Biocompatibilidad: conceptos básicos Introducción

Biocompatibilidad: conceptos básicos
Dr. Jose Antonio Correa Ortiz
Dra. Gloriana Pacheco
Introducción
La biocompatibilidad puede parecer un tema de poca importancia dentro del campo de la odontología,
pero en realidad es vital tener un amplio conocimiento sobre la complejidad y naturaleza de éste
tópico, ya que afecta directa e indirectamente aspectos éticos, legales, sociales y técnicos de la
práctica odontológica, principalmente en el campo de la rehabilitación y endodoncia, en donde las
terapias dependen en gran parte de los biomateriales dentales (1).
La biocompatibilidad se define como la capacidad de un material de generar una respuesta biológica
apropiada al ser aplicado sobre un tejido, ya que no existe un material inerte, dependiendo de la
función física y de la respuesta biológica que deseamos de un material. Esta definición implica la
interacción entre un huésped, el material y la función esperada del material (1).
Muchos autores comparan la biocompatibilidad con el color, ya que el color de un objeto es una
propiedad que depende tanto del material, su interacción con la luz (el medio ambiente) y finalmente
como lo interpreta el observador. Modificaciones en la fuente de luz, características del objeto o un
cambio de observador hará que el color percibido sea distinto. (Imagen 1) (1).
Imagen 1. ilustra como el color del objeto percibido
cambia según la posición del observador y la fuente de
luz.
Figura 1
Por ejemplo, existen muchos materiales utilizados para obturar cavidades retrógradas en una
apexificación, como son el MTA (Mineral Trióxido Agregado), la amalgama y el Super EBA. Ninguno de
los materiales mencionados son inertes, todos son hasta cierto grado citotóxicos y generan una
respuesta distinta sobre los tejidos periapicales, pero se siguen utilizando ya que cada uno tiene
ventajas y desventajas (2).
La amalgama es un material que ha mostrado buenos resultados clínicos aunque se ha demostrado
que es corrosivo, tóxico y que libera mercurio. El Super Eba por otra parte tiene ventajas como alta
resistencia compresiva y tensil, su pH es neutro, tiene una baja solubilidad, y se adhiere a la dentina,
pero posee muchas desventajas como su alta sensibilidad a la humedad, irrita los tejidos periapicales,
es parcialmente soluble en fluidos orales y es reabsorbible. En estudios de citotoxicidad, se ha
observado que el MTA no afecta la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial y que causa una
pequeña pero estadísticamente significativa reducción de la proliferación celular. Además este material
es el único que consistentemente favorece la regeneración del ligamento periodontal, la aposición de
material parecido al cemento y la formación ósea (Imagen 2) (3).
Imagen 2. ilustrando la interacción entre un huésped, el
material y la función esperada del material.
Figura 2
MATERIAL FUNCIONANDO
La bicompatibilidad es un proceso dinámico continuo ya que la respuesta del cuerpo a los materiales
dentales sufre cambios con el paso del tiempo, además todos los materiales sufren cambios, ya sea
por procesos de corrosión, fatiga entre otros.
Para explicar lo anterior se puede tomar como ejemplo un implante dental oseointegrado, que con el
paso del tiempo, debido a varios factores, fracase (1). También estudios comparativos muestran que el
material más citotóxico, cuando está recién preparado, es la amalgama, y el menos citotóxico en esta
condición es el MTA. Por el contrario, al evaluar los materiales luego de 24 horas, la amalgama
disminuye su citotoxicidad y el MTA la aumenta (4).
El personal de trabajo es el que presenta un mayor riesgo de generar reacciones adversas ante los
materiales dentales, ya éstos se encuentran en contacto constante con los mismos, durante su
manipulación o fraguado. Un ejemplo clásico es la amalgama, ya que la liberación de vapores de
mercurio de las amalgamas durante su colocación y remoción es sustancialmente mayor que cuando
se encuentra colocada dentro de la cavidad oral. Otro ejemplo es el contacto crónico con el látex y los
materiales a base de resina (1).
Como existe mucha evidencia que demuestra que siempre existe un riesgo inherente a que los
materiales dentales generen una respuesta tanto a nivel local como sistémico, ya sea a menor o mayor
grado, tanto en el paciente como en el personal de trabajo, los odontólogos asumen un riesgo legal al
utilizarlos. Un enfrentamiento legal como consecuencia de un daño causado por un material dental es
poco frecuente, pero no imposible, por lo que es indispensable contar con el debido respaldo (1).
En los últimos 30 años, el público y varios organismos gubernamentales han solicitado pruebas que
demuestren que los materiales utilizados en odontología sean biológicamente seguros y efectivos. La
importancia de regular los materiales dentales ha sido un tema de discusión debido al auge de grupos
organizados que luchan por el tratamiento ético en los pacientes, además de que existe mayor
conciencia por parte de los pacientes con respecto a los riesgos que involucran el cuidado de la salud y
las preocupaciones del personal de salud con respecto a las posibles demandas de los pacientes.
