centro de investigacin y de estudios avanzados del

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE
PLANTAS
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
DESARROLLO DE TECNOLOGÍAS PARA LA
REGENERACIÓN IN VITRO Y TRANSFORMACIÓN
GENÉTICA DE MAGUEY (Agave tequilana Weber,
var. azul)
Tesis que presenta
KARLA KARINA VALENZUELA SÁNCHEZ
para obtener el Grado de
Doctora en Ciencias
en la Especialidad de
Biotecnología de Plantas
Director de Tesis:
Dr. Octavio Paredes López
Irapuato, Guanajuato, México
Junio 2006
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos en el
Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato, bajo la
asesoría del Dr. Octavio Paredes López.
DEDICATORIA
A Dios
A mis padres Socorro y Saúl
A mis hermanos Nidia y Saúl,
A mi novio Toño.
AGRADECIMIENTOS
.
Al Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Unidad Irapuato del
Instituto Politécnico Nacional.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y al Consejo de Ciencia y
Tecnología del Estado de Guanajuato por los apoyos recibidos durante la
elaboración de este trabajo.
Al Dr. Octavio Paredes López por haberme permitido formar parte de su equipo
de investigación, por su confianza, apoyo y preciados consejos durante la
realización de este doctorado.
Al Dr. Andrés Cruz Hernández por formar parte de mi comité de sinodales, por
sus provechosas aportaciones a la realización de este trabajo, por su ánimo y
constante apoyo.
Al Dr. Víctor Olalde Portugal por haber accedido a formar parte de mi comité de
sinodales, por su incondicional apoyo para la realización de esta tesis, por sus
atinados consejos y por abrirme las puertas de su grupo.
A los Drs. Ángel Gabriel Alpuche Solís y Juan T. Frías Hernández por acceder
a formar parte de mi comité de sinodales y por los útiles consejos y
observaciones en la revisión de este trabajo.
A la Dra. Male Valverde por su ayuda en las revisiones de los trabajos, por su
ánimo y apoyo.
A la M.C. Rosalinda Serrato F. por su paciencia y apoyo imprescindible en la
técnica de propagación in vitro.
Al Dr. Luís Parra Negrete del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad
de Guanajuato y al Ing. Manuel Cárdenas del rancho el “El Pachon”, Zapopan,
Jal., por proporcionar amablemente las plantas de Agave tequilana.
A Raúl Juárez y Teresa García, por su valiosa colaboración en la realización
del proyecto y a los estudiantes de verano Fausto Luna, Sue Ureta y Saúl
Zañudo, por ese tiempo que fue de gran enseñanza para mi.
A la comunidad del CINVESTAV Irapuato por su apoyo y hacer llevadero el
tiempo de mi estancia.
A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología de Alimentos por su ayuda
y por hacer de mi estancia un tiempo agradable y al laboratorio de Bioquímica
Ecológica por el tiempo tan grato que conviví con ellos.
A mis amigos por tantos momentos inolvidables, gracias por su inigualable
amistad y por ser parte importante de mi vida.
CONTENIDO
Página
CONTENIDO
i
ÍNDICE DE TABLAS
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
viii
ABREVIATURAS
xii
RESUMEN
1
INTRODUCCIÓN
3
REVISIÓN DE LITERATURA
5
A. MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS
5
1. MEJORAMIENTO TRADICIONAL
5
2. MEJORAMIENTO POR INGENIERÍA GENÉTICA
6
a. Cultivo de tejidos vegetales
7
1) Organogénesis
7
2) Embriogénesis somática
9
3) Variación somaclonal
11
b. Transformación genética
12
1) Sistemas biológicos para la transferencia de genes
12
2) Sistemas físicos para la transferencia de genes
13
3) Marcadores de selección y genes reporteros
14
i
Página
B. MAGUEY: MODELO DE ESTUDIO
15
7. IMPORTANCIA DEL MAGUEY
16
a. Importancia cultural
16
b. Importancia ecológica
17
c. Importancia económica
18
2. Agave tequilana
18
a. Tequila
19
b. Plagas y enfermedades
21
c. Variabilidad genética
25
8. ANTECEDENTES
DE
MEJORAMIENTO
AGAVES
GENÉTICO
EN
26
OBJETIVOS
28
A. GENERAL
28
B. ESPECÍFICOS
28
MATERIALES Y MÉTODOS
29
A. MATERIALES
29
1. MATERIAL VEGETAL
29
2. VECTORES
29
3. CEPAS BACTERIANAS
29
B. MÉTODOS
34
1. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO IN VITRO
34
2. INDUCCIÓN DE EMBRIOGENESIS SÓMATICA
34
a. Producción de embriones
34
b. Germinación de embriones
34
ii
Página
3. ESTABLECIMIENTO DEL SISTEMA DE REGENERACIÓN
MEDIANTE ORGANOGÉNESIS INDIRECTA
36
a. Inducción y mantenimiento del estado de callo
36
b. Producción de brotes
37
c. Enraizamiento y aclimatación
37
4. DETERMINACIÓN
SELECTIVOS:
DE
LA
SENSIBILIDAD
KANAMICINA
A
AGENTES
(ANTIBIÓTICO)
Y
FOSFINOTRICINA (HERBICIDA)
5. ENSAYOS
DE
TRANSFORMACIÓN
37
VÍA
Agrobacterium
tumefaciens
42
a. Transferencia de plásmidos a cepas de Agrobacterium
42
b. Evaluación de la susceptibilidad del A. tequilana a la
infección por cepas silvestres de Agrobacterium
42
c. Evaluación de la expresión transitoria para la selección
de condiciones de transformación
45
1) Respuesta al tipo de daño en el tejido vegetal
45
2) Tipo de cultivo bacteriano y tiempo de exposición con
el explante
45
3) Tiempo de cocultivo
45
d. Ensayos de transformación estable
6. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA BIOBALÍSTICA
a. Purificación de plásmidos y preparación de partículas
46
46
46
b. Evaluación de la expresión transitoria para la selección
de condiciones de transformación
46
1) Medio osmótico
46
iii
Página
2) Presión
47
3) Distancia
47
4) Concentración de DNA
47
c. Ensayos de transformación estable
47
7. SELECCIÓN DE MATERIAL TRANSFORMADO
47
8. ANÁLISIS HISTOQUÍMICO
48
9. ANÁLISIS MOLECULAR DE MATERIAL TRANSFORMADO
48
a. Extracción de DNA
48
b. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
49
c. Análisis tipo Southern blot
50
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
51
A. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO in vitro
51
B. INDUCCIÓN DE EMBRIOGENESIS SÓMATICA
51
1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES
51
2. GERMINACIÓN DE EMBRIONES
51
C. SISTEMA
DE
REGENERACIÓN
VÍA
ORGANOGÉNESIS
INDIRECTA
52
1. INDUCCIÓN Y MANTENIMIENTO DEL ESTADO DE CALLO
52
a. Producción de brotes
59
b. Enraizamiento y aclimatación
64
D. SENSIBILIDAD DE EXPLANTES DE A. tequilana A AGENTES
SELECTIVOS
64
1. KANAMICINA (ANTIBIÓTICO)
64
2. FOSFINOTRICINA (HERBICIDA)
67
iv
Página
E. ENSAYOS
DE
TRANSFORMACIÓN
VÍA
Agrobacterium
tumefaciens
1. INCORPORACIÓN
68
DE
PLÁSMIDOS
EN
CEPAS
DE
68
Agrobacterium
2. SUSCEPTIBILIDAD DEL A. tequilana A LA INFECCIÓN DE
CEPAS SILVESTRES DE Agrobacterium tumefaciens
73
3. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE TRANSFORMACIÓN
74
F. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA BIOBALÍSTICA
82
1. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE TRANSFORMACIÓN
82
G. SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES
93
H. ANÁLISIS MOLECULARES
97
1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
2. ANÁLISIS TIPO SOUTHERN BLOT
97
CONCLUSIONES
102
PERSPECTIVAS
105
BIBLIOGRAFÍA
106
APÉNDICE
121
v
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla
1. Plásmidos
Página
utilizados
en
ensayos
de
transformación
vía
Agrobacterium tumefaciens
30
2. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación mediante
Biobalística
31
3. Composición de medios de cultivo MS1 y MS-L2 en (mg/l)
35
4. Evaluación de la inducción del estado de callo en diferentes tejidos
de Agave tequilana
38
5. Evaluación de zeatina como fuente de citocininas en la inducción
del estado de callo en segmentos meristematicos de Agave
tequilana
39
6. Evaluación del efecto de las auxinas 2,4-D y NAA en el
mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana
41
7. Evaluación de la sensibilidad de explantes de Agave tequilana al
antibiótico kanamicina y al herbicida fosfinotricina (ppt)
43
8. Evaluación de la sensibilidad de plantas de Agave tequilana al
herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA)
44
9. Organogénesis en explantes obtenidos a partir de diferentes
fracciones de meristemo
58
vi
Tabla
Página
10. Capacidad de regeneración de callos de A. tequilana obtenidos de
los tratamientos de mantenimiento de callos
65
11. Efectos de la exposición al medio osmótico (sorbitol 15%) en la
expresión transitoria del gen gus A
87
12. Efectos de la distancia y presión en explantes de Agave tequilana
bombardeados con el plásmido pAHC25 utilizando el sistema de
baja presión
88
13. Efecto de la concentración de DNA de los plásmidos pAHC25 y
pBI426 en la expresión transitoria del gen gus A
89
14. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes presiones y
distancias utilizando el sistema de alta presión
vii
91
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura
Página
1. Esquematización de la anatomía del Agave tequilana
20
2. Producción de tequila en México expresado en millones de litros
22
3. Consumo de miles de toneladas de Agave tequilana en México
para la producción de tequila
23
4. Exportación de tequila en México expresado en millones de litros
24
5. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de
transformación vía Agrobacterium
32
6. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de
transformación vía biobalística
33
7. Esquematización de los explantes obtenidos a partir de cortes en
piñas de plántulas in vitro, utilizados en los experimentos de
determinación de tamaño de explante mínimo regenerable
40
8. Establecimiento del cultivo in vitro de Agave tequilana a partir de la
ropagación de segmentos de la región meristemática de la piña
53
9. Producción de embriones a partir de segmentos de hojas de
plántulas in vitro de A. tequilana
54
10. Respuesta a la inducción del estado de callo en tejidos de hoja y
piña de A. tequilana, utilizando diferentes fuentes de citocininas
viii
56
Figura
Página
11. Formación de callos en explantes obtenidos a partir de diferentes
cortes de meristemos de plántulas in vitro de A. tequilana
57
12. Crecimiento de callos de A. tequilana, en respuesta a los
tratamientos con 2,4-D solo y en combinación con BAP
60
13. Crecimiento de callos de A. tequilana, en respuesta a los
tratamientos con NAA solo y en combinación con BAP
14.
Apariencia de callos generados en los tratamientos de
mantenimiento de callos
15.
61
62
Regeneración completa de A. tequilana vía organogénesis
indirecta a partir de segmentos de tejido meristematico (piñas)
66
16. Sensibilidad de callos de A. tequilana al antibiótico kanamicina
69
17. Efecto en hojas de tabaco a diferentes concentraciones del
herbicida fosfinotricina (ppt), adicionado en el medio (mg/l)
70
18. Sensibilidad de callos de A. tequilana al herbicida fosfinotricina
(ppt)
71
19. Sensibilidad de plantas de A. tequilana al herbicida fosfinotricina
en su forma comercial (BASTA)
72
20. Amplificación del fragmento del gen nptII presente en los
plásmidos P35SGUS y pBIN m-gfp5-ER en cepas LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens después de la transformación
ix
75
Figura
Página
21. Susceptibilidad de plantas de A. tequilana a la infeccion de natural
Agrobacterium tumefaciens
76
22. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tipos de
daño
79
23. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tiempos de
exposición con el cultivo bacteriano
80
24. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes tiempo de cocultivo
de A. tumefaciens con callos de A. tequilana
25. Expresión del gen gus A en explantes de tabaco (sistema control)
81
86
26. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana
bombardeados con el sistema de baja presión
90
27. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana
bombardeados con el sistema de alta presión
92
28. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema
baja presión)
95
29. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema
de alta presión)
96
30. Amplificación del gen npt II en materiales de A. tequilana
regenerados en medio de selección
99
31. Amplificación del gen gus A en materiales de A. tequilana
regenerados en medio de selección
100
x
Figura
Página
32. Análisis Southern blot con el gen gus A en el DNA de callos
desarrollados en medio de selección
xi
101
ABREVIATURAS
°C
Grado centígrado
µg
Microgramo
µl
Microlitro
µM
Micromolar
2,4-D
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
ANOVA
Análisis de varianza
BA
Benciladenina
BAP
Bencilaminopurina
C.R.T.
Consejo regulador del tequila
CAM
Metabolismo ácido de crasuláceas
cat
Cloranfenicol acetiltransferasa
CFB
Capacidad de fromación de brotes
cm
Centímetro
cm2
Centímetro cuadrado
CTV
Cultivo de tejidos vegetales
cv
Coeficiente de variación
dms
Diferencias mínimas significativas
DNA
Ácido desoxirribonucleico
DO
Densidad óptica
FD
Factor de dilución
gfp
Proteína verde fluorescente
gus A
β-glucuronidasa
xii
hph
Higromicina fosfotransferasa
hr
Horas
IAA
Ácido 3-Indolacético
IBA
Ácido 3-Indolbutírico
kb
Kilobase
KIN
Cinetina
lux
Luciferasa
l
Litro
M
Molar
mg
Miligramo
min
Minuto
mm
Milímetro
mM
Milimolar
MS
Medio de cultivo Murashige y Skoog (1962)
MS1
Medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) modificado
NAA
Ácido naftalenacético
nm
Nanómetros
nos
Nopalino sintasa
nptII
Neomicina fosfotransferasa
pb
Pares de bases
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
pH
Potencial de hidrogeno
ppt
Fosfinotricina
psi
Libra por pulgada cuadrada
RAPDs
Amplificación al azar de DNA polimórfico
xiii
T-DNA
DNA de transferencia
TMCA
Tasa de media de crecimiento anual
v
Volumen
X-Gluc
Ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico
xiv
I. RESUMEN
Agave tequilana Weber cv. Azul es la especie de agave más cultivada porque
es la fuente de carbohidratos y componentes químicos minoritarios para la
producción de la bebida alcohólica llamada “tequila”, distintivo de la cultura
mexicana. Debido a la forma de cultivar durante años el agave, mediante
hijuelos y sin permitir floración, su diversidad genética es muy limitada, lo que
ha generado clones más vulnerables a nuevos y más agresivos patógenos,
esto tiene como consecuencia la incidencia de enfermedades en grandes áreas
geográficas. Tomando en cuenta este problema, en este trabajo se desarrolló
un sistema de regeneración vía organogénesis indirecta en Agave tequilana.
Segmentos de hoja y tejido meristemático de la cabeza central, también
llamada piña, fueron evaluados como fuente de explante. Un tamaño mínimo
de explante regenerable con alta capacidad de formación de brotes (19.5 CFB),
fue obtenido a partir de un corte transversal en piñas de plántulas in vitro en
medio MS1, sin embargo en este medio la brotación se da a la par de la
formación de callos sin poder utilizarlos para experimentos de transformación
por lo que para el cultivo de callos, la mejor respuesta se encontró utilizando
ácido naftalenacético (NAA) como fuente de auxina dando 4.7 de CFB, la cual
fue contrastante comparada con el uso de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D). La capacidad de regeneración de los callos fue mantenida por al menos
tres meses. Los brotes regenerados fueron enraizados en medio MS1 libre de
hormonas y aclimatados en invernadero con un 100% de sobrevivencia.
También fueron evaluadas condiciones de transformación genética mediante
los sistemas de Agrobacterium tumefaciens y biobalística. Para A. tumefaciens
fueron determinadas como condiciones óptimas de transformación: daño con
aguja de 13 mm, cultivo bacteriano líquido, 10 min de exposición del tejido con
el cultivo bacteriano y 4 días de cocultivo. Para biobalística fueron
seleccionadas para la transformación con el sistema de baja presión, 4 h de
exposición al medio osmótico, 80 psi de presión y 20 cm de distancia y para
alta presión se observó mejor respuesta a 1350 psi y 12 cm de distancia. El
material de A. tequilana transformado por biobalística con el plásmido pBI426,
fue regenerado en selección y se comprobó su transformación estable
1
mediante análisis tipo PCR y Southern blot con una eficiencia de
transformación de 0.6 para el sistema de baja presión y 1.66 para alta presión.
2
II. INTRODUCCIÓN
Es indiscutible el papel tan importante que las diferentes especies vegetales
han jugado desde siempre en el sustento del género humano, lo que ha llevado
al hombre a una constante búsqueda para el mejoramiento de los cultivos por
medio de la transferencia de material genético, usando métodos tradicionales y
de ingeniería genética. Debido a que el mejoramiento tradicional es un proceso
lento y laborioso, la ingeniería genética ha cobrado mayor interés porque ha
provisto de alternativas para el mejoramiento de
cultivos a través de la
manipulación de genes propios o exógenos (transformación genética) (Jauhar,
2001). La capacidad de introducir y expresar diversos genes en plantas fue
descrita por primera vez en tabaco en 1984, y se ha venido extendiendo en
mas de 120 especies en al menos 35 familias, que hasta el 2004 representaba
81
millones
de
hectáreas
concentradas
principalmente
en
América
correspondientes a un 90% del área global (Birch, 1997; Eizaguirre y col.,
2006). Los sistemas de transformación más utilizados son: el bombardeo de
micropartículas, también llamado biobalística y el mediado por la bacteria
Agrobacterium tumefaciens (Finer y col., 1999; Valentine, 2003).
El maguey azul (Agave tequilana Weber var. azul) es uno de los agaves más
cultivados en México, ya que es el único entre cientos de especies dentro del
género que se considera apropiado y autorizado para producir la bebida
alcohólica llamada “tequila”.
Esto se debe a sus altas concentraciones de
inulina y a su bajo contenido en fibras, además de otros componentes químicos
que contribuyen a darle un peculiar aroma y sabor a esta bebida. Actualmente
la industria tequilera presenta diversos problemas, los cuales deben ser
tratados de manera inmediata ya que la tendencia en el consumo de tequila
continúa a la alza. Entre algunos de los problemas agronómicos del agave se
encuentran los siguientes: mejoramiento genético de difícil aplicación,
problemas fitosanitarios y diversidad genética limitada (Gil-Vega, 1997).
En la bibliografía son escasos los trabajos de mejoramiento genético
reportados para el género Agave. Utilizando técnicas de mejoramiento
tradicional las cuales son difíciles de aplicar en este tipo de plantas, solo se
reporta la obtención del híbrido diploide 11648, producto de una cruza entre A.
