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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 3, pp. 285-304, septiembre-diciembre, 2015.
METODOLOGÍA PARA UTILIZAR UN MOLDE ÚNICO EN LA
PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE ADN INMOVILIZADO EN
AGAROSA DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE,
ÚTILES EN MINIECP
Yenis Santamaría Casola
Avenida 25 No 15202 esq. 158, Cubanacán, Playa, Código Postal 11600, Apartado 6412, 6414, La Habana,
Cuba.
Recibido: 16 de marzo de 2015.
Aceptado: 18 de septiembre de 2015.
Palabras clave: Electroforesis de Campos Pulsantes, análisis bidimensional de plimorfismos, método no enzimático,
cámara multi-miniTAFE.
Key words: Pulsed Field Gel Electrophoresis, two-dimensional analysis of polymorphisms, non-enzymatic method,
multi-miniTAFE chamber
RESUMEN. La Electroforesis de Campos Pulsantes (ECP), se considera el “estándar de oro” de
los métodos de tipificación molecular. Este método permite estudiar polimorfismos de moléculas
de ADN con un amplio rango de tallas pero no discrimina pequeñas diferencias de tamaño en un
solo experimento, además esta técnica consume gran cantidad de reactivos y tiempo. El análisis
bidimensional de polimorfismos por ECP y la miniaturización de estos equipos, superan estas
limitaciones. La inmovilización de moléculas de ADN en agarosa, útiles en ECP, involucra
procedimientos engorrosos, por el sucesivo trasvase de recipientes al que son sometidas las
suspensiones celulares, lo que puede aumentar la probabilidad de contaminación de la muestra
con nucleasas y afectar la reproducibilidad de la técnica. Se hace necesario la obtención de un
método rápido y sencillo que permita, la utilización de un único molde para el cultivo de
Saccharomyces cerevisiae, la inmovilización de las células y el tratamiento no enzimático, para
preparar muestras de ADN inmovilizado en agarosa, útiles en miniECP uni/bidimensional y que
facilite en la 2D el análisis de un alto formato de muestras.
ABSTRACT. The Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) is considered the "gold standard" of
molecular typing methods. This method allows studying polymorphisms of DNA molecules with
a wide range of sizes but does not discriminate small differences in size in a single experiment;
moreover this technique consumes large amounts of reagents and time. The two-dimensional
polymorphism analysis by PFGE and miniaturization of these equipments, overcome these
limitations. The immobilization of DNA molecules in agarose, useful in PFGE involves
cumbersome procedures, by the successive transfer of containers to which are subjected the cell
suspensions, which may increase the likelihood of sample contamination with nucleases and
affect the reproducibility of the technique. A quick and easy method is needed that allows the use
of a single mold for culture Saccharomyces cerevisiae, immobilization of cells and non-enzymatic
treatment to prepare DNA samples immobilized in agarose, useful in miniPFGE uni/twodimensional and facilitating in the 2D, the analysis of a high format the sample.
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INTRODUCCIÓN
La Electroforesis de Campos Pulsantes (ECP), separa moléculas de ADN de grandes tamaños
(>20 kilobases (kb)). Los cambios en la secuencia de bases del ADN cromosomal que provocan
diferencias de unas pocas kb o que no varían el tamaño de los cromosomas, no pueden ser
detectados mediante un único experimento de ECP. La Electroforesis de Campos Pulsantes
Bidimensional (2D-ECP), permite explorar mayores regiones del genoma de eucariotas
unicelulares (mapeo de genes), como es el caso de S. cerevisiae. Pero tiene las limitantes que
fueron resueltas por la tecnología de ECP en minigeles (miniECP): el empleo de largos tiempos
de electroforesis (24-40 h), gran cantidad de reactivos y muestras biológicas y las condiciones de
separación de las moléculas de ADN es a prueba y error.1-6
Para la inmovilización de moléculas de ADN en agarosa en un molde específico, se requiere del
previo crecimiento celular en medio líquido y/o sólido de los microorganismos y su posterior
incubación en disoluciones que utilizan o no enzimas. Los métodos enzimáticos de preparación de
muestras de ADN inmovilizado en agarosa, requieren el uso de grandes cantidades de enzimas y
reactivos costosos y necesitan entre dos y tres días para completar el análisis del ADN genómico
de los microorganismos. Estos procedimientos son trabajosos, ya que las suspensiones celulares
son sometidas sucesivamente al trasvase de recipientes, lo que puede aumentar la probabilidad de
contaminación de la muestra con nucleasas y afectar la reproducibilidad de la técnica.1-6
En la actualidad no se ha descrito un método rápido y sencillo que permita eliminar la excesiva
manipulación experimental en la preparación de muestras de ADN inmovilizado en agarosa, ni se
ha comprobado la utilidad del sistema miniECP en la electroforesis bidimensional de
microorganismos unicelulares eucariontes como S. cerevisiae.