Desafortunadamente, determinar la biocompatibilidad de un material es un tema sumamente
complejo, que implica el uso de varias pruebas, las cuales en su mayoría son costosas y complicadas.
A pesar de estos inconvenientes las pruebas de biocompatibilidad continúan siendo el único medio por
el cual se puede asegurar la seguridad o no de un material (1).
Pruebas de biocompatibilidad
Historicamente, nuevos materiales eran simplemente evaluados en humanos para observar si eran
biocompatibles. Desde hace muchos años esto no ha sido aceptable, en la actualidad los nuevos
materiales deben pasar por varias pruebas arduas antes de ser utilizados en humanos. Estas pruebas
se clasifican en: In Vitro, In vivo y por último Pruebas de uso. Investigadores reconocen que la manera
más eficiente, económica y relevante para evaluar la biocompatibilidad de los materiales es realizando
estudios que combinen los tres grandes grupos (5).
PRUEBAS
IN VITRO

Citotoxicidad:
1. # de crecimiento celular.
2. Permeabilidad
de
la
membrana
celular.
3. Biosíntesis enzimática: DNA, MTT.
4. Pruebas indirectas (uso de barreras).
5. Pruebas de barrera dentinal.

IN VIVO



Irritación de mucosas
Sensibilidad cutánea
Implantación
PRUEBAS DE USO


En animales
En humanos
Mutagénesis y carcinogénesis:
1. AMES
2. STYLES
Pruebas In vitro
Se llevan acabo en un tubo de ensayo o en una placa de cultivo, fuera de un organismo vivo. Son
ensayos muy diversos, pero en general se realizan colocando el material en contacto directo con
poblaciones celulares o bacterias y miden: el grado de citotoxicidad o crecimiento celular, funciones
metabólicas de la célula y el efecto del material sobre el material genético de la célula (mutagénesis)
(1).
Dentro de las ventajas que tienen estas pruebas es que son rápidas, fáciles de realizar y relativamente
menos costosas en comparación a otros ensayos disponibles, permite tamizaje a gran escala, se logra
obtener un excelente control experimental y son altamente reproducibles. La desventaja principal es
que la relevancia clínica es cuestionable, debido a que no hay presencia de una respuesta inflamatoria
u otros mecanismos de protección por parte de los tejidos que podrían modificar los resultados, como
consecuencia se pueden obtener resultados poco fiables sobre la respuesta biológica de un material
(1).
Imagen 3 tomada de www.uchile.cl/.../ publicaciones/cesaf/n10/1.html,
mostrando pruebas In Vitro Utilizando tubos de ensayo.
Figura3
Cuando las pruebas son directas se puede mostrar el efecto tóxico de un material sobre un cultivo
celular, pero no permite medir efectivamente el efecto de sustancias tóxicas solubles presentes en el
material. Con las pruebas indirectas, en donde hay algún tipo de barrera entre el material y el cultivo
celular, sí es posible medir el efecto de las sustancias solubles, por lo que se considera importante
realizar ambas pruebas para evaluar un solo material (6).
Las pruebas directas se pueden subdividir; en el primer grupo, el material está físicamente presente
con el cultivo celular y en el otro grupo, algún extracto del material entra en contacto con el cultivo
celular (5).
Los cultivos idealmente utilizados para estas pruebas son las de células primarias. Aquí las células son
tomadas de tejido animal, crecen durante un periodo corto de tiempo y mantienen las
características In vivo, pero tienen la desventaja de provenir de un solo individuo. También se utilizan
cultivos de células continuas, éstas son células primarias transformadas para ser cultivadas
indefinidamente, son más estables genética y metabolicamente que las primarias, por lo que permite
estandarizar las pruebas, aunque son la segunda opción para estudios de citotoxicidad (6).
Distintas líneas celulares están siendo utilizadas para examinar materiales dentales, por ejemplo se ha
demostrado que gránulos de hidroxiapatita inhiben en diferente grado el crecimiento de fibroblastos
humanos, además se han utilizado células parecidas al osteoblasto de ratas para probar diversos
materiales para relleno óseo (6).
Se han realizado ensayos directos e indirectos de distintos materiales dentales sobre cultivos de
células parecidas al osteoblasto humano y fibroblastos humanos de tejido gingival, en donde se ha
observado que hay un mayor efecto de los materiales sobre las células parecidas al osteoblasto
humano que sobre los fibroblastos. Esto indica que las células parecidas al osteoblasto humano
representan un sistema altamente sensible para evaluar toxicidad celular específica, principalmente
cuando se quieren probar materiales que estarán en contacto directo sobre el tejido óseo (6).
Pruebas de citotoxicidad
Estos ensayos evalúan el efecto de los materiales sobre diferentes poblaciones celulares midiendo el
número o crecimiento celular luego de la exposición a los materiales. Además estas pruebas
determinan daños a nivel de la membrana celular, biosíntesis o actividad enzimática y el material
genético (7).
