Práctica 11: Cultivo de Protozoarios (I Parte)

PRACTICA #11
CULTIVO DE PROTOZOARIOS
I. Parte
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocer algunas técnicas de cultivo de protozoarios que permitan su
multiplicación, cuyas poblaciones pueden ser utilizadas en estudios diferentes
al diagnóstico.
INTRODUCCCION
En el diagnóstico clínico, el cultivo de los protozoarios parásitos no juega un
papel importante, y la microscopía sigue siendo la técnica de elección para la
identificación de la mayoría de ellos. Aunque no es posible el cultivo in vitro de
todos los protozoarios parásitos, algunos de ellos se pueden aislar y cultivar en
medio de cultivo. En algunos casos hay reactivos comerciales disponibles para
inmunodagnóstico, y por otro lado, las técnicas de PCR constituirán el método
de elección en el futuro.
La importancia del cultivo de protozoarios es principalmente por motivos de
investigación de las especies de dichos organismos. Actualmente, las técnicas
de cultivo son utilizadas para el estudio in vitro de los parásitos, desde diferentes
puntos de vista. El cultivo es un prerrequisito para estudios que requieren un
gran número de células, por ejemplo en pruebas de antiparasitarios, estudios
antigénicos o de biología molecular, etc.
Hay tres tipos básicos de sistemas de cultivo:
a) xénico, en el cual el parásito es cultivado en presencia de una flora
indefinida.
b) monoxénico, en el cual el parasito es cultivado en presencia de una sola
especie adicional
c) axénico, en el cual el parasito es cultivado en ausencia de cualquier
organismo.
d) El término "polixénico" algunas veces es usado erróneamente como un
sinónimo de xénico. Este término polixénico debe referirse solamente a
cultivos en los cuales es conocida la identidad de todas las especies
presentes.
Sin la posibilidad de cultivar un determinado parásito, se recurre al cultivo en
tejidos de células o a la inoculación en animales, métodos más laboriosos y
antieconómicos.
MATERIALES Y METODOS
I. Aislamiento de Entamoeba histolytica de materia fecal, en
Medio Difasico LE.
Solución de Locke:
Disuelva los reactivos en el siguiente orden:
1000 ml de agua destilada
8.0 g de cloruro de sodio
0.2 g de cloruro de calcio
0.2 g de cloruro de potasio
0.01 g de cloruro de magnesio
2.0 g de fosfato de sodio dibásico
0.4 g de bicarbonato de sodio
0.3 g de fosfato de potasio monobásico.
Esterilice en autoclave durante 15 min a 121°C y 15lb/in2 de presión. Enfríe a
temperatura ambiente. Si hay cualquier precipitado, separe por filtración, en
papel Whatman no. 1. Vuelva a esterilizar en autoclave.
Preparación de la fase sólida con huevo:
Se esteriliza la superficie de huevos frescos de gallina, mediante flameado con
etanol de 70% y enseguida se rompe y se deja caer en una probeta graduada
estéril. Se añaden 12.5 ml de sol. de Locke por cada 45 ml de huevo. Se
emulsifica en una licuadora y se filtra a través de una gasa, utilizando vacío
hasta eliminar todas las burbujas de aire. Se adicionan cantidades de 5 ml de
huevo emulsificado a tubos de cultivo de 16 x 125 mm con tapón de rosca
aflojado, y se autoclavean a 100°C durante 10 min., colocando los tubos
inclinados, en un ángulo que produzca 12 a 15 mm de huevo en el fondo del
tubo. El medio inclinado resultante debe quedar libre de burbujas. Se enfrían a
temperatura ambiente y el huevo solidificado se cubre con 6 ml de solución de
Locke. Se esteriliza a 121°C durante 15 min a una presión de 15 lb/in2.
Después de enfriar los medios inclinados a temperatura ambiente, se aprietan
los tapones y se pueden refrigerar hasta seis meses.
Inoculación de los medios :
Las muestras de heces se emulsifican en solución salina fisiológica y se filtran
por una gasa para eliminar las partículas gruesas antes de inocular el medio.
Sin embargo puede añadirse directamente al medio una cantidad de heces del
tamaño de un chícharo.
Es bueno incluir porciones de heces con sangre y moco. También puede usarse
un concentrado obtenido del método de flotación con sulfato de zinc o con
sacarosa, lo que reduce la cantidad de debris mientras se concentran los
quistes en la muestra. Sin embargo el sulfato de zinc puede dañar los quistes.
Los tubos del cultivo conteniendo medio e inculados con las heces, se incuban
verticalmente a 35.5°C durante 48 hs y se examinan. Puede extraerse una gota
de sedimento del tubo de cultivo y se examina al microscopio entre porta y
cubre.
Alternativamente, los tubos de cultivo pueden examinarse con un microscopio
invertido. Las amibas se observan adheridas a la pared de vidrio del tubo. Si no
hay crecimiento a las 48 hs, se hace una resiembra. La mayor parte del liquido
se descarta y se deja menos de 1 ml en el tubo. El sedimento se resuspende en
el poco liquido que quedó y se transfiere a un tubo con medio nuevo y se incuba
otras 48 hs y se vuelve a examinar . Si a este plazo no hay amibas se da por
negativo.