MÉTODOS DE TIPIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
La tipificación de microorganismos es el establecimiento de nuevas subcategorías dentro de una
misma especie, útil en estudios de epidemiología molecular de las enfermedades infecciosas ya
que permite determinar la relación clonal que existe entre varios aislados de una misma especie.
Información de gran importancia cuando se producen brotes epidémicos causados por cepas
multirresistentes, pues permite determinar el número de clones circulantes, identificar las fuentes
de contaminación o reservorio y los vehículos de transmisión.1,2
Los métodos empleados para la tipificación se clasifican en dos grupos, fenotípicos y genotípicos.
Los fenotípicos están fundamentados en determinar las características fisiológicas, culturales y
bioquímicas expresadas por los microorganismos por ejemplo la biotipificación, tipificación por
antibiogramas (sensibilidad/resistencia a los antimicrobianoss), serotipificación (reacción
antígeno-anticuerpo), fagotipificación (sensibilidad a bacteriófagos) y la tipificación por
susceptibilidad a bacteriocinas.3
Estos métodos tienen problemas de reproducibilidad asociados a la variabilidad de la expresión
genética y problemas de tipificabilidad debido que una proporción alta de microorganismos no
pueden ser caracterizados.4
Los métodos genotípicos basados en el análisis del ADN de microorganismos tienen las ventajas
de tener alto grado de tipificabilidad, buena reproducibilidad, capacidad optima de discriminación
y pueden aplicarse a microorganismos que no pueden ser cultivados con facilidad. Estas técnicas
moleculares han jugado un importante papel en la tipificación de microorganismos patógenos, y
en la vigilancia y control epidemiológico de enfermedades que afectan tanto al hombre como a los
animales. Dentro de las más utilizadas se encuentran las basadas en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa combinada con restricción enzimática, electroforesis convencional en gel de agarosa,
la hibridación de las moléculas con sondas específicas, la secuenciación completa o parcial del
genoma y los microarreglos.5 Estos métodos a pesar de ser rápidos y reproducibles, involucran
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múltiples pasos, son costosos, requieren experiencia previa y además, en un único experimento,
sólo pueden analizarse regiones pequeñas del genoma.
Actualmente, una de las técnicas más utilizadas para caracterizar el genoma de los
microorganismos, es la ECP. Esta se considera el “estándar de oro” de los métodos de tipificación
molecular. Los patrones de bandas que se obtienen después de la electroforesis, de muestras de
ADN procedentes de un microorganismo, caracterizan inequívocamente su dotación genética y
son altamente reproducibles y discriminatorios.6
ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES
La electroforesis es uno de los métodos analíticos más empleados en los laboratorios de
investigación para determinar la cantidad de nucleótidos que contienen las moléculas de ADN.
Esta cantidad se denomina talla o tamaño, se expresa en pares de bases y es proporcional a la
longitud de la molécula (un segmento de 10 nucleótidos mide 3,4 nm de longitud).7 Dichas
moléculas, en disolución acuosa y a pH neutro, se cargan negativamente debido a la ionización de
sus grupos fosfatos, de manera que la aplicación de un campo eléctrico externo, provoca que las
moléculas migren hacia el electrodo positivo (ánodo).8 Esta migración ocurre en dependencia del
tamaño, la carga neta y la forma hidrodinámica de las moléculas.9-17
En esta variante electroforética se aplica un campo eléctrico constante, donde las moléculas de
ADN lineal se orientan permanentemente y avanzan a través del gel a una velocidad constante que
está limitada por la matriz del gel.18,19 Sin embargo las mezclas que contienen moléculas de ADN
mayores de 20 kb no pueden ser separadas mediante electroforesis convencional.19
Esta limitación fue solucionada en 1984 cuando se reportó la utilización de los campos pulsantes
(aplicación de pulsos eléctricos que alternan periódicamente su dirección de aplicación, y cuyas
líneas de fuerza forman un cierto ángulo en relación con el gel), para separar las moléculas de
ADN de 200-2000 kb. Esta nueva metodología fue denominada ECP20 y permitió incrementar el
rango de separación de esas moléculas hasta tamaños superiores a las 5,0 Mb.14 Esto ha permitido,
separar los cromosomas intactos de varios eucariotas unicelulares como levaduras, facilitando el