3
angustifolia X A. amaniensis y una retrocruza con A. amaniensis. (Robert y
col., 1992).
En lo que respecta al cultivo de tejidos, se han reportado diferentes trabajos en
varias especies del género como Agave victoria-reginae, A. sisalana, A.
fourcroydes, A. parrasana y A. cantala (Robert y col., 1987; Binh y col., 1990;
Rodríguez-Garay y col., 1996; Nikam, 1997; Santacruz-Ruvalcaba y col., 1999;
Hazra y col., 2002; Martínez-Palacios y col., 2003; Nikam y col., 2003), todos
ellos enfocados principalmente a la propagación masiva con fines industriales y
de conservación, de igual manera Robert y col. (1992) reportan un sistema de
regeneración en nuestra especie de interés Agave tequilana.
A pesar de existir sistemas de propagación reportados en diferentes especies
de agave incluyendo la especie A. tequilana, ninguno de estos fue desarrollado
para ser usado en programas de mejoramiento genético, ya sea de forma
directa, induciendo variación genética mediante la manipulación del cultivo in
vitro o indirecta, como fuente de explante en sistemas de transformación
genética. En este sentido solo se reporta la tesis realizada por Santacruz
Ruvalcaba en el 2001, donde establece un sistema de transformación mediante
biobalística en callos embriogénicos de Agave tequilana.
Tomando en cuenta que el cultivo de agave azul presenta grandes problemas,
que la industria tequilera demanda alternativas para hacerles frente y que el
uso de herramientas de ingeniería genética son una buena opción para el
mejoramiento vegetal además de la falta de trabajos realizados con esta
finalidad, se planteó el establecer protocolos de transformación genética
basándonos en los sistemas de biobalística y/o Agrobacterium tumefaciens,
además de desarrollar un sistema de regeneración in vitro vía organogénesis
indirecta con cultivo de callos, que sirvió como fuente de explante para el
establecimiento de dichos protocolos. Este trabajo sentará las bases para el
desarrollo de programas de mejoramiento genético en A. tequilana, además de
servir como punto de partida para trabajos similares en otras especies
importantes de agave.
4
III. REVISIÓN DE LITERATURA
A. Mejoramiento genético de plantas
A través de los siglos el hombre ha explotado diferentes especies vegetales
con el objetivo de satisfacer varias de sus necesidades básicas (alimentación,
vestido, etc.), lo que lo ha llevado a tratar de mejorar los cultivos con el fin de
conferirles características que permitan cubrir dichas necesidades. El
mejoramiento comúnmente se lograba de forma tradicional, como ejemplo
podemos mencionar el caso de la explotación del vigor híbrido en la producción
de granos de maíz, de sorgo y de mijo durante el periodo de 1965-1990 en el
que la producción tuvo un incremento extraordinario. Actualmente, con la
aparición de nuevas herramientas de ingeniería genética, las técnicas del
mejoramiento de plantas
se han hecho más sofisticadas facilitando la
introducción de genes foráneos a los cultivos en menor tiempo (Jauhar, 2001).
En los últimos 15 años, el desarrollo de nuevas técnicas biotecnológicas de
transferencia directa de genes ha añadido nuevas dimensiones a los
programas de mejoramiento de plantas, como casos sobresalientes podemos
hablar del desarrollo de cultivos con insecticidas en maíz, soya y algodón
(resistentes a plagas), papayas resistentes a virus, plantas tolerantes a
herbicidas, así como el desarrollo del “golden rice” (arroz que produce vitamina
A y hierro), además es importante mencionar que las nuevas tendencias
involucran introducción de genes en cloroplastos para incrementar la cantidad
de proteína recombinante y evitar el flujo génico. (Tennant y col., 1994; Ye y
col., 2000; Jauhar, 2001; Lutz y col., 2001).
1. Mejoramiento tradicional
El mejoramiento tradicional de plantas ha sido usado empíricamente durante
siglos por el hombre sin conocer las bases genéticas. Dicho mejoramiento
consiste en un conjunto de técnicas de selección y cruza de individuos con
rasgos deseables para obtener cultivos con mejores características agrícolas.
El tiempo necesario para transferir una característica deseable a un cultivo
depende de la especie (ciclo de vida), del origen del gen y de la distancia
evolutiva entre el cultivo que se desea mejorar (filogenia), por lo que se hace
un proceso laborioso y lento. Transferir un gen de interés por métodos
5
tradicionales entre plantas emparentadas podría tomar de 5 a 10 años
(hablando de cultivos de ciclo corto), si hablamos de plantas lejanas
filogenéticamente podría tardar entre 10 y 15 años o más (si es que es posible),
además los probables problemas de fertilidad antes y después de la hibridación
son obstáculos considerables (Jauhar, 2001).
El mejoramiento tradicional implica combinaciones de información genética a
nivel cromosómico, ya sea que se transfiera una parte de algún cromosoma
específico, parte del material cromosómico o el grupo de cromosomas
completo,
resultando
en
un
enfermedades por ejemplo).
cultivo
superior
(resistente
a
plagas
o
De cualquier modo, la transferencia de
información genética por métodos tradicionales es una transferencia “masiva”
por medio de la cual se incorporan genes que no son de interés e incluso
genes que resultan indeseables revelando así que es un proceso “vagamente”
dirigido (controlado).
2. Mejoramiento por ingeniería genética
El desarrollo de técnicas de ingeniería genética permite llevar a cabo procesos
de inserción de un gen o genes bien caracterizados dentro de células
regenerables
(animal,
vegetal
o
bacteriana)
y
subsecuentemente
la
recuperación de individuos fértiles con dichos genes integrados en el genoma.
En el caso específico del mejoramiento de plantas, estas tecnologías pueden
conferir nuevas características (resistencia a agentes tóxicos, tolerancia a
factores ambientales, resistencia a plagas y enfermedades, etc.), así como
ayudar a resolver preguntas de la regulación de la expresión genética (LópezMeyer y col., 1996).
Según Birch (1997), los requerimientos esenciales de un sistema de
transferencia de genes para poder producir plantas transgénicas son:
•
Disponibilidad de un tejido blanco que incluya células competentes para
la regeneración de plantas.
•
Un método para introducir DNA en células regenerables.
•
Un procedimiento de selección y regeneración de plantas transformadas
con una frecuencia satisfactoria.
6
Para cumplir exitosamente con los requerimientos anteriormente descritos se
han
desarrollado
diferentes
herramientas
de
cultivo
de
tejidos,
de
transformación y obviamente de selección, descritas de forma resumida en los
siguientes puntos.
a. Cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales (CTV), se basa principalmente en que desde
cualquiera de las partes que componen una planta (células, tejidos u órganos),
mediante una manipulación bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas
se puede llegar a la formación de un individuo completo (Núñez-Palenius y
Ochoa Alejo, 1999). Este fenómeno de regeneración somática en las plantas
reside en la totipotencia que poseen las células que las conforman, es decir,
que cualquier célula posee la información genética necesaria para formar un
nuevo individuo. Para llegar a establecer un cultivo de tejidos se deben tomar
en cuenta los siguientes puntos: el tipo de explante, el medio de cultivo y las
condiciones del cultivo propiamente (asepsia, temperatura, fotoperíodo, luz y
humedad). Se le llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido vegetal
que se usa para la regeneración de la planta.
El medio de cultivo debe
componerse principalmente por elementos minerales (macro y micronutrientes),
compuestos orgánicos como vitaminas, fitorreguladores y fuentes de carbono
(Sutter, 1996). Los medios de cultivo de uso más común son el MS (Murashige
y Skoog, 1962), el LS (Linsmaier y Skoog, 1965) y el B5 (Gamborg y col.,
1968); también existen medios de uso específico según el objetivo del cultivo y
la vía de regeneración elegida que son modificaciones de los arriba
mencionados. Existen dos procesos (vías) de regeneración in vitro:
Organogénesis y Embriogénesis somática.
1). Organogénesis
La organogénesis se define como el desarrollo de órganos de novo a partir de
tejidos meristemáticos o no meristemáticos cultivados in vitro. Esta vía de
regeneración consiste en la formación de órganos a partir de primordios
producto de una desdiferenciación celular. Las células que fungen como
progenitores son estimuladas para que se lleve a cabo de forma acelerada una
7
serie de divisiones celulares que tienen como consecuencia la formación de
un meristemoide (Schwarz y Beaty, 1996; Núñez-Palenius y Ochoa-Alejo,
1999). Los meristemoides son caracterizados como agregados de células con
características similares a las células meristemáticas y que en un principio
cuentan con la plasticidad necesaria para diferenciarse en primordios (brote,
raíz) (Schwarz y Beaty, 1996).
Se considera que en la propagación in vitro vía organogénesis se presentan
dos eventos, el primero consiste en el crecimiento y desarrollo de brotes a
partir de los meristemos regenerados, seguido del segundo evento que es la
formación de novo de un meristemo radicular. La organogénesis puede ser
indirecta o directa, la diferencia entre estos dos eventos radica en la presencia
o ausencia respectivamente de un estado de callo (tejido no diferenciado)
durante el desarrollo de las diferentes etapas que conforman esta vía de
regeneración. La organogénesis indirecta involucra una etapa intermedia de
formación de tejido calloso durante el desarrollo de todos los eventos
involucrados:
Explante
Callo
Meristemoide
La formación de órganos de novo
Órgano (primordio)
vía organogénesis indirecta puede
incrementar la posibilidad de introducir variación en la constitución cromosomal
de las células en el estado de callo y de aquí también la posibilidad de
variaciones fisiológicas o morfogénicas en los órganos producidos, este tipo de
variación ha sido llamada variación somaclonal (Schwarz y Beaty, 1996).
La organogénesis directa tiene lugar en el explante original, evitando el paso de
callo y llevando a cabo la siguiente secuencia:
Explante
Meristemoide
Órgano (primordio)
Debido a que en esta vía no se lleva a cabo la formación de un tejido calloso,
las células del explante tienen la capacidad de actuar como precursores
directos del nuevo primordio. Tanto en la organogénesis indirecta como en la
directa se han definido 4 etapas producidas por la fase de desdiferenciación,
éstas son: la competencia, la inducción, la determinación, y finalmente después
8
de determinado el tejido, ocurre la diferenciación hasta la formación del nuevo
órgano (Schwarz y Beaty, 1996).
La organogénesis es altamente influenciada por fitohormonas, considerándose
de manera general que una relación alta de auxinas:citocininas induce este
proceso.
2). Embriogénesis somática
Desde la primera descripción de embriogénesis somática por Steward (1958) y
Reinert (1959), este sistema de regeneración ha sido ampliamente usada como
herramienta en el estudio del desarrollo de plantas (Zimmerman, 1993), para la
propagación clonal y el desarrollo de tecnologías para el mejoramiento de
plantas a través de la genética celular somática y de la transformación
genética.
Se le llama embriogénesis somática a la capacidad que tienen ciertas células
para formar embriones bajo condiciones específicas de cultivo in vitro, y
mediante un proceso similar a la embriogénesis cigótica. Esta vía de
regeneración es una de las pruebas más notables de la totipotencia celular
(Pérez y col., 1999). La embriogénesis somática puede ser dividida en las
siguientes etapas:
1. Inducción. Es el proceso de conversión de una célula somática a una célula
proembriongénica.
Se considera
que los factores determinantes para que
suceda este proceso son: genotipo, grado de diferenciación de las células del
explante, fitohormonas (auxinas) y el aislamiento celular.
2. Histodiferenciación. En esta etapa las masas de células proembriogénicas se
diferencian
formando
embriones
somáticos
mediante
una
división
y
diferenciación celular simultáneas. Durante esta etapa los embriones somáticos
pasan una serie de estadios intermedios muy similares a los que ocurren en la
embriogénesis cigótica.
corazón y
En las dicotiledóneas estos estadios son: globular,
torpedo, mientras que en las monocotiledóneas son: globular,
coleoptilar y escutelar.
9
3. Maduración. Es la fase de maduración de un embrión somático para que
adquiera la capacidad de germinar, ocurre básicamente una elongación celular
sin división.
4. Germinación. Es el proceso de elongación y reactivación metabólica de un
embrión somático maduro para convertirse en una plántula.
Debido a la naturaleza independiente de los embriones somáticos, esta vía de
regeneración in vitro tiene algunas ventajas:
•
Se pueden producir grandes cantidades de embriones somáticos.
•
Escalar el sistema de producción en un cultivo en suspensión es
relativamente fácil
•
La manipulación de los embriones producidos puede hacerse de
forma independiente, pues representan una autonomía con
respecto al tejido madre.
•
Es posible inducir la latencia en los embriones somáticos
maduros.
•
Pueden ser encapsulados para ser utilizados como semillas
sintéticas.
La embriogénesis somática se puede llevar a cabo de dos formas, cuando los
embriones somáticos se desarrollan a partir de células individuales dentro de
un explante (embriogénesis directa) y cuando la diferenciación de los
embriones es precedida por la proliferación de un tejido calloso (embriogénesis
indirecta) (Witjaksono, 1997).
Para que se lleve a cabo el proceso de embriogénesis directa las células
necesitan
solamente
un
determinadas y necesitan
medio
básico,
se
encuentran
previamente
sólo condiciones permisivas para expresar su
capacidad morfogénica, estas células se conocen como predeterminadas.
Aunque este proceso no requiere reguladores de crecimiento, la embriogénesis
se puede estimular por auxinas que actúan sobre algún tipo de células que
están presentes en el explante al tiempo de la selección del tejido; se ha
sugerido que estas células están reprimidas in vivo y cuando son extraídas de
la planta se liberan de esta inhibición, expresando su potencial morfogénico
(Cruz-Hernández, 1998). Durante el primer paso de la embriogénesis somática
10
indirecta es indispensable obtener un tejido calloso o bien una suspensión
celular embriogénica a partir de la cual se obtendrá la diferenciación de los
embriones somáticos en el segundo paso. Para que se lleve a cabo la
inducción se requiere de medios más complejos y es dependiente de la
presencia de reguladores de crecimiento en el medio, se sabe que la
embriogénesis somática indirecta es inducida normalmente por auxinas (CruzHernández, 1998; Pérez y col., 1999).
Los embriones somáticos tienen la capacidad de formar embriones
secundarios, a este fenómeno se le llama embriogénesis repetitiva. Para que
el proceso
de repetición ocurra es necesario que se suprima el desarrollo
independiente, esto ocurre en presencia de auxinas, originando que los
embriones no crezcan o maduren, las células continúan dividiéndose y pueden
aumentar de tamaño o dividirse en embriones adicionales (Cruz-Hernández,
1998).
Algunos de los factores que pueden influir en el establecimiento de la
embriogénesis repetitiva son el nitrógeno inorgánico (amonio y bajas
concentraciones de nitrato) y el nitrógeno orgánico (glutamina, prolina).
Un sistema de regeneración eficiente y confiable es indudablemente una
herramienta imprescindible para llegar a desarrollar sistemas de transformación
genética exitosos.
3). Variación somaclonal
La investigación en el cultivo de tejidos vegetales y su subsecuente
regeneración de plantas y progenie ha revelado la presencia de variaciones
genéticas inducidas por el cultivo in vitro (Phillips, y col., 1994). La variación
somaclonal es una manifestación de la influencia epigenética o cambios en el
genoma de células vegetativas en diferenciación, inducida por las condiciones
del cultivo de tejidos (Larkin y col., 1981; Muller y col., 1990). Este tipo de
variaciones se presentan como anormalidades citológicas, mutaciones
fenotípicas, que pueden ser cualitativas y cuantitativas, y cambios en la
secuencia, activación y silenciamiento génico. La variación somaclonal
depende principalmente de la fuente del explante, la edad del cultivo, el uso de
agentes mutagénicos y de la presión de selección aplicada a los cultivos
(Skirvin y col., 1994). Cualquier cambio inducido por las condiciones del cultivo
11
in vitro se espera que generen plantas estables que lleven características de
interés heredables, sin embargo, aunque estos cambios al azar no son
deseables en los experimentos de transformación genética, en algunas
ocasiones pueden producir plantas con ventajas agronómicas (Soniya y col.,
2001).
b. Transformación genética
Para llevar a cabo la introducción de genes foráneos a células mediante
manipulación directa se han establecido diferentes sistemas que se han
agrupado en dos modalidades, sistemas biológicos y sistemas físicos.
1). Sistemas biológicos para la transferencia de genes
Los sistemas biológicos de transformación son los que utilizan algún organismo
o material biológico como vector, tales como virus o bacterias. En este tipo de
sistemas podemos encontrar los que utilizan virus vegetales y dos basados en
bacterias (Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes) (LópezMeyer y col., 1996).
El método biológico de transformación más usado es el de Agrobacterium
tumefaciens, bacteria Gram negativa presente en suelos, de metabolismo
aerobio, fitopatógena causante de la enfermedad llamada “agalla de la corona”
que afecta a muchas especies de dicotiledóneas. Esta enfermedad se
caracteriza por la formación de tumores en el tejido vegetal atacado;
específicamente, el agente responsable de la formación de estos tumores es
un megaplásmido presente en la bacteria llamado Ti (140-335 kb). Durante la
infección, una pequeña porción del DNA del plásmido Ti (15-30 kb) llamada TDNA, es transferido al núcleo de la célula vegetal donde se inserta por
recombinación ilegítima en el DNA nuclear, de esta manera el T-DNA se
mantiene estable en el genoma de las células transformadas, y es transferido a
la progenie en forma Mendeliana (Hooykaas, 1995; López-Meyer y col., 1996).
El T-DNA lleva genes que codifican para varias enzimas involucradas en la
síntesis de reguladores de crecimiento como auxinas y citocininas, así como en
la síntesis de otros compuestos llamados opinas. Los reguladores de
crecimiento generados por la introducción de dichos genes son los causantes
12
del crecimiento desmedido observado en los tumores; mientras que las opinas
participan como fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo de la bacteria
dentro de la planta (Hooykaas, 1995; López-Meyer y col., 1996). Los genes
responsables de la transferencia del T-DNA se encuentran dentro del plásmido
Ti y son llamados genes de virulencia (genes vir). Para que Agrobacterium
lleve a cabo la infección requiere que el tejido vegetal se encuentre herido ya
que los genes vir son inducidos por compuestos fenólicos que se desprenden
de las células dañadas. Las únicas regiones del T-DNA que son absolutamente
necesarias para la transferencia e integración dentro del genoma de la planta,
son
pequeñas secuencias repetidas de 25 pb localizadas en los bordes
(López-Meyer y col., 1996).
Dentro de la región conocida como vir o de virulencia se encuentran
codificados los genes virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH, cada uno de estos
genes cumple diferentes funciones involucradas en el proceso de transferencia
del T-DNA, por ejemplo virA y virG se encargan de regular de forma positiva la
expresión de los otros genes vir, por otro lado virC y virD participan en el
procesamiento y síntesis de la copia del T-DNA, mientras que virB y virE están
involucrados en la formación de los elementos necesarios para facilitar el
movimiento del T-DNA, por último virH posiblemente ayude a la supervivencia
de la bacteria en presencia de los compuestos bactericidas y bacteriostáticos.