II. Cultivo de Giardia lamblia
Preparación del medio TYI-S-33
Se disuelven los reactivos en el orden descrito a continuación:
600 ml de agua desionizada o destilada
1.0 g de fosfato de potasio dibásico
0.6 g de fosfato de potasio monobásico
2.0 g de cloruro de sodio
20.0 g de peptona digerido de caseína
10.0 g de extracto de levadura
10.0 g de glucosa
2.0 g de cloruro de L-cysteína
0.2 g de ácido ascórbico
1.0 ml de citrato de amonio férrico, forma café (22.8 mg/ml)
Añada 500 mg de bilis bovina deshidratada por litro.
Lleve a un volumen final de 880 ml y ajuste a pH 7.0 usando una solución de
hidróxido de sodio 1 N
Esterilice por filtración a través de un filtro con poro de 0.22 µm. No se
autoclavea. Se reparte en cantidades de 13 ml en tubos de 16 x 150 mm.
El medio estéril TYI-base puede ser almacenado a −20°C durante varios
meses.
2.1. Los cultivos pueden iniciarse a partir de trofozoítos de biopsia duodenal,
pero mas comúnmente a partir de heces.
2.2. En primer lugar se procede a la purificacion de los quistes de las heces.
La muestra de heces se diluye 1:12 (vol/vol) en agua destilada. Se toman
20 ml y se colocan en un vasito con unas perlas de vidrio, homogenizando
en un vortex por 5 min., filtrando después el material a través de una gasa.
2.4. En un recipiente con hielo se colocan 5 ml del filtrado en un tubo de
centrífuga de 50-ml conteniendo 10 ml de sacarosa 1M. Se centrifuga a
450 x g durante 5 min.
2.5. Se separa el sobrenadante con una pipeta y se diluye a 50 ml con agua.
Centrifugue a 450 x g durante 5 min. Decante y descarte el líquido.
2.6. Se resuspende el sedimento en un tubo de centrífuga de 15 ml
conteniendo 2.5 ml de agua destilada, colocado sobre hielo, y coloque
en la superficie con mucho cuidado, una capa de 10 ml de sacarosa 0.5 M
Centrifugue a 450 x g durante 5 min. Con una pipeta Pasteur, separe
1ml del líquido del fondo y colóquelo en un tubo de centrifuga de 15 ml.
2.7. Examine este material y busque quistes de Giardia.
2.8. Diluya a 10 ml con agua distilada y centrifugue a 450 x g durante 5 min.
Decante y elimine el sobrenadante . Resuspenda el sedimento y úselo
para inocular los medios de cultivo
2.9 Los Cultivos se inician en tubos de 16 x 125 mm, conteniendo 13 ml de
medio TYI-S-33 o en otro tipo de tubos llenados a 80% de su capacidad.
2.10. El medio TYI-S-33 debe contener antibióticos y antimicóticos.
Una combinación adecuada incluye lo siguiente, por mililitro: 1 µg de
anfotericina B (solución patrón 1-mg/ml), 1 mg de moxolactamo (solución
patrón 300-mg/ml ), 1 mg de ticarcillina (solución patrón 400-mg/ml),
40 µg de gentamicina (solución patrón 40-mg/ml), y 200 U de penicillina
(solución patron 100,000-U/ml).
2.11. Los tubos de cultivo se incuban verticalmente a 35.5 °C y se examinan
diariamente en el microscopio invertido. El medio debe decantarse (o
extraerse con una pipeta) y reemplazarse con medio fresco y antibióticos
diariamente durante la primera semana y despues cada dos dias dos
semanas. Si no se observan trofozoítos a este tiempo, el cultivo se
considera negativo. La mayoría de los trofozoítos se adhieren a la pared
de vidrio.
III.
Cultivo de Trichomonas vaginalis en Medio TYM:
Agua destilada 600 ml
20.0 g de peptona digerido de caseína (Trypticase)
10.0 g de extracto de levadura
5.0 g de maltosa
1.0 g de cloruro de L-cysteína
0.2 g de acido ascorbico
0.8 g de fosfato de potasio dibasico
0.8 g de fosfato de potasio monobasico
Ajuste a pH 6.0.
Se lleva a 900 ml con agua destilada y se reparten cantidades de 90-ml en
frascos. Esterilice en autoclave 15 min a 121°C y 15 lb/in2 de presión. Puede
almacenarse por varios meses a −20°C . Para completer el medio adicione al
medio 10 ml de suero bovino inactivado con calor, en condiciones de esterilidad.
Deben adicionarse al medio antibióticos y antifúngicos. Es efectiva una
combinación de penicillina, estreptomycina y kanamycina, más mycostatina o
nystatina en concentración de 100 µg/ml
Nota: No utilizar el medio después de 1 semana de su preparación.
Inoculación de los medios:
Para el cultivo de Trichomonas se inoculan tubos del medio con un exudado
vaginal sospechoso del parásito. Los tubos de cultivo se incuban verticalmente
a 35.5 °C y se examinan diariamente durante 4 dias., en un microscopio
invertido. Después de ese tiempo si no se observa crecimiento se considera
negativo.
Bibliografía:
C. Graham Clark1* and Louis S. Diamond2
Methods for Cultivation of Luminal Parasitic Protists of Clinical Importance
Clin Microbiol Rev. 2002 July; 15(3): 329–341.
Proveedores:
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United Kingdom, starch rice powder (catalog no. 21150294); Sigma Aldrich, St. Louis,
Mo., adult bovine serum (catalog no. B-2771) and yeast extract (catalog no. Y-1625);
Oxoid Ltd., Basingstoke, United Kingdom, liver digest neutralized (LP027).