mapeo de los genes a través de técnicas como Southern Blot y Reacción en Cadena de la
Polimerasa.20
Antes de realizar el proceso de electroforesis, las moléculas de ADN, pueden ser o no, digeridas
con endonucleasas de restricción. Su tamaño se puede estimar al comparar la distancia que migra
la molécula con las distancias migradas por los marcadores de tamaños. Se pueden emplear
ecuaciones que describan las distancias migradas por las moléculas bajo condiciones diferentes de
electroforesis y posteriormente reemplazar adecuadamente en ellas las distancias migradas y las
variables experimentales.17
Durante la ECP se cambia periódicamente la orientación del campo eléctrico, en un ángulo mayor
de 90º. El tiempo que el campo está activo en cada una de las dos direcciones se denomina tiempo
del pulso (tp) y el ángulo que se forma entre las direcciones del campo se denomina ángulo de
reorientación. En cada pulso las moléculas migran a lo largo de la dirección de cada campo
eléctrico, pero el avance neto se obtiene sobre la bisectriz del ángulo de reorientación.14
Las reorientaciones periódicas del campo eléctrico provocan que las moléculas se demoren
alineándose con el campo. Esa demora, o porción del tiempo del pulso que consumen en la
reorientación, denominada tiempo de reorientación (tr), depende de las condiciones de
electroforesis y de la longitud o tamaño de la molécula del ADN. Cuanto menor sea el tamaño de
la molécula, menor será su tr.21 Por eso, durante cada pulso, las moléculas mayores se retrasan con
respecto a las menores y avanzan menos distancia en el gel. Cuando se aplican varios pulsos, las
diferencias entre las pequeñas migraciones de las moléculas durante cada pulso se magnifican y se
evidencia la separación entre las bandas. Por lo que podemos decir, que la duración de una corrida
de ECP es el tiempo necesario para que se distingan las moléculas de dos tamaños diferentes
como dos bandas separadas.14
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En condiciones experimentales dadas, la duración de los pulsos eléctricos determina el tamaño de
las moléculas que pueden ser resueltas, mientras que el número de pulsos o cantidad de pulsos
aplicados (Np), fija la duración de la electroforesis o tiempo de electroforesis (te) mediante la
relación te = 2 x tp x Np.22 Si a una molécula de tamaño L, se le aplica un tp mayor que su tr, le
sobra un determinado tiempo para migrar en la dirección del campo, conocido como tiempo de
migración (tm) y se calcula restando al tp el tr (tm=tp-tr). La distancia que migra una molécula de
tamaño Lk durante un pulso completo, se denomina migración por pulso (dk) y es la suma de las
distancias migradas en cada dirección del campo.22 La distancia (Dk) que migra cualquier
molécula después de una determinada cantidad de Np, puede calcularse como el producto Np*dk.14
SISTEMAS ACTUALES DE ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES
Se han descrito diferentes variaciones en la técnica que han conducido al concepto de
configuraciones o sistemas de ECP, que se caracterizan por poseer cámaras en las cuales se
colocan los electrodos en ordenamientos diferentes (Fig. 1). Estos sistemas se basan en el mismo
fundamento físico de alternar la orientación del campo eléctrico, pero difieren entre sí en el
ángulo que forman las líneas de fuerza de los campos eléctricos y en la homogeneidad de los
mismos.
Entre las variantes se encuentran, la electroforesis en gel con gradientes de campos pulsantes
(PFGE, del inglés, Pulsed Field Gradient Gel Electrophoresis, Fig. 1 A),20 la de campos
ortogonales alternantes (OFAGE, del inglés, Orthogonal Field Alternating Gel Electrophoresis,
Fig. 1 B),23 la electroforesis rotatoria, (RGE, del inglés, Rotating Gel Electrophoresis, Fig. 1 E)24
y la de inversión de campos (FIGE, del inglés, Field Inversion Gel Electrophoresis, Fig. 1 F).23
Entre las configuraciones más empleadas en la actualidad están la electroforesis de campos
eléctricos homogéneos en un contorno fijo (CHEF, del inglés, Contour Clamped Homogeneous
Electric Field, Fig. 1 D)25 y la electroforesis de campos alternantes transversales (TAFE, del
inglés, Transversal Alternating Field Electrophoresis, Fig. 1 C).21
Fig. 1. Esquema de la disposición de electrodos con respecto al gel en los sistemas más
comúnmente empleados. A) PFGE20, B) OFAGE23, C) TAFE21, D) CHEF25, E) RGE24 en la
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variante de rotación del gel, F) FIGE23. A+ A-, B+B- son los electrodos que generan los campos
eléctricos pulsantes.