2). Sistemas físicos para la transferencia se genes
Los sistemas de transformación basados en métodos físicos son aquellos que
realizan la transferencia de material genético por medio de agentes físicos
como presión y electricidad. Dentro de estos métodos podemos encontrar la
transformación de protoplastos, la microinyección y el más usado es el basado
en el bombardeo de micropartículas (biobalística).
El bombardeo de micropartículas o biobalística es un método rápido para
liberar DNA dentro de las células de la planta, tanto para ensayos de expresión
transitoria como para estudios de transformación estable. El principal beneficio
es que tejido vegetal intacto puede servir como blanco, además de que no está
limitado por el rango de hospederos, en contraste con otros métodos como
transformación de protoplastos y el uso de A. tumefaciens (Finer y col., 1992).
13
La técnica de biobalística se considera como un sistema versátil que ha tenido
aplicación en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y ha estimulado el
desarrollo de la ingeniería genética. El proceso puede ser definido como la
introducción de material genético (DNA purificado) dentro de células y tejidos a
través del disparo de microproyectiles a altas velocidades.
Este poderoso método de transformación está sujeto a un número de factores
limitantes, las consideraciones técnicas incluyen el tipo de pistola (alta o baja
presión), el tipo de partícula (oro o tungsteno) y las condiciones experimentales
(distancia y presión), además algunos tejidos pueden ser resistentes a la
penetración de las partículas debido a una cutícula fuerte, paredes celulares
lignificadas o superficies irregulares (Hunold y col., 1994).
Después de que las partículas cubiertas de DNA son introducidas existen
numerosos factores que influyen en la expresión génica y subsecuentemente
la recuperación de plantas transgénicas, estos factores están lógicamente
relacionados con la capacidad del tejido para servir como blanco en un proceso
de introducción de DNA, resultando en la expresión y eventual integración del
DNA foráneo. Para llevar a cabo una transformación exitosa vía bombardeo de
partículas, el plásmido (DNA) debe ser cuidadosamente diseñado y
seleccionado, además se debe poner especial atención
en la naturaleza,
estado y receptividad de los tejidos blancos (Finer y col., 1999).
3). Marcadores de selección y genes reporteros
El DNA plasmídico que se introduce en la célula por eventos de transformación
contiene la información necesaria que le permita crecer y seleccionarse en el
hospedero (bacteria), genes marcadores y el gen(es) de interés. Los genes
marcadores pueden ser de selección y/o reporteros. Un gen está propiamente
compuesto por el promotor, región codificante y terminador. Los intrones y las
regiones de unión son regiones de DNA adicionales que se usan para
potenciar, modular o estabilizar la expresión génica (Finer y col., 1999).
Se han diseñado varios marcadores de selección con genes que confieren
resistencia a antibióticos o a herbicidas, de tal forma que el uso del agente de
selección mata o retarda el desarrollo de las células de los tejidos no
transformados. Entre los marcadores destacan aquellos que confieren
14
resistencia a kanamicina (nptII), a cloranfenicol (cat),
a fosfinotricina (bar),
higromicina (hph), por mencionar algunos (Schrott, 1995). Elegir el marcador de
selección apropiado es un punto crítico para la recuperación exitosa de tejidos
transformados. El marcador de selección simplemente permite que las células
transformadas proliferen en presencia de un agente selectivo, mientras que las
no transformadas no logran crecer o multiplicarse; la resistencia de estos genes
actúa inactivando al agente selectivo o produciendo un tejido insensible al
mismo (Finer y col., 1999).
Por otro lado, es conveniente contar en nuestra construcción utilizada para
transformación, genes reporteros los cuales producen enzimas con actividad
detectable y cuantificable en las células transformadas y entre los más usados
podemos mencionar: gus A (β-glucuronidasa), nos (nopalina sintetasa), lux
(luciferasa) y gfp (proteína verde fluorescente), estos genes reporteros nos
permiten determinar si nuestro gen de interés se expresa en un tejido en
particular (Jefferson, 1987; Londsdale y col., 1996; Haseloff y col., 1997; CruzHernández, 1998). El gen gus A es ampliamente usado para monitorear no solo
la expresión transitoria de un gen, si no también la transformación estable; sin
embargo para visualizar la actividad de la enzima, el tejido debe ser sacrificado,
sin dejar de mencionar que algunos tejidos pueden presentar actividad tipo
GUS de manera constitutiva (Hansch, y col., 1995). El uso de los genes lux y
gfp como genes reporteros no requiere la destrucción del tejido para ser
visualizada su actividad, sin embargo su empleo se ve limitado por requerir
equipos especiales para su visualización y por traslaparse sus ondas de
excitación y emisión con la de otros componentes presentes en el tejido
(Londsdale y col., 1996; Haseloff y col., 1997).
A. Maguey: modelo de estudio
Maguey es el nombre usado en México para llamar a algunas de las diferentes
especies pertenecientes al género Agave. La gran mayoría de estas plantas
son de suma importancia en el ámbito cultural, económico y ecológico en
nuestro país.
Uno de los agaves más cultivados en México es el Agave
tequilana Weber var. Azul, es la única de 136 especies dentro del género que
se considera apropiada y autorizada para la producción de la bebida alcohólica
llamada “tequila” debido a su bajo contenido de fibras y altas concentraciones
15
de inulinas. Por otro lado es la única especia permitida por el Consejo
Regulador del Tequila a usarse en la zona de la denominación de origen con
fines de producción de Tequila.
El género Agave, término griego que quiere decir “admirable”, fue descrito por
Carlos Linneo en 1753, pertenece a la familia Agavaceae del orden de las
Liliales, clase Monocotiledoneae y división Angiospermae. En la actualidad se
le reconocen aproximadamente 136 especies, 26 subespecies, 29 variedades
y 7 formas (Gentry, 1982).
Las plantas de este género se adaptan a
condiciones de sequía y sobreviven a la falta de agua y a las temperaturas
altas porque son suculentas, tienen estomas hundidos, cutícula gruesa y un
ciclo fotosintético CAM (metabolismo ácido de las crasuláceas), así como por
producir raíces superficiales y ramificadas cuando hay lluvias ligeras (Nobel,
1988; Bye, 1994).
1. Importancia del maguey
a. Importancia cultural
Tomando en cuenta que el agave no es privativo de nuestro país y pese a que
la voz “Maguey” la trajeron los colonizadores de las Antillas, esta planta como
en ningún otro lugar de la tierra se ha integrado íntimamente al paisaje, como al
sentir y vivir de la gente en México (Muriá, 1994). En nuestra región y en
diferentes culturas se reconoció al maguey con diferentes nombres: Metl en
Náhuatl, Tocamba en Purépecha y Guabla en Otomí. Hablar de agaves es
hablar de México y su historia, es remontarse a un pasado prehispánico en el
que, gracias a la simbiosis hombre-agave, subsistieron las culturas del altiplano
de México en periodos de escasez de agua y alimento (Valenzuela, 1994).
El agave se ha aprovechado como papel, vallas, las hojas o pencas como tejas
en techumbres, tallos o quiotes como vigas, las fibras de las hojas en hilaturas
para tejidos, puntas de las pencas como clavos, punzones y agujas, zumo para
licor del cual se hace vino, vinagre, miel, azúcar, algunos de los cuales se les
atribuyen propiedades medicinales, además de que fueron usadas en rituales y
sacrificios como fermentos bebidos sólo por una élite de sacerdotes y nobles.
El uso de los agaves alcanzó su mayor intensidad durante el florecimiento de la
cultura Azteca, la cual se conoce por algunos investigadores como la cultura
16
del maguey (Goncalves de Lima, 1956; Gentry, 1982). La importancia de estas
plantas los llevó a deidificarlas bajo la representación de la diosa Mayahuel en
los códices mexicanos (Goncalves de Lima, 1956). Los habitantes de aquella
época consideraban que el maguey era una planta de nutrimento principal.
Los agaves se diversificaron por el territorio mexicano gracias a la migración de
las etnias, adaptándose a los diferentes ambientes (Gentry, 1982). Con la
conquista, la amplia gama de usos se redujo y los fermentos fueron destilados
para obtener bebidas alcohólicas llamadas aguardientes vinos de “mezcal” o
“mezcales” (Valenzuela, 1994).
Desde la colonia hasta el periodo independiente, sobrevivieron por mucho
tiempo la obtención de fibras a gran escala con el henequén y el auge de las
haciendas pulqueras en el centro de México. En tiempos modernos, las fibras
naturales han perdido relevancia al sustituirse con las sintéticas y el mercado
del henequén (Agave fourcroydes) se ha reducido, mientras que el desarrollo
pulquero no ha crecido y hasta la fecha el uso se encuentra bien delimitado
para los estados del centro del país (Valenzuela, 1994).
Actualmente la especie más cultivada en México es el Agave tequilana (Weber)
var. Azul, la cual se utiliza para la elaboración de uno de los llamados “vinos de
mezcal” (Tequila), cuyo desarrollo agroindustrial floreció en los siglos XVII y
XVIII continuando hasta nuestros días, tomando cada vez más prestigio
internacional lo que lo ha llevado a convertirse en distintivo de nuestro país.
b. Importancia ecológica
México es uno de los países con mayor diversidad biológica y uno de los
principales centros de origen y centros endémicos de muchos grupos de flora y
fauna. Se estima que existen 30,000 especies de plantas con flores en México,
pertenecientes a 2,410 géneros, con un endemismo de 10% para géneros y
52% para las especies. Entre las familias botánicas que tienen su centro de
origen y diversidad en nuestro país se encuentran las agaváceas (FrancoMartínez, 1995).
En general, las especies de agave son utilizadas para evitar la pérdida de suelo
(en terrazas de cultivo o en zonas de recuperación) por efecto del agua,
poseen un sistema radical superficial ampliamente desarrollado que retiene las
partículas de suelo. Estas plantas, gracias a las características fisiológicas y
17
anatómicas que las hacen resistentes a condiciones climáticas extremas,
pueden usarse contra la desertificación.
c. Importancia económica
Dentro de la amplia gama de usos que a lo largo de los años se le han atribuido
al maguey, sin lugar a duda el ser materia prima en la producción industrial de
fibras y de bebidas alcohólicas son los de mayor importancia desde un punto
de vista económico.
En la producción de fibras, la cual se lleva a cabo a partir de las hojas, las
especies más utilizadas son A. fourcroydes (henequén), A. sisalana (sisal) y A.
lechuguilla (ixtle) (Robert y col., 1992). A pesar de que esta industria tuvo un
fuerte mercado de exportación, este ha ido disminuyendo ya que las fibras
naturales han perdido relevancia al sustituirse con las sintéticas (Valenzuela,
1994).
Haciendo referencia a la industria de bebidas alcohólicas, varias especies de
agave son cultivadas para materia prima, las más importantes son A. atrovirens
Karw, A. tequilana Weber, A. potatorum Zucc., A. Salmiana y A. cochlearis
Jacobi. La principal característica que se toma en cuenta es la composición de
carbohidratos, además de que notablemente poseen altas concentraciones de
fructosa y polifructósidos (Madrigal-Lugo y col., 1989). Los diferentes tipos de
bebidas que se producen son principalmente aguamiel, pulque, tequila, mezcal
y bacanora, el tequila es la que mayor relevancia económica ha cobrado. Otros
aspectos del aprovechamiento de los agaves que actualmente están cobrando
importancia son, la obtención de saponinas, utilizadas para la elaboración de
esteroides y el uso de los carbohidratos (fructanos tipo inulina) por su potencial
nutracéutico (Ohtsuki y col., 2004; López y col., 2003).
2. Agave tequilana
El Agave tequilana (Figura 1) se distingue por sus hojas largas color azulverdoso, tallos delgados y panículas pesadas-difusas, con flores relativamente
largas y con tépalos largos en proporción a su relativo tubo corto (Gentry,
1982). El ciclo de vida de esta planta es de 8 a 10 años de plantación a
cosecha y es poliploide con un número básico de cromosomas x = 30.
18
La reproducción del
Agave tequilana se da por tres formas: por semillas
(sexual), por hijuelos del rizoma (asexual) y bulbillos que provienen de la
inflorescencia o quiote (asexual).
La vía sexual o sea por semillas, no es
utilizada y pocas veces se observa ya que se suprime la floración en el cultivo
para impedir que ésta consuma los carbohidratos de reservas. Además, las
semillas del Agave tequilana tienen un bajo porcentaje de germinación, el
crecimiento es lento y las plántulas resultantes son muy heterogéneas para el
cultivo. Los hijuelos a partir de rizomas son la forma más común de
reproducción utilizada en el establecimiento de las plantaciones, ha sido la
única forma que se ha practicado por mucho tiempo (200 años o más). La
ventaja de este tipo de propagación es la rapidez con la que se obtienen
plántulas de buen tamaño y la cantidad de éstas producidas por planta. Por
último, la otra vía asexual de reproducción es la de bulbillos, que son hijuelos
pequeños que emergen en el quiote junto a las flores no fecundadas que caen
posteriormente sin formar frutos, esta vía es poco utilizada ya que el tiempo y
costo de producción es mayor (Valenzuela, 1994).
a. Tequila
El tequila es una bebida alcohólica obtenida a partir de los azúcares del agave
tequilero Agave tequilana Weber, variedad azul y de otros azúcares en una
proporción del 51 y 49 por ciento, respectivamente. Esta bebida solamente es
producida en un territorio protegido por la denominación de origen que
comprende todo el estado de Jalisco y algunos municipios de los estados de
Guanajuato, Michoacán, Nayarit y Tamaulipas (Valenzuela, 1994). La industria
tequilera, considerada la más antigua en la zona occidental del país, promovió
lo que sería el primer producto mexicano en ser oficial y legalmente reconocido
por su nombre de origen.
La producción tequilera ha conservado una
tendencia en ascenso en el mercado nacional y de exportación, aunque
ha presentado altibajos a partir de la década de los ochenta. Del tequila
exportado, el 88% va a los Estados Unidos, el 9% se distribuye en países
europeos y Canadá y el 3% en el resto del mundo. Según el Consejo
Regulador de Tequila de México (2006), la agroindustria mexicana del tequila
durante el periodo que comprendió de enero a diciembre de 2005 produjo 71.3
19
Quiote o
inflorescencia
Hojas o
pencas
A
Piña o cabeza
central
Hijuelos
B
Rizoma
Figura 1. Esquematización de la anatomía del Agave tequilana. A) Agave
tequilana Weber var. Azul; B) Principales partes de una planta de agave.
20
millones de litros de tequila, para lo cual fueron necesarias 250, 000 ton de
agave como materia prima, de la cantidad total de tequila producido el 54% fue
exportado (C.R.T., 2006) (Figuras 2, 3 y 4). Dentro de las exportaciones
mexicanas de la industria de bebidas alcohólicas, el tequila sobresale por su
tasa media de crecimiento anual (TMCA) que está por encima de la cerveza, la
cual es un producto altamente demandado en el mercado internacional
(Monroy-Sánchez, 1999).
En las gráficas de producción y exportación de tequila, así como en la de
consumo de agaves (Figuras 2, 3 y 4), son notorios los ciclos fluctuantes de la
industria tequilera, esto se debe a que se presentan temporadas de escasez y
sobreoferta de la materia prima (Agave tequilana) como consecuencia de la
mala planeación de los cultivos, así como de problemas de plagas y
enfermedades, potenciados por la escasa variabilidad genética presente en el
cultivo. Como ejemplo de lo anterior, en la Figura 3 se observa el incremento
de los volúmenes de producción de agave en los últimos años debido a la
popularidad que alcanzó este cultivo después de los graves problemas de
pérdida por enfermedades que se presentaron entre los años de 1995 y 2000.
Debido a la moda en el cultivo de Agave tequilana, actualmente se tiene una
sobreoferta de agave y se estipula que esto será al menos por los próximos
tres años, prediciéndose niveles cercanos a 1.8 millones de toneladas (Dalton,
2005).
b. Plagas y enfermedades
Uno de los principales problemas agronómicos que afectan al cultivo de A.
tequilana y que ha tenido como consecuencias pérdidas millonarias para la
industria tequilera es la incidencia de enfermedades, principalmente las
causadas por bacterias (Jiménez-Hidalgo y col., 2004).
Dentro de los microorganismos que han producido algunas enfermedades
difíciles de combatir en el cultivo se encuentran bacterias como Erwinia sp. y
Erwinia carotovora y hongos como Fusarium oxysporum, Phythophtora sp.,
Alternaria sp., Verticillium sp. y Geotrichum sp. (Monroy-Sánchez, 1999).
Jiménez-Hidalgo y col., en el 2004 reportaron por primera vez la asociación de
la bacteria Erwinia cacticida con los síntomas de la enfermedad de la pudrición
21
80
71.3
70
60
50
40
30
64.6
59.9
50.3
40.8 37.5
31.6 33.3
28
49.7
31.2
18.5
20
51.5
49.1
39.5
37.7
46.9
41.9 44.3
36.7
29
22.2
12.8
10 3.6
56.4
13.1
7.5
9.6
10.2
12.9
47.9
23.4
12.1
0
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Tequila 100% de agave
Tequila
Total
Figura 2. Producción de tequila en México expresado en millones de litros
(Consejo Regulador del Tequila, 2006).
22
300
250
200
150
100
50
0
1995
1996
1997
1998
2000
2001
2002
2003
2004
2005
TEQ. 100%
18.6
40.7
70.1
106.8 149.4
95
56.7
54.5
65.1
65
117.4
TEQUILA
62.5
84.3
91.1
104.7 144.1 100.2
86.6
66.6
100
123.3
TOTAL
81.1
125
161.2 186.1 254.1 239.1 156.9 141.1 131.7
165
240.7
79.3
1999
Figura 3. Consumo de miles de toneladas de Agave tequilana en México
para la producción de tequila (Consejo Regulador del Tequila, 2006).
23
50
32.5
27.8 26.1
24
21.2
33
26.4
27.2
34.3
37.9 40
26.4
30
20
10
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Tequila 100% 0.3
0.5
0.8
1.6
1.8
2.5
2
2.4
3.8
Tequila
20.9 23.5
27
24.5 25.4
30
24.4
24
29.2 29.6 31.1
Total
21.2
27.8 26.1 27.2 32.5 26.4 26.4
24
33
4.7
0
6.8
34.3 37.9
Figura 4. Exportación de tequila en México expresado en millones de
litros (Consejo Regulador del Tequila, 2006).
24
blanda de la raíz en Agave tequilana.
