencia. Este tipo de terapia génica sería la indicada para corregir de forma definitiva las enfermedades congénitas, una vez que la técnica sea eficaz y segura, situación que no parece darse en el momento actual. La terapia génica de la línea germinal humana no ha sido practicada debido a las limitaciones de la tecnología de manipulación de las células germinales y a considerandos éticos, en especial el peligro de la modificación del acervo genético de la especie humana, y el riesgo de potenciación genética, que derivaría en prácticas de eugenesia por selección artificial de genes que confiriesen caracteres ventajosos para el individuo. Células germinales: son que se dividen por mitosis originando la mayor parte de las células del organismo, esta línea celular es la precursora de los gametos: óvulos y espermatozoides en los organismos que se reproducen sexualmente. Estas células contienen el material genético que se va a pasar a la siguiente generación. FIGURA 2: Célula germinal Fuente: http://teragenica98.blogspot.com/ DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE FIGURA 3: Célula germinal Fuente: http://teragenica98.blogspot.com/ Página14 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 2.2 TERAPIA GÉNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS Es aquella dirigida a modificar la dotación genética de células no germinales, es decir, de las células somáticas o constituyentes del organismo. Por ello, la modificación genética no puede transmitirse a la descendencia. Por consenso general entre los investigadores y con la legislación actual, basada en motivos éticos y de seguridad, solamente se llevan a cabo protocolos clínicos en este tipo de terapia génica. En principio, la terapia génica somática no ha sido motivo de reservas éticas, salvo las relacionadas con su posible aplicación a la ingeniería genética de potenciación, es decir, toda manipulación genética cuyo objetivo sea potenciar algún carácter, como la altura, sin pretender tratar enfermedad alguna. Células somáticas: son aquellas que forman el crecimiento de tejidos y órganos de un ser vivo, procedentes de células madre originadas durante el desarrollo embrionario y que sufren un proceso de proliferación celular y apoptosis. FIGURA 4: Célula somática. Neurona. Fuente: http://teragenica98.blogspot.com/ DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE FIGURA 5: Célula somática. Conos, bastones. Fuente: http://teragenica98.blogspot.com/ Página15 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Por otra parte, y en función de la estrategia aplicada, la terapia génica también puede clasificarse en: MANERAS DE REALIZAR TERAPIA GÉNICA FIGURA 7: Terapia génica in vivo, ex vivo. FIGURA 6: Tipos de terapia génica. FUENTE:..http://www.comoves.unam.mx/articulos/genica/genica3.html 2.3 TERAPIA GÉNICA IN VIVO Agrupa las técnicas en las que el material genético se introduce directamente en las células del organismo, sin que se produzca su extracción ni manipulación in vitro. Es decir, la transformación celular tiene lugar dentro del paciente, actuando como fármaco al interaccionar con células específicas del cuerpo y transferirle su contenido genético. FIGURA 8.- Terapia génica in vivo. Fuente: http://preujct.cl/biologia/curtis/libro/c19d.htm DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página16 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA La gran ventaja de las técnicas in vivo sobre la terapia génica in vitro es su mayor sencillez. Sin embargo, tienen el inconveniente de que el grado de control sobre todo el proceso de transferencia es menor, la eficiencia global es también menor (dado que no pueden amplificarse las células transducidas) y, finalmente, es difícil conseguir un alto grado de especificidad tisular. FIGURA 9.- Modelo de transferencia genética in vivo mediado por liposomas catiónicos: introducción del gen q codifica el regulador trasmembrana de la fibrosis quística (CFTR). FUENTE:http://www.sefh.es/bibliotecavirtual/fhtomo2/CAP06.pdf FIGURA 10.-Fibrosis quística. Fuente: http://www.umm.edu/esp_imagepages/18135.htm DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página17 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 2.4 TERAPIA GÉNICA EX VIVO Comprende todos aquellos protocolos en los que las células a tratar son extraídas del paciente, aisladas, crecidas en cultivo y sometidas al proceso de transferencia in vitro. FIGURA 11.- Terapia génica ex vivo. Fuente: http://preujct.cl/biologia/curtis/libro/c19d.htm Una vez que se han seleccionado las células que han sido efectivamente transducidas, se expanden en cultivo y se introducen de nuevo en el paciente. VENTAJAS Sus principales ventajas son el permitir la elección del tipo de célula a tratar, mantener un estrecho control sobre todo el proceso, y la mayor eficacia de la transducción genética. PROBLEMAS Los problemas más importantes de esta modalidad son la mayor complejidad y coste de los protocolos La imposibilidad de transducir aquellos tejidos que no son susceptibles de crecer en cultivo Existe siempre el riesgo inherente a la manipulación de las células en cuanto a problemas de contaminación. En las últimas dos décadas aproximadamente, los conceptos y la tecnología de la ingeniería genética aplicados a la terapéutica han pasado desde la ciencia ficción al inicio de su experimentación clínica. Esta tecnología ha evolucionado rápidamente, y en la actualidad hay más de 200 protocolos de terapia génica en fase de ensayo clínico. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página18 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Por ello, si bien la terapia de fundamento genético se encuentra mayoritariamente en fase de experimentación, estas técnicas se incorporarán al arsenal terapéutico en un futuro nada lejano para su uso clínico seguro y eficaz. FIGURA12.- Modelo de transferencia génica ex vivo: introducción del gen que codifica el receptor de LDL en el tratamiento de la hipercolesterolemia familiar monogénica. FUENTE: http://www.sefh.es/bibliotecavirtual/fhtomo2/CAP06.pdf FIGURA 13.- Se extrae células del paciente con genes defectuosos y en el laboratorio, a través de vectores se les transfieren los genes deseados. Finalmente las células transformadas se introducen de nuevo en el paciente. FUENTE: http://www.investigalog.com/biologia_y_ciencias_de_la_salud/terapia-genica-ex-vivo/ DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página19 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA CÓMO SE UTILIZA Para introducir un gen en una célula eucariota se utilizan vectores que transportan normalmente material genético a las células como virus. El ADN o ARN de estos organismos es cortado con enzimas de restricción con el fin de quitar las regiones patógenas e insertar en estas zonas de su genoma el gen de interés médico. Una vez recombinado el genoma del vector con el nuevo material genético, este se ensambla de forma fisiológica y se le deja “infectar”. El vector, al realizar sus procesos de incorporación al genoma humano y a sus mecanismos de trascripción y traducción de proteínas terminará finalmente generando cantidades de la proteína normal que seguramente va a tener efectos terapéuticos en el paciente. FIGURA 14.- Introducción un gen en una célula eucariota http://cmciesporcar.blogspot.com/2012/05/la-terapia-genica-frente-al-cancer.html DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página20 CAPÍTULOIII TRANSFERENCIA GÉNICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA TRANSFERENCIA GÉNICA La terapia génica requiere que se transfieran eficientemente los genes clonados a células enfermas, de manera que los genes introducidos sean expresados en cantidad adecuada. Tras la transferencia génica, los genes insertados se pueden llegar a integrar en los cromosomas de la célula, o bien quedar como elementos genéticos extracromosómicos (episomas). FIGURA 15.- Trasferencia génica http://www.slideshare.net/JhonHenryCeballosSalcedo/terapia-genica-9653198 3.1 GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS Y GENES NO INTEGRADROS 3.1.1 GENES INTEGRADOS EN CROMOSOMAS La ventaja de que el gen se integre en el cromosoma es que puede perpetuarse por replicación cromosómica tras la división celular. FIGURA 16.-Cromosoma Fuente: http://www.whfreeman.com/Catalog DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Como las células de la progenie también contienen los genes introducidos, se puede obtener una expresión estable a largo plazo. Así, en los tejidos formados por células en división activa, la clave es dirigir la modificación a las células madre (una Página22 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA población minoritaria de células precursoras indiferenciadas que dan lugar a las células diferenciadas maduras del tejido). Además, las células madre no sólo dan lugar a las células maduras del tejido, sino que al mismo tiempo se renuevan ellas mismas. En consecuencia, se trata de una población inmortal de células a partir de la cual deriva el resto de células del tejido. La transferencia eficiente de genes a las células madre y la posterior expresión del gen estable ofrece, por tanto, la posibilidad de curar un trastorno genético. No obstante, la integración cromosómica tiene sus inconvenientes debido a que la inserción suele ocurrir casi al azar: la localización de los genes insertados puede variar enormemente entre células. En algunos casos, los genes insertados pueden no expresarse debido a su inserción en regiones muy condensadas. En ciertas ocasiones, la integración puede provocar la muerte de la célula huésped (por ejemplo, por inserción en un gen crucial, inactivándolo). Este tipo de acontecimientos tiene consecuencias únicamente para la célula en la que sucede la integración. Una preocupación mayor es el riesgo de cáncer: la integración puede perturbar los patrones normales de expresión de genes que controlan la división o la proliferación celular, por ejemplo a través de la activación de un oncogén o de la inactivación de un gen supresor de tumores o de un gen implicado en la apoptosis (muerte celular programada). La terapia génica ex vivo ofrece al menos la oportunidad de seleccionar las células en las que la integración ha tenido éxito, gracias a que se amplifica a estas células en cultivo y se comprueba si sus fenotipos presentan alguna evidencia obvia de transformación neoplásica, como paso previo a su readministración al paciente. 