En el TAFE, se obtienen trayectos rectos de migración utilizando dos campos eléctricos no
homogéneos que cruzan transversalmente el plano del gel y que garantizan líneas isopotenciales a
lo ancho del mismo, mientras que en el CHEF, se aplican campos eléctricos homogéneos,
distribuyendo el voltaje alrededor de un contorno de electrodos dispuestos hexagonalmente.25 El
sistema de electroforesis tipo CHEF más utilizado en el mundo es el CHEF MapperTM (BioRad,
EUA, 1995). Por lo general, la separación de las moléculas de ADN en este sistema, consume
gran cantidad de reactivos (por ejemplo, grandes cantidades de enzimas, 80 mg/mL de Proteinasa
K) y tiempo. Se conoce que el CHEF necesita más de 20 horas de electroforesis para separar los
cromosomas de levaduras y parásitos, así como de los macrofragmentos de restricción del genoma
de las bacterias.26 Por otra parte, este sistema necesita mucha disolución tampón (5,0 L) y muestra
biológica.27 Además el equipamiento de este sistema resulta muy costoso lo que limita su uso,
especialmente en los países subdesarrollados.25
Sistemas miniaturizados de electroforesis de campos pulsantes
En 1995 se desarrolló un sistema de electroforesis de campos pulsados miniaturizado,28,29 que
hasta el momento, es el único que ha sido desarrollado y se comercializa con el nombre Guefast
06 (Neuronic SA, Cuba).28,29 Estas nuevas versiones (miniCHEF y miniTAFE), superan las
deficiencias de los sistemas CHEF y TAFE. Emplean muestras delgadas entre 0,05 cm y 0,1 cm
de grosor, ya que bloques de más de 0,1 cm de grosor (empleados en los sistemas CHEF y TAFE)
provocan la aparición de bandas gruesas que necesitan más tiempo y más longitud del gel para
separarse, además de no mejorar en calidad el patrón electroforético, ni revelar mayor cantidad de
bandas.30
Estos nuevos sistemas, permiten aplicar campos eléctricos más intensos utilizando fuentes de poca
potencia, lo cual le proporciona a los geles una resolución adecuada entre las bandas del patrón
electroforético.28,29 Esto permite además, la obtención rápida de los cariotipos y pulsotipos
(cuando el microorganismo posee un cromosoma circular grande) moleculares de los
microorganismos.31 Por ejemplo, el cariotipo de la levadura S. cerevisiae puede ser resuelto entre
cuatro y cinco horas de corrida electroforética28,29,32 utilizando la cámara miniCHEF, mientras que
los sistemas CHEF y TAFE emplean para ello tiempos prolongados de electroforesis de 24 a 40
horas y grandes volúmenes de reactivos,33,34 lo que reduce la habilidad de analizar grandes
números de muestras en corto tiempo.6
En los sistemas miniaturizados, la separación entre los electrodos opuestos es menor, lo que
permite, al construir cámaras más pequeñas, el ahorro de materiales empleados en su
construcción, el requerimiento de menos volumen de tampón (400 y 900 mL) para cubrir los
electrodos y el gel, baja generación de calor aún con campos eléctricos elevados y por
consiguiente, la disminución de los costos.28,29 Estos equipos poseen un sistema limitador de
turbulencias en la disolución tampón, emplean pequeñas cantidades de reactivos químicos,
material biológico en las muestras que depositan en sus geles y ocupan además poco espacio en el
laboratorio.28,29 Además, brindan la posibilidad de analizar múltiples ventanas de resolución en un
día de trabajo, lo que no ha sido posible lograr con los sistemas convencionales.35-39
Los autores de estos equipos demostraron que la ECP puede realizarse en geles que no tienen que
ser extremadamente largos como los utilizados en los sistemas anteriores, por ejemplo 12,7 x 14
cm (largo x ancho) (CHEF DR II, BioRad, EUA, 1995), sino que con medidas de 5,0 x 7,0 cm
(largo x ancho), estos geles tienen un tamaño suficiente para brindar patrones de bandas bien
resueltos y útiles en aplicaciones analíticas y preparativas, así como suficientemente anchos para
admitir hasta 19 muestras en un solo experimento.30 No obstante, esto puede ser una limitante en
estudios masivos donde se analicen muchas muestras. Por tanto sería útil profundizar en el estudio
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para optimizar las minicámaras en cuanto a la posibilidad de obtener a bajo costo, patrones de
bandas rectos y reproducibles y analizar en poco tiempo, cantidades de muestras variables con uso
eficiente de los reactivos. De esta forma se facilitaría la introducción de la ECP en estudios
masivos de epidemiología molecular tales como la caracterización de brotes infecciosos. Esto
sería factible mediante la utilización de la cámara Multi-miniTAFE, la cual se construyó a partir
de las dimensiones conocidas de la cámara miniTAFE, pero con ancho interno modificable y alta
capacidad de análisis.40 Posee forma de ortoedro y los pares de electrodos de polaridades opuestas
miden 31,8 cm de longitud, están separados 7,8 cm y están en configuración TAFE. Está
fabricada en acrílico y entre sus accesorios se encuentran: las ‘láminas A’, que dividen los
compartimentos contiguos con tamaño similar al miniTAFE y los ‘bloques B’, sólidos dieléctricos
que ocluyen dichos compartimentos. Ambos tipos de piezas están hechas de acrílico y poseen tres
ranuras para dividir la cámara en cuatro compartimentos de tamaño similar 7,3 x 11,4 x 6,4 cm
(largo x ancho x alto). Cada compartimiento contiene uno de los minigeles del marco múltiple,
cada minigel es de 3,85 x 7,1 x 0,5 cm (largo x ancho x grosor). En cada compartimento se
analizan simultáneamente hasta 19 muestras de moléculas de ADN, con formato 0,2 x 0,2 x 0,07
cm (largo x ancho x alto), y 12 muestras si estas miden 0,3 x 0,3 x 0,07 cm. Por tanto, la
capacidad total de esta cámara es de hasta 76 muestras de estas moléculas en cada experimento.