Número y crecimiento celular
Cuando se evalúa el crecimiento o número celular, el material es colocado directamente en contacto
son un cultivo celular. Si el material no es citotóxico, las células permanecen en contacto con el
material y continúan creciendo normalmente, por otra parte si el material es citotóxico, el crecimiento
celular se detiene y se observará un halo de inhibición alrededor del material. La densidad celular
puede ser descrita de forma: cualitativa, semi-cualitativa, o cuantitativamente. El Teflón es utilizado
como control negativo ya que es un material inherte, por otra parte el Cloruro de polivinilo plastificado
es utilizado como control positivo ya que es un material altamente citotóxico (5).
Estas pruebas son utilizadas para medir la capacidad antimicrobiana de los materiales endodónticos
sobre microorganismos patógenos. Materiales endodónticos con una elevada capacidad antibacteriana,
frecuentemente inducen inducen efectos adversos severos durante y después del tx endodóntico,
además de ser citotóxicos y mutagénicos (8).
Clutivo deAgar
Imagen tomada de www.troybio.com/images/ Product_I
mages_BBL/BBL.htm
Figura4
Permeabilidad de la membrana
Otro grupo de pruebas miden la citotoxicidad de un material evaluando los cambios en la
permeabilidad de membrana celular. Esto se realiza observando la facilidad con que un colorante
pueda atravesar la membrana celular, estas pruebas se basa en la primicia que la pérdida de la
permeabilidad de la membrana es equivalente a un daño celular severo o a la muerte celular. La gran
ventaja de estas pruebas es que identifican tanto células vivas como muertas, esto es importante
debido a que las células pueden estar físicamente presentes pero muertas.
Existen dos tipos de tintes utilizados para realizar estos ensayos:
Colorantes vitales, estos son transportados activamente al interior de la célula y quedan retenido
cuando la célula está vital y el material no generado un efecto citotóxico sobre la célula. Por otra parte,
si el material es citotóxico, el colorante sale del interior de la célula, indicando así muerte celular.
Dentro del los colorantes vitales utilizados se encuentran el Na51CRO4 (51Cr) y el Rojo neutro (RN)
(5).
Colorantes no vitales, estos no son transportados activamente al interior de una célula viva, por otra
parte si un material es citotóxico, genera daños a nivel de la membrana celular, ocasionando así que el
colozrante sea transportado al interior de la célula indicando muerte celular (5).
Imagen ilustrando la permeabilidad selectiva de una célula con la membrana intacta, en donde
componentes como el Cromo 51 y el Rojo Neutro son secuestrados activamente por células sanas,
pero salen cuando se pierde la integridad de la membrana. Otros componentes como el Tripán azul son
excluidos por una célula sana, pero pueden difundirse a través de una membrana celular lesionada.
Biosíntesis enzimática
Algunas pruebas in Vitro utilizan la actividad biosíntesis enzimática de las células para evaluar la
respuesta citotóxica. Pruebas que miden la síntesis de DNA o la síntesis proteica son un ejemplo de
este tipo de pruebas, estas se llevan acabo agregando precursores de radioisótopos marcados (3Htimidina o 3H-leucina) al cultivo celular y luego los que son incorporados al DNA o proteína, son
cuantificados. De esta forma se determina la influencia del material sobre la síntesis de proteínas en
un cultivo celular (5).
El ensayo con MTT es otra prueba encimática comúnmente utilizada para medir la citotoxicidad de los
materiales, tiene como propósito medir la actividad de la deshidrogenasa celular. Es una prueba simple
debido a que no requiere de radioisótopos, es rápida y precisa ya que permite cuantificar exactamente
el número de células viables (9).
La deshidrogenasa celular tiene la capacidad de convertir la molécula denominada MTT, por medio de
distintos agentes reductores, en un compuesto de formazan, azul insoluble. Si la deshidrogenasa se
encuentra inactiva por efectos citotóxicos de un material, no se formará el formazan. La producción de
formazan puede ser cuantificada disolviendo el líquido y midiendo la densidad óptica de la solución
restante. La cantidad de Formazan producida es directamente proporcional al número de células
viables (Imagen #4) (5).
Figura 4
Imagen 4 tomada de CRAIG, R. Materiales de Odontología restauradora. Ed. Harcourt
Brace. 11 edición p 137, para ilustrar como la deshidrogenasa celular convierte la molécula MTT
(la cual es amarilla y soluble), por medio de distintos agentes reductores, en un compuesto de
formazan, azul insoluble.
Pruebas indirectas (uso de barreras)
En la mayoría de las pruebas de citotoxicidad, el material entra en contacto directo con los cultivos
celulares. Investigadores reconocen que In vivo, existe poco contacto directo entre las células y el
material, esto debido a la presencia de un epitelio queratinizado, dentina o matriz extracelular, debido
muchos estudios sin el uso de barreras, no son extrapolables a lo que sucede en la clínica. Por
ejemplo, el Oxido de zinc y Eugenol, es un material que genera una respuesta relativamente leve
sobre el tejido pular, en comparación con las respuestas severas que se obtienen cuando el mismo
material entra en contacto directo con células In Vitro, o en ensayos de implantación. Debido a lo
anterior, se han ideado pruebas In Vitro utilizando barreras para simular mejor las condiciones In Vivo.