3.1.2 GENES NO INTEGRADOS Algunos sistemas de transferencia génica están diseñados para insertar genes en células donde pueden quedar como elementos extracromosómicos (episomas) y tener una expresión elevada. Si las células están dividiéndose activamente, el gen introducido puede no segregar igualmente a las células hijas, por lo que la expresión a largo plazo puede ser un problema. El resultado es que la posibilidad de curar un trastorno genético puede ser remota: harán falta tratamientos repetidos de terapia génica. Sin embrago, en algunos casos puede ser que no haga falta una expresión estable a largo plazo. Por FIGURA 17.- Trasferencia génica Fuente: http://www.asgct.org/ ejemplo, las terapias génicas contra el cáncer suelen implicar la transferencia y expresión de genes a células cancerosas con la intención de DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página23 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA eliminarlas. Una vez eliminado el tumor, el gen terapéutico puede no ser necesario nunca más. 3.2 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA Para alcanzar un determinado efecto biológico en terapia génica es necesario introducir de manera eficaz la secuencia génica de interés en la célula diana y conseguir su expresión. Estos objetivos suponen contar con un adecuado sistema de vehiculización o transferencia y, al mismo tiempo, disponer de promotores adecuados para conseguir la máxima expresión del gen insertado en la célula. La introducción en una célula de material genómico foráneo se denomina transferencia génica, transducción o transfección. Los principales sistemas de transferencia pueden agruparse en dos tipos: los métodos físico-químicos y los vectores virales. 3.2.1 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA FÍSICO-QUÍMICOS O NO VIRALES Los métodos de transferencia génica físico-químicos o no virales fueron los primeros en ser desarrollados. En estos métodos el ADN foráneo o exógeno está integrado en un plásmido, que es una molécula de ADN que puede ser mantenida de manera episómica, es decir, de forma estable e independiente del genoma de la célula huésped. FIGURA 18.- Plásmido Fuente: http://www.whfreeman.com/Catalog/ DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página24 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA VENTAJAS En general, presentan las siguientes ventajas: Son sencillos de preparar, lo que permite su producción de forma industrial No tienen limitaciones en cuanto al tamaño del ADN que pueden transferir Son poco tóxicos; y no son inmunogénicos. INCONVENIENTES Los inconvenientes de estos métodos son: Su baja eficacia de transducción de las células diana Y que algunos de ellos sólo pueden utilizarse in vitro. 3.2.1 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA FÍSICO-QUÍMICOS Microinyección Precipitación con fosfato cálcico Electroporación Inyección directa de ADN “desnudo” Conjugados ADN-proteínas Liposomas CUADRO 2.- Métodos de trasferencia Génica. Fuente: Creada por la autora. 3.2.1.1 MÉTODOS QUÍMICOS Transferencia con fosfato de calcio Se empezó a usar esta técnica en los años 60, pero fue en los 70 cuando se empezó a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfección. Se basa en la precipitación del DNA exógeno y los iones de calcio, provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfección puede llegar al 10% de las células, aunque suele ser transitoria. No es una técnica que provoque toxicidad en las células pero la expresión del transgén es muy pequeña. Únicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicación es "ex vivo". DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página25 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 3.2.1.2 SISTEMAS FÍSICOS Consiste en colocar el DNA mediante una inyección en el núcleo de las células. Al introducirlo directamente allí, evitamos la degradación citoplasmática y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualización. Las células que sobreviven y han insertado el material genético presentan una alta eficacia de expresión del mismo. La técnica es muy laboriosa y necesita células aisladas para su realización. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyección en embriones se denomina terapia génica germinal siendo un método "in vivo". Microinyección Los sistemas de microinyección de genes en oocitos, huevos y embriones de animales permiten el estudio de los genes transferidos durante el desarrollo embrionario normal. Estos métodos permiten la introducción de cualquier DNA en cualquier célula sin necesidad de presión selectiva para mantenerlo si bien se necesita un equipamiento costoso y mucha práctica con la desventaja de que se pueden tratar un número reducido de células cada vez. Se utilizan también para introducir vectores plasmídicos en núcleos de protoplastos vegetales. La microinyección se realiza al microscopio con capilares de vidrio de diámetro entre 0,1 y 0,5 mm y con ayuda de un micromanipulador. FIGURA 19.- Sistema de microinyección. Fuente: ttp://recursos.cnice.mec.es/biologia/bachillerato/segundo/biologia/ud06/02_06_04_02_044.html DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página26 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Electroporación Sirve tanto para células de mamífero o de plantas como para levaduras y bacterias. Consiste en un proceso físico que, de modo transitorio y por acción de un breve pulso eléctrico, permeabiliza las membranas tanto de células procariotas como eucariotas, al hacer que se formen poros en las mismas, permitiendo la entrada en la célula de moléculas de DNA grandes e incluso de partículas víricas. Es un método bastante ineficaz puesto que de cada 1000 células, sólo una de ellas recibe el DNA. Según el tamaño de la célula se necesita mayor o menor voltaje de modo que cuanta más pequeña es la célula, mayor voltaje se necesita para que se formen los poros en la membrana. Cuando cesa el pulso eléctrico, los poros se cierran. DNA desnudo Es aquel ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica. Para la transferencia de genes, suele estar constituida por un plásmido bacteriano que contiene el gen a transferir. Se inyecta directamente en el tejido objetivo donde se expresa generalmente sin integrarse en el genoma de las células huésped. El método consiste en la introducción del DNA en una solución salina o sérica, normalmente mediante inyección intramuscular, para conseguir la expresión del transgén. Se ha observado actualmente expresión en timo, piel, músculo cardíaco y músculo esquelético. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la célula aunque se postula que es a través del complejo del poro nuclear. Tiene un bajo porcentaje de células transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realización de la terapia génica "in vivo". DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página27 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA FIGURA 20.- Ejemplo de una vacuna de ADN desnudo. Fuente: http://www.ortodoncia.ws/publicaciones/2011/images/171/3.gif 3.2.1.3 VECTORES NO VIRALES Liposomas En 1965 se descubrió que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipídica a semejanza de una célula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la célula, pero hasta 1980 no se consiguió una eficacia de transfección adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catiónicos (cargados positivamente) y liposomas aniónicos (cargados negativamente). Existen muchos lípidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se están probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro". DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página28 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA FIGURA 21.- Estructura del liposoma. Fuente: http://www.infinitefractal.com/movabletype/blogs/my_blog/metodos-de-produccion-de-lipos.html VENTAJAS Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradación al transgén hasta su llegada al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos específicos incluyendo receptores en la capa lipídica. Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfección, una expresión transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes séricos. 