No obstante, con otro formato de muestras, se podría acomodar otra cantidad diferente de las
mismas.40
Empleo de softwares para la selección a priori de las condiciones electroforéticas
Riverón y colaboradores desarrollaron además, un software llamado PFGE Simulator (Neuronic
SA, Cuba),37,15,38 que facilita el diseño de experimentos en los miniequipos de ECP, al permitir la
predicción del patrón de bandas que se obtendría al separar moléculas de ADN lineal en las
cámaras CHEF y miniCHEF. Este software realiza las predicciones utilizando la ecuación que
describe la migración de las moléculas de ADN de secuencia conocida para cualquier condición
de temperatura, tiempo de pulso, cantidad de pulsos y campo eléctrico aplicado. Además, carga
dichas secuencias, identifica la posición de los sitios de restricción para todas las enzimas de
restricción conocidas y brinda, como datos de salida, la cantidad y tamaño de los fragmentos de
las moléculas de ADN en kb, generados con cada enzima de restricción.15
Esta ecuación está representada como:
n
Di   d ik Np k
k 1
(Ec. I),
donde:
Np k
es la cantidad de pulsos aplicados.
d ik
es la migración por pulso de la molécula.
i durante el tiempo de pulso.
k se calcula según la expresión siguiente:
d ik  vri  tpik  (tpik  tri )  vmi  (tpik  tri )  1  (tpik  tri )
vr
vm
(Ec. II).
tr
i y i son las velocidades de migración (en cm/s) durante y después
En la ecuación II,16 i ,
de la reorientación y el tiempo de reorientación (en s) de la molécula i, respectivamente y se
calculan según las expresiones siguientes:
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0.0207  Q.E 1.45
vr 
8L1.35
vm 
0.665  Q.E
8L1.08
 L1.14 
tr  0.134  

 vr 
(tp  tr )
(Ec. III)
1.76
(Ec. IV)
0.926
(Ec. V);
tp  tr
tp  tr
ik
i es una función que toma valor 1,0 si
ik
i ., ‘Q’ es la
ik
i y 0 si
donde
carga neta de la molécula de ADN (en statcoulomb) y se calcula como 1e ·pb, ‘e ’ es la carga del
electrón y ‘pb’ la cantidad de pares de bases, ‘L’ es el largo del contorno (en cm) de la molécula
lineal de ADN, y se calcula como 0,34 nm · pb, ‘E’ es el campo eléctrico en statvolt/cm, ‘ƞ’ es la
viscosidad del tampón (en Poises). Esta última se calcula interpolando el valor de la temperatura
del tampón en un polinomio que describe la relación entre la viscosidad del agua y su temperatura
en grados Celsius (ºC).15
Esto ha significado una reducción considerable de tiempo y reactivos respecto a los sistemas
convencionales de ECP (CHEF y TAFE), los cuales carecen de una herramienta para seleccionar
a priori las condiciones de electroforesis deseadas en CHEF, por lo que se necesita realizar
múltiples repeticiones de los experimentos para optimizar, en términos de resolución, las
separaciones de las moléculas de ADN en estos equipos.38
La comparación de los pulsotipos de cepas diferentes puede ser una labor compleja, cuando los
fragmentos de restricción producen un número elevado de bandas,39 por lo que dicha tarea se lleva
a cabo con la ayuda de software especializados como: GelCompar versión 4.0 (Applied Maths,
Holanda), Molecular Analyst Fingerprinting versión 1.0 (Bio-Rad, EUA), BioImage versión 3.2
(BioImage, Dinamarca) y GuefastScan (Neuronic SA, Cuba). Estos softwares poseen
herramientas para medir la semejanza entre los pulsotipos, basándose en la cantidad de bandas y
su posición en el gel. La forma típica en que se muestran los resultados de la comparación es
mediante una “dendrografía”, que es un gráfico que ofrece una representación visual de las
semejanzas y diferencias genéticas existentes entre los microorganismos analizados.39
PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE ADN PARA EL ANÁLISIS MEDIANTE
ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES
Para la tipificación de microorganismos mediante ECP, en los equipos convencionales o en los
que emplean minicámaras, es imprescindible disponer de un método de preparación de moléculas
de ADN intactas e inmovilizadas en agarosa, debido a que los métodos conocidos de aislamiento
y purificación de ADN en medio líquido provocan rupturas de dichas moléculas.25
La preparación de muestras del ADN genómico para realizar la técnica de ECP incluye cultivar
los microorganismos en medio líquido o sólido, mezclar las células con agarosa fundida que se
vierte luego en pequeños moldes, obteniéndose bloques de agarosa que contienen las células
intactas. Las células embebidas se someten in situ a una lisis con enzimas y detergentes. En el
caso de levaduras los bloques se insertan en un gel de agarosa y se someten a electroforesis y en
las bacterias, antes de realizar este paso, se digiere el ADN cromosomal al utilizar endonucleasas
de restricción de baja frecuencia de corte.3 Se ha reportado, además, el uso de un método no
enzimático para la preparación de muestras de varias especies de microorganismos.41,42 Durante el
proceso de electroforesis la polaridad de la corriente se cambia a intervalos de tiempo
predeterminados. La visualización de los patrones electroforéticos se logra por tinción de los geles
con un compuesto fluorescente como el bromuro de etidio. Los resultados en el gel (en forma de
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patrones de bandas de moléculas de ADN) pueden ser fotografiados y almacenados en formato
digital.