Entre las principales plagas que afectan al cultivo de
podemos
mencionar
Agave
tequilana
al picudo del agave (Scyphophorus acupunctatos),
algodoncillo o piojo harinoso (Planococcus harinoso), y algunas epecies de
nemátodos, por mencionar algunos (Rodríguez y col., 2004).
En la actualidad las enfermedades en el cultivo de A. tequilana representan
grandes pérdidas económicas para México. Esta problemática en la obtención
de la materia prima para la producción de tequila, aunada a la mala planeación
en el establecimiento de los cultivos, ha creado una crisis en la industria
tequilera ya que en la actualidad la demanda de la bebida se ha incrementado
en el ámbito nacional como internacional.
c. Variabilidad genética
Otro importante problema agronómico que el cultivo del agave azul presenta
es que la mayoría de los agaves cultivados son clonas estériles, algunas veces
poliploides que raramente producen semillas viables (Robert y col., 1992).
A pesar de que la reproducción sexual se da escasamente, en las plantaciones
es evitada por los mismos agricultores, ya que cortan las inflorescencias tan
pronto empiezan a desarrollarse para impedir que hagan uso de los azúcares
almacenados (Robert y col., 1992). Esta situación ha traído como consecuencia
la pérdida de variabilidad genética en el cultivo, haciéndolo más susceptible a
la proliferación de enfermedades. Debido al largo periodo de desarrollo que la
planta presenta, la supresión de la floración en los cultivos y la poca viabilidad
de las semillas, hace que las estrategias de mejoramiento genético
convencional sean de difícil aplicación (Robert, y col., 1992).
Gil-Vega y col. (2001) reportaron que de 40 selecciones de A. tequilana
analizadas mediante RAPDs, 39 fueron isogénicas, concluyeron que este
bajo nivel de polimorfismo se propone como resultado de la promoción de un
genotipo
conservado
durante
muchos
años
bajo
una
propagación
exclusivamente vegetativa. Este problema de erosión genética también está
presente en otras especies importantes de agave que han sido manipuladas
para su industrialización, como el Agave fourcroydes utilizado en la producción
25
de fibras. En un estudio similar al anterior no se observó variación genética
entre tres variedades de esa especie mediante un análisis de isoenzimas
(Colunga-GarciaMarín y col., 1999).
La industrialización de diferentes especies de agave ha tenido como
consecuencia la pérdida de variabilidad genética y de germoplasma (Granich,
2003).
2. Antecedentes de mejoramiento genético en agaves
El único reporte que se tiene de mejoramiento genético tradicional en agave es
la obtención del híbrido diploide 11648 en Tanzania producto de una cruza
entre A. angustifolia X A. amaniensis y una retrocruza con A. amaniensis. El
híbrido es un alto productor de fibras en términos de hoja, contenido y calidad
de la fibra, desafortunadamente su extremada susceptibilidad a especies de
Phytophtora ha evitado su cultivo exitoso (Robert y col., 1992).
Existen algunos trabajos de cultivo de tejidos en maguey y en otras agaváceas
que se han realizado con el objetivo de propagar masivamente esta planta,
tanto para fines de producción industrial (Agave tequilana), como para
conservación (Agave victoria-reginae). En lo que respecta a especies de agave
de uso ornamental en peligro de extinción, Rodríguez-Garay y colaboradores
en 1996 lograron obtener plantas de Agave victoria-reginae a través
de
embriogénesis somática directa de segmentos de hojas en medio MS
suplementado con 2,4-D (Rodríguez-Garay y col., 1996). En otro trabajo en
esta misma especie se reporta la regeneración vía embriogénesis somática y
organogénesis a partir de segmentos de tallo utilizando un medio MS
modificado suplementado con los reguladores 2,4-D y BA (Martínez-Palacios y
col., 2003) . En Agave parrasana Santacruz-Ruvalcaba y col. (1999) reportaron
haber obtenido de manera eficiente plantas propagadas a partir de la
proliferación de brotes axilares usando MS con BA. Dentro de las principales
especies utilizadas como materia prima para la producción de fibras que son
Agave fourcroydes, Agave cantala y Agave sisalana, existen reportes de
regeneración vía organogénesis a partir de tejidos de rizoma, hojas, tallos y
estolones, utilizando como reguladores de crecimiento NAA, IBA, KIN, BA, IAA
y 2,4-D en diferentes combinaciones y concentraciones para cada uno de los
26
casos (Robert y col., 1987; Binh y col., 1990; Nikam, 1997; Hazra y col., 2002).
Para la especie Agave sisalana Perr. ex. Engelm Nikam y col., (2003) reportan
la regeneración de plantas vía embriogénesis somática a partir de segmentos
de tallo de bulbillos tratados con KIN, 2,4-D y BAP. Por último en Agave
tequilana Robert y col. (1992) reportaron la propagación vía organogénesis a
partir de tallo y hojas en MS modificado (fuentes de nitrógeno) utilizando BAP
como regulador de crecimiento.
En lo que respecta a trabajos de transformación genética publicados del género
Agave, Smith y Hood (1995) sólo reportan la formación de tumores producidos
por la inserción del plásmido Ti de A. tumefaciens en Agave salmiana Otto.
Santacruz Ruvalcaba (2001) transformó callos embriogénicos de A. tequilana
mediante biobalística con el sistema PDS-1000 He® (Pistola de alta presión);
bombardeó a 800 psi, con un pretratamiento con manitol 0.2 M + sorbitol 0.2 M
y sacarosa al 12% y logró observar la expresión del gen gus A de manera mas
constante cuando usó el plásmido pBarGus respecto a otros plásmidos. Con el
análisis molecular tipo Southern reportó la integración y expresión del gen bar
en siete clonas.
27
IV. OBJETIVOS
A. General
Evaluar diferentes tecnologías para la regeneración in vitro y transformación
genética de maguey (Agave tequilana Weber var. Azul).
B. Específicos
Desarrollar un sistema de cultivo de tejidos in vitro para regenerar Agave
tequilana.
Evaluar condiciones de transformación genética para Agave tequilana
mediante biobalística y/o vía Agrobacterium tumefaciens.
Obtener y analizar molecularmente materiales transgénicos de Agave
tequilana.
28
V. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Materiales
1. Material vegetal
Se utilizaron plantas de Agave tequilana Weber var. Azul de un año de edad,
donadas por el Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Guanajuato
y por el Rancho “El Pachon”, Zapopan, Jalisco, México.
2. Vectores
Para llevar a cabo los ensayos de transformación vía Agrobacterium
tumefaciens y mediante bombardeo de partículas (biobalística) se utilizaron
diferentes
vectores
cuyas
características
se
encuentran
descritas
y
esquematizadas en la Tabla 1 y 2 y en la Figuras 5 y 6.
3. Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas que se utilizaron en este estudio fueron las siguientes:
•
Cepas de Escherichia coli TOP 10’F que contenían los plásmidos
p35SGUS, pBIN m-gfp5-ER, pBI426, pAHC25 y pCATGFP.
•
La cepa ayudadora HB101 también de E. coli, para la cruza triparental.
•
Cepas
LBA4404
de
Agrobacterium
tumefaciens
(competentes
y
conteniendo el plásmido pBI121). La cepa LBA4404 es derivada de la cepa
silvestre Ach5, que porta el plásmido pLA4404 (tipo octopina), que es
derivado del pTiAch5 (Hooykaas y Schilperoort, 1992). Este plásmido no
tiene la región del T-DNA pero contiene la región vir que actúa en trans y es
huésped de plásmidos binarios.
•
Las cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens, C58, H63 y A281.
29
Tabla 1. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación vía
Agrobacterium tumefaciens.
Plásmido
Descripción
Vector binario derivado del BIN19
que contiene las
secuencias repetidas del plásmido pTiT7 para la
pBI121
transferencia del T-DNA a células vegetales, el gen
(Bevan, 1984)
nptII de resistencia a kanamicina, así como el gen gus
A que codifica para la β-glucuronidasa (GUS), bajo el
control del promotor constitutivo 35S del mosaico del
virus de la coliflor (CaMV35S).
Derivado del BIN19 que contiene los genes nptII que
p35S GUS
confiere resistencia a kanamicina y gus A (GUS)
(Vancanneyt y col., interrumpido por un intron, bajo el control del promotor
1990)
35S.
Vector binario derivado del pB121, el gen reportero
pBIN m-gfp5-ER
GUS se encuentra remplazado por el gen m-gfp-ER
(Haseloff y col.,
que codifica para la proteína verde fluorescente.
1997)
30
Tabla 2. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación mediante
Biobalística.
Plásmido
Descripción
Plásmido basado en pUC9 que contiene la información
pBI426
que codifica para la proteína fusionada de GUS-NPTII
(Dalta y col.,
bajo el control de un promotor doble 35S del virus del
1991)
mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador de la
nopalino sintetasa (NOS).
pAHC25
Plásmido derivado de pUC8 que contiene el gen de
(Christensen y
selección bar que confiere resistencia a fosfinotricina y
Quail, 1996)
el gen reportero gus A (GUS), bajo el control del
promotor constitutivo Ubi-1.
Plásmido derivado de pUC9 que contiene el gen
pCATgfp
reportero GFP que codifica para la enzima verde
(Heim y col.,
fluorescente, bajo el control del promotor constitutivo
1995)
35S.
31
A) pBI121
nptII
gusA
35S
NOS
T
HindIII PstI XbaI
SmaI
SphI
BamHI
SnaBI
B) p35SGUS
nptII
EcoRI
SnaBI
)
35S
Intron PIV2 (240 pb)
NOS
T
HindIII PstI XbaI
SmaI
SphI
BamHI
EcoRI
C) pBIN m-gfp5-ER
nptII
35S
M-gfp5-
HindIII PstI XbaI
SphI
BamHI
NOS
T
EcoRI
Figura 5. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de
transformación vía Agrobacterium tumefaciens. En los esquemas se
muestran los genes reporteros (gus A y gfp), el de resistencia a kanamicina
(nptII), así como los promotores y terminadores.
32
D) pBI426
gusA • nptII
35S • 35 S
HindIII
NcoI
NOS
T
EcoRI
BamHI
XbaI
E) pAHC25
gusA
Ubi 1
PstI
XbaI
bar
SmaI EcoRI
BamHI
BamHI
NOS
T
EcoRI
PstI
F) pCATgfp
nptII
gfp
35S
HindIII
NcoI
BamHI
NOS
T
EcoRI
XbaI
Figura 6. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de
transformación mediante biobalística. En los esquemas se muestran los
genes reporteros (gus A y gfp), los de resistencia a agentes selectivos (bar y
nptII), así como los promotores y terminadores.
33
B. Métodos
1. Establecimiento del cultivo in vitro
El cultivo in vitro
de Agave tequilana se estableció a partir de hijuelos de
plantas de aproximadamente un año de edad. A estos hijuelos se les
eliminaron las hojas hasta llegar a la obtención de la “piña”, la cual fue
desinfestada mediante lavados consecutivos con detergente comercial.
Posteriormente se lavaron con etanol al 70% y finalmente con hipoclorito de
sodio comercial (Clorox) al 2.4%, el proceso se llevó a cabo en condiciones
asépticas en una campana de flujo laminar.
Una vez desinfestadas las piñas se obtuvieron segmentos de la región
meristemática utilizando un sacabocados de 8 mm y se colocaron en medio
MS1 (Tabla 3) en presencia de cefotaxima. Las condiciones de incubación
fueron: temperatura de 25º C y un fotoperíodo de 18 horas luz por 6 horas de
oscuridad.
2. Inducción de embriogénesis somática
a. Producción de embriones
Para llevar a cabo la producción de embriones somáticos de Agave tequilana,
se usaron como explantes segmentos de hojas de plántulas regeneradas in
vitro, fueron colocados en medio MS-L2 (Tabla 3), suplementado con 2,4-D,
basándonos
en la metodología descrita para
Agave victoria-reginae
(Rodríguez-Garay, 1996). Las concentraciones que se evaluaron fueron: 0.07,
0.15, 0.3, 0.46 y 0.62 mg/l de 2,4-D.
b. Germinación de embriones
Los embriones producidos fueron transferidos a medio de regeneración (1/2
MS sin reguladores de crecimiento) para la germinación, esto se hizo siguiendo
el protocolo descrito para Agave victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996).
34
Tabla 3. Composición de medios de cultivo MS1 y MS-L2 en (mg/l).
Componentes del medio
MS1
MS-L2
NH4NO3
825.0
1650.0
KNO3
950.0
1900.0
MgSO4 . 7 H2O
370.0
370.0
CaCl2 . 2H2O
440.0
332.2
KI
0.83
0.83
KH2PO4
170.0
170.0
m-Inositol
100.0
250.0
Sacarosa
30 000.0
ZnSO4 . 7H2O
8.6
8.6
MnSO4 . H2O
27.68
16.9
CuSO4 . 5H2O
0.025
0.025
CoCl2 . 6H2O
0.025
0.025
H3BO3
6.2
6.2
Na2MoO4 . 2H2O
0.25
0.25
FeSO4 . 7H2O
27.8
27.8
Na2EDTA
37.3
37.3
Tiamina . HCl
20
2.0
Ácido nicotínico
-
0.5
Glicina
-
2.0
Piridoxina
-
0.5
2,4-D
0.025
-
BAP
10
-
30 000.0
35
3. Establecimiento del sistema de regeneración mediante organogénesis
indirecta
a. Inducción y mantenimiento del estado de callo
Para seleccionar la fuente de explante óptima para la producción de callos de
Agave tequilana, se evaluaron segmentos de hoja de plántulas de agave
enraizadas in vitro y segmentos obtenidos de la región meristemática de
plántulas in vitro y de hijuelos. Estos explantes fueron colocados en medio MS
(Murashige y Skoog, 1962) y medio MS1 suplementados con diferentes
concentraciones de BAP o zeatina como fuente de citocinina en combinación
con 2,4-D como fuente de auxina (Tabla 4 y 5). Las condiciones de incubación
fueron: temperatura de 25º C y un fotoperíodo de 18 horas luz por 6 horas de
oscuridad. La respuesta de los explantes se evaluó periódicamente hasta
completar un mes de exposición al medio (subcultivos cada 15 días) y se
determinó el porcentaje de explantes formadores de callo.
Después de haber seleccionado la fuente óptima de tejido, se realizó un
experimento para determinar el tamaño mínimo del explante. Este experimento
se llevó a cabo con diferentes tipos y número de cortes en el explante (Figura
7). Posteriormente, éstos fueron cultivados en las mismas condiciones
mencionadas anteriormente, utilizando como tratamiento el de inducción de
callo.
Para llevar a cabo el mantenimiento de los callos obtenidos, se evaluaron
diferentes tratamientos de 2,4-D o ácido naftalenacético NAA, solos o en
combinación con BAP (Tabla 6), de igual manera se evaluaron tratamientos
utilizando únicamente BAP como regulador. Los callos fueron colocados en
medio MS1 con los diferentes tratamientos e incubados en las mismas
condiciones mencionadas anteriormente. Se llevó a cabo la evaluación de la
respuesta de los callos a los diferentes tratamientos, considerando friabilidad,
oxidación, ausencia de brotación y área de crecimiento. Todos los tratamientos
se evaluaron durante 1 mes, realizando subcultivos cada 15 días.
Los experimentos se realizaron en un diseño completamente al azar con 3
repeticiones por tratamiento. Cada repetición consistió en una caja petri con 10
explantes por caja. Los datos fueron evaluados con un análisis de varianza
(ANOVA) con el paquete de diseños experimentos FAUANL versión 2.5 de la
36
Universidad Autónoma de Nuevo León. Las medias de los tratamientos fueron
separadas usando la prueba de diferencia mínima significativa (dms) (α = 0.05).
b. Producción de brotes
Los callos obtenidos de los diferentes tratamientos fueron colocados en medio
MS1 e incubados en las mismas condiciones para llevar a cabo la formación de
brotes. Esta capacidad fue evaluada después de un mes, tomando en cuenta
el número de brotes producidos por explante y el número total de explantes que
presentaban producción de brotes. Estos datos se utilizaron para calcular el
índice de capacidad de formación de brotes (CFB) de acuerdo a lo reportado
por Martínez-Pulido y col. (1992):
CFB = (Número promedio de brotes por explante) X (% de explantes con
brotes)/100
c. Enraizamiento y aclimatación
Una vez que los brotes producidos alcanzaron una altura de 2 cm
aproximadamente, fueron separados y transferidos a medio MS1 sin
reguladores para la elongación y producción de raíces. Las plántulas que
presentaban un sistema radical completo fueron lavadas para eliminar el agar,
transferidas a macetas que contenían suelo estéril y llevadas a invernadero
donde se completo su desarrollo.
4. Determinación de la sensibilidad a agentes selectivos: kanamicina
(antibiótico) y fosfinotricina (herbicida)
Para establecer un sistema de transformación en necesario contar con un
sistema de selección confiable que permita asegurar la recuperación de plantas
transgénicas, para esto es necesario determinar la sensibilidad intrínseca de
los tejidos a los agentes selectivos que se vayan a usar. Por esta razón, se
realizaron experimentos en los cuales se expuso el tejido a diferentes
concentraciones del antibiótico kanamicina y del herbicida fosfinotricina (Tabla
7); el antibiótico, esterilizado por filtración
fue adicionado al medio de
regeneración (MS1). Se evaluó la tasa de supervivencia de los explantes de
forma semanal durante un mes. Con los resultados obtenidos de estos
37
Tabla 4. Evaluación de la inducción del estado de callo en diferentes
tejidos de Agave tequilana.
Tratamiento
Medio
BAP
2,4-D
(mg/l)
(mg/l)
1
MS
-
-
2
MS1
-
-
3
MS
2.5
0.025
4
MS
5
0.025
5
MS
10
0.025
6
MS1
2.5
0.025
7
MS1
5
0.025
8
MS1
10
0.025
38
Tabla 5. Evaluación de zeatina como fuente de citocininas en la inducción
del estado de callo en segmentos meristematicos de Agave tequilana.
Tratamiento
Zeatina
2,4-D
(mg/l)
(mg/l)
1
-
-
2
1
0.025
3
2
0.025
4
4
0.025
39
A
B
C
Figura 7. Esquematización de los explantes obtenidos a partir de cortes
en piñas de plántulas in vitro. Los explantes se utilizaron en los experimentos
de determinación de tamaño de explante mínimo regenerable. A) Meristemo
completo; B) Corte transversal de meristemo; C) Corte longitudinal de
meristemo.
40
Tabla 6. Evaluación del efecto de las auxinas 2,4-D y NAA en el
mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana.
Tratamiento
BAP
2,4-D
NAA
mg/l
mg/l
mg/l
1
-
-
-
2
10
0.025
-
3
5
0.125
-
4
5
0.25
-
5
5
0.5
-
6
-
0.125
-
7
-
0.25
-
8
-
0.5
-
9
5
-
0.25
10
5
-
0.5
11
5
-
1
12
-
-
0.25
13
-
-
0.5
14
-
-
1
41
experimentos se estableció la dosis letal mínima para la selección de los tejidos
una vez transformados.