Un ejemplo de ensayos indirectos es Método de cubierta de Agar. El Agar forma una barrera entre las
células y el material dental, el cual es colocado encima del agar. Nutrientes, gases y sustancias tóxicas
solubles pueden difundirse a traves del agar, si el material es citotóxico, las células serán lesionadas y
el rojo neutro será liberado, dejando así una zona de inhibición de crecimiento celular (Imagen 5) (10).
Imagen # ilustrando el Método de cubierta de Agar.
MÉTODO DE CUBIERTA DE AGAR
Figura 6
Si el material es citotóxico → lesiona las células → rojo
neutro se libera → zona de inhibición
Estrato de células teñidas con rojo neutro
Pruebas de barrera dentinal
Muchos estudios han demostrado que la dentina forma una barrera por la cual atraviesan sustancias
tóxicas que logran lesionar el tejido pulpar, por este motivo se han ideado ensayos que utilizan discos
de dentina como barrera entre el material y el cultivo celular. Este método ofrece la ventaja de
difusión direccional entre el material restaurador y el medio de cultivo celular (Imagen # 6).
Imagen 6 tomada de http://www.ccs.ufpb.br/
morfologia/atlasdente.htmn Para ilustrar como la dentina forma una
barrera por la cual atraviesan sustancias tóxicas que logran lesionar el tejido
pulpar.
Figura 6
Para llevar acabo esta prueba (Imagen 7), se coloca el material a evaluar (A) sobre el disco de dentina
(B). Al otro lado del disco se encuentra en contacto con el cultivo celular o cámara de recolección (C).
Componentes del material se logran difundir atreves de la dentina y el efecto sobre el medio de cultivo
puede ser evaluado. Para determinar la rata de difusión, se puede recolectar el fluido circulando dentro
y fuera de la cámara de recolección.
A. El material
B. Disco de dentina en el aparato utilizado para sujetarlo
C. Lado del disco en contacto con cultivo celular (cámara de
recolección).
D. Cultivo celular Citotoxicidad del material
Figura 7
Imagen 7 cortesía del Dr. Carlos Andrés Ochoa para ilustrar un modelo utilizando discos de dentina
como barreras para tratar de predecir la toxicidad de los materiales In vivo.
Pruebas de Mutagénesis y carcinogénesis
Estas pruebas estudian el efecto de los materiales sobre el material genético tanto en células como en
bacterias y posteriormente se evalúan los materiales en mamíferos. Se realizan en un orden específico
y se detienen cuando existe cualquier indicio de mutagenicidad por parte del material o químico.
Existen muchos mecanismos por los cuales una sustancia puede afectar el material genético de la
célula. Los mutágenos genotóxicos alteran directamente el DNA de la célula a través de diferentes
tipos de mutaciones, pero estos no son considerados cancerígenos. Pueden ser mutagénicos en su
estado nativo, o en algunos casos requieren de activación o biotransformación, por lo que se
denominan promutágenos.
Los mutágenos epigenéticos no alteran el DNA directamente, pero si favorecen el crecimiento tumoral
alterando la bioquímica celular, su sistema inmune, actuando como hormonas o por medio de otros
mecanismos. Debido a lo anterior, estos materiales sí se consideran cancerígenos.
Carcinogénesis se denomina como la capacidad del material dental para producir neoplasia In Vivo. Los
mutágenos pueden o no ser carcinogénicos, de igual manera los materiales carcinogénicos pueden o
no ser mutágenos, por esto la cuantificación y relevancia de las pruebas que intentan medir
mutagénesis y carcingénesis de los materiales son extremadamente complejas (Imagen#8).
Imagen 8
tomada de http://www.sandia.gov/newscenter/news-releases/2005/images/
mitopic.jpg
Para ilustrar los cambios estructurales que se pueden
observar entre una célula en estado normal y una célula
cancerígena.
Célula normal
Célula cancerigena
Figura 8
El ensayo de mutagénesis a corto plazo más comúnmente utilizado y con excelente valides es la
prueba de AMES. Se utilizan Cepas mutantes de Salmonella typhurium (Imagen #9), las cuales
requieren de histidina exógena, las cepas nativas no necesitan histidina exógena, por esto la exclusión
de la histidina exógena del medio de cultivo permite evaluar si un material tiene la habilidad de
convertir células mutantes en células nativas. Químicos con una elevada frecuencia de conversión
celular tienen una alta probabilidad de ser carcinogénicos en mamíferos, ya que altera el material
genético celular (Imagen #10).