La migración de las moléculas de ADN al ser expuestas a ECP, es afectada por la concentración,
el grado de desproteinización y la presencia de sales en las muestras de dichas moléculas.14 Para la
adecuada obtención de muestras, se deben cultivar los microorganismos y estudiar el
comportamiento de su crecimiento bajo las condiciones experimentales deseadas.
Determinación del crecimiento celular
El crecimiento celular se define como un incremento en el número de células en el tiempo. El
crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: las características del
microorganismo, la composición del medio de cultivo (las células crecerán más lentamente en un
medio mínimo, que en un medio rico con todos los nutrientes. En dependencia de la fuente de
carbono y de la facilidad con que la asimilen, crecerán con mayor o menor velocidad), las
condiciones de incubación (temperatura, agitación, concentración de CO2 y O2 en la atmósfera de
cultivo), y la procedencia y características del inóculo (la curva de crecimiento variará en
dependencia de que se proceda de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial).43
Métodos de medición del crecimiento celular
Los métodos directos son aquellos en los que se cuenta el total de células en un volumen conocido
y así se estima el número total en la población. Ejemplo de ello se encuentran los contadores
electrónicos y el recuento de células viables.44 Los métodos indirectos utilizan parámetros
distintos del número de células, pero que pueden relacionarse de forma directa con éste, ejemplo,
la determinación de peso seco, nitrógeno celular, moléculas de ADN, actividad metabólica y
turbidez del cultivo.43
Cálculo de los parámetros cinéticos de una población celular
El incremento en el número de células de un cultivo en un recipiente cerrado, en el que existe
limitación de nutrientes, es lento al principio (Fase de latencia o adaptación) y después llega a ser
de forma exponencial (Fase de crecimiento exponencial), o ajustarse también a un modelo
logístico.43,45 Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generación o duplicación de
un microorganismo. Como este tiempo es constante, la representación logarítmica (logaritmo
natural del número de células frente al tiempo), del crecimiento durante esta fase exponencial, es
una línea recta. La pendiente de esta línea, es la constante de velocidad de crecimiento del
organismo, que es una medida del número de divisiones por célula y por unidad de tiempo y
depende de las condiciones de crecimiento, que afecta a la frecuencia de los eventos de división
celular y a la probabilidad de que las células hijas sobrevivan. Posteriormente no hay incremento
neto del número de células (Fase estacionaria), hasta que comienzan a morir progresivamente
(Fase de declive o muerte celular).43
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS INTACTAS EN MINIBLOQUES DE AGAROSA
Es necesario cultivar los microorganismos bajo condiciones específicas de crecimiento según el
tipo celular, se colectan por centrifugación y se eliminan los restos de medio de cultivo. Esto se
realiza mediante lavados con determinadas disoluciones cuyos componentes protegen a las
moléculas de ADN, ejemplo, agentes quelantes de iones metálicos como Ca++ y Mg++, entre los
que se encuentra el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), que inhiben la acción de las
endonucleasas al no quedar disponibles cofactores libres para su actividad.42,46 Las células
intactas, son inmovilizadas en minibloques de agarosa, ya que la manipulación de moléculas de
ADN desnudo de grandes tamaños en disoluciones, puede provocar la ruptura de la doble cadena
de la molécula debido a fuerzas mecánicas.