Se llevó a cabo también un experimento para determinar la dosis para
seleccionar plantas de agave transformadas mediante exposición al herbicida
comercial. Se expusieron las hojas de los agaves a las siguientes
concentraciones del herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA)
(Tabla 8) y se evaluó el daño en las hojas semanalmente durante un mes.
5. Ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens
a. Transferencia de plásmidos a cepas de Agrobacterium
Para realizar los ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens,
primero se llevó a cabo la transferencia del DNA plasmídico a la bacteria (cepa
LBA4404), los plásmidos que se utilizaron fueron (P35SGUS y pBIN m-gfp5ER) y la transferencia se hizo por medio de una cruza triparental utilizando a la
cepa HB101 como proveedora del plásmido ayudador (Shaw, 1994). Otro
método que se utilizó para la transformación de Agrobacterium fue el de tratar
las células con NaCl y CaCl2, y permitir posteriormente la transferencia del
DNA a la bacteria mediante el choque térmico por la congelación con nitrógeno
líquido (Chen y col., 1994). Mediante la selección con antibióticos, se
obtuvieron las colonias de A. tumefaciens que recibieron cada uno de los
plásmidos; la transferencia a Agrobacterium se verificó mediante PCR con
primers dirigidos al gen de resistencia al antibiótico kanamicina (nptII).
b. Evaluación de la susceptibilidad del A. tequilana a la infección por
cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens
Con el fin de evaluar la susceptibilidad del agave a la infección natural de
Agrobacterium tumefaciens, la cual produce la enfermedad conocida como
agalla de la corona, fueron inyectadas plantas de A. tequilana de
aproximadamente 2 años de edad crecidas en invernadero con un cultivo
bacteriano concentrado de las cepas silvestres de Agrobacterium C58, H63 y
A281 de manera individual. Las inyecciones se realizaron en la región del tallo,
cercana a las raíces y posteriormente se evaluó la aparición de tumores en
dicha región.
42
Tabla 7. Evaluación de la sensibilidad de explantes de Agave tequilana al
antibiótico kanamicina y al herbicida fosfinotricina (ppt).
Tratamiento
Kanamicina
Fosfinotricina
mg/l
mg/l
1
-
-
2
25
-
3
50
-
4
100
-
5
200
-
6
-
1
7
-
2
8
-
3
9
-
4
10
-
5
43
Tabla 8. Evaluación de la sensibilidad de plantas de Agave tequilana al
herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA).
Tratamiento
% BASTA (v/v)
1
0
2
4
3
8
4
12
5
16
44
c. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones
de transformación
Para determinar las condiciones óptimas de transformación de los callos de A.
tequilana mediante el uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, se
evaluaron los siguientes parámetros, utilizando los plásmidos descritos
anteriormente:
1). Respuesta al tipo de daño en el tejido vegetal
Para permitir la interacción entre Agrobacterium tumefaciens y el tejido vegetal
es necesario que se produzcan compuestos atrayentes para la bacteria en el
tejido herido, por ello es necesario determinar el tipo de daño que permita una
buena recuperación del explante. Con este fin, se dañaron callos de agave
utilizando bombardeo de micropartículas de tungsteno y agujas de 13 y 32 mm,
posteriormente se evaluó el porcentaje de sobrevivencia de los explantes.
2). Tipo de cultivo bacteriano y tiempo de exposición con el explante
Para seleccionar el tipo de cultivo y el tiempo de exposición óptimos para llevar
a cabo la transformación genética, se expusieron callos de agave a cultivos
concentrados sólido y líquido de la bacteria, y se determinó la sobrevivencia.
Después de seleccionar el tipo de cultivo adecuado, se expusieron los callos
durante diferentes tiempos (0, 5, 10, 20, 30 min) y de igual manera se evaluó el
porcentaje de sobrevivencia de los explantes.
3). Tiempo de cocultivo
Habiendo seleccionado los parámetros anteriores, se infectaron callos de
agave en esas condiciones y se incubaron a diferentes tiempos en cocultivo (0,
1, 2, 3, 4 y 5 días) para que se llevara a cabo la transferencia del plásmido al
tejido vegetal. El tiempo de cocultivo óptimo, se seleccionó evaluando la
expresión transitoria del gen reportero de acuerdo al plásmido utilizado (gus A
o gfp).
45
d. Ensayos de transformación estable
Con los parámetros óptimos determinados se llevó a cabo la transformación
mediante Agrobacterium tumefaciens. Posterior al cocultivo, los callos
transformados fueron colocados en medio MS1 con cefotaxima 500 mg/l, para
eliminar la bacteria y después se expusieron al mismo medio pero con la dosis
letal determinada del agente de selección correspondiente. De esta forma se
permitió solo la sobrevivencia de material transformado.
6. Ensayos de transformación vía biobalística
a. Purificación de plásmidos y preparación de partículas
Los plásmidos fueron purificados utilizando el método de Birboim (Birboim y
Doly, 1979) de lisis alcalina y su integridad fue verificada mediante digestión
con enzimas de restricción, lo que se observó al realizar una electroforesis en
un gel de agarosa al 1% y teñirlo en bromuro de etidio.
Las partículas de tungsteno (M10) utilizadas fueron esterilizadas con alcohol,
sonicadas y enjuagadas con agua estéril (ver Apéndice). Se precipitó el DNA
de la suspensión mezclándolas con el DNA (plásmido), CaCl2 (2.5 M) y
espermidina (100 mM) (Finer y col., 1992). Una vez preparada la suspensión
se utilizaron 4μl del precipitado por bombardeo.
b. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones
de transformación
Para determinar condiciones óptimas de transformación de callos de A.
tequilana mediante bombardeo con alta y baja presión se evaluaron los
siguientes parámetros
1). Medio osmótico
Para determinar el tiempo de exposición al medio osmótico se colocaron los
explantes en medio MS1 adicionado con 15% de sorbitol (agente osmótico) y
se expusieron a diferentes tiempos previo al bombardeo (4 y 8 horas),
posteriormente se llevó a cabo el bombardeo.
46
2). Presión
Se utilizaron los sistemas de bombardeo de alta y baja presión. Utilizando el
sistema de baja presión, se evaluaron; 60, 80, 100 y 120 psi de presión y de
igual manera utilizando el sistema de alta presión,
fueron evaluados las
presiones de 450, 900 y 1350 psi.
3). Distancia
En combinación con las presiones también analizaron distancias de 17.5 a 22.5
cm en intervalos de 2.5 cm, para el sistema de baja presión. Para el sistema de
alta presión se analizaron distancias de 9 a 15 cm en intervalos de 3 cm. La
distancia corresponde a la longitud entre la posición del filtro que contiene las
partículas hasta el soporte donde se colocan los explantes.
4). Concentración de DNA
Tomando en cuenta que en los protocolos de transformación se recomienda no
utilizar una concentración mayor de 1 μg/μl del plásmido, se evaluó el efecto
de la concentración del plásmido en la expresión transitoria. Se bombardearon
callos con partículas que fueron precipitadas con el plásmido a dos diferentes
concentraciones (0.1 μg/μl y 1 μg/μl).
El efecto de todos los parámetros anteriormente mencionados fue cuantificado
mediante el número de foci que presentaron, como efecto de actividad de βglucuronidasa.
c. Ensayos de transformación estable
Después de evaluar los diferentes parámetros de transformación y seleccionar
las mejores condiciones, se bombardearon callos con las condiciones
seleccionadas utilizando ambos sistemas. Los explantes transformados se
incubaron en oscuridad durante 48 horas, para permitir la recuperación del
tejido, posteriormente fueron sometidos a selección.
7. Selección de material transformado
Todos los explantes provenientes de los ensayos de transformación realizados
con ambos métodos (Agrobacterium y biobalística), fueron colocados en medio
47
de regeneración MS1 suplementado con la dosis determinada del agente de
selección, de esta manera se llevo a cabo una preselección. Los callos que
sobrevivieron fueron transferidos a medio con la dosis determinada para una
segunda ronda de selección, asegurándonos de esta manera que solo se
regeneraba material transformado.
8. Análisis histoquímico
Para analizar la expresión del gen gus A en los ensayos de expresión
transitoria y en los tejidos que sobrevivieron a los procesos de selección, se
llevaron a cabo ensayos histoquímicos basados en el método de Jefferson
(1987).
Al tejido transformado se le adicionaron 500 μl de regulador de reacción con el
sustrato X-gluc (5-bromo-4-cloro-indolil glucurónido), fosfato de potasio (100
mM pH 7.0), EDTA (10 mM pH 8.0), ferricianuro de potasio (0.5 mM) y
ferrocianuro de potasio (0.1 mM) (Ver apéndice). El tejido con el regulador se
incubó a 37°C en la oscuridad durante una noche. Transcurrido este tiempo se
retiró la solución y los tejidos fueron lavados tres veces con una mezcla de
metanol-acetona (3:1) para remover posibles pigmentos que pudieran interferir
con la visualización del color. Las células transformadas fueron reconocidas
fácilmente, por la producción de un precipitado azul que se registró como
número de foci.
9. Análisis molecular de material transformado
a. Extracción de DNA
La extracción del DNA de los materiales seleccionados de agave se llevó a
cabo basándonos en el método reportado por Keb-Llanes y col., 2002, el cual
se realizó partiendo de 0.3 gramos de tejido fresco. El tejido fue molido y
transferido aun tubo con las siguientes soluciones: solución A (CTAB 2%, TrisHCl 100 mM pH8, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, polivinilpirrolidona 4%, ácido
ascórbico 0.1% y β-mercaptoetanol 10 mM), solución B (Tris-HCl 100 mM pH 8,
EDTA 50 mM, NaCl 100 mM y β-mercaptoetanol 10 mM) y SDS 20%; esta
mezcla se incubo a 65°C por 10 min, posteriormente se agrego acetato de
potasio (5M) previamente enfriado; se agitó vigorosamente y se centrifugó
48
(15,300 g, por 15 min, 4°C), recuperándose 1 ml de la fase acuosa a la que se
le adicionó ½ volumen de isopropanol frió, se mezclo suavemente y se dejo
precipitar en hielo por 20 min. Después se centrifugo (9600 g, por 10 min) y se
lavó con etanol al 70% (v/v); posteriormente se resuspendió en TE; después el
DNA se precipito incubando en hielo por 20 min con 1/10 de volumen de
acetato de sodio 3 M pH 5.2 y ½ de volumen de isopropanol frió,
posteriormente se centrifugo (9600g por 10 min); se repitió el procedimiento a
partir del lavado con etanol al 70%. Finalmente el DNA resuspendió en TE.
La integridad del DNA obtenido se analizó mediante electroforesis en geles de
agarosa al 1%, visualizados con bromuro de etidio; la concentración se calculó
por densidad óptica a 260 nm utilizando la siguiente fórmula:
[DNA] = DO 260 X 50 X FD / 100
[DNA] : Concentración de DNA
DO 260 : Densidad óptica leída a 260 nm de longitud de onda
FD : Factor de dilución = Volumen total / Volumen de DNA
b. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
El análisis de la amplificación del DNA del material seleccionado para
determinar la integración de los genes introducidos se llevó a cabo usando
oligonucleótidos específicos para el gen gus A y/o nptII (Jefferson y col., 1987;
Beck y col., 1982). Los oligonucleótidos fueron los siguientes:
gus A:
5′ AGT GTA CGT ATC ACC GTT TGT GTG AAC 3′ (Sentido)
5′ ATC GCC GCT TTG GAC ATA CCA TCC GTA 3′ (Antisentido)
npt II:
5′ TAT TCG GCT ATG ACT TGG GC 3′ (Sentido)
5′ GCC AAC GCT ATG TCC TGA TA 3′ (Antisentido)
49
Las condiciones de reacción fueron las siguientes:
gus A
nptII
94ºC 4min
94ºC 4min
92 ºC 1min
92 ºC 1min
55 ºC 1.2 min
30 ciclos
57 ºC 1.2 min
72 ºC 1.1 min
72°C 1.1 min
72 ºC 5 min
72 ºC 5 min
35 ciclos
Los productos obtenidos fueron analizados en geles de agarosa al 1% y
visualizados mediante tinción con bromuro de etidio.
c. Análisis tipo Southern blot
La determinación tanto de la integración como el posible número de copias de
los genes introducidos se llevo a cabo mediante un análisis tipo Southern de la
siguiente manera: El DNA extraído de los callos seleccionados fue digerido
mediante una doble digestión con la enzima EcoRI, la cual corta en uno de los
extremos del gen gus A en el plásmido PBI426. El DNA digerido fue calentado
a 65 °C por 15 minutos, se enfrió en hielo durante 5 minutos y el producto de la
digestión se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se
observo
tiñendo
con
bromuro
de
etidio.
Posteriormente
el
gel
fue
desntaturalizado y transferido a una membrana de nylon por capilaridad. El
DNA se fijó a la membrana con luz ultravioleta. La hibridación de la membrana
se llevo a cabo utilizando como sonda el gen gus A marcado radioactivamente
(Sambrook y col., 1989).
50
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A. Establecimiento del cultivo in vitro
Se logró establecer un sistema de cultivo in vitro para Agave tequilana a partir
del cultivo de segmentos obtenidos de la región meristemática o piña, de
hijuelos de agave de aproximadamente un año de edad, en medio MS1. Como
respuesta del tejido a la exposición al medio, se obtuvo la producción de brotes
con una buena eficiencia (20 a 30 brotes por explante), llegando hasta el
establecimiento de las plantas en invernadero. En cuanto al proceso de
desinfectación el utilizado fue exitoso, ya que no se observó contaminación en
los explantes cultivados. El tiempo total que se necesitó para obtener una
plántula de Agave tequilana enraizada in vitro a partir de la desinfestación fue
de 3 meses aproximadamente (Figura 8).
B. Inducción de embriogenesis somática
1. Producción de embriones
Con la finalidad de establecer un sistema de regeneración vía embriognesis en
Agave tequilana, se evaluaron segmentos de hojas obtenidas de plantas
enraizadas in vitro. Como resultado de la influencia del medio MS-L2 sobre los
segmentos, solo se observó el abultamiento del tejido y la aparición de algunas
estructuras con apariencia embrionaria (Figura 9 A, B y C). Esto se observó 6
semanas después de colocarlos en el medio. Dichas estructuras se
presentaron en un promedio de 3 por explante y aparecieron en 40% de los
mismos. A pesar de ser una eficiencia muy baja en cuanto a la producción de
este tipo de estructuras, nuestras observaciones nos indicaron la posible
producción de embriones similar a la reportada con el mismo sistema en la
especie Agave Victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996).
2. Germinación de embriones
Al llevar a cabo la transferencia de las estructuras embrionarias al medio de
germinación, se observó solo muerte del tejido sin llegar a obtener en ninguna
de estas la regeneración de una plántula de Agave tequilana producto de su
germinación (Figura 9 D), contrario a lo reportado para la especie Agave
victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996), donde ellos reportan la obtención de
51
plántulas regeneradas a partir de embriones. De manera similar se reporto que
a concentraciones más elevadas de 2,4-D en medio MS se obtuvo la
regeneración de plantas vía embriogénesis indirecta, mediante el cultivo de
segmentos de tallo de plántulas (Martínez-Palacios y col., 2003).
Tomando en cuenta lo anterior es importante destacar que siendo el Agave
tequilana y Agave victoria-reginae plantas pertenecientes al mismo genero, la
respuesta de sus tejidos al medio, componente y condiciones de cultivo es muy
diferente.
Es importante continuar con estudios que nos permitan desarrollar un sistema
de regeneración vía embriogénesis preferentemente indirecta y a partir de
tejido meristemático para ser utilizados como fuente de explante en trabajos de
transformación debido a la estabilidad genética que este sistema brinda
(Williams and Maheswaran, 1986; Isabel y col., 1995).
Santacruz-Ruvalcaba (2001), en su tesis doctoral reporta un sistema de
transformación utilizando callos embriogénicos, sin embargo, no existen
reportes de como esta constituido este sistema. En este sentido a pesar de no
haber obtenido la germinación de embriones, nuestros resultados son un
primer indicio de la respuesta de este tipo de tejidos para futuras evaluaciones
que sean hechas con esa finalidad.
C. Sistema de regeneración vía organogénesis indirecta
1. Inducción y mantenimiento del estado de callo
Los segmentos de hoja que fueron expuestos a medio MS y MS1
suplementado con las diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D no mostraron
desarrollo de una estructura de callo. Se observó en cambio un leve
crecimiento del tejido; solamente los explantes obtenidos de la cabeza central
(piña) y expuestos a medio MS1 suplementado con 10 mg/l de BAP y 0.025
mg/l de 2,4-D tuvieron la capacidad de formar callos en un 100% (Figura 10B).
Para obtener mejor respuesta en el tiempo de formación de callo con los
explantes obtenidos del tejido meristemático se utilizó zeatina como fuente de
citocinina. Se observó la formación de estructuras callosas a diferentes
concentraciones de zeatina en combinación con 2,4-D; sin embargo, éstos
fueron menos friables y con una apariencia seca y dura en la superficie (Figura
10C).
52
0
12
32
60
(Días)
22 Días
Figura 8. Establecimiento del cultivo in vitro de Agave tequilana. El cultivo
in vitro se estableció a partir de la propagación de segmentos de la región
meristemática de la piña.
53
A
B
C
D
Figura 9. Ensayo para la producción de embriones somáticos a partir de
segmentos de hojas de plántulas in vitro de A. tequilana. A) Inducción del
estado embriogénico; B) Producción de estructuras embriogénicas; C)
Separación de estructuras; D) Germinación con embriones muertos.
54
Para la determinación del tamaño mínimo regenerable del explante, los
segmentos obtenidos a partir de los diferentes cortes de la región
meristemática de las plántulas enraizadas in vitro, fueron colocados en medio
MS1 de regeneración. Los callos presentaron una apariencia compacta y
saludable después de 15 días en incubación (Figura 11). Sin embargo, los
explantes obtenidos a partir del corte longitudinal mostraron un alto porcentaje
de formación de callo (77.5%), en comparación con los obtenidos a partir de los
otros cortes (Tabla 9) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006)
En un experimento previo se observó que disminuyendo la concentración de
citocininas (5 mg/l) y aumentando la de auxinas (0.25 mg/l), hay un crecimiento
en los callos sin llevarse a cabo la formación de brotes. Posteriormente, se
evaluaron diferentes tratamientos con 2,4-D y NAA, (solos o en combinación
con BAP) y se observaron diferentes respuestas en las características de
crecimiento y friabilidad.