3.2.2 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA MEDIADA POR VIRUS En la transferencia mediada por virus se sustituyen ciertos genes prescindibles del vector por aquellos genes que se desea introducir en las células diana. La región que ocupan estos genes se denomina región para inserción o “cassette”; su tamaño (número de kilobases: kb) depende del tamaño del virus y de los genes que puedan ser sustituidos y, obviamente, constituye un factor limitante a la hora de insertar las secuencias génicas de interés. Actualmente, los virus constituyen la forma más eficaz de transferir genes terapéuticos al interior de las células diana, y son los vectores más utilizados en terapia génica. Los virus están constituidos por pequeños ácidos nucleicos (ADN o ARN) encapsulados en envolturas proteicas que los protegen y les permiten entrar en las células. Una vez en el interior de la célula, la información contenida en el ácido nucleico dirige la síntesis de proteínas virales, aprovechando el sistema sintetizador (ribosomas) y el aparato productor de energía (mitocondrias) de la célula huésped; de este modo se generan nuevos viriones. Los vectores virales se obtienen por eliminación de uno o más genes indispensables para la replicación del virus, y su sustitución por el gen terapéutico. De esta forma, el nuevo virus es defectivo, lo que significa que mantiene la capacidad de infectar las DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página29 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA células pero es incapaz de multiplicarse en ellas. Es decir, un virus puede ser transformado estructuralmente mediante diversas técnicas, dando lugar a un vector recombinante relativamente seguro, siempre y cuando se sustituya los genes responsables de su replicación y virulencia por los genes terapéuticos, manteniendo su capacidad infectiva intacta. VENTAJAS Los vectores virales constituyen los sistemas más eficaces para transferir genes, ya que son capaces de infectar una elevada proporción de las células diana, es decir, poseen una elevada eficacia de transfección, que en algunos casos llega a ser incluso del 100 %. LIMITACIONES Existen, sin embargo, importantes limitaciones en el empleo de virus, derivados de la transferencia y la expresión de secuencias virales. En consecuencia, la seguridad en el empleo de los vectores virales constituye una importante preocupación, bien porque puede producirse una transferencia involuntaria del virus nativo patógeno, o bien porque pueda activarse un virus patógeno o un oncogén debido a la posibilidad de recombinación génica al insertarse un gen foráneo en el genoma del huésped. Otro punto clave a considerar en la terapia génica in vivo es la reacción inmunitaria que el organismo receptor pone en marcha, pudiendo eliminar el material genético a través de la muerte de las células genéticamente modificadas. Para contrarrestar esta reacción inmune se intenta eliminar el mayor número posible de genes víricos del vector, con el fin de obtener una expresión más estable del gen terapéutico. 3.2.2 MÉTODOS DE TRANSFERENCIA MEDIADA POR VIRUS Retrovirus Adenovirus Herpesvirus Virus Adenoasociados CUADRO 3.- Métodos de transferencia mediada por virus. Fuente: Creada por la autora. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página30 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA FIGURA 22.- Estructura genómica de los principales virus utilizados para la construcción de vectores víricos de transferencia génica. En cada caso se muestra la secuencia de ADN del genoma vírico, que para retrovirus y adenovirus asociados es la forma provírica integrada. Se indican también las características relevantes de cada sistema, como la secuencia y, necesaria para la encapsidación de los genomas víricos. Asimismo se indica el tamaño de cada genoma y las principales regiones codificadoras de proteínas víricas (excepto para el virus del herpes simple). Retrovirus: las regiones LTR se denominan repeticiones terminales largas y contienen secuencias promotoras, secuencias de poliadenilación y secuencias necesarias para la integración. Adenovirus: las regiones E1A, E1B y E3 se pueden eliminar o sustituir por un gen recombinante de interés para formar los vectores adenovíricos. Virus del herpes simple: las regiones a, b y c son repeticiones que se encuentran invertidas en a', b' y c'. Adenovirus asociados: las regiones ITR, llamadas repeticiones terminales invertidas, flanquean al gen de interés en vectores. FUENTE:..http://www.hvil.sld.cu/bvs/archivos/6 67_76terapia%20genica.pdf 3.2.2.1 VECTORES RETROVÍRICOS FIGURA 23.- Trasferencia a un retrovirus. Fuente: http://journals.cambridge.org/fulltext_content/ERM/ERM6_18/S146239940400818Xsup002.htm DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página31 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Los vectores víricos más estudiados provienen de los retrovirus. Los retrovirus más estudiados son los oncovirus sencillos, como el virus del sarcoma de Rous (VSR) y el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV). Cada partícula retrovírica (virión) contiene dos copias de ARN genómico vírico empaquetadas dentro de un complejo proteico que, a su vez, está rodeado por una envuelta proteolipídica. La propiedad más interesante de los retrovirus es la producción de transcriptasa inversa, una polimerasa de ADN dependiente de ARN. La mayoría de ensayos clínicos de terapia génica utilizan actualmente retrovirus murinos defectuosos, incapaces de replicación. FIGURA 24.- Estructura del genoma de un retrovirus. Fuente: http://www.unav.es/ocw/genetica/tema12-3-1.html Las principales ventajas de los vectores retrovíricos como vehículos de transferencia son su extraordinaria eficiencia, que les permite transducir cerca del 100 % de las células diana, y su capacidad para integrar de manera estable en los cromosomas celulares el material genético que contienen. Sin embargo, existen varias limitaciones que dificultan el uso de los vectores retrovíricos como vehículos generales de transferencia génica. Para que tenga lugar la integración del provirus recombinante es necesario que la célula diana se replique. Por lo tanto, no es posible transducir a células posmitóticas, como neuronas diferenciadas o fibras musculares. La eficiencia de transducción puede mejorarse significativamente en algunos tejidos, como la médula ósea o el hígado, cuando se provoca la división celular mediante cultivos ex vivo o mediante tratamiento con fármacos (5-fluorouracilo en médula ósea y tetracloruro de carbono en hígado). La concentración de partículas víricas recombinantes en los sobrenadantes de las líneas celulares productoras es también un factor limitante. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página32 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Los retrovirus recombinantes son relativamente lábiles en comparación con otros virus. Se ha intentado purificar o concentrar las partículas, aunque ello ha dado como resultado una pérdida considerable de capacidad de transducción. Los títulos habituales de 105 a 106 partículas víricas/ml de sobrenadante a veces resultan insuficientes, en especial para la terapia génica in vivo, ya que los viriones recombinantes son inactivados rápidamente por el sistema del complemento. Otra limitación de los vectores retrovíricos está relacionada con el tamaño de la secuencia que debe insertarse, que no debe superar las 8 kb para que pueda ser empaquetada eficazmente y no influya negativamente en el título obtenido. Ello implica que algunas secuencias de ADN complementario como la del gen de la distrofina, de 14 kb, no puedan incluirse en vectores retrovíricos. Finalmente hay que considerar también cuestiones de seguridad en torno al uso clínico de los vectores retrovíricos. Existe la posibilidad de que se generen virus «silvestres» con capacidad de replicación mediante recombinación homóloga de secuencias retrovíricas, principalmente en las líneas celulares productoras. Además, la integración aleatoria del provirus recombinante en el genoma celular podría provocar la activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores. Sin embargo, estudios de toxicidad en modelos animales finalizados recientemente han indicado que no hay riesgo significativo en el uso de los sistemas retrovíricos actuales para terapia génica. FIGURA 25.- Generación de retrovirus recombinantes para transferencia génica. Los vectores retrovíricos se obtienen al sustituir todas las secuencias codificadoras del genoma de un retrovirus, por secuencias recombinantes de interés terapéutico. Dichos vectores se introducen en líneas celulares empaquetadoras, manipuladas para expresar constitutivamente los genes gag, poly env. Las células resultantes, llamadas productoras, son capaces de encapsidar el ARN derivado de los vectores retrovíricos produciendo viriones recombinantes sin capacidad de replicación. Éstos se recogen en el sobrenadante celular y servirán como vehículos eficientes de transferencia y expresión de los genes de interés. Fuente:http://www.hvil.sld.cu/bvs/archivos/667_76terapia%20genica.pdf DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página33 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 3.2.2.2 VECTORES ADENOVÍRICOS FIGURA27.- Estructura del genoma de un adenovirus. Fuente: http://www.unav.es/ocw/genetica/tema12-3-1.html FIGURA 26.- Estructura del genoma de un adenovirus. Fuente: http://www.unav.es/ocw/genetica/tema12-31.html Los adenovirus son patógenos débiles que afectan principalmente las vías respiratorias y no se han asociado a enfermedades malignas. Cada partícula vírica contiene una molécula de ADN de doble cadena de tamaño considerable (36 kb) y entra en las células mediante endocitosis mediada por receptores, seguido de la rotura del correspondiente endosoma y migración del genoma adenovírico al núcleo donde permanece en forma extracromosómica. El genoma adenovírico comprende una serie de genes que se expresan al principio de la infección y codifican proteínas reguladoras, y una serie de genes tardíos, que codifican proteínas estructurales. Cuando el genoma vírico entra en la célula, se activan los genes que se expresan inicialmente (E1). Ellos a su vez activan otros genes reguladores importantes E2, E3 y E4. En la segunda fase de replicación se expresan los genes tardíos (L1-L5), produciendo más virus que finalmente provocan la muerte de la célula. El actual conocimiento de la genética molecular del adenovirus posibilita su manipulación como vehículo para terapia génica. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página34 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA FIGURA 28.