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Los minibloques se preparan en accesorios o moldes en los que se vierte la suspensión de células
en agarosa a 45°C y se tapan para evitar la formación de meniscos. Esta agarosa debe ser lo
suficientemente pura y porosa para permitir la difusión de enzimas y otros compuestos, hasta los
componentes celulares. El sistema se deja en reposo a temperatura ambiente o en frío, hasta que la
agarosa solidifique. Las tiras de gel que se forman en las ranuras del molde, se cortan en pequeños
bloques delgados y del mismo tamaño, cuyas dimensiones coinciden con las de los pocillos del
gel, en los que son depositados, para ser colocados en la cámara electroforética, una vez expuestos
a la disolución apropiada para el tratamiento de las células. Existen distintos tipos de moldes, los
que forman bloques similares e independientes20 (Fig. 2 A), los que forman tiras planas y largas
que se cortan para formar bloques independientes14,47 (Fig. 2 B) y los que forman barras o varillas
largas de agarosa que se cortan para formar bloques independientes.14,48
En ellos se generan muestras que, en general, son de dimensiones mayores que los pocillos del
gel. Por eso, para que los bloques posean las dimensiones de los pocillos del gel es necesario
cortarlos con un bisturí o cualquier otro implemento. Sin embargo, no todos los bloques cortados
manualmente quedan con dimensiones similares. Esta desigualdad influye en la calidad del patrón
electroforético, pues la resolución de las moléculas en los geles depende del grosor de la muestra
que se deposita en el gel. De esa forma, se dificulta la comparación de los patrones en las
diferentes carrileras del gel, lo cual es una desventaja cuando se desea tipificar microorganismos.
Fig. 2. Tipos de moldes formadores de minibloques de agarosa. Para obtener bloques similares e
independientes (A). Para obtener tiras planas y largas que se cortan para formar bloques
independientes del juego de accesorios del Guefast 06 (Neuronic SA, Cuba) (B).
En 1993, Mazurek G H. reportó la utilización de un molde para inmovilizar las células y tratarlas
en el interior del mismo49 (Fig. 3). Se propuso que ese molde pudiera ser desechable o reusable
según el material de fabricación. Este molde presentó las siguientes desventajas: prolongado
tiempo de preparación de muestras, la carencia de un aditamento para cortar los minibloques que
garantizara que en todos los pocillos del gel se depositaran muestras similares y la formación de
meniscos debido a la tensión superficial de la agarosa líquida en las paredes del mismo, por ser un
sistema abierto.49
Debido a los inconvenientes antes mencionados, resultaría práctico confeccionar un molde que
posibilitara inmovilizar las células y tratarlas en el interior del mismo, con el fin de minimizar el
riesgo de contaminación por nucleasas que introduce la manipulación experimental. El molde
debe facilitar la preparación de las muestras en un corto tiempo y poseer además, un aditamento
que permita la obtención de las mismas con dimensiones similares. Se debe tener en cuenta, en
qué medida puede afectar al grosor de los bloques y a su vez la concentración de las moléculas de
ADN contenidas en los mismos, los meniscos que forma en las paredes internas del molde, la
mezcla de agarosa y células. El grosor de los bloques es un factor importante que influye en la
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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 3, pp. 285-304, septiembre-diciembre, 2015.
resolución que puede alcanzar las moléculas de ADN y en la calidad de los patrones de
bandas.14,50,51
Fig. 3. Molde de formación de minibloques que permite la inmovilización de células, liberación y
desproteinización de las moléculas del ADN en el interior del mismo.
LIBERACIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE ADN INTACTAS POSTERIOR A LA
INMOVILIZACIÓN DE LAS CÉLULAS EN AGAROSA
En este proceso, ocurre la liberación y desproteinización de las moléculas de ADN. Este
procedimiento puede ser realizado con enzimas (método enzimático)52 o reactivos específicos
como detergentes y agentes desproteinizantes que difunden libremente hacia el interior de la
matriz (método no enzimático).53 Los minibloques con las células inmovilizadas se sumergen en
una disolución de liberación de ADN que puede o no contener enzimas, para romper la pared de la
célula en estudio. Los métodos enzimáticos, emplean generalmente disoluciones que contienen
enzimas líticas, que son reactivos biológicos costosos como lisozima y/o mutanolisina.54 Estas se
emplean para la liberación de las moléculas de ADN, de las estructuras celulares inmovilizadas,
sin ser dañadas67 y con posibilidades de ser amplificadas.55,56 Para desproteinizar en estos casos, se
utilizan disoluciones que contienen detergentes y proteasas como la Proteinasa K.20,57-61
Los métodos no enzimáticos rinden moléculas de ADN con calidad suficiente para la restricción y
la ECP47,42,62,63 y son menos costosos que los enzimáticos. Estos métodos utilizan disoluciones,
tanto para la liberación de las moléculas de ADN como para su desproteinización, que contienen
solamente reactivos químicos como agentes quelantes, tampones biológicos cuya función es
mantener el pH de la disolución constante, como el hidroximetil aminometano (Tris), detergentes
potentes que ayudan a la lisis celular como el sarcosyl, sustancias hidrosolubles que permitan la
abertura de poros en la membrana celular como la urea entre otros.64 Cuando las muestras se
incuban con disoluciones desproteinizantes que contienen enzimas proteasas, es necesario añadir
inhibidores de estas últimas, antes de efectuar la digestión o realizar diálisis extensas,65,66 por lo
que estos procedimientos en general, consumen un tiempo de dos a tres días de realización, sin
sumarle los prolongados tiempos de electroforesis en los equipos de ECP convencionales,57,58 lo
cual constituye una limitación para el uso de esta técnica con fines epidemiológicos.
