cuantificación de fructanos, en bulbo

“CUANTIFICACIÓN DE FRUCTANOS
EN BULBO DE AJO PARDILLO”
V i l l a g ó m e z A r a n d a A n a L a u r a (1)
Mercado Silva E. (2);
(1) Escuela de Bachilleres, “Salvador Allende” Plantel Sur, Universidad Autónoma de Querétaro.
(2) Laboratorio de Fisiología y bioquímica de Poscosecha Frutas y Hortalizas. Departamento de Investigación y
Postgrado en Alimentos. Facultad de Química. Universidad Autónoma de Querétaro.
Resumen
En el presente trabajo, se realizó un ensayo sobre la extracción de fructanos en bulbo de ajo pardillo, para observar su presencia en diferentes etapas de desarrollo.
El proceso se efectuó con muestras de ajo pardillo previamente pulverizadas y liofilizadas. Se extrajo mediante
la adición de agua caliente (80°C) con agitación constante. Se almacenó a temperatura de 2°C; antes del procedimiento se calentó a 80°C y dejó enfriar a temperatura ambiente. A la muestra se adicionó 200µl de enzima A,
incubó a 40°C por 30 min; después 200µl de borohidrido alcalino, incubó a 40°C por 30 min; luego 500 µl de
acido acético y agitó; para remover azucares reductores.
De la solución se colocó 200 µl en tres tubos, a los dos primeros se adicionó 200µl de enzima B, al tercero buffer
2, e incubó a 40°C por 20 min. Posteriormente, se agregó 5ml de PAHBA, se colocó en baño maría a 100°C por
6 min y a 20°C por 5 min. Transcurrido el tiempo, se hizo la lectura de absorbancia mediante el espectroscopio,
y utilizó una formula para determinar el porcentaje de fructano en cada muestra.
En promedio, en el muestreo 0 se obtuvo un porcentaje de fructano de 12.09%, en el muestreo 2, fue de 18.43%,
y en el muestreo 4, 44.48%. Esto nos indica que, la concentración de fructano en el bulbo de ajo, tiende a acumularse en mayor cantidad al final del periodo de desarrollo, a razón de las condiciones a las que se encuentra.
Introducción
El ajo (Allium sativum) es una hortaliza empleada comúnmente en cocina y medicina naturista, por su olor y sabor penetrante, así como su efecto antibiótico, inflamatorio, antihipertensiva, diurético, etc. La cabeza esta formada por varios bulbillos (dientes) cubiertos por una capa delgada; se compone aproximadamente en un 60% de
agua, y un 35% de carbohidratos, principalmente fructano (inulina)
El fructano, es un polímero de moléculas de fructosa unidos por glucosídicos (fructosa, glucosa y sacarosa). Son
la principal reserva de hidratos de carbono en familias del reino vegetal, y tienden a estar presentes en familias
expuestas a sequías o temperaturas bajas; cuya función es proteger a la planta del estrés a causa del medio ambiente. Además, interviene en su metabolismo, como catalizador, en la polimerización, etc.
De los tres tipos de fructanos, el que se encuentra presente en el ajo, es la inulina, la cual es una fibra soluble en
agua, que se almacena en el tejido fino de la planta, que interviene en la textura, sensación y estabilidad del tejido. Es adicionada a diversos productos cotidianos, por ser fácilmente extraída mediante agua caliente.
Objetivo
Observar la presencia de fructanos en bulbo de ajo.
Comparar en diversas etapas de desarrollo y a diferente tiempo de almacenaje.
Metodología
Elaboración de reactivos. Se prepararon los reactivos a utilizar:
• Buffer 1: 11.6g ácido maleico + 900ml agua destilada. Ajustó PH a 6.5 con hidróxido de sodio (2M).
• Buffer 2: 5.8 ml ácido glacial + 900ml agua destilada. Ajustó PH a 4.5 con hidróxido de sodio (1M).
Ambos se aforaron a 1L y refrigeraron a 4°C.
• Enzima A: contenido vial del Kit + 22 ml Buffer 1. Enzima B: contenido vial del Kit + 22 ml Buffer 2. Ambas
se dividieron en alícuotas y refrigeraron a -20°C.
1
•
•
•
•
•
•
Solución A: 10g ácido hidroxibenzoico hidrozida + 60ml agua destilada + 10 ml ácido clorhídrico concentrado.
Aforó a 200ml y guardó a temperatura ambiente.
Solución B: 24.9g citrato trisodico dihidratado + 500ml agua destilada + 2.2g clorhídrico de calcio dihidratado.
Aforó a 2L y almacenó a temperatura ambiente.
PAHBAH: (antes de usar) Agregar 20ml de solución A en 180ml de solución B, mantener en hielo.