Imagen 9
tomada de www.zdravljeizivot.com/hrv/ index.php?k=saznaj...
mostrando Salmonella typhimurium
Figura 9
Figura 10
Imagen 10 ilustra como se puede evaluar si un material tiene la habilidad de convertir células
mutantes en células nativas, por medio de la exclusión de la histidina exógena.
Otra prueba para evaluar la mutagénesis es la prueba de transformación celular de STYLES. Fue
creada con el objetivo de ofrecer una alternativa a los ensayos en bacterias como la de AMES, ya que
utiliza cultivos celulares de mamíferos, principalmente fibroblastos.
Cuantifica la capacidad de cancerígenos potenciales para transformar líneas celulares estandarizadas,
esto se lleva acabo de la siguiente forma: normalmente fibroblastos nativos no crecen en un cultivo de
agar blando, en cambio células geneticamente transformadas sí crecen en este medio, basandose en
esto, fibroblastos nativos son colocados en contacto con el material que se esta evaluando, luego de
un tiempo determinado los fibroblastos son colocados en un gel de agar, si el crecimiento celular es
positivo, significa que las células fueron transformadas a una cepa mutante y por ende el material
evaluado es un potencial cancerígeno (Imagen 11) (11).
Figura 11
Imagen11 ilustra como los fibroblastos nativos crecen en un Medio de Eagle, luego de colocar el
material dental sobre el cultivo, si las células son capaces de crecer en el gel de agar, las células
fueron mutadas por el material, por lo que se concluye ya que el material es un potencial
cancerígeno.
Es importante mencionar que aunque la mayor parte de las pruebas de Mutagénesis y carcinogénesis
son realizadas In Vitro, también se mide el aumento en la inducción tumoral por reacciones químicas
cuando los materiales son evaluados en animales por otra serie de pruebas que se van a mencionar a
continuación.
Pruebas In vivo (en animales)
Se realizan directamente sobre mamíferos como ratones, ratas, hamseters y conjillos de indias,
aunque se utilizan muchos otros animales. Se mide la alteración en la fx hepática y el aumento en en
la inducción tumoral por una reacción química.
Estas son diferentes a las Pruebas de uso (realizadas en algunos casos en animales), ya que el
material no es colocado en el animal para observar su uso final.
Imagen 12
tomada de www.boulesis.com/.../ bioetica/conclusion/
Mostrando un estudio in vivo realizado en una rata
Figura 12
La gran ventaja de estos ensayos es que permiten muchas interacciones complejas entre el material y
un sistema biológico funcional, por ejemplo, se puede generar una respuesta inmune o del sistema de
complemento, difícilmente recreado en un ensayo In Vitro. Lo que permite la obtención de resultados
más relevantes (5).
Estas pruebas presentan la desventaja que los resultados son difíciles de interpretar y controlar.
Además son muy costosas, se demoran mucho tiempo, e involucran muchos aspectos ético-legales
(5).
Prueba de Irritación de mucosas
Determina si un material puede generar inflamación a nivel de mucosas o piel erosionada. El ensayo se
realiza colocando el material a evaluar, además de los controles positivos (+) y negativos (-) sobre la
mejilla de un animal, en estos casos se utilizan preferiblemente animales pequeños como por ejemplo
el hámster, rata o conejo. Luego de varias semanas de estar en contacto con el material los animales
son fotografiados y luego sacrificados para llevar acabo los respectivos estudios histopatológicos del
tejido y así determinar finalmente la respuesta inflamatoria que generó el material (Imagen 13).
Figura 13
Se coloca el material
Luego de varias semanas
se observa la respuesta
Imagen 13, ilustra como se coloca el material a evaluar sobre la mejilla de un animal. Luego los
animales son fotografiados y posteriormente sacrificados para llevar acabo los respectivos estudios
histopatológicos.
Prueba de Sensibilización cutánea
Estos ensayos evalúan si un material genera una respuesta inflamatoria ya sea con eritema, edema o
puede no generar respuesta alguna. Se llevan acabo inyectando el material de forma intradérmica para
crear una respuesta de hipersensibilidad de la piel.
Primer se debe inyectar el coadyuvante de Freund, para potencializar la respuesta. Seguidamente se
colocan parches adhesivos que contienen el material que se está examinando y se observa la
respuesta que se genere sobre los tejidos, las cuales pueden ser desde muy leves hasta muy severas
con enrojecimiento intenso e inflamación. El grado de respuesta y el porcentaje de animales que
muestren una reacción frente al material son la base para estimar el grado de alergenicidad de un
material (Imagen 13).
Figura 13
Imagen 13, muestra como primero se inyecta el coadyuvante de Freund, para potencializar la
respuesta. Seguidamente se colocan parches adhesivos que contienen el material que se está
examinando y se observa la respuesta que se genere sobre los tejidos.
Las pruebas en animales que miden las propiedades mutagénicas y carcinogénicas de un material han
sido creadas por toxicólogos. Estas pruebas se realizan bajo un orden específico, y se detienen cuando
hay algún indicio de que un material o químico es un potencial mutagénico.