En el empleo de métodos no enzimáticos, solo es necesario dializar los minibloques con
compuestos quelantes y tampones biológicos (agentes desproteinizantes), que difundirán hacia el
interior de los minibloques de agarosa para liberar y desproteinizar las moléculas de ADN, 42,67 así
como para arrastrar fuera de los mismos, restos celulares procedentes de la ruptura de la pared
celular. Estos procedimientos se realizan en un solo paso de incubación y solo toma 2
horas.42,62,63,37,68,69
El método de preparación de muestras de moléculas de ADN, debe garantizar que estas moléculas
contenidas en los minibloques de agarosa, puedan ser separadas intactas mediante ECP y además,
en caso de ser necesario, puedan digerirse con endonucleasas de restricción para que los
fragmentos sean posteriormente separados. Una vez liberadas y desproteinizadas las moléculas de
ADN que están inmovilizadas en los minibloques de agarosa, se procede a colocar estos últimos,
en los pocillos de los minigeles de electroforesis, para la posterior separación de la mezcla de
fragmentos de moléculas de ADN mediante ECP.
294
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 46, No. 3, pp. 285-304, septiembre-diciembre, 2015.
APLICACIONES DE LAS ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES
El estudio epidemiológico molecular de las enfermedades infecciosas tiene por objeto determinar
la relación clonal que existe entre varios aislados de una misma especie. Esta información es muy
útil, sobre todo cuando se producen brotes epidémicos causados por cepas multirresistentes,
porque permite determinar el número de clones circulantes, identificar la fuente de contaminación
o reservorio y los vehículos de transmisión. Además, permite evaluar la eficacia de las medidas de
control dirigidas a evitar la diseminación de clones.55
La tipificación de microorganismos procariotas es fundamental ya que permite identificar aislados
y evaluar la interrelación con otras cepas70 además puede proporcionar información sobre la
distribución de tipos microbianos en poblaciones humanas y animales, lo cual puede ser aplicado
en programas de vigilancia a nivel local, regional, nacional o global. De especial interés puede ser
el monitoreo de marcadores asociados con la patogenicidad, inmunogenicidad o resistencia a
medicamentos.
La ECP puede ser empleada en la caracterización de micobacterias, en la obtención de cariotipos
de diferentes hongos,71 en la clasificación de levaduras, en estudios y mapeo de moléculas de
ADN, en estudios de enfermedades hereditarias,72,73 identificación genotípica y aislamiento de
moléculas de polinucleótidos74 y en estudios del origen de las contaminaciones en la industria
biotecnológica.75 Existen varios reportes que describen el uso de la ECP para caracterizar
molecularmente diferentes microorganismos patógenos, por ejemplo:, Stenotrophomonas
maltophilia,76 Salmonella spp.,36,77 Vibrio vulnificus,78 Bordetella pertussis,79,80 Haemophilus
influenzae,81 Clostridium botulinum,82 Staphylococcus spp.,83 Pseudomonas aeruginosa,84,85
Acinetobacter baumannii,86,87 Nocardia seriolae,88 Listeria monocytogenes,89 Laribacter
hongkongensis,90 Mannheimia haemolytic,91 Brettanomyces bruxellensis92 y Escherichia coli,93
Campylobacter spp.,94 Brachyspira spp.,95 Providencia y Morganella spp.,96 Serratia
marcescens,97 Mycobacterium tuberculosis39 y Bartonella henselae.98 En el año 2006, se
publicaron 19 ensayos clínicos llevados a cabo empleando la metodología de ECP. 74 La ECP ha
ampliado hasta 9,0 Mb el límite de resolución de la electroforesis en gel de agarosa y ha cubierto
el intervalo de tamaños que no podía ser estudiado ni por la electroforesis convencional en gel ni
por los métodos citogenéticos.72
En síntesis, la ECP permite la detección de grupos de patógenos con tipos similares y de origen
común en espacio y tiempo, para mejorar las advertencias anticipadas de brotes potenciales.
Además, puede ayudar en el momento de planear los servicios de salud e intervenciones
preventivas como desarrollo de vacunas y programas de inmunización. Esta técnica también
puede ser utilizada en estudios clínicos para la delineación de patrones de colonización y para la
identificación de fuentes de transmisión de microorganismos infecciosos, lo