Los callos cultivados en los diferentes tratamientos de mantenimiento lograron
mantenerse sin presentar la formación de brotes durante tres meses como
mínimo (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). En resultados preliminares se
observó que los callos expuestos en medio sin fuente de auxinas, no logran
sobrevivir, además se determinó que el tiempo entre la inducción del estado de
callo y la transferencia a los distintos tratamientos de mantenimiento fue
determinante para el efecto de la preservación de la estructura callosa. Se
observó que el tiempo máximo para hacer la transferencia después de la
inducción debe ser de 7 días, si es mayor la predeterminación del estado de
organogénesis se hace presente en los callos. De manera general, se encontró
en los primeros experimentos que una disminución en la concentración de
citocininas (BAP) y, como consecuencia un aumento en la concentración de
auxinas (2,4-D) da como resultado una mejor respuesta en el crecimiento de
los callos.
Lo anterior concuerda con lo reportado por
Núñez-Palenius y col. (1999)
quienes indican que para establecer un sistema de regeneración se debe
considerar que un incremento en la concentración de auxinas y consecuente
decremento en la concentración de citocininas induce la condición de callo en
los explantes. En este sentido Robert y col. (1987) obtuvieron un extenso
55
A
B
C
Figura 10. Respuesta a la inducción del estado de callo en tejidos de hoja
y piña de A. tequilana, utilizando diferentes fuentes de citocininas. A)
Segmentos de hoja; B) Callos (BAP); C) Callos (Zeatina).
56
A
B
C
Figura 11. Formación de callos en explantes obtenidos a partir de
diferentes cortes de meristemos de plántulas in vitro de A. tequilana. A)
Meristemo completo; B) Corte transversal; C) Corte longitudinal.
57
Tabla 9. Organogénesis en explantes obtenidos a partir de diferentes
fracciones de meristemo.
Tipo de corte
meristemático
Capacidad de formaci ón
de callos (%)
Capacidad de formaci ón
brotes (CFB)
Completo
68.6 b
15.9
Transversal
71.5 b
19.5
Longitudinal
77.5 a
7.8
Valores seguidos por la misma letra en cada columna no difieren estadísticamente a
p=0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
58
crecimiento de callos en explantes de A. fourcroydes utilizando una relación
alta de auxinas/citocininas (2.5 mg/l IBA y 1 mg/l BAP).
Los callos crecidos en diferentes concentraciones de auxinas (2,4-D y NAA),
solas o en combinación con BAP, mostraron efectos muy contrastantes en
cuanto a crecimiento (Figuras 12 y 13). Mientras que los callos crecidos en los
tratamientos con 2,4-D tuvieron bajos índices de crecimiento, cuando fueron
expuestos a esas mismas concentraciones pero en combinación con BAP, el
crecimiento se incrementó en más de un 100% (Figura 12). En términos
generales, los callos presentaron una apariencia compacta y un color verde
brillante, además se observó poca friabilidad y pequeñas áreas de oxidación
(Figura 14A y 14C). En contraste, los tratamientos en los que se utilizó NAA
como fuente de auxinas, presentaron altos índices de crecimiento. De manera
contraria a los tratamientos con 2,4-D, cuando fueron utilizados en combinación
con BAP los niveles decrecieron drásticamente (Figura 12); sin embargo, sólo
los callos obtenidos de los tratamientos con NAA presentaron alta friabilidad
(Figura 13B y 13D) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). La respuesta
contrastante entre las dos auxinas puede explicarse tomando en cuenta que
la actividad auxina-citocinina en la división celular puede tener una función
antagónica ya que la auxina NAA se une a la enzima reguladora de citocininas,
llamada citocinina oxidasa, o bien, puede tener un efecto sinérgico, ya que los
niveles de auxinas libres como el 2,4-D son incrementados por la influencia de
citocininas (Coenen y Lomax., 1997). Tomando en cuenta las características de
friabilidad y crecimiento, los tratamientos con alta concentración de NAA (1.0
mg/l) fueron los que produjeron una mejor respuesta (Valenzuela-Sánchez y
col., 2006).
2.
Producción de brotes
Los callos obtenidos en los tratamientos con zeatina (como fuente de
citocininas) no mostraron el desarrollo de órganos (brotes). Sin embargo,
cuando se realizó la transferencia de los callos a medio de regeneración MS1
se observó bajo nivel de organogénesis, comparado con los obtenidos en
callos inducidos en el mismo medio. En este sentido, Hazra y col. (2002),
reportaron que no se obtuvo la formación de brotes en tratamientos con zeatina
de callos de Agave sisalana.
59
a
0.6
b
0.5
0.4
c
0.3
0.2
c
d
0.5 2,4-D
0.5 2,4-D/ 5 BAP
0.25 2,4-D
0.25 2,4-D/ 5 BAP
0
0.125 2,4-D/ 5 BAP
0.1
0.125 2,4-D
Area de crecimiento cm 2
Área
a
0.7
Tratamientos mg/l
Figura 12. Crecimiento de callos de A. tequilana en respuesta a los
tratamientos con 2,4-D solo y en combinación con BAP. Valores seguidos
con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la
prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
60
0.6
0.5
b
0.4
0.3
c
cd
0.2
d
d
0.25 NAA/ 5 BAP
0.5 NAA
0.25 NAA/ 5 BAP
0.25 NAA
0
0.1 NAA
0.1
0.5 NAA/ 5 BAP
Área de crecimiento cm2
a
0.7
Tratamientos mg/l
Figura 13. Crecimiento de callos de A. tequilana en respuesta a los
tratamientos con NAA solo y en combinación con BAP. Valores seguidos
con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la
prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
61
A
B
C
D
Figura 14. Apariencia de callos generados en los tratamientos de
mantenimiento de callos. Tratamientos: A) 0.25 mg/l 2,4-D; B) 1 mg/l NAA; C)
5 mg/l BAP y 0.25 mg/l 2,4-D; D) 5 mg/l BAP y 1 mg/l NAA.
62
Los callos obtenidos a partir de las piñas o cabezas centrales (región
meristemática) completas y los explantes obtenidos de los diferentes cortes de
las mismas mostraron diferencias significativas en su coeficiente de formación
de brotes (CFB). Los callos obtenidos a partir de los cortes transversales,
presentaron los mayores índices de CFB (19.5), comparados con los
provenientes de los cortes longitudinales (Tabla 9). A pesar de que estos
últimos fueron los que mostraron los niveles más altos de capacidad de
formación de callos (Tabla 9) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006).
Los callos obtenidos de los tratamientos con NAA y 2,4-D solos o en
combinación con BAP mostraron bajos niveles de formación de brotes,
comparados con el tratamiento control (callos en medio MS1) (Tabla 10). Es
importante mencionar que utilizando el medio MS1 la aparición de brotes es de
forma inmediata a la formación del callo, sin permitir manipular dicho estado.
Del total de los tratamientos evaluados, los que presentaron mayor nivel de
CFB fueron los que utilizaron la más alta concentración de NAA (1.0 mg/l)
como único regulador y en la concentración más baja de 2,4-D (0.125 mg/l)
combinado con BAP (4.7 y 3.19, respectivamente) (Tabla 10) (ValenzuelaSánchez y col., 2006).
Las condiciones de un cultivo de callos pueden favorecer la aparición de
cambios genéticos y epigenéticos en los explantes. Este fenómeno puede
causar una pérdida progresiva de la capacidad de regeneración (Gómez,
1998). En nuestros resultados se observó que en la mayoría de los casos esta
capacidad fue recuperada, mostrando brotes de apariencia y desarrollo normal.
A pesar de que los valores de CFB fueron bajos en comparación con el sistema
de regeneración usado como control (MS1), son aceptables si consideramos
que para llevar a cabo los experimentos de transformación genética el sistema
de cultivo de callos no tiene limitación en cuanto a la disponibilidad del
explante. Otra alternativa que podría brindar este sistema, es la inducción de
variabilidad genética en el cultivo al manipular el estado de callo por tiempos
prolongados (Núñez-Palenius y col., 1999).
Un sistema de transformación genética exitoso depende particularmente de un
eficiente sistema de regeneración (Birch, 1997). En este sentido, el uso de un
sistema de regeneración vía organogénesis indirecta, a partir de segmentos
meristemáticos y la manipulación del estado de callo es una buena alternativa
63
como
sistema
de
transformación
genética
de
Agave
tequilana.
Las
características celulares como estado de diferenciación y crecimiento de los
tejidos meristemáticos y el hecho de poder hacer un cultivo repetitivo de los
callos. pueden garantizar la regeneración de plantas de origen unicelular,
facilitando así, la posibilidad de una doble selección, lo cual reduciría la
frecuencia de plantas quiméras.
3. Enraizamiento y aclimatación
Los brotes maduros transferidos a medios MS1 libre de reguladores de
crecimiento, mostraron la aparición de las primeras raíces después de diez días
y el sistema radical se observó completamente desarrollado a las tres
semanas, dando como resultado plántulas con apariencia fuerte y saludable
(Figuras 15C, 15D y 15E) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). Las plántulas
enraizadas fueron aclimatadas con un 100% de sobrevivencia y se mantuvieron
en invernadero para
que
continuaran
su ciclo de desarrollo, y hasta las
últimas observaciones se presentaban aparentemente normales (Figura 15F).
Este proceso tomo un total de 5 meses.
D. Sensibilidad de explantes de A. tequilana a agentes selectivos
1. Kanamicina (antibiótico)
A los 30 días de exposición al medio de regeneración (MS1) suplementado con
las concentraciones del antibiótico kanamicina utilizadas, los callos mostraron
diferentes porcentajes de sobrevivencia con respecto a cada una de de estas
concentraciones. Los efectos del antibiótico fueron notorios a partir de los
primeros 15 días, observándose en los callos los primeros índices de necrosis,
así como también interrupción del desarrollo, contrastando con los callos
control en los que ya se observaba la aparición de los primeros brotes. Como
se observa en la Figura 16, existe una relación inversa entre la concentración
del antibiótico en el medio y la sobreviviencia del tejido. A 25 mg/l de
kanamicina no se observó un efecto significativo del antibiótico
sobrevivió
un
96.7%,
sin
ya
que
embargo, al aumentar la dosis a 50 mg/l, la
sobrevivencia disminuyó drásticamente a un 46%, finalmente con 100 mg/l
murió el 91% de los explantes. Tomando en cuenta lo anterior, se seleccionó la
64
Tabla 10. Capacidad de regeneración de callos de A. tequilana obtenidos
de los tratamientos de mantenimiento de callos.
Concentración de reguladores
Capacidad de formación de brotes
de crecimiento (mg/l)
(BFC)
BA
2,4-D
0.0
0.0
0.0
0.0
0.25
2.06 cd
0.0
0.5
3.34 bc
0.0
1.0
4.7 b
0.125
0.0
1.85 cde
0.25
0.0
1.05 def
0.5
0.0
0.33 ef
0.0
0.0
--
0.0
0.25
0.15 f
0.0
0.5
0.87 def
0.0
1.0
0.35 ef
0.125
0.0
3.19 bc
0.25
0.0
3.12 c
0.5
0.0
2.08 de
0.025
--
14.5 a
5
10*
NAA
--
* Concentración usada en el sistema de propagación con el medio MS1.
Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de
acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms)
65
A
B
C
D
E
F
Figura 15. Regeneración completa de A. tequilana vía organogénesis
indirecta a partir de segmentos de tejido meristematico (piñas). A)
Obtención del explante inicial; B) Inducción del estado de callo; C) Producción
de brotes; D) Separación de brotes; E) Enraizamiento; F) Aclimatación.
66
concentración de 100 mg/l como dosis para llevar a cabo una preselección de
los explantes transformados. 200 mg/l podría resultar una dosis tóxica para el
tejido al ser utilizada en la primera etapa de selección, tomando esto en cuenta
se determinó usarla como un segundo tratamiento selectivo, después de que
los explantes se hubieran recuperado al ser expuestos en el medio de
regeneración adicionado con una dosis del antibiótico más baja (100 mg/l).
Santacruz-Ruvalcaba (2001) utilizó 40 mg/l de kanamicina para seleccionar
callos embriogénicos de Agave tequilana, esto demuestra que la respuesta al
antibiótico es específica del tipo de tejido incluso dentro de la misma especie.
Este contraste resalta la importancia del análisis de sensibilidad del tejido que
vaya a ser utilizado en trabajos de transformación genética, ya que la selección
es un paso determinante en el desarrollo de este tipo de metodologías (Yang y
Christou, 1994).
2. Fosfinotricina (herbicida)
Para el primer experimento de las evaluaciones de sensibilidad a fosfinotricina
(0, 0.25, 0.5, 1 y 2 mg/l) no se observó efecto alguno ya que los callos
mostraron un desarrollo normal llegando hasta la regeneración de plántulas in
vitro. En un segundo ensayo se aumentó el rango de concentración del agente,
además de forma simultánea se realizó un experimento control utilizando las
mismas concentraciones de herbicida en hojas de tabaco para verificar la
actividad de éste en el medio. A partir de la primera semana se observaron
altos índices de letalidad en las hojas de tabaco, a diferencia de las hojas
control donde la apariencia era saludable y el desarrollo fue notorio,
corroborándose así, la actividad del herbicida sobre el tejido (Figura 17). De
igual manera, al elevar las concentraciones se pudo evaluar el porcentaje de
sobrevivencia en los explantes de A. tequilana, observándose en las primeras
semanas de exposición de los callos al medio con el herbicida notorios índices
de necrosamiento. Sin embargo, a partir de la concentración de 2 mg/l de ppt,
la sobrevivencia fue importante (29%), y conforme aumentó la concentración
del herbicida esta se vio disminuida hasta llegar a 0 % (4 mg/l de ppt), por lo
que se seleccionó esta concentración como dosis letal mínima (Figura 18).
Para llevar a cabo una segunda selección en plantas ya adaptadas en
invernadero, se utilizó el herbicida ppt en su forma comercial (BASTA), al igual
67
que en los ensayos in vitro, con las primeras dosis utilizadas (0.25, 0.5, 1 y 2 %
v/v), no se observó ningún daño en las hojas de las plantas de agave. Se
decidió aumentar la dosis hasta 16 % v/v, de esta forma a la primera semana
de exposición se pudo observar el necrosamiento en las hojas a partir de la
concentración de 4%. Después de transcurrido el mes y de completar la
evaluación se determinó que 8% (v/v) era una concentración adecuada para
seleccionar plantas de agave trasformadas con el gen bar (confiere resistencia
a fosfinotricina) ya que a concentraciones menores el daño en las plantas no
era total (Figura 19). Tomando en cuenta que las dosis comerciales
recomendadas para el control de malezas se encuentran generalmente por
arriba del 1 % v/v del producto, las plantas de agave mostraron ser resistentes
a concentraciones del herbicida hasta 4 veces mayores.
En contraste con los resultados obtenidos para el antibiótico kanamicina, las
dosis determinadas para el herbicida fosfinotricina tanto in vitro como para
plantas en invernadero fueron similares a las reportadas por SantacruzRuvalcaba (2001), donde reporta 3 mg/l de ppt para seleccionar callos
embriogénicos y 6% v/v de BASTA para plantas en invernadero. Para la
selección in vitro utilizando 3 mg/l de ppt se observaron todavía pequeños
índices de sobrevivencia (Figura 18), sin embargo se debe tomar en cuenta
que en este trabajo se evaluaron callos organogénicos y Santacruz-Ruvalcaba
trabajó callos embriogénicos.
E. Ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens
1. Incorporación de plásmidos en cepas de Agrobacterium
Las cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformadas con los
plásmidos pBI121,
p35SGUS y pBINGFP mediante congelamiento con N2
líquido crecieron satisfactoriamente en medio de selección, lo que indicó que
contenían el plásmido transferido, sin embargo utilizando el método de cruza
triparental (Ditta y col., 1980), no fue posible recuperar colonias resistentes, a
pesar de ser este un método sencillo y ampliamente utilizado para transferir
plásmidos binarios recombinantes a células de A. tumefaciens. Para corroborar
la incorporación de los plásmidos en la bacteria, se llevó a cabo un análisis tipo
68
% de
sobrevivencia
100
a
100
a
96.7
90
80
70
60
b
50
46
40
30
20
c
10
9.0
0
0
25
50
100
c
1.3
200
Concentración
mg
de kanamicina mg/l
Figura 16. Sensibilidad de callos de A. tequilana al antibiótico kanamicina.
Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de
acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
69
2.5
0
7.5
5
10
Figura 17. Efecto en hojas de tabaco a diferentes concentraciones del
herbicida fosfinotricina (ppt) adicionado en el medio (mg/l).
70
% de
sobrevivencia
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
100
b
29
c
8
0
2
3
c
0
4
c
0
5
mg/l de PPT
mg
Figura 18. Sensibilidad de callos de A. tequilana al herbicida fosfinotricina
(ppt). Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p=
0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
71
% BASTA
(V/V)
Plantas evaluadas
1
2
3
4
5
6
7
0
-
-
-
-
-
-
-
4
+
++
+
+
+
++
+
8
+++ ++
+++
+++
+++
+++
+++
12
+++ +++
+++
+++
+++
+++
+++
16
+++ +++
+++
+++
+++
+++
+++
Daño:
- sin daño, + mínimo, ++ abundante, +++ total
Figura 19. Sensibilidad de plantas de A. tequilana al herbicida
fosfinotricina en su forma comercial (BASTA).
72
PCR con oligonucleotidos dirigidos al gen nptII. En el DNA obtenido de las
colonias seleccionadas se logró amplificar un fragmento correspondiente al gen
nptII, que confiere resistencia al antibiótico kanamicina, demostrando asi su
transformación. En la Figura 20, se observa la banda de 617 pb que
corresponde al fragmento del gen nptII presente en las cepas analizadas, las
cuales se muestran en los carriles 1 y 2, similar al que se observa en el carril 5
que muestra una banda correspondiente al fragmento de 617 pb amplificado
directamente del DNA plasmídico (p35SGUS) utilizado como control positivo,
esta banda no se observa en el carril 4 donde se cargó el producto de la
amplificación de agua como control negativo.