- Trasferencia a un adenovirus. FUENTE: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb1624.html VENTAJAS Pueden infectar la mayoría de tipos celulares de mamífero. Pueden producirse a títulos elevados (³ 1012 partículas/ml) mediante su propagación en células 293 y su posterior purificación en gradientes de cloruro de cesio, por lo cual resultan adecuados para terapia génica in vivo. A diferencia de los vectores retrovíricos, son capaces de transducir eficientemente células quiescentes como neuronas y hepatocitos. El hecho de que los vectores adenovíricos generalmente no se integran en el genoma de las células transducidas elimina el peligro potencial de mutagénesis por inserción. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página35 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA DESVENTAJAS La expresión del gen terapéutico es transitoria. Producen inducción de una respuesta inmunitaria fuerte en las células hospedadoras, contra pequeñas cantidades de proteínas víricas sintetizadas por el vector. 3.2.2.3 VECTORES BASADOS EN EL VIRUS DEL HERPES FIGURA 29.-Herpesvirus Fuente: http://www.unav.es/ocw/genetica/tema12-3-1.html Basados en el virus del herpes simplex (HSV), que tienen un marcado tropismo neuronal y por eso se emplean fundamentalmente para la transferencia de genes al sistema nervioso. Los HSV son virus envueltos con un genoma lineal de 152 kb de ADN bicatenario, en el que se han identificado más de 80 genes. El genoma está dividido en dos regiones únicas (Larga y Corta) que están flanqueadas por repeticiones terminales (TR) y repeticiones internas (IR). El virus se une a glicosamino-glucanos celulares y a receptores celulares específicos (por ejemplo, el receptor HveC, que pertenece a la súper familia de las inmunoglobulinas y se expresa a alto nivel en el sistema nervioso). Tras la entrada en la célula, el virus avanza por transporte retrógrado y llega al núcleo, penetrando por los poros nucleares. Después de entrar en el núcleo se expresan los genes inmediatos tempranos, que activan la expresión de los genes tempranos (necesarios para la síntesis de ADN viral) y de los genes tardíos (proteínas estructurales). DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página36 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Una característica importante es que uno de los genes inmediatos tempranos (ICP4) es absolutamente necesario para la replicación viral, por lo que basta eliminarlo del genoma para obtener virus defectivos. En los vectores actualmente en uso se han delecionado todos los genes inmediatos tempranos, por lo que son totalmente apatogénicos. Otra característica importante de estos virus es que cuando no se replican entran en un periodo de latencia en el que se transcriben únicamente unos transcritos asociados a latencia (LATs), aunque no se expresen los genes inmediatos tempranos. Por tanto, incluyendo la unidad transcripcional en la región de latencia se pueden obtener virus defectivos que expresan de forma persistente un gen terapéutico. Además, se trata de vectores de gran capacidad porque permiten acomodar hasta 50 kb de ADN exógeno. FIGURA 30.- Estructura del genoma de un herpes virus Fuente: http://www.unav.es/ocw/genetica/tema12-3-1.html 3.2.2.4 VECTORES BASADOS EN EL ADENOVIRUS ASOCIADO Los adenovirus asociados (AAV) son miembros de la familia de los parvovirus y no se han relacionado con ninguna enfermedad humana. Dichos virus son relativamente pequeños (4,7 kb), estables y pueden infectar también una gran variedad de células humanas. Pueden propagarse como virus líticos o mantenerse como provirus, que se integran en el ADN de la célula hospedadora. En un proceso de infección, para una replicación eficiente, el adenovirus asociado requiere co-infección con adenovirus o virus del herpes simple; de ahí la clasificación del AAV como un virus defectuoso. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página37 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA La integración del genoma de los adenovirus asociados en el ADN del hospedador es menos eficiente y precisa que la integración retrovírica, puesto que en dicho proceso se producen frecuentemente pequeñas deleciones y/o reordenamientos. Sin embargo, los genomas integrados de AAV son estables. Una propiedad característica de los adenovirus asociados es que la integración de su genoma vírico se produce dentro de una pequeña región del cromosoma 19. No obstante, no parece que ninguno de los adenovectores asociados, construidos hasta la fecha, conserve dicha propiedad. Otra limitación de los vectores AAV es la restricción en el tamaño de las secuencias transgénicas que deben acomodarse, que no puede superar las 4,5 kb. Recientemente, experimentos in vivo han demostrado que los vectores AAV pueden persistir y expresar el transgén en células de crecimiento lento o incluso quiescentes, sin que se observen respuestas inflamatorias o inmunológicas tóxicas. 3.3 MARCAJE CELULAR Consiste en introducir, junto con el gen terapéutico, uno o más genes que permitirán identificar y seleccionar aquellas células diana que hayan incorporado el transgén Así, por ejemplo, el marcaje con un gen que confiere resistencia a neomicina permite la detección selectiva de las células cuando se hacen crecer en un medio que contiene dicho antibiótico. Por otra parte, un riesgo potencial de la terapia génica es la posibilidad de aparición de complicaciones que requirieran la suspensión del tratamiento. Es por ello que se ha desarrollado una alternativa consistente en el doble marcaje de la célula con genes distintos de la secuencia de interés, es decir, la célula marcada lleva un gen foráneo que nos sirve de marcador, como el de resistencia a neomicina, que permite seleccionar in vitro las células que han tomado el ADN exógeno o conocer in vivo el grado de transfección, y el otro gen, como el de la enzima timidinacinasa del virus del herpes simplex, que permite hacer una selección negativa in vivo de las células marcadas, mediante la administración de ganciclovir, el cual es fosforilado por la enzima y activado, provocando la muerte celular; de este modo se elimina las células modificadas si la situación lo requiere debido a la toxicidad del tratamiento u otras complicaciones. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página38 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA FIGURA 31.- Procedimiento regulador del marcaje fenotípico para células humanas. Fuente: http://www.hvil.sld.cu/bvs/archivos/667_76terapia%20genica.pdf 3.3.1 ESTUDIOS DE MARCAJE El marcaje genético de células hemopoyéticas no produce un beneficio inmediato a los pacientes, pero la información obtenida de dichos estudios ayuda a mejorar los resultados de terapias que emplean el trasplante de precursores hemopoyéticas (HSC) con el fin de erradicar tumores. También ayuda a conocer con mayor profundidad la biología de los HSC y a mejorar la eficiencia de la transferencia y expresión génicas. Marcaje de linfocitos infiltradores de tumores El marcaje de linfocitos aislados de tumores sólidos (TIL) fue el primer experimento de transferencia génica a seres humanos aprobado en Estados Unidos en 1989. En dicho experimento se marcaron ex vivo TIL aislados de pacientes con cáncer en estadios avanzados mediante transducción con un vector retrovírico que contenía el gen de la resistencia a la neomicina (neo) como marcador selectivo y se reinfundieron al paciente. Los resultados obtenidos demostraron que las células manipuladas podían ser devueltas al paciente sin ningún riesgo y posteriormente se podían detectar in vivo. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página39 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Marcaje de células hemopoyéticas Para diferentes enfermedades malignas, la recuperación de precursores hemopoyéticos puede mejorar la esperanza de vida de los pacientes sometidos a radioterapia o quimioterapia. Sin embargo, la recidiva es la causa principal por la cual dicho tratamiento suele ser ineficaz. La posibilidad de que las células reinfundidas al paciente pudieran contribuir a la recidiva condujo a una evaluación exhaustiva de las técnicas utilizadas para «limpiar» la médula ósea con el fin de eliminar las células malignas. Ello se realizó marcando la médula ósea recogida del paciente y analizando posteriormente la presencia del gen marcador en células malignas cuando se producía la recidiva. Dichos estudios empezaron en 1991 e incluían pacientes con leucemia mieloide aguda y con neuroblastoma. La médula ósea de dichos pacientes se transdujo ex vivo con vectores retrovíricos análogos a los empleados en el estudio de marcaje de TIL. Los datos recogidos demostraron que la médula ósea obtenida después de los tratamientos de limpieza puede contener aún células tumorales residuales que contribuyen a la recidiva de la enfermedad. Así pues, será necesario mejorar los métodos de limpieza para mayor eficiencia en el trasplante autólogo de médula ósea. Asimismo, otros estudios de marcaje para analizar la causa de la recidiva en la leucemia aguda, cáncer de mama y mieloma no han mostrado hasta el momento recidivas en las que se encuentre células hemopoyéticas marcadas con el gen neo, probablemente porque las técnicas actuales de marcaje aún son ineficientes. Actualmente existe mayor interés en los estudios de marcaje con retrovirus para analizar la eficiencia de transducción de las células hemopoyéticas precursoras antes de utilizarlas para trasplante. Estudios en la población infantil han demostrado que el gen marcador neo se detecta en el 2-15 % de las células precursoras después del trasplante autólogo de médula ósea y se expresa durante más de 3 años en la población hemopoyética descendiente. Dichos experimentos de marcaje permitirán valorar el efecto de la administración de factores de crecimiento sobre la capacidad de colonización de las células hemopoyéticas precursoras a corto y largo plazo, y sobre su transducibilidad. Asimismo servirán para identificar fenotípicamente a dichas células con el fin de estudiar con mayor profundidad su biología. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página40 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA PROTEINAS VIRALES MARCADAS FIRUGA 32.- Proteínas virales marcadas. Fuente: http://biol4medio.blogspot.com/ DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página41 CAPÍTULO IV TERAPIA GÉNICA UTILIZADA PARA TRATAR ENFERMEDADES UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 4.1 TERAPIA GÉNICA UTILIZADA PARA TRATAR ENFERMEDADES 4.1 ENFERMEDADES GENÉTICAS De la multitud de enfermedades genéticas que no existen actualmente tratamientos satisfactorios, sólo unas pocas han sido seleccionadas para ensayos clínicos de terapia génica. Entre ellas se encuentran enfermedades que afectan a células hemopoyéticas, como el déficit de adenosín-desaminasa y la enfermedad de Gaucher; enfermedades q afectan a la sangre, como la hemofilia; enfermedades que afectan el hígado, como la hipercolesterolemia familiar, y enfermedades que afectan el pulmón, como la fibrosis quística. FIGURA 33.- Terapia génica ex vivo para el tratamiento de enfermedades que afectan células hemopoyéticas. Las células hemopoyéticas se extraen a partir de sangre o médula ósea del paciente. Después de ser sometidas a un proceso de purificación para enriquecer a la población de interés, las células resultantes se tratan con retrovirus recombinantes que contienen el gen terapéutico. Finalmente, las células corregidas se reintroducen al paciente mediante transfusión sanguínea. FUENTE: http://www.hvil.sld.cu/bvs/archivos/667_76terapia%20genica.pdf DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 42 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 4.1.1 INMUNODEFICIENCIA COMBINADA GRAVE ADENOSÍN-DESAMINASA o DEFICIENCIA DE La inmunodeficiencia combinada grave (llamada en inglés SCID, severe combined immunodeficiency) es un trastorno de inmunodeficiencia. Esta enfermedad se caracteriza por una deficiencia grave o por la mala función de los linfocitos B y de anticuerpos, y en ciertos casos de linfocitos T, debido a la deficiencia en la enzima adenosina desaminasa. La adenosina desaminasa (ADA), es una enzima esencial para el metabolismo de ciertos tipos de células del organismo, en especial, de las células que se ocupan del desarrollo del sistema inmune, como por ejemplo de los linfocitos T. Su ausencia, produce una enfermedad poco frecuente llamada deficiencia de ADA y los niños que nacen con este defecto genético tendrán una forma de la llamada Inmunodeficiencia Combinada Grave. La deficiencia de adenosin desaminasa se observa en un 25% de los casos con inmunodeficiencia severa combinada. Esta enfermedad es un fenotipo clínico el cual afecta niños que muestran ausencia de antígenos específicos de los linfocitos T y B, diarrea e infecciones recurrentes, llevando a la muerte a los niños afectados durante los primeros meses de vida, a causa de infecciones severas, si no es tratada adecuadamente (Niños burbuja). FIGURA 34.- Inmunodeficiencia Combinada Grave. FUENTE:http://scidsindorme.blogspot.com/ En septiembre de 1990, una niña de 4 años que sufría deficiencia de ADA recibió una infusión de sus propios linfocitos T que habían sido manipulados ex vivo para introducirles una copia normal del gen de la ADA. Se escogió esta deficiencia de ADA como la primera enfermedad susceptible para terapia génica por varias razones: El gen había sido clonado y su correspondiente ADN complementario era del tamaño adecuado para insertarse fácilmente en un vector retrovírico. Estudios previos de trasplante de médula ósea sugerían que solamente era necesario corregir los linfocitos T para curar la enfermedad. La cantidad de enzima necesaria para mantener la función del sistema inmunológico en determinados casos puede ser el 5-10 % del nivel normal. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 43 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Las células T corregidas tienen una ventaja selectiva sobre las células deficientes en ADA. FIGURA 35.- Para tratar la SCID (inmunodeficiencia combina grave), usando terapia génica, se transfiere un gen ADA humano clonado a un vector vírico, que entonces se utiliza para infectar glóbulos blancos extraídos del paciente. El gen ADA trasferido se incorpora en un cromosoma y se activa. Después de hacer crecer estas células para incrementar en el paciente, donde produce ADA, lo que permite el desarrollo de la respuesta inmunitaria. FUENTE: http://www.aragoneria.com/boreas/articulos/terapiagenica1.htm A partir de dicho protocolo se demostró que los linfocitos de un paciente con inmunodeficiencia se pueden aislar, pueden crecer en el laboratorio, manipularse genéticamente y ser devueltos al propio paciente sin mayor riesgo. Los dos primeros pacientes han respondido positivamente a la terapia. El número total de linfocitos en su sangre ascendió a niveles normales y en el primer niño tratado la cantidad de enzima ADA en sus linfocitos T ascendió hasta el 25 % de los niveles normales. Además, durante una pausa de 6 meses y medio en su tratamiento, tanto el número de linfocitos manipulados genéticamente como los niveles de enzima ADA se mantuvieron constantes. Ello sugería que la vida media de los linfocitos corregidos era mayor de 6 meses y medio, y que dichos linfocitos proliferaban creando un nivel terapéutico de células corregidas. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 44 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Sin embargo, es posible que las pocas células T corregidas no abarquen completamente el repertorio de un sistema inmunitario normal, por lo cual se ha iniciado ya una modificación al anterior protocolo en que células hemopoyéticas precursoras de sangre periférica se modifican mediante transducción con el mismo vector retrovírico empleado en el primer protocolo, para proporcionar una protección extraordinaria al sistema inmunitario del paciente. 4.1.2 ENFERMEDAD DE GAUCHER FIGURA 36.- Enfermedad de Gaucher. FUENTE:http://www.ferato.com/wiki/index.php/En fermedad_de_Gaucher La enfermedad de Gaucher (GD) es una enfermedad de almacenamiento lisosómico, de herencia autosómica recesiva, debida a la acumulación de glucocerebrósido (un tipo de esfingolípido) por déficit de la enzima glucocerebrosidasa. La acumulación de dicho glucolípido se produce principalmente en los macrófagos del sistema reticuloendotelial, lo cual produce esplenomegalia, lesiones dolorosas en los huesos y en determinados casos lesiones neurológicas. Las células que acumulan el glucocerebrósido se muestran grandes, con aspecto mesenquimatoso, núcleo no desplazado y citoplasma con aspecto de "celofán arrugado" (células de Gaucher). Las podemos ver sobre todo en médula ósea, hígado, bazo y ganglios linfáticos. FIGURA 37.- Microfotografía de célula de Gaucher FUENTE:http://www.umm.edu/esp_imagepages/1450.htm DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 45 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Las manifestaciones de la enfermedad de Gaucher incluyen anemia, trombocitopenia, hepatoesplenomegalia y lesiones óseas. FIGURA 38.- Manifestaciones clínicas de la enfermedad de Gaucher. Fuente:http://scientia1.wordpress.com/2012/05/25/las-zanahorias-transgenicas-gaucher-y-elnuevo-gobierno-frances/ Más del 90 % de los pacientes sufren trastornos óseos. El malestar, el dolor característico y la incapacidad producidos por estos trastornos óseos afectan gravemente a la calidad de vida de quienes la padecen. Se puede manifestar en cualquier momento de la vida: niños, jóvenes, adultos o ancianos pueden presentar la enfermedad, pero resulta importante hacer un rápido diagnóstico e instaurar la terapia específica para dicha enfermedad, ya que con ello radica la pronta mejoría de los síntomas y las deficiencias que presenta el paciente. Esporádicamente se ha utilizado con éxito el trasplante alogénico de médula ósea como modalidad terapéutica. Al igual que para la deficiencia de ADA, conocer la secuencia de ADN complementario del gen que codifica la glucocerebrosidasa y el hecho de que el principal tipo celular afectado derive del sistema hemopoyético, ha llevado a proponer a la terapia génica ex vivo utilizando vectores retrovíricos como tratamiento alternativo. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 46 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA FIGURA 39.- la terapia génica ex vivo utilizando vectores retrovíricos como tratamiento alternativo. Fuente: http://es.scribd.com/doc/15116210/GENOMA-Y-ENFERMEDADES-GENETICAS En este caso, las células diana son también las células hemopoyéticas precursoras con capacidad de producir macrófagos corregidos en el paciente. 4.1.3 HIPERCOLESTEROLEMIA La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad genética autosómica dominante causada por mutaciones en el gen que codifica el receptor de LDL (colesterol LDL o "malo") localizado en el cromosoma 19. La consecuencia de este trastorno es una reducción importante en el número de receptores funcionales para las LDL a nivel hepático, por lo que se produce un aumento en las concentraciones plasmáticas de colesterol transportado en las lipoproteínas de baja densidad, asociado al depósito de colesterol en los tendones y al desarrollo de enfermedad cardiovascular prematura, especialmente cardiopatía isquémica. FIGURA 40.