Hidróxido de sodio (50mM): 2g hidróxido sodio + 900ml agua destilada. Aforó a 1L, temperatura ambiente.
Borohidrido alcalino: (antes de usar) 20mg borohidrido + 2 ml hidróxido sódio.
Acido acético (2M): 116 ml + 600 ml água destilada. Aforó a 1L y almacenó a temperatura ambiente.
Extracción. De muestras de ajo pardillo previamente pulverizadas y liofilizadas (1, 17, 13, 5, 7, 20, 6, 8, 19, 15,
18, 21) de diferentes muestreos (0, 2, 4), se disolvieron 100mg en 40 ml de agua destilada a 80°C y agitó por 15
minutos, manteniendo la temperatura constante. Se homogenizó y dejó enfriar a temperatura ambiente, para después refrigerar a 2°C hasta la cuantificación.
Eliminación de sacarosa, almidón y azucares reductores. En tubo de ensayo, se adicionó 200µl de la solución
de la muestra y 200 µl de enzima A, e incubó por 30 min a 40°C. Luego, se agregaron 200 µl de borohidrido alcalino e incubaron por 30 min a 40°C. Después, se agregó 500 µl de acido acético (2 molar) y agitó en vortex.
Hidrólisis y medición. Se colocaron 200 µl de la solución anterior en tres tubos, a los dos primeros se agregó 1
µl de enzima B, y al tercero (blanco) 200 µl de buffer 2. Se incubaron por 20 minutos a 40°C.
Blanco y estándar. Se agregó 300 µl de buffer 2 por duplicado (blanco). Para el estándar, se adiciona 200 µl de
D-fruct a 900 µl de buffer, y se adicionó 200 µl de solución en tres tubos con 100 µl de buffer 2.
Tanto a las muestras como blanco y estándar, se agregó 5ml de PAHBAH, se incubó a baño maría a 100°C por 6
minutos y posteriormente se colocaron en agua de 18 – 20°C por 5 minutos. Al finalizar el tiempo, se realizó la
medición de absorbancia de cada tubo, mediante el espectrómetro, utilizando el método de fructano.
Cálculos. Para determinar el porcentaje de fructano contenido c/muestra, se utilizó la formula indicada en el Kit:
Donde: A (absorbancia) = Promedio T1 Y T2 – T3.
F (factor de fructosa) = 54.5µg / absorbancia de fructosa.
V (volumen de extracción) = 100 ml. W (peso de muestra) = 100 µg
Resultados
Durante el baño maría en agua caliente, a causa del PAHBA, las muestras que contenían fructano, presentaban
una coloración amarilla, siendo visible en el tubo 1 y 2, siendo transparente el tercero. Esto, daba una preliminar
de lo que serían las lecturas, ya que en las muestras del muestreo 0 el color fue muy tenue; en el muestreo 2, la
matiz era mas sutil, mientras que en el muestreo 4, la tonalidad era mas claro. Por lo tanto, se espero que la concentración de fructano fuera más baja en el primero, y más alta en el último.
Los resultados de la lectura en el espectrómetro, se muestran en las tablas a continuación.
Muestra
1
17
13
T1
0.17
0.1593
0.1594
T2
0.1601
0.1374
0.1415
T3
0.0309
0.0166
0.0294
A
0.13415
0.13175
0.12105
% Fructan
13.81
13.56
12.46
5
7
20
6
8
19
18
0.1252
0.147
0.1599
0.1371
0.1779
0.1292
0.1646
0.172
0.1449
0.1396
0.1862
0.1732
0.1211
0.1636
0.0444
0.0536
0.0401
0.0447
0.0425
0.0287
0.0291
0.1042
0.09235
0.10965
0.11695
0.13305
0.09645
0.135
10.72
9.50
11.29
12.04
13.69
9.93
13.89
Muestra
1
17
13
5
7
20
6
8
19
15
18
21
T1
0.2062
0.1912
0.1793
0.2634
0.2112
0.2007
0.1888
0.2131
0.2169
0.1518
0.2077
0.2983
T2
0.2182
0.2073
0.1854
0.2668
0.2334
0.2008
0.1775
0.1857
0.2336
0.2427
0.2229
0.2951
T3
0.045
0.0066
0.0309
0.0155
0.0604
0.0543
0.0187
0.0453
0.0461
0.0409
0.0255
0.0614
A
0.1672
0.19265
0.15145
0.2496
0.1619
0.14645
0.16445
0.1541
0.17915
0.15635
0.1898
0.2353
% Fructan
17.21
19.83
15.59
25.69
16.66
15.07
16.93
15.86
18.44
16.09
19.53
24.22
Tab la 1. Fructano en muestr eo 0
Tab la 2. Fructano en muestr eo 2
2
Muestra
1
17
13
5
7
6
8
19
15
18
21
T1
0.5595
0.5696
0.5302
0.5774
0.3525
0.344
0.3872
0.4804
0.4087
0.3612
0.47
T2
0.5827
0.5438
0.4485
0.4242
0.388