2. Susceptibilidad del A. tequilana a la infección de cepas silvestres de
Agrobacterium tumefaciens
La enfermedad de la agalla de la corona producida por la transferencia del TDNA de Agrobacterium a la célula vegetal, es un microcosmos en donde la
bacteria puede crecer y durante este proceso ocurren principalmente dos
fenómenos, consecuencia de la expresión de los genes presentes en el T-DNA:
(a) producción de enzimas que estimulan el crecimiento del tumor, y (b)
producción de opinas, que son metabolizables solamente por la bacteria
(Valentine, 2003). Para llevar a cabo los ensayos de transformación vía
Agrobacterium se evaluó la susceptibilidad de las plantas de agave a la
infección por cepas silvestres de la bacteria, como se describió en la
metodología. No se observó la formación de agallas como síntoma de la
infección de las cepas (Figura 21), posiblemente porque, el agave es una
planta monocotiledónea y se ha reportado que este tipo de plantas no son
hospederas naturales para A. tumefaciens (Vain y col., 1995; Tzfira y Citovsky,
2002; Gelvin, 2003). La ausencia de formación de tumores en plantas
monocotiledóneas puede deberse a que no producen factores fenólicos que
activan la expresión de los genes vir en el plásmido Ti, a que no se lleva a cabo
la trascripción de los oncogenes o por diferencia en la fisiología de hormonas
endógenas comparadas con las presentes en plantas dicotiledóneas (Usami y
col., 1987; Smith y Hood, 1995). Sin embargo, De Cleene and De Ley (1976),
reportaron la formación de tumores producidos como resultado de la infección
con la bacteria A. tumefaciens en la especie Agave salmiana Otto. Con estos
73
resultados no se descartó el uso de Agrobacterium como medio de
transformación para la especie tequilana, ya que se han desarrollado exitosos
sistemas de transformación, manipulando las condiciones de infección en otros
cultivos, a pesar de que estos no presentaron la formación de tumores debido a
la infección natural de A. tumefaciens, como ejemplo podemos mencionar maiz,
(Ishida y col., 1996), arroz (Chan y col., 1993; Hiei y col., 1994; Dong y col.,
1996; Rashid y col., 1996; Toki, 1997), cebada (Tingay y col., 1997) y trigo
(Cheng y col., 1997).
Otros puntos importantes a considerar en el proceso de infección con
Agrobacterium tumefaciens y a los cuales también se le puede atribuir el que
no se haya observado la formación de tumores en las plantas de Agave
tequilana, son la edad de la planta, su estado fisiológico, así como el proceso
de infección y la cepa utilizada, ya que se ha observado la influencia de estos
factores en el desarrollo de tumores en plantas dicotiledóneas sensibles a la
infección por la bacteria (Hernalsteens y col., 1984; Vain y col., 1995).
Finalmente es importante mencionar que el primer paso en el proceso de
infección mediado por Agrobacterium, es la fijación de la bacteria a la pared
celular de la planta hospedera, el cual se ve también afectado por la edad del
tejido, el tipo de células, el estado del ciclo celular, entre otros parámetro
fisiológicos (Graves y col., 1988).
3. Selección de condiciones de transformación
Para determinar las condiciones óptimas para establecer un sistema de
transformación vía Agrobacterium tumefaciens, el primer parámetro evaluado
fue el daño en el explante, ya que los azúcares y compuestos fenólicos que son
liberados como consecuencia de heridas en el tejido vegetal, además de ser
una señal de oportunidad patogénica para la bacteria, también inducen la
trascripción de los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia e
integración del T-DNA en la célula vegetal (Valentine, 2003). Park y col., (1996)
reportan que hiriendo sistemáticamente con aguja hipodérmica un tejido
meristemático
de
arroz,
se
favoreció
su
transformación
genética,
probablemente porque se facilitó la penetración de la bacteria en el tejido, se
74
M 1 2
3 4 5
1,018pb
506 pb
617 pb
Figura 20. Amplificación del fragmento de 617 pb del gen nptII presente en
los plásmidos P35SGUS y pBIN m-gfp5-ER en cepas LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens después de la transformación. Carril M)
Marcador 1 Kb; 1) LBA4404 con p35SGUS; 2) LBA4404 con pBIN m-gfp5-ER;
4) Control negativo; 5) Control positivo (p35SGUS).
75
A)
B)
D)
C)
E)
Figura 21. Susceptibilidad de plantas de A. tequilana a la infeccion de
natural Agrobacterium tumefaciens. A) Infección con C58; B) Infección con
H63; C) Infección con A281; D) Infección con LBA4404; E) Ensayo con agua
(control -).
proporcionó acceso a células susceptibles y la producción de componentes que
inducen la expresión de los genes de virulencia.
76
En nuestros estudios, al evaluar los diferentes tipos de daño en callos
obtenidos de tejido meristemático y de acuerdo al porcentaje de sobrevivencia,
el daño con aguja de 13 mm fue el óptimo para realizar los ensayos de
transformación, ya que éste fue el que menos efecto negativo causó a los
explantes, ya que presentaron el mayor índice de sobreviencia comparado con
los otros dos tratamientos, los cuales no mostraron diferencias significativas al
ser comparados entre ellos (Figura 22).
Se consideró el parámetro de sobrevivencia para seleccionar un método de
daño, ya que además de tomar en cuenta el efecto que tienen las heridas en el
tejido al favorecer los fenómenos de transferencia del T-DNA, es importante
considerar que un daño excesivo en los callos podría limitar su recuperación y
como consecuencia la regeneración de brotes.
Otro de los parámetros evaluados fue el tipo de medio de cultivo bacteriano
para llevar a cabo la infección, los resultados mostraron que el medio de cultivo
sólido fue más agresivo para el tejido, gran porcentaje de los explantes no se
pudieron regenerar, esto se atribuye a la densidad bacteriana y a la exposición
directa con el tejido. A partir de lo anterior, se decidió utilizar medio líquido de
cultivo bacteriano para realizar los ensayos de transformación. Porque de igual
forma al evaluar los índices de sobrevivencia de exposición del cultivo
bacteriano con el tejido se determinó 10 min como tiempo óptimo (Figura 23).
Tomando en cuenta que la concentración celular y el periodo de inoculación
son variables claves en la transferencia de genes mediada por Agrobacterium
(Birch, 1997), es importante destacar que el uso de tiempos de infección
prolongados y densidades bacterianas altas, puede tener efectos adversos en
el crecimiento de los callos y su subsecuente regeneración, a pesar de que los
niveles de expresión transitoria sean altos, como lo reportaron en arroz Kumria
y col., (2001).
El
periodo de cocultivo es un parámetro determinante en el proceso de
transformación vía Agrobacterium y difiere dependiendo de la especie. Se ha
observado que largos periodos muestran mayor eficiencia en la transferencia
del plásmido Ti a la célula vegetal (Kondo y col., 2000). En explantes de un
híbrido cítrico (Citrange), los niveles de expresión transitoria del gen gus A se
incrementaron conforme se aumento el periodo de cocultivo de 1 a 5 días
(Cervera y col., 1998), de manera similar Cao y col., (1998) sugieren que la
77
baja eficiencia de transformación de manzana (James and Dandekar 1991) se
debió a un periodo insuficiente de cocultivo, ya que un prolongado periodo de 2
a 4 días incrementó la expresión gus casi 100 veces (De Bond y col, 1994).
Haciendo referencia a lo anterior, en transformación genética de ajo se reportó
que con 3 o más días de cocultivo se observaron mayores niveles de expresión
transitoria comparada con 1 y 2 días respectivamente (Kondo y col., 2000). En
este sentido, en nuestros resultados observamos que en callos de A. tequilana
los mayores niveles de expresión del gen gus A se encontraron con 4 días de
cocultivo del tejido con la bacteria (Figura 24); después de este tiempo no se
observó un diferencia notoria en la expresión del gen gus A. Tomando en
cuenta lo anterior se decidió seleccionar 4 días como tiempo óptimo de
cocultivo, además de los resultados en la expresión transitoria, también se
consideró que se ha reportado que resulta más difícil eliminar la bacteria
Agrobacterium después de largos periodos de su exposición con el tejido
vegetal teniendo como consecuencia un sobrecrecimiento de la bacteria y un
decremento en la regeneración de brotes transformados (Cervera y col., 1998;
Kondo y col., 2000). En la Figura 24 también se observa una diferencia muy
marcada en cuanto a la apariencia y desarrollo de los callos expuestos a los
diferentes tiempos de cocultivo, mientras mayor fue el tiempo de cocultivo los
callos mostraron una mejor apariencia y un desarrollo más avanzado, algunos
incluso iniciando la producción de brotes. Lo anterior puede ser explicado, si
tomamos en cuenta que un periodo adecuado de cocultivo pudo permitir una
recuperación del tejido después del tratamiento de infección con la bacteria, lo
cual hizo menos agresivo el cambio a medio con antibiótico para llevar a cabo
la eliminación de la misma.
Los resultados anteriores son los primeros reportes de obtención de expresión
transitoria del gen gus A en explantes de Agave tequilana mediante su
transferencia utilizando como sistema a la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
Hasta la fecha no se encuentra reportado en la bibliografía ningún trabajo
similar, tomando esto en cuenta es importante destacar que estos resultados
sientan las bases para el establecimiento de un sistema de transformación
genética para la planta monocotiledónea A. tequilana vía A. tumefaciens.
78
% de
sobrevivencia
a
100
10
a
93.3
b
73.3
9
8
b
70
7
6
5
4
3
2
1
0
Control
Aguja 13 mm
Aguja 32 mm
Partículas
Figura 22. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tipos
de daño. Valores seguidos con la misma letra, no difieren estadísticamente a
p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
79
% de
sobrevivencia
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
91.06
b
71.1
b
66.76
c
49
0
5
10
20
c
39
30
Minutos
Figura 23. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes
tiempos de exposición con el cultivo bacteriano. Valores seguidos con la
misma letra, no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de
diferencias mínimas significativas (dms).
80
Explantes
Días de cocultivo
1
2
3
4
5
1
-
+
-
+
-
2
-
-
-
+
-
3
+
+
-
++
-
+
++
++
++
-
4
5
++ +++
-
+++ +++
- Sin coloración
+ Intensidad de coloración
Control
Figura 24. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes tiempo de
cocultivo de A. tumefaciens con callos de A. tequilana.
F. Ensayos de transformación vía biobalística
81
1. Selección de condiciones de transformación
Previo a los ensayos de transformación en agave se estandarizaron las
condiciones de bombardeo con equipos de alta y baja presión, en hojas de
tabaco como sistema control. Evaluando el número de foci (manchas o puntos
azules) como producto de la expresión transitoria del gen gus A, la cual fue
considerada como una unidad de expresión (Hagio y col., 1995) se
seleccionaron como condiciones de partida 80 psi y 20 cm de distancia para el
sistema de baja presión y 900 psi y 11.5 cm para alta presión. En la Figura 25
se observan de manera abundante y homogénea los puntos azules (foci) sobre
las hojas de tabaco como producto de la reacción enzimática llevada a cabo
por la enzima β-glucuronidasa, la cual es codificada por el gen gus A.
A partir de la última década, las técnicas de biobalística han sido mejoradas y
utilizadas de manera tal que podrían ser extrapoladas a cualquier tipo de tejido
y especie vegetal (Christou, 1992; Sanford y col., 1993; Takumi y Shimada,
1996; Kim y Minamikawa, 1997). Es indispensable el establecimiento de las
condiciones de bombardeo a fin de obtener valores promedio entre células
muertas y el menor daño posible, lo cual se ve reflejado en los niveles de
expresión del transgen y la consecuente recuperación del plantas transgénicas
(Gordon-Kam y col., 1990; Kauch y col., 1995).
Tomando como base los resultados observados en los explantes de tabaco, se
hicieron evaluaciones de la expresión transitoria del gen gus A utilizando
diferentes condiciones de bombardeo, como tiempo de exposición al medio
osmótico, presión de bombardeo, distancia y concentración de DNA, lo que
permitió obtener los siguientes resultados.
Para el medio osmótico, primero se evaluaron diferentes tiempos de exposición
del medio con los explantes previo al bombardeo. Se registro el número de
explantes que presentaban foci, así como el número de foci en cada explante
para cada uno de los tratamientos evaluados. Al llevar a cabo la comparación
estadística de los resultados, nos permitió seleccionar 4 horas como tiempo
óptimo de exposición, ya que fue el que mostró una diferencia significativa con
respecto a los otros tratamientos (Tabla 11). Sin embargo esta diferencia se vio
influenciada por la disminución de la concentración del DNA plasmidico
utilizado, ya que al variar el tiempo de exposición utilizando 1 µg/µl, no se
observó diferencia significativa en cuanto a los niveles de expresión en los dos
82
tratamientos, contrastantemente a lo que se observó cuando se utilizó 0.1 µg/µl
(Tabla 11), por esta razón se llevó a cabo una evaluación posterior de la
concentración del DNA en los dos plásmidos utilizados.
La expresión tanto transitoria como estable se ve mejorada al aplicar un
tratamiento osmótico, ya que se reduce el daño celular al prevenir la extrusión
del protoplasma de las células bombardeadas y
incrementan
las
posibilidades
de
sobrevivencia
de esa manera se
celular,
este
estado
plasmolizado debe ser mantenido por algunas horas antes y después del
bombardeo para que sea mas efectivo (Vain y col., 1993; Yang y Christou,
1999).
Otros de los parámetros evaluados fueron la distancia y la presión, la
evaluación se realizó de forma conjunta para ambos sistemas (alta y baja
presión).
Como se observa en la Tabla 12, al bombardear callos con el sistema de baja
presión se observaron diferencias en los índices de expresión transitoria del
gen gus A con las diferentes combinaciones de presión y distancia. El mayor
número de foci, se observó utilizando 20 cm de distancia combinada con 80 y
90 psi de presión. Tomando en cuenta estos resultados se seleccionaron las
condiciones 80 psi de presión y 20 cm como óptimas para la expresión
transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana (Tabla 12).
Los niveles de expresión transitoria no se incrementaron de manera
proporcional al incremento de la presión, esto es similar a lo reportado por Stiff,
(1995), de igual manera Santacruz-Ruvalcaba reportan un comportamiento
similar en callos embriogénicos de Agave tequilana bombardeados. Si bien
altos índices de expresión transitoria no garantiza un alto índice de
transformación estable, si establece condiciones a seguir para conseguir este
tipo de transformación.
Se evaluó el efecto de la concentración del DNA sobre la expresión transitoria
en los dos plásmidos pBI426 y pAHC25, y se determinó que la concentración
del plásmido, así como el tipo tienen una influencia directa sobre la expresión
transitoria del gen gus A en callos de agave. Se observaron diferencias
significativas al disminuir la concentración de ambos plásmidos, sin embargo
esta diferencia fue más notoria en los ensayos realizados con el plásmido
pBI426 al aumentar arriba del doble el número de foci contabilizados (Tabla
83
13). Al comparar todos los tratamientos evaluados se determinó que el nivel
más alto de expresión transitoria del gen gus A se observó con el plásmido
pAHC25 en 0.1µg/µl de concentración (Tabla 13). Tomando en cuenta lo
anterior, es importante cuestionar la influencia de la concentración de DNA del
plásmido en la expresión del gen gus A; ya que esta puede estar también
influenciada por el tipo de promotor bajo el cual esté regulado el gen reportero
y el tamaño del plásmido. En este sentido los índices de expresión transitoria
obtenidos con el plásmido pAHC25 fueron ligeramente mayores comparados
con el plásmido pBI426, esto se debe probablemente a que en el plásmido
pAHC25 el gen gus A esta regulado por un promotor de tipo especifico para
monocotiledóneas (Ubi) y el Agave tequilana es una planta perteneciente a
este grupo, mientras que el otro plásmido contiene un promotor constitutivo
(35S). Al igual que en otros trabajos de transformación genética de
monocotiledóneas el uso de promotores específicos para este tipo de plantas
ha resultado en mayores niveles de expresión comparados con el uso de
promotores constitutivos (Taylor y col., 1993; Sági y col., 1995). SantacruzRuvalcaba (2001), recomiendan la evaluación de promotores específicos para
monocotiledóneas con la finalidad de aumentar los niveles de transformación.
Los ensayos de expresión transitoria llevados a cabo en el sistema de alta
presión, también mostraron diferencias en cuanto a los parámetros de distancia
y presión analizados. Los resultados fueron muy variados y en la mayoría de
los tratamientos los valores de expresión fueron un poco más bajos
comparados con los obtenidos con el sistema de baja presión (Tabla 11, 12, 13
y 14), a diferencia del tratamiento de 1350 psi de presión y 12 cm de distancia
el cual mostró valores muy altos de expresión (Tabla 14). En este sentido se
seleccionaron tales condiciones como óptimas para llevar a cabo la expresión
transitoria en callos de A. tequilana. Esto es diferente a las selecciones
determinadas por Santacruz-Ruvalcaba (2001) en la transformación de callos
embriogénicos de A. tequilana (800 psi de presión y 7 cm de distancia),
quienes reportan la obtención de una media de 5.9 foci por 25 mg de callo.
De manera general, comparando los niveles de expresión transitoria obtenidos
en este trabajo con trabajos similares reportados para otros cultivos incluyendo
otras monocotiledóneas (Oard y col., 1990; Bansal, y col., 1992; Kauch y col.,
1995; Sági y col., 1995 y Cruz-Hernández y col., 2000), podrían ser un poco
84
bajos a excepción de los obtenidos a 1350 psi y 12 cm, sin embargo siguen
siendo considerables, tomando en cuenta que son los primeros reportes de
expresión transitoria en este tipo de plantas, lo cual abre de manera importante
la posibilidad de seguir variando condiciones para lograr aumentar estos
niveles y de igual manera favorecer la transformación estable.
En las Figuras 26 y 27, se observa la expresión gus A en los callos de A.
tequilana bombardeados con baja y alta presión respectivamente, es notoria la
diferencia entre ambos sistemas en cuanto a la apariencia de los foci. En los
bombardeos con el sistema de baja presión los foci, se observan como
manchas dispersas
y menos definidas (Figura 26), contrario a los
bombardeados con el sistema de alta presión donde se muestran como puntos
pequeños y bien definidos (Figura 27). Lo anterior puede deberse a que la
dispersión de las partículas es diferente en ambos sistemas; en el sistema de
baja presión no se logra una buena dispersión observándose conglomerados
de partículas de tungsteno a diferencia con en el sistema de alta presión,
donde el mecanismo permite una dispersión mas homogénea de ellas; esto se
corroboro en ensayos de bombardeo hechos sobre papel filtro con ambos
sistemas.
Es importante mencionar que se llevaron a cabo ensayos de expresión
transitoria en los callos de Agave tequilana utilizando el gen gfp como reportero
tanto con el sistema de biobalística como vía Agrobacterium tumefaciens,
tomando en cuenta la ventaja que tiene el uso del gen gfp de la proteína verde
fluorescente como gen reportero, ya que su monitoreo no requiere la
destrucción del tejido. Pese a esto los resultados no pudieron ser evaluados en
ninguno de los dos sistemas, ya que no se pudo observar la fluorescencia de la
proteína producto de la expresión del transgen. El color verde de los callos de
A. tequilana es muy intenso lo cual indica el alto contenido de clorofila,
tomando esto en cuenta probablemente al incidir la lus uv a los callos, la
clorofila presente en el tejido se confundió con la posible fluorescencia de la
proteína. Cabe mencionar que no se debe descartar el uso de este gen
reportero para trabajos posteriores de transformación en esta especie, ya que
seria importante evaluar diferentes tejidos como fuente de explante para este
tipo de trabajos, los cuales no interfirieran con el monitoreo de la proteína.