-Hipercolesterolemia Fuente: http://blog.codeconutrilife.com/colesterol/el-colesterol-que-se-hereda/ DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 47 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA La afección se transmite de manera característica de padres a hijos en forma autosómica dominante, lo cual significa que sólo se necesita recibir el gen anormal de uno de los padres para heredar la enfermedad. En casos excepcionales, un niño puede heredar el gen de ambos padres. Cuando esto ocurre, el incremento en los niveles de colesterol es mucho más severo, aumentando enormemente el riesgo de cardiopatía y ataques cardíacos. Los individuos afectados por dicha enfermedad genética tienen niveles extremadamente elevados de colesterol, lo cual predispone a enfermedades cardiovasculares prematuras. Para tratar a individuos con esta deficiencia se ha iniciado un programa de terapia génica ex vivo en que se realiza una lobectomía hepática (extirpación quirúrgica de un lóbulo del hígado) a los pacientes. El lóbulo extraído se procesa con colagenasa para obtener los hepatocitos deficientes, que se transducen mediante un vector retrovírico que contiene el gen del receptor de LDL. FIGURA 41.-Terapia génica ex vivo. Fuente:http://luisadamdecelis.blogspot.com/2011_04_01_archive.html Finalmente, los hepatocitos transducidos se devuelven al paciente mediante inyección en el bazo y/o la vena porta. Los hepatocitos corregidos tienen la capacidad de eliminar el colesterol de la sangre, lo cual ayuda a prevenir la progresión de la enfermedad cardiovascular. Dicho procedimiento había sido realizado previamente con éxito en un modelo animal de la enfermedad, el conejo hiperlipidémico Watanabe. Estudios aún en fase experimental están evaluando la eficiencia de otros sistemas de transferencia, como la terapia génica in vivo mediante retrovirus o adenovirus recombinantes. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 48 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 4.1.4 FIBROSIS QUÍSTICA La fibrosis quística (abreviatura FQ), es una enfermedad genética recesiva que afecta mayormente a los pulmones, y también en menor medida al páncreas, hígado e intestino. FIGURA 42.-Fibrosis quística. Fuente: http://www.umm.edu/esp_imagepages/18135.htm Se caracteriza por un defecto en la estimulación de la secreción de cloruros en el epitelio pulmonar debido a la alteración de una proteína reguladora transmembrana de conductancia de la fibrosis quística (CFTR), lo que provoca infecciones pulmonares frecuentes, que pueden llegar a ser letales. Es una de las enfermedades genéticas más frecuentes en la raza blanca con una incidencia en la población española, según recientes estudios de cribado neonatal, de aproximadamente 1/5.000 nacidos vivos. Al presentar una herencia autosómica recesiva, se calcula que un 4-5% de la población general son portadores de esta entidad en la raza blanca. FIG. 43.- Localización del gen CFTR En su forma más común, una mutación de FUENTE:http://es.wikipedia.org/wiki/Fibrosis_qu%C3%ADstica un aminoácido (falta una fenilalanina en la posición 508) conduce a un fallo del transporte celular y localización en la membrana celular de la proteína CFTR. Se han descrito más de 1.800 mutaciones, siendo la mayoría de ellas pequeñas deleciones, aunque con diferentes efectos, como cambios en el marco de lectura, cambios de aminoácidos, terminación prematura de la proteína o alteraciones en el splicing. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 49 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Para el tratamiento de esta enfermedad se ha considerado principalmente la terapia génica in vivo. Se ha demostrado la capacidad de los vectores adenovíricos para introducir genes en el epitelio pulmonar de modelos animales y ello ha promovido el inicio de ensayos clínicos para pacientes con fibrosis quística. FIGURA 44.- Terapia génica in vivo usando un vector adenovirus. FUENTE: http://cientificblog28ciencias.blogspot.com/ Asimismo, se han iniciado ensayos clínicos utilizando transferencia génica por liposomas. Dado que ambas técnicas tienen como limitación el hecho de que la expresión génica es solamente transitoria, será importante evaluar las consecuencias de su uso repetido. FIGURA 45.- Transferencia génica por liposomas. FUENTE: http://genetictools.wordpress.com/ 4.1.5 ENFERMEDADES DE COAGULACIÓN Y OTRAS ENFERMEDADES QUE IMPLICAN LA CIRCULACIÓN SANGUÍNEA En estudios preclínicos se ha estudiado el desarrollo de métodos para aportar productos génicos a la circulación sanguínea. Se han realizado diversos estudios de transducción de tejidos primarios, como queratinocitos, mioblastos y fibroblastos. Algunos de estos experimentos han indicado que es posible la expresión génica a largo plazo in vivo después de trasplantar las células transducidas ex vivo. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 50 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA En el caso de los queratinocitos, se han utilizado satisfactoriamente vectores retrovíricos y métodos de trasplante establecidos, aunque ningún producto génico expresado por dichos vectores se secretó a la circulación durante largo tiempo. Experimentos con mioblastos y fibroblastos han demostrado expresión génica prolongada después de su trasplante. Para el tratamiento de la hemofilia B, después de inyectar por vía intramuscular mioblastos primarios transducidos con el gen que codifica al factor de coagulación IX humano, dicha proteína fue sintetizada eficientemente y excretada a la circulación durante más de 6 meses. FIGURA 46.- Mioblastos primarios transducidos con el gen que codifica al factor de coagulación IX humana. Fuente:http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php?title=2010_Lecture_22 En cuanto a los fibroblastos, se ha conseguido la expresión de b-glucuronidasa durante más de 5 meses y la corrección del defecto de acumulación lisosómica en ratones deficientes en dicha enzima. Sin embargo, en ambos estudios se tuvo que utilizar vectores que contenían promotores no víricos, ya que las regiones promotoras víricas (LTR) resultaron inactivas 4.2 ENFERMEDADES ADQUIRIDAS 4.2.1 TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER En la actualidad se considera que las alteraciones genéticas desempeñan un papel esencial en la patogenia del cáncer. Por una parte, los oncogenes son genes que pueden producir transformación maligna cuando se expresan de forma inadecuada debido a mutación, a ampliación, o a nueva disposición. Los protooncogenes son los genes normales que desempeñan un importante papel en la proliferación y diferenciaciones celulares normales, pero que son susceptibles de ser mutados y convertirse en oncogenes, provocando la aparición de cáncer. En la mayor parte de los casos codifican factores de crecimiento, receptores, u otras moléculas implicadas en las vías de transducción de la señal, o factores de DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 51 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA transcripción que regulan la expresión génica. El número de protooncogenes identificados hasta ahora sobrepasa los 50, y se cree que podría alcanzar los 100. Por otra parte, los antioncogenes o genes supresores de tumores actúan inhibiendo el crecimiento celular, y una categoría relacionada de genes están implicados en la génesis tumoral cuando se pierden o se inactivan. El número de genes supresores de tumores identificados y clonados molecularmente hasta ahora es pequeño, alrededor de diez; no obstante, se espera un incremento sustancial en los próximos años. Los más conocidos son: Rb, p53, FAP, DCC, NF1, NF2, WT1 y p16. 5.1. ESTRATEGIAS EN TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER En el cáncer, no se trata de corregir un defecto genético como ocurre en las enfermedades genéticas, sino de utilizar la manipulación génica para dotar de una nueva propiedad a las células, que permite aprovecharlas en algún aspecto de la patología oncológica con fines terapéuticos. En la actualidad, se han desarrollado distintas estrategias en terapia génica del cáncer, y se están realizando diversos ensayos clínicos para tratar diferentes tipos de cáncer: de mama, ovario, cabeza y cuello, pulmón, próstata, células renales, tumor cerebral, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas, melanoma, mieloma múltiple y neuroblastoma. FIGURA 47.- ESTRATEGIAS EN TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER Fuente:http://news.bbc.co.uk/hi/spanish/science/newsid_5306000/53 06598.stm DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 52 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Terapia génica in vivo para el tratamiento de melanoma. En dicho procedimiento, un vector de expresión que contiene el gen del antígeno de histocompatibilidad HLA-B7 se completa con lípidos que forman liposomas. Los liposomas se inyectan directamente a las células tumorales para que expresen la proteína HLA-B7 en su superficie celular, la cual es reconocida por el sistema inmunitario del paciente como extraña. FIG. 48.- Terapia génica in vivo para el tratamiento de melanoma. Fuente:http://www.hvil.sld.cu/bvs/archivos/667_76terapia%20geni ca.pdf Ello deberá provocar una respuesta inmunológica potente para destruir las células tumorales y producir una recidiva del melanoma. A continuación se enumeran las diferentes estrategias aplicadas en los ensayos clínicos realizados en terapia génica del cáncer: Aumentar la actividad antitumoral de células inmunes por medio de citoquinas (interleucinas, factores de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonias o interferones). Aumentar la inmunogenicidad del tumor introduciendo antígenos foráneos (“vacunas tumorales”). Introducir un gen “suicida” o de sensibilidad aumentada a determinados fármacos. Se transduce el gen de una enzima (timidina cinasa) que activa selectivamente un profármaco (aciclovir). Bloquear la expresión de oncogenes mediante terapia antisentido (se aplica a secuencias cortas de ADN o ARN diseñadas para ser complementarias de secuencias génicas específicas, con el fin de interferir el flujo de información genética). Introducir genes supresores de tumores (p53). Eliminación de las células tumorales mediante adenovirus oncolíticos. Transferencia de genes con efecto antiangiogénico, para inhibir la formación de vasos sanguíneos inducidos por el propio tumor. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 53 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Introducir genes de resistencia a fármacos para reducir la toxicidad de la quimioterapia, particularmente sobre la médula ósea. 4.2.2 TERAPIA GÉNICA DE LA INFECCIÓN POR VIH Actualmente, la infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) se considera una enfermedad genética de carácter adquirido, ya que el virus retrotranscribe su ARN genómico e integra el ADN de doble hélice resultante en el cromosoma de la célula huésped, de modo que es capaz de modular las funciones de la célula para, finalmente, suprimir el sistema inmune. Por ello, el SIDA es en la actualidad un claro objetivo de la terapia génica. Se han realizado ya numerosos estudios sobre el tratamiento de la infección por el VIH mediante terapia génica, tanto in vitro en diferentes líneas celulares como in vivo en animales de experimentación. Asimismo, en la actualidad se están ensayando diversos protocolos clínicos de terapia génica para el tratamiento del SIDA. Los ensayos clínicos en desarrollo utilizan mayoritariamente técnicas ex vivo. Se aíslan células del paciente, las cuales se utilizan como vehículos celulares de los genes terapéuticos. Mediante vectores víricos o por inyección directa de ADN, se introduce un gen terapéutico en estas células diana. A continuación, las células transducidas, es decir, aquellas que han incorporado y expresado el transgén, son reintroducidas en el paciente por vía intravenosa. En algunos protocolos, las células transducidas, previamente a su administración al paciente, son expandidas en un cultivo celular para aumentar su número. FIGURA 49.- terapia génica para el VIH. FUENTE:http://luciaalasdeesperanza.blogspot.com/ 2010/07/aaas-aaas-news-release-science-gene.html A continuación se enumeran las diferentes estrategias aplicadas en los ensayos clínicos realizados en terapia génica de la infección por VIH: Transferir un gen del virus VIH, para así estimular la respuesta inmune del paciente en cuanto dicho gen sea expresado. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 54 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Introducir genes de inhibidores celulares de la replicación vírica (interferón-a) en líneas celulares de linfocitos T y monocitos, y con la subsiguiente inhibición de la producción de VIH. Transferir genes de proteínas mutantes del VIH, las cuales compiten con las proteínas víricas nativas, dificultando el ensamblaje del virus o inhibiendo su replicación. Retener proteínas víricas reguladoras mediante señuelos de ARN, sobreexpresados en la célula a partir de genes transferidos, los cuales impiden la unión de estas proteínas a sus verdaderos puntos de acción. Oligonucleótidos antisentido, que son hebras cortas de ARN químicamente modificado y no funcional, complementarias de las secuencias genéticas del VIH. La formación de parejas (“dúplex”) sentido: antisentido bloquea la traducción y promueve la degradación de los complejos de ARN inestables. Manejo de ribozimas, que son ARN con propiedades catalíticas. Al igual que los ARN antisentido, los ribozimas se unen a secuencias complementarias del ARN diana con la propiedad adicional de su actividad enzimática ribonucleasa, que rompe catalíticamente el ARN sustrato. Esto les exime de las limitaciones estequiométricas que afectan a los ARN antisentido. Además, no parecen inducir respuesta inmunológica. En el caso de los virus ARN, los ribozimas resultan particularmente interesantes, ya que pueden degradar al ARN genómico vírico antes de su integración, así como a los ARN mensajeros y al ARN genómico destinado al ensamblaje y la generación de nuevos viriones. Introducción en las células diana de genes que codifican anticuerpos de cadena única frente a proteínas del VIH, de manera que la expresión de tales anticuerpos neutraliza las proteínas víricas dentro de las células infectadas, incluso antes de que se produzca el ensamblaje del virus, tratándose pues de una verdadera “inmunización intracelular”. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 55 CAPÍTULO V ESTADO ACTUAL DE LA TERAPIA GÉNICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 5.1 LOGROS ALCANZADOS EN TERAPIA GÉNICA Probablemente, la conclusión más importante de los ensayos clínicos de terapia génica hasta el momento es que la transferencia génica a seres humanos es factible. La mayoría de estudios han demostrado que los genes pueden ser transferidos a individuos, tanto ex vivo como in vivo, y que todos los vectores utilizados han funcionado como se esperaba. FIGURA 50.- Terapia Génica In Vivo y Ex Vivo. Fuente:http://quimicosonador.wordpress.com/2012/02/08/deportistas-geneticamentemodificados/ Además, varios estudios han demostrado que genes terapéuticos transferidos a seres humanos mediante vectores retrovíricos, vectores adenovíricos y complejos plásmidoliposoma, pueden producir respuestas biológicas a partir del producto génico que generan. La mayoría de dichos estudios se han centrado en anomalías hereditarias monogénicas, donde el fenotipo biológico anormal podría corregirse si el producto génico normal se expresara de forma apropiada en el lugar adecuado. La experiencia de los estudios de marcaje ha mostrado que la transferencia génica a seres humanos puede aportar conocimientos importantes de biología humana al hacer posible el seguimiento de células genéticamente marcadas en el individuo receptor. En este sentido, se ha observado que la contaminación de médula ósea autóloga con células tumorales es bastante común, por lo que estudios actuales se están centrando en mejorar los métodos de limpieza para eliminar totalmente dichas células malignas. Otros estudios terapéuticos apoyan el concepto biológico de que la corrección mínima de un genotipo puede tener consecuencias significativas en el fenotipo. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 56 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Finalmente, teniendo en cuenta el número total de individuos que ha sido sometido a ensayos de transferencia génica, han sido muy pocos los efectos adversos. Además, éstos principalmente han sido debidos a la dosis y a la forma de administración de los vectores, como la inducción de inflamación en el epitelio pulmonar debido a la administración de vectores adenovíricos. 5.2 INCONVENIENTES QUE LIMITAN EL ÉXITO DE LA TERAPIA GÉNICA Algunos de los problemas surgidos en los ensayos de terapia génica son genéricos de dicha metodología, mientras que otros son específicos del vector de transferencia utilizado. La mayoría de estudios de terapia o transferencia génica se han visto afectados por resultados inconsistentes, con variaciones inexplicables entre individuos. Por ejemplo, en los ensayos de fibrosis quística, vectores adenovíricos y complejos plásmido-liposoma pudieron transferir el gen CFTR al epitelio respiratorio, pero su expresión se produjo solamente en menos del 5 % de las células diana y no se observó en todos los pacientes. Asimismo, en la mayoría de ensayos de marcaje de médula ósea realizados ex vivo, la transferencia génica se observó de manera intermitente. FIGURA 51.- La transferencia génica. Fuente: http://www.slideshare.net/oscarmalo/biologa-molecular-ing-gentica-biotecnologa-reprodasistida También ha habido varios ejemplos en los cuales las predicciones basadas en estudios de transferencia génica utilizando modelos animales no se han traducido en estudios seguros y eficaces aplicados a seres humanos. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 57 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA Por ejemplo, en los estudios realizados con vacunas antitumorales para intentar generar una respuesta inmunitaria antitumoral específica, no ha habido prueba concluyente de regresión de los tumores, contrariamente a los resultados obtenidos en modelos animales. Asimismo, existen problemas en la producción de vectores que habría que resolver antes que se puedan iniciar ensayos clínicos a gran escala. Se ha observado la generación de vectores retrovíricos y adenovíricos capaces de replicación cuando se producen los respectivos stocks para aplicarse clínicamente. También, la producción de stocks de complejos plásmido-liposoma se ha visto afectada por falta de reproducibilidad, agregación y contaminación con endotoxinas. Finalmente, la experiencia clínica acumulada hasta la fecha sugiere que todos los vectores utilizados para terapia génica necesitan mejoras, aunque cada uno en particular puede resultar relativamente adecuado para los tejidos a los cuales se ha dirigido. Las características que se han de mejorar en todos los vectores son: Un incremento en la eficiencia de transferencia génica. Un incremento en especificidad. La posibilidad de regulación de la expresión génica. La posibilidad de producción de grandes stocks de vector puro. Son también obstáculos específicos del tipo de vector utilizado el riesgo de mutagénesis por inserción en vectores retrovíricos, la inmunidad e inflamación desarrolladas por los vectores adenovíricos, y la ineficiencia de translocación del transgén al núcleo por los complejos plásmido-liposoma. No será posible encontrar el vector ideal, debido a la diversidad de aplicaciones humanas de transferencia génica; para cada una de ellas, el vector ideal tendrá que ser diferente. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 58 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA 5.3 PERSPECTIVAS FUTURAS El proyecto del genoma humano proveerá alrededor de 100.000 genes que podrán incluirse en vectores de expresión para terapia génica. Por lo tanto, el futuro de dicha terapia innovadora es prometedor. Sin embargo, en la actualidad se ensaya mayoritariamente la terapia génica ex vivo. FIGURA 52.