La valides de cualquiera de estas pruebas depende de la especie del animal, el tejido, genero entre
otros factores. Los experimentos normalmente se dividen en los que son a corto plazo o con límite de
tiempo, o pruebas a largo plazo o sin límite de tiempo. Las pruebas a corto plazo miden alteración
funcional del hígado o un aumento en la inducción tumoral cuando los animales son expuestos a los
químicos. Las pruebas a largo plazo se llevan acabo manteniendo el químico en contacto con el animal
durante la mayor parte de su vida.
Prueba de Implantación
Estos ensayos sirven para evaluar los materiales que entrarán en contacto con tejidos subcutáneos o
hueso, ya que determinan la alergenicidad, inflamación crónica o formación de tumores. El implante es
colocado dependiendo de los tejidos que entren en contacto con el material durante su uso clínico (por
ejemplo tejido conectivo, hueso o músculo).
La mayoría de estas pruebas se llevan acabo en materiales que entren en contacto directo con tejidos
blandos como son los implantes dentales, materiales utilizados en endodoncia y en periodoncia,
aunque la amalgama y ciertas aleaciones son evaluadas también ya que entran en contacto con tejido
gingival en algunas restauraciones.
La prueba de implantación a corto plazo se realiza colocando el material a evaluar en tubos de
polietileno con un extremo abierto. Se colocan tanto las muestras como los controles en zonas aparte y
se dejan durante 1-11 semanas, posteriormente la respuesta de los tejidos es evaluada ya sea
histológicamente, por métodos de histoquímica o inmunohistoquímica.
Las pruebas de implantación a largo plazo, se llevan a cabo para identificar inflamación crónica o
formación de tumores. Se realizan de igual forma que las de corto plazo, la diferencia es que el
material se deja durante 1-2 años antes de ser examinado (Imagen 14).
Figura 13
Imagen 14 muestra como se implantan los Tubos de polietileno abiertos con el material y luego de un
periodo de tiempo se evalúa la respuesta que generó el material sobre los tejidos.
Pruebas de Uso
Son estudios clínicos esenciales de un material ya que son las más relevantes de todas y se diferencian
de otros ensayos en animales porque en este caso el material debe ser utilizado bajo las condiciones
idénticas a las de su futuro uso clínico. Esta relevancia es directamente proporcional a la exactitud con
que se hayan recreado las condiciones clínicas, tomando en cuenta el tiempo, localización, ambiente y
la técnica con que se coloca el material (8).
Debido a lo anterior se utilizan animales mas grandes con condiciones orales similares a las de los
humanos, como por ejemplo perros y monos. Si se realizan en humanos, estás pruebas se denominan
ensayos clínicos (8).
La gran ventaja que presentan las pruebas de uso es su relevancia clínica, todas las otras pruebas se
deben comparar con esta, finalmente se puede decir que los ensayos de Uso son definitivas para
probar si un material es biocompatible o no. Por otra parte tiene las desventajas de ser
extremadamente costosas, se demoran mucho tiempo, son sumamente difíciles de controlar e
interpretar e involucran muchos aspectos ético-legales por lo que pocas veces se realizan en humanos
(8).
En humanos los estudios pueden ser de tipo retrospectivos, o preferiblemente prospectivos
controlados, pero siempre se debe tener en cuenta que ningún estudio es definitivo, aunque un
material obtenga excelente resultados de biocompatibilidad, podrían aún ocasionar respuestas
adversas en muchos pacientes.
Pruebas de Irritación pulpar
No existe un material artificial que pueda ser colocado dentro de un diente que sea o actue mejor que
la dentina ni que brinde una mejor protección a la pulpa que la dentina, por esto, el tejido pulpar, al
estar frente a diferentes estímulos ya sea de tipo primarios o secundarios, responde depositando una
matriz de dentina terciaria. Los estímulos pueden ser por ejemplo caries, atrición, abración, erosión,
trauma y cualquier tipo de proceso restaurativo (9).
Esta dentina terciaria, a diferencia de la primaria y secundaria que se depositan a lo largo de toda la
unión pulpo-dentinal, se localiza localmente. Además la dentina terciaria se puede clasificar en
reaccionaria o de origen reparativa. En general, la dentina reaccionaria es secretada por odontoblastos
pre.-existenes y la reparativa por células parecidas a los odontoblastos. La secreción de dentina
reaccionaria es la principal respuesta postoperatoria del odontoblasto ante algún proceso restaurativo
(10).
Existe mucha evidencia que muesta que los efectos de una preparación cavitaria, especialmente el
grosor de la dentina residual pueden jugar un paple muy importante en la estimulación de formación
de dentina reaccionaria que la irritación o toxicidad de los materiales de restauración. Aunque la
naturaleza exacta de esta realción aún es incierta.