0.3719
0.3644
0.4837
0.4809
0.3849
0.4356
T3
0.046
0.0536
0.0183
0.0137
0.0295
0.007
0.0033
0.0023
0.031
0.0113
0.0052
A
0.5251
0.5031
0.47105
0.4871
0.34075
0.35095
0.3725
0.47975
0.4138
0.36175
0.4476
%Fructan
54.04
51.78
48.48
50.13
35.07
36.12
38.34
49.38
42.59
37.23
46.07
Muestra
Fructan
T1
0.3475
T2
0.3503
T3
0.0634
A
0.2855
%Fructan
29.38
T ab la 4. Valor d e Fru c ta no d e l k it (Con tro l)
D-fructosa
T1
1.796
T2
1.0913
T3
1.0533
Prom
1.314
F
41.5
T ab la 5. Valor d e l fa c tor d e fruc to sa
Tab la 3. Fructano en muestr eo 4
El valor del control, Fructano, según lo indicaba el kit Megazyme, debía ser 28.8. El valor obtenido en el proceso
fue de 29.38, donde la diferencia es mínima, lo que nos indicó que el procedimiento fue acertado.
Para realizar una comparación general de los tres muestreos, se calculó el promedio de la absorbancia de las
muestras en cada uno, siendo 12.09 para el M0, 18.43 para M2, y 44.48 para M4.
50
45
44.48
40
Fecha
24-Sep
06-Feb
04-May
Días
0
136
224
% Fructan
12.09
18.43
44.48
Tab la 6. Promed io d e por cen taj e fructano
e n los d if er e n te s mu e s tr eos .
35
% Fructano
Muestreo
0
2
4
30
25
20
18.43
15
12.09
10
5
0
1
2
3
G r afi ca 1 . Por c e nt aj e d e f uc t an o e n d if e re n te s et a p a s de
desarrol lo de ajo.
Conclusiones
De acuerdo a los resultados obtenidos, los fructanos están presentes en todo momento del desarrollo del ajo,
siendo únicamente la concentración de los mismos lo que varía significativamente, teniendo quizás una relación
directa con las condiciones ambientales que le rodean.
Al inicio, al momento de la siembra el 24 de septiembre, la semilla a germinar contiene un 12 % de fructano;
donde el clima de la región es templada.
En el segundo muestreo, realizado el 6 de febrero, los resultados de fructano señalan un 18.43 %. Después de
136 días de la siembra, los fructanos han incrementado en un aproximadamente 53 %. Sin embardo, la temperatura del ambiente ha evolucionado, de templada a frío.
3
Para el cuarto muestreo, realizado el 4 de mayo, el porcentaje de fructano contenido es de 44.48 %; donde al
transcurrir 224 días de la siembra, se ha elevado un aproximado 260%; pero la temperatura ha sufrido otro cambio significativo, de frió ahora predomina cálido.
La razón principal, sospecho, es por las drásticas transformaciones del clima que experimenta durante su desarrollo, a diferencia de la mayoría de las frutas y vegetales de temporada cálida.
Los fructanos (inulina), al ser principalmente carbohidratos de reserva, son sintetizados y utilizados por la planta
para sobrevivir y desarrollar el bulbo, mientras el estrés a causa de las bajas temperaturas y la, falta de humedad
se encuentre sobre esta. Por otro lado, cuando la temperatura poco o poco se eleva, la plata puede recibir mas fácilmente nutrientes necesarios para continuar su progreso. Así, después de 8 meses, la temperatura predominante
es cálida, por lo cual, los fructanos al no ser utilizados para obtener energía, viajan al interior del bulbo, donde
van a acumularse y ayudar a dar volumen, estructura y estabilidad al tejido, el cual, ahora por la sequía se encuentra en condiciones drásticas, y van a actuar para conservar humedad y preservar el bulbo.
Para concluir, quisiera agradecer a todas las personas que me apoyaron durante mi estancia en el verano de la
ciencia, del cual, me llevo muchos conocimientos y experiencias, que reafirman mi gusto por las ciencias. Gracias por la oportunidad.
Referencias
Fructan assay procedure for fructo-oligosaccharides and fructan polysaccharide.
Kit “Megazyme”, Irlanda, 2004.
www.fruit-eze.com
www.biophysj.org
www.quimica.net
www.wikipedia.org
www.geocites.com
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