85
Figura 25. Expresión del gen gus A en explantes de tabaco. El tabaco se
utilizó como sistema control.
86
Tabla 11. Efectos de la exposición al medio osmótico (sorbitol 15%) en la
expresión transitoria del gen gus A. Se utilizó el plásmido pAHC25 (80 psi
a 20 cm).
Tiempo de
exposición
(horas)
Concentración
de DNA ( µg/µl)
*Número de
explantes
GUS positivo
Número de
foci
promedio por
explante
4
1
4
39 b
4
0.1
4.5
59 a
8
1
2.5
33 b
8
0.1
3.5
37 b
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
87
Tabla 12. Efectos de la distancia y presión en explantes de Agave
tequilana bombardeados con el plásmido pAHC25 utilizando el sistema de
baja presión.
Número de
promedio
de foci por
explante
Distancia
(cm)
Presión
(psi)
Número de
explantes
GUS
positivo
17.5
80
90
100
5
9
8
20
80
90
100
7
9
1
27 a
12 ab
1d
22.5
80
90
100
9
7
1
9b
8c
2d
12 bc
9b
10 b
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
88
Tabla 13. Efecto de la concentración de DNA de los plásmidos pAHC25 y
pBI426 en la expresión transitoria del gen gus A. Bombardeos a 80 psi de
presión y 20 cm de distancia.
Plásmido Concentración
de DNA (µg/µl)
Número de
explantes
GUS positivo
Número
promedio de
foci por
explante
pAHC25
1
4
47 b
pAHC25
0.1
6.5
52 a
pBI426
1
4.6
18 c
pBI426
0.1
3.3
44 b
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
89
Figura 26. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave
tequilana bombardeados con el sistema de baja presión.
90
Tabla 14. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes presiones y
distancias utilizando el sistema de alta presión.
Distancia
(cm)
Presión
(psi)
Número de
explantes GUS
positivo
Número de
promedio de
foci por
explante
9
450
900
1350
2
2
4
3 d
7 c
10 b
12
450
900
1350
0
3
8
0e
15 b
106 a
15
450
900
1350
0
2.5
1
0e
8c
6d
* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores
seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
91
Figura 27. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave
tequilana bombardeados con el sistema de alta presión.
92
G. Selección de transformantes
Los ensayos de transformación estable vía Agrobacterium y biobalística en
callos de Agave tequilana se realizaron con las siguientes condiciones
seleccionadas a partir de los experimentos de expresión transitoria:
Agrobacterium tumefaciens
Daño con aguja de 13 mm, 10 min de exposición con cultivo líquido
concentrado de la bacteria (+100 µM de acetocyringona), 4 días de cocultivo y
eliminación de la bacteria en medio con 500 mg/l de cefotaxima.
Biobalística
Tratamiento de 4 horas en medio con 15% de sorbitol previo al bombardeo, 80
psi de presión a una distancia de 20 cm utilizando el sistema de baja presión y
1350 psi de presión y 12 cm de distancia para el sistema de alta presión y 48
horas en oscuridad para la recuperación del tejido.
Después de realizar los eventos de transformación los explantes fueron
sometidos al sistema de selección correspondiente.
En los ensayos de transformación estable vía Agrobacterium, al colocar los
callos en medio de regeneración MS1 suplementado con 100 mg/l del
antibiótico kanamicina como dosis de preselección, lograron sobrevivir varios
explantes, sin embargo al llevar a cabo la segunda ronda de selección (200
mg/l) estos explantes mostraron índices severos de oxidación y no fue posible
regenerar ningún material resistente a la selección con el antibiótico. Lo
anterior pudo deberse a que no se llevó a cabo una integración de los genes,
probablemente el mecanismo de transferencia se realizó en las células
superficiales del tejido; tomando en cuenta esto es necesario evaluar otros
tratamientos de daño que permitan una difusión más profunda de la bacteria.
El hecho de no haber seleccionado materiales de A. tequilana transformados
vía Agrobacterium tumefaciens, no descarta la posibilidad de que se llegue a
lograr con éxito este proceso, ya que los resultados en cuanto a la expresión
transitoria del gen gus A discutidos anteriormente, demuestra al menos la
presencia del gen al tejido vegetal mediante este método. En este sentido es
importante evaluar en trabajos posteriores variantes en las condiciones de
infección y cocultivo, así como otras cepas de Agrobacterium que presenten
93
más
virulencia,
todos
estos
factores
han
demostrado
favorecer
la
transformación genética en otras plantas monocotiledóneas.
En los ensayos mediante biobalística (baja presión) se lograron seleccionar
callos bombardeados con ambos plásmidos pAHC25 y pBI426, en medio MS1
de regeneración suplementado con 4 mg/ de ppt o 100 mg/l de kanamicina
respectivamente. Al llevar a cabo la segunda ronda de selección con ambos
agentes, sólo sobrevivieron los callos bombardeados con el plásmido pBI426
(Figura 28), los cuales mostraron una apariencia sana e inicios de brotación
durante los subcultivos en presencia de 200 mg/l del antibiótico kanamicina.
De un total de 150 callos bombardeados con el plásmido pBI426, se lograron
seleccionar solo 12 las cuales fueron designadas como B1 hasta B12, lo que
nos da un 8% de eficiencia de transformación en cuanto a
la selección,
utilizando el sistema de baja presión.
Con alta presión, también se regeneró material bombardeado con el plásmido
pBI426 (Figura 29).
De un total de 250 explantes bombardeados se seleccionaron 22 designadas
A1 hasta A22, resultando un 8.8% similar a los obtenidos con el sistema de
baja presión.
En los resultados obtenidos en la selección de material transformado es notorio
que los niveles de expresión transitoria no fueron correspondientes a los
índices de material seleccionado, ya que al comparar los índices de expresión
transitoria entre los plásmidos pAHC25 y pBI426, la expresión fue mas alta
utilizando el primero (Tabla 12), probablemente eso de deba a la diferencia en
tamaño, ya que la integración solo se logro con el plásmido de menor tamaño
(pBI426).
Como se ha reportado, la expresión transitoria de un gen es relativamente fácil
de producirse, sin embargo la recuperación de transformantes estables se
presenta en porcentajes muy bajos (Russell y col., 1992).
Tomando en cuenta que el porcentaje de recuperación de callos en el proceso
de selección es considerable, esto no es garantía de que se conserve este
porcentaje de manera estricta en su evaluación molecular.
94
Figura 28. Selección de callos transformados mediante biobalística
(Sistema de baja presión).
95
Figura 29. Selección de callos transformados mediante biobalística
(Sistema de alta presión).
96
H. Análisis moleculares
1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Los materiales sobrevivientes a la selección, que fueron bombardeados
mediante ambos sistemas (baja y alta presión), se analizaron mediante PCR,
para corroborar la presencia de los transgenes. En la Figura 30 se observa en
los carriles 5 y 6 la amplificación de un fragmento de 617 pb correspondiente al
gen nptII, en dos de las muestras seleccionadas como posibles candidatas que
fueron transformadas con el plásmido pBI426 mediante biobalística (B3 y B7).
De manera similar en la Figura 31, se muestra la amplificación de un fragmento
de 1500 pb correspondientes al gen gus A en DNA genómico obtenido de las
mismas muestras anteriores (B3 y B7).
Las 22 muestras (A1-A22) de DNA genómico obtenidas de los callos
transformados con alta presión y que sobrevivieron al sistema de selección
durante un mes, también fueron analizadas molecularmente y de estos solo se
logro la amplificación del fragmento correspondiente al gen gus A en 7 de las
candidatas (A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20).
La presencia de estos fragmentos de manera preliminar sugiere que los
materiales de donde se obtuvo el DNA es transgénico. Y como se menciono
anteriormente los porcentajes de selección no fueron correspondientes a los
obtenidos mediante el análisis PCR.
Todas las muestras anteriores fueron evaluadas posteriormente mediante un
análisis tipo Southern blot para confirmar la integración del gen.
2. Análisis tipo Southern blot
Para confirmar la integración del transgen producto de la transformación
estable en los callos de Agave tequilana, se realizo un análisis tipo Southern
blot en las nueve muestras de DNA genómico que dieron positivo al análisis
PCR (B3, B7, A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20). Como se puede observar en la
Figura 32 que muestra el autoradiograma obtenido en la hibridación con las
muestras, en el carril 2 se observa la señal positiva correspondiente a la
hibridación de la sonda (gus A) con el plásmido pBI426 utilizado como control
positivo, de manera contraria en el carril 3 no se observa señal de hibridación
con el DNA de A. tequilana sin transformar. En los carriles 6, 8, 9 y 10 se
97
observan bandas de diferentes tamaños productos de la hibridación de la
sonda con el DNA de las muestras A8, A15, A19 y A20, de manera similar en el
carril 11 se observan también señales positivas que corresponden a la muestra
B7 (Figura 32). Tomando en cuenta los diferentes tamaños de señales
observadas en el autoradiograma se puede estimar la integración de al menos
de 1 a 4 copias en las diferentes muestras positivas. Los niveles de expresión
del transgen en plantas es generalmente impredecible, esto se debe
principalmente al número de copias y/o el sitio de integración, sobre todo
plantas transgénicas generadas mediante biobalística las cuales presentan
patrones de integración que son generalmente complejos debido al propio
mecanismo de integración del sistema sobre el cual no se tiene un control
directo (Finnegan y Mc Elroy, 1994; Hansen y Wright, 1999).
Los resultados obtenidos en este último análisis nos permite demostrar la
integración estable de genes en el genoma nuclear de células de callos
organogénicos de Agave tequilana, mediante el uso de biobalística.
De manera general con los resultados de la hibridación nos permitió corroborar
aquellos obtenidos por PCR, ya que de las 9 muestras analizadas que
presentaron amplificación del transgen, en 5 de ellas se confirmo su naturaleza
transgénica.
Tomando en cuenta el número total de callos bombardeados con cada uno de
los sistemas y el número que resultaron positivos en el análisis Southern blot,
la eficiencia de transformación para el sistema de baja presión es de 0.6 y para
alta presión de 1.66.
El uso de la técnica de biobalística para la transferencia de genes en Agave
tequilana, nos produjo resultados satisfactorios. Lo que nos confirma la
universatilidad de esta técnica en cuanto al rango de hospederos susceptibles
de transformación, además de permitir el uso de más de un plásmido, ya que
se puede lograr la expresión de múltiples genes (Ellis y col., 1993; Hadi y col.,
1996).
Cabe resaltar que este trabajo es el primero en llevar a cabo la evaluación de
diferentes técnicas de transformación genética en Agave tequilana, lo que
establece bases para desarrollar futuras investigaciones con la finalidad de
modificar genéticamente este cultivo ya sea para transferirle características
especificas o bien para su estudio.
98
1 2
3
4
5 6
650 pb
500 pb
617 pb
Figura 30. Amplificación del fragmento de 617 pb del gen npt II en
materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección. Carriles
1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control negativo (agua); 3) DNA
de A. tequilana sin transformar; 4) Control positivo plásmido pB1426; 5 y 6)
Muestras de candidatas B3 y B7 respectivamente.
99
1
2
3 4
5
6
1,650 pb
1,000 pb
1500 pb
Figura 31. Amplificación del fragmento de 1500 pb del gen gus A en
materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección. Carriles
1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control negativo (agua); 3) Control
positivo plásmido pB1426; 4 y 5) Muestras de candidatas B3 y B7
respectivamente; 6) DNA de A. tequilana sin transformar.
100
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
5,000 pb
2,000 pb
1,650 pb
1000 pb
Figura 32. Análisis Southern blot con el gen gus A en el DNA de callos
desarrollados en medio de selección. Carriles 1) Marcador de peso
molecular de 1Kb; 2) Control positivo (plásmido); 3) Control negativo (DNA de
agave sin transformar); Carriles 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) A3, A5, A8, A9, A15,
A19 y A20; Carriles 11 y 12) B3 y B7.
101
VII. CONCLUSIONES
1) El tejido meristemático de hijuelos de un año de edad de Agave
tequilana fue adecuado para establecer un sistema de cultivo in vitro con
capacidad de regeneración.
2) El proceso de transferencia a suelo y aclimatación de plantas de A.
tequilana regeradas in vitro fue sencillo y con excelente porcentaje de
sobrevivencia.
3) El uso de segmentos de hojas de plántulas de A. tequilana enraizadas in
vitro y tratadas con 2,4-D, no permite la producción de embriones con
capacidad de germinación.
4) El corte longitudinal del meristemo de plántulas de A. tequilana
enraizadas in vitro generó explantes con alta producción de tejido no
diferenciado (callo) pero con baja capacidad de formación de brotes
(CFB). Opuestamente, el corte transversal, generó poca producción de
callo pero con alta capacidad de formación de brotes.
5) El uso de altas concentraciones de auxinas permitió cultivar y propagar
in vitro callos organogénicos de A. tequilana con capacidad regenerable;
sto brindó una fuente de explantes que puede manipularse para
transformación genética.
6) Los mayores índices de capacidad de formación de brotes (CFB) en el
mantenimiento del estado de callo los presentaron los tratamientos con
NAA solo o 2,4-D con BAP. En los experimentos de transformación, esta
propiedad los hizo más adecuados como tejido blanco para asegurar la
regeneración de brotes transformados vía organogénesis indirecta.
102
7) El medio de regeneración suplementado con 100 mg/l (preselección) y
200 mg/l (segunda selección) del antibiótico kanamicina o 4 mg/l del
herbicida fosfinotricina, permitió seleccionar callos de Agave tequilana
transformados con los genes de selección nptII y bar respectivamente.
De igual manera el uso de una concentración de 8 % v/v del herbicida
fosfinotricina en su forma comercial (BASTA) sobre hojas de plantas de
agave, permitirá llevar a cabo una doble selección en plantas
transformadas con el gen bar.
8) Tomando en cuenta que las plantas de A. tequilana no mostraron
susceptibilidad
a
la
infección
natural
de
cepas
silvestres
de
Agrobacterium tumefaciens, se cuenta con un sistema de expresión
transitoria para el gen gus A en este cultivo, sentando de esta manera
las bases para el desarrollo de protocolos de transformación mediante
esta vía.
9) Se obtuvieron niveles aceptables de expresión transitoria del gen gus A
en callos de A. tequilana bombardeados mediante sistemas de alta y
baja presión.
10) Los niveles de expresión transitoria del gen (gus A) fueron mayores con
el promotor de la ubiquitina de maíz (específico de monocotiledóneas)
que con el promotor del virus del mosaico de la coliflor (constitutivo). Sin
embargo, la integración de los genes sóo se logró en el segundo caso.
11) Mediante el sistema de biobalística, tanto de alta como de baja presión
y usando el plásmido pB1426, se logró obtener material seleccionado al
cual mediante análisis moleculares de tipo PCR y Southern blot se
confirmó la integración de los transgenes en el genoma vegetal.
12) Las eficiencias de transformación obtenidas mediante biobalística
utilizando los sistemas de baja y alta presión fueron 0.6 y 1.66
respectivamente.
103
13) Este es el primer reporte de cultivo de callos organogénicos y de
evaluación de diferentes métodos de transformación genética en Agave
tequilana.
104
VIII. PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este estudio dejan abierta la posibilidad para
trabajos posteriores que permitan la manipulación genética del agave azul y
que en un momento dado puedan favorecer y/o proteger su cultivo. Por un
lado, manipulando genes que medien su resistencia a bacterias u hongos que
son los principales agentes de enfermedades en este cultivo; ya se han
reportado con éxito trabajos similares en otros cultivos. Por otro lado, sería muy
conveniente acortar su ciclo de desarrollo ya que el periodo de maduración de
esta planta es muy largo; esto quizá podría lograrse con la expresión de genes
claves en las rutas metabólicas implicadas en el desarrollo como es la ruta de
giberelinas la cual se ha manipulado con éxito acortando el tiempo de
crecimiento en algunas especies leñosas.
Otro punto clave a considerar es la manipulación del contenido de azúcares
que puede realizarse mediante la sobreexpresión de enzimas implicadas en
esta ruta. Finalmente el agave podria ser una planta atractiva como productor
de compuestos de alto valor (e.g. farmacéutico o nutracéutico) debido a su
adaptación a condiciones extremas sobre todo de sequia, tomando en cuenta
que uno de los principales problemas que atraviesa la humanidad es la falta de
agua.
Otra de las ventajas que ofrece el uso de sistemas de transformación, es que
permitiría llevar a cabo estudios de la fisiología del agave mediante la
generación de mutantes por inserción.
Finalmente tomando en cuenta que éste es el primer reporte de transformación
de una especie del género Agave, tal información podría servir de base para
trabajos similares en otras especies importantes del género en nuestro país
como son las especies mezcaleras y pulqueras, entre otras.
Es importante no dejar de lado la relevancia que estas plantas han tenido
desde los inicios de nuestra cultura y todas las bondades que nos ofrecen, para
seguir llevando a cabo estudios que permitan conocer más acerca de ellas y
aprovecharlas de manera más eficiente y ecológicamente amigable.
105
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X. APÉNDICE
Esterilización de partículas de tungsteno (M10)
(Finer y col., 1992)
Pesar 20 mg de partículas.
Lavar con 200 µl de etanol.
Agitar en vórtex por 10 min.
Sonicar por 1 min.
Centrifugar por 2 min a 1420 x g.
Desechar sobrenadante.
Lavar con 200 µl de agua desionizada estéril.
Agitar en vórtex por 1 min.
Centrifugar por 2 min a 1420 x g.
Desechar sobrenadante.
Realizar tres lavados con agua desionizada estéril.
Resuspender las partículas en 200 µl de agua desionizada estéril agitando en
vórtex por 1 min.
121
Preparación de solución de reacción de β- glucuronidasa
Preparar soluciones Stock:
Concentración Stock
NaPO4 (pH 7)*
Concentración final
1M
100 mM
EDTA (pH 7)
0.5 M
10 mM
K4Fe(CN)6 (fotosensible)
0.5 M
0.5 mM
Triton X-100
10%
0.1%
Esterilizar las soluciones en autoclave.
* Para preparar la solución de fosfatos pH 7, mezclar 57.7 ml de Na2HPO4 1 M
más 42.3 ml de NaH2PO4 1M. Llevarlo a un litro con agua desionizada. El
resultado es una solución 0.1 M de concentración.
La solución final se almacena en congelación (-20°C) hasta que se requiera
prepararlo con el X-Gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico).
Para preparar 50 ml de reactivo:
Pesar 25 mg de X-Gluc.
Disolver con 500 µl de DMSO.
Agitar en vórtex.
Adicionar al buffer.
Cubrir con aluminio y almacenar en congelación.
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