La dificultad de medir la respuesta pulpar al corte de la dentina, se da porque es multifactorial, ya que
los cambios a nivel pulpar se dan desde el momento en que se inicia la preparación hasta que
finalmente se coloca la restauración final. Por otra parte los eventos que se llevan acabo varían entre
una restauración y otra (12).
Debido a lo anterior, existen muchas variantes que se deben considerar cuando se realizan pruebas de
irritación pulpar, como por ejemplo: el método de preparación, la condición de la pared de dentina
remanente, la presencia de bacterias, el método de aplicación del material restaurativo, entre otros
(12).
Generalmente estos ensayos se llevan acabo colocando el material a evaluar sobre preparaciones clase
V en igual número de dientes y tanto maxilares como mandibulares, asegurándose así una distribución
uniforme de todos los dientes, además se utilizan dientes sanos de monos u otros animales.
Primero se coloca anestesia y luego de realizar profilaxis de los dientes, se preparan las cavidades bajo
estricto control de esterilización y suficiente irrigación para evitar generar cambios de temperatura en
la pulpa, asegurándose de que todas las preparaciones sean lo más uniformes posibles. El material es
colocado sobre las cavidades y se deja durante 1-8 semanas. Finalmente los dientes son extraídos y
seccionados para ser evaluados bajo el microscopio, además por medio de un fotomicrómetro se mide
el grosor de la dentina remanente y reparativa.
Los tejidos seccionados son evaluados y las respuestas tanto inflamatorias como necróticas son
clasificadas, basándose en su apariencia, disrupción de la estructura del tejido y el número de células
inflamatorias (tanto crónicas como agudas) presentes, en tres grupos principales:



Leve: se observa poca hiperemia del tejido, pocas células inflamatorias y ligera hemorragia en la
zona odondoblástica.
Moderado: hay un aumento considerable de células inflamatorias, hiperemia y una ligera
desorganización de la capa odondoblástica
Severa: se observa un marcado infiltrado de células inflamatorias, hiperemia, desorganización
completa de la capa odondoblástica en la zona de la preparación cavitaria, reducción o ausencia
de la predestina y en algunos casos abscesos localizados.
Al igual que en procesos cariosos, las células mononucleares son usualmente más prominentes en
respuestas inflamatorias. Si hay presencia de neutrófilos, se debe sospechar la presencia también de
bacterias o productos bacterianos se deben sospechar.
La mayor parte de estos estudios han sido realizados en dientes sin caries con tejido pulpar sano o
intacto. Actualmente se reconoce el hecho de que el tejido pulpar inflamado responde de forma
diferente que el tejido pulpar sano a las bases cavitarias, los cementos y agentes restaurativos, por lo
que se han hecho esfuerzos para crear técnicas que logren identificar las diferentes respuestas
generadas por los tejidos pulpares en distintos estadíos.
Estas pruebas son de suma importancia ya que el éxito de de una restauración depende del
entendimiento y conocimiento por parte del clínico, sobre todos los posibles daños que se puedan
generar sobre el tejido pulpar. De esta forma se el odontólogo podrá tomar decisiones más adecuadas,
sobre el tratamiento a realizar, que no generen daños innecesarios sobre la pulpa.
Correlación entre las pruebas de biocompatibilidad
Uno de los primeros en proponer una forma estructurada para el estudio de la biocompatibilidad fue
Autian, y lo esquematizó en tres niveles (13):
1. Toxicidad Inespecífica (en cultivos celulares o en pequeños animales).
2. Toxicidad Específica (pruebas de uso por ejemplo en primates subhumanos).
3. Pruebas clínicas en humanos.
Solamente los materiales que pasaban exitosamente el primer nivel de evaluación, podría continuar al
segundo nivel y así sucesivamente. Según Autian el término inespecífico se refiere al hecho de que las
pruebas no reflejan la aplicación clínica del material. El término específico indica el uso de modelos
biológicos en donde se intenta simular el uso clínico del material (13).
Figura 15
Imagen #15 mostrando como el número de pruebas disminuía con la progresión de las distintas
etapas, los materiales no aceptables eran eliminados desde etapas tempranas.
Langeland propuso otro esquema, el cual fue adoptado como Reporte técnico 7405 en 1984, que
consistía de tres etapas (13):
1. Pruebas de inicio o primarias (citotoxicidad, toxicidad sistémica, mutagénesis).
2. Pruebas secundarias (sensibilidad cutánea, pruebas de implantación, irritación de mucosas e
inflamación).
3. Pruebas de Uso (equivalentes a las pruebas clínicas).
En ambos conceptos los materiales dentales deben pasar por las tres etapas, iniciando con las más
simples hasta las más complicadas, desde pruebas In Vitro a pruebas en animales y de ensayos
preclínicos a clínicos en humanos. Al igual que Rutian, Langeland proponía que solamente los
materiales que pasaran exitosamente el primer nivel, podrían ser evaluados en un segundo nivel y
finalmente los materiales con los mejores resultados pasaban a la tercera etapa (13).