-Genoma humano fuente:http://www.portaleureka.com/accesible/medicina/135-terapia-genica Este procedimiento utiliza tecnologías muy especializadas y es demasiado caro para aplicarse rutinariamente en cualquier centro médico. Para que la terapia génica humana tenga un impacto real en el área de la salud, será necesario desarrollar vectores que puedan ser administrados con seguridad y eficacia directamente a los pacientes, tal y como se ha conseguido con los fármacos actuales. El diseño de nuevos vectores (víricos, sintéticos o una combinación de ambos) comportará la posibilidad de actuar sobre tipos celulares específicos, la inserción o el mantenimiento de la información genética en un lugar seguro dentro del núcleo celular y la regulación mediante estímulos fisiológicos. Junto con los métodos de diagnóstico, la terapia génica también podrá aplicarse para prevenir estados patológicos al suministrar genes protectores antes que dichas enfermedades se manifiesten. Actualmente se encuentra en un período de implantación y experimentación clínica que incluye a más de 1.000 pacientes en todo el mundo, aunque todavía existen pocos resultados publicados. Conforme mejore la tecnología de la transferencia génica (hecho que se está produciendo con rapidez) y se entiendan mejor las características biológicas causantes de los procesos patológicos, será posible incorporar plenamente la terapia génica en la práctica clínica para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades humanas. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 59 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA PORCENTAJES DE ENSAYOS DE TERAPIA GÉNICA EN LA ACTUALIDAD FIGURA 53.- Ensayos de terapia génica por enfermedades. Fuente:http://es.wikipedia.org/wiki/Terapia_g%C3%A9nica FIGURA 54.- Ensayos de terapia génica por países. Fuente:http://es.wikipedia.org/wiki/Terapia_g%C3%A9nica FIGURA 55.ensayos de terapia según el vector utilizado. Fuente:http://es.wikipedia.org/wiki/Terapia_g%C3%A9nica COSTOS ECONOMICOS Es sensato preguntarse si la terapia génica será otra tecnología cara a medio plazo. Si se emplea en transplantes de médula ósea, en la terapia génica humana será trabajada intensamente y supondría unos considerables costes iniciales. Pero aun cuando nadie asigna un valor económico en el mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes curados, lo más seguro es que algún día la terapia génica costará considerablemente menos que la hospitalización repetitiva por enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis quística. La terapia génica se puede convertir en un método de cura bastante costoso, para pacientes que sufran alguna enfermedad genética causado por el defecto en un gen. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 60 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA En un futuro más lejano, las perspectivas para la terapia génica en humanos todavía no están claras. Pero si se rompiese el eslabón entre el transplante de médula ósea y la terapia génica, ésta se podría aplicar a un círculo de pacientes más extensos. Por ejemplo, si vectores específicos para un particular tipo de célula diana se pudiera desarrollar, la combinación vector/gen, quizá pueda ser administrada de forma intravenosa. A este nivel, si alguna vez se alcanza, la medicina estará en el umbral de una nueva era para el tratamiento de más de 3.000 desórdenes genéticos que afecten a nuestra especie. 5.4 CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GÉNICA La modificación del material genético de una célula afecta tanto a la célula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros potenciales del uso de un tratamiento que diseña premeditadamente cambios genéticos que son potencialmente propagables. Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genéticas de la línea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos son: MUTAGÉNESIS.- Todas las integraciones cromosómicas, aparte de los cambios homólogos, poseen el potencial de alteración de locis endógenos fortuitos y por lo tanto producir mutagénesis, que puede derivar en oncogénesis. Si realizamos la terapia génica en células somáticas nosotros no transmitiremos los genes manipulados en esas células somáticas a las futuras generaciones pero alteramos la línea genética del individuo. La intervención directa en las células somáticas difiere del tratamiento médico convencional sólo en que aquí hay una clara y directa conexión entre la terapia y la selección genética. En el caso de síndromes causados por locis dominantes el conjunto completo de genes está representado por los individuos afectados. Su éxito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamaño de este conjunto en la siguiente generación. Si los individuos llevan alelos no reproductivos, la frecuencia del gen en la población está mantenida por que ocurran nuevas mutaciones. En las enfermedades genéticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y dominante en el hombre. Como el número de afectados es mucho mayor (todos los machos que lleven el alelo se verán afectados) la influencia del éxito de la terapia en la frecuencia génica será también mayor. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 61 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA La modificación deliberada de la línea germinal tendría efecto sobre la estructura de la población sólo por una transformación genética a gran escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta ventaja selectiva. Un hecho preocupante sería la introducción de resistencia a una enfermedad patógena. Si sólo "los elegidos" son protegidos de la enfermedad podría existir la posibilidad de un gran cambio genético en la población por ello es ineludible preguntarse si: ¿Sería la terapia génica en la línea germinal realmente necesaria? La terapia génica somática, tiene un efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformación génica de la línea germinal puede sólo tener efectos sobre la descendencia aún no nacida. Esto por lo tanto no afectará al paciente que está siendo tratado. Con las posibilidades de investigación de prenatales de la preimplantación tanto como de la donación de esperma, óvulos y adopción es muy difícil ver como la intervención deliberada en la línea germinal puede ser éticamente justificable. FIGURA 56.- Genética. Fuente: http://www.terapiagenica.es/ Cómo avanzará la ciencia en pos de lograr nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas. Se nutrirá de la biología molecular y la genética. Habrá curas a la medida de cada paciente. Sin embargo, no se olvidará el rol básico de la prevención. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 62 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA CONCLUSIONES GENERAL Se efectuó una investigación de aspectos varios sobre el tema “Terapia Génica”, mediante la recopilación de información, y analices minucioso de la misma, lograr una visión global del contenido, el mismo que estoy segura que valdrá de guía y sustento para investigaciones futuras. ESPECIFÍCAS Se Exploraron aspectos generales acerca del tema, mediante una minuciosa investigación tanto de sus referencias históricas, requisitos, criterios y normas requeridas. Se distinguieron las modalidades terapia génica en función del tipo de célula diana, así como los tipos de T.G. según las estrategias utilizadas. Se describieron de manera puntualizada como se realiza la Trasferencia génica, estudiando los genes integrados y no integrados en los cromosomas, los métodos de transferencia genética y marcaje celular. Se conocieron distintas enfermedades en las que es posible el uso de T.G como alternativa para curarlas, pues sólo unas pocas han sido seleccionadas para ensayos clínicos. Se Evaluó el estado actual en el que se encuentra la Terapia génica, analizando distintos parámetros que puedan servir para examinar dicha situación. DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 63 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA BIBLIOGRAFÍA FUENTES DE LIBROS W. S. Klug, M.R. cunning y C.A. Spencer. Conceptos de Genética, 8ª ed. Pearson Educación, 2006. L. MASON. Ania. Lo esencial en Célula y Genética. 2aedicion. Elsevier science limited, Madrid-España 2004. FUENTES ELECTRÓNICAS ADENOSINA DEAMINASA (ADA). www.inmunodiagnostico.cl/noticias/2011/06/22/adenosina-deaminasa-ada/ APLICACIONES DE LA TERAPIA GÉNICA. http://www.uclm.es/profesorado/jjordan/pdf/review/12.pdf BIOLOGÍA MOLECULAR. http://www.slideshare.net/JhonHenryCeballosSalcedo/terapia-genica-9653198 CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DE DNA. http://lnx.futuremedicos.com/Revista_future/Articulos&Trabajos/Basi cas/bq/clonacion_DNA.htm GRÁFICOS. http://www.ortodoncia.ws/publicaciones/2011/images/171/3.gif MICROFOTOGRAFÍA DE CÉLULA DE GAUCHER. http://www.umm.edu/esp_imagepages/1450.htm TERAPIA GÉNICA. http://es.scribd.com/doc/8640169/Terapia-Genica TERAPIA GÉNICA. http://www.slideshare.net/lxis/terapia-genica TERAPIA GÉNICA. http://www.hvil.sld.cu/bvs/archivos/667_76terapia%20genica.pdf TERAPIA GÉNICA MEMORIA O ESPERANZA. http://www.slideshare.net/aliras/terapia-genica-memoria-o-esperanza TERAPIA GÉNICA, GENERALIDADES. http://www.sefh.es/bibliotecavirtual/fhtomo2/CAP06.pdf DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 64 UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CUENCA TERAPIA GENICA COMO TRATAMIENTO PARA LA INMUNODEFICIENCIA COMBINADA SEVERA HUMANA ﴾SCID﴿-X1, SOLUCION O PROBLEMA. http://www.javeriana.edu.co/Genetica/PDFDOC/Terapia%20Genica.pdf TIPOS DE TERAPIA GÉNICA. http://www.terapiagenica.es/wordpress/tag/terapia-genica/ TERAPIA GENICA/TERAPIA CELULAR EN HEMOFILIA. http://www.slideshare.net/aliras/terapia-genicaterapia-celular-en-hemofilia VECTORES VIRALES. http://www.unav.es/ocw/genetica/tema12-3-1.html DORIS PATRICIA BAUTISTA CALLE Página 65