Figura 16
Imagen #16 ilustra como el número de pruebas disminuía con la progresión de las distintas etapas, los
materiales no aceptables eran eliminados desde etapas tempranas.
Los modelos anteriores presentaban la desventaja de que las pruebas iniciales no tenían la capacidad
de predecir el comportamiento de los materiales a futuro, ocasionando así que muchos materiales
buenos fueran descartados en etapas muy tempranas y por otra parte materiales malos podrían
avanzar.
En la actualidad nuevos esquemas mantiene el concepto piramidal, en donde las pruebas primarias y
secundarias continúan teniendo un papel importante aunque a menor escala conforme progresan las
distintas etapas, ya que se reconoce la necesidad de utilizar diferentes tipos de pruebas al mismo
tiempo y además que la biocompatibilidad de un material es un proceso continuo que evoluciona con la
experiencia clínica del mismo.
Estos modelos han sido creados para reflejar la complejidad de las pruebas de biocompatibilidad de los
materiales, involucrando aspectos regulatorios y científicos. Tienen como objetivo principal reducir los
experimentos en animales, mejorando las pruebas In Vitro (simulando al máximo las condiciones In
vivo). Esto ha sido logrado utilizando barreras apropiadas en las pruebas, cultivos celulares y tejidos
más convenientes, además marcadores biológicos clínicos relevantes para medir los efectos biológicos
inducidos por un material (13).
Figura 16
Imagenes Muestra un nuevo esquema para las pruebas de biocompatibilidad, en donde se reconoce la
necesidad de usar varios tipos de pruebas al tiempo y tratar la biocompatibilidad como un proceso
continuo.
Hoy en día la flexibilidad para el uso de las distintas pruebas, permite que las 3 tipos de pruebas de
biocompatibilidad continúen siendo efectivas a lo largo de la evaluación de un material y durante su
servicio clínico. Por ejemplo una pruebas In Vitro puede ser útiles para investigar una respuesta
biológica específica observada durante las pruebas clínicas o después de haber introducido el material
al mercado.
Conclusión
El tema de la biocompatibilidad es especialmente relevante en el campo de la endodoncia debido a que
el éxito de los tratamientos depende, en gran parte, de los materiales que se mantienen en contacto
con los tejidos durante largos periodos de tiempo. Desafortunadamente no existe una sustancia
inherte, por lo que es fundamental realizar las debidas pruebas para poder elegir materiales que reúna
las mejores propiedades clínicas deseadas.
Distintos motivos han ocasionado un desarrollo y perfeccionamiento de las pruebas in Vitro,
principalmente la preocupación de los profesionales de la salud ante el aumento de las demandas por
responsabilidad profesional y la promulgación de distintas normas y reglamentos que buscan un
desarrollo tecnológico que permitan un bienestar humano que no se de a expensas del maltrato a
otras especies.
Bibliografía
1. JOHN C. WATAHA, Principles of biocompatibility for dental practitioners. The journal of
prosthetic dentistry, agosto 2001 p203-209.
2. OSORIO, R., HEFTI, A., VERTUCCI,F., SHAWLEY, A.Cytotoxicity of endodontic materials. J of
Endod. 1998;24(2):91-96
3. ADAMO,H. A comparison of MTA, Super-EBA, composite and amalgamas root end filling
materials using a bacterial microleakage model. Int Endod J.1999;32:197-203.
4. KEISER, K., JONSON, C., TIPTON, D. Cytotoxicity of mineral trioxide aggregate using human
periodontal ligament fibroblast. J of Endod. 2000; 26(5):288-291
5. CRAIG, R. Materiales de Odontología restauradora. Ed. Harcourt Brace. 11 edición. Pág..
126-162.
6. H. LANG, TH. MERTENS, The use of cultures of human osteoblastlike cells as an In vitro
test system for dental materials, J Oral Maxillofac Surg, 48:606-611, 1990.
7. KAWAHARA H, Biological testing of dental materials by means of tissue culture Int. Dent. J
1988: 18: 443
8. C.H.J Hauman y R.M.Love, Biocompatibility of dental materials used in contemporary
endodontic therapy: a review. Part1. Intracanal drugs and substances, Int. Endod. Journal,
36,75-85,2003.
9. MOSSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and citotoxicity assays. J Immunologyc Meth 1983;(65):55-3
10. GUESS, W. Agar difussion method for toxixity screening of plastics on cultured cell
monolayers. J. Pharm Sci 54:1545,1965.
11. STYLES, J. Tissue culture methods of evaluating biocompatibility of polymers, Boca Ratón
1981. Vol. 2. CRC Press.
12. PETER E. MURRAY; IMAD ABOUT; PHILIP J. LUMLEY; GAY SMITH; JEAN C. FRANQUIN; ANTHONY
J. SMITH. Postoperative pulpal and repair responses. JADA, marzo 2000 Vol. 131, marzo
13. G. SCHMALZ. Concepts in biocompatibility testing of dental restorative materials, Clin Oral
Invest 1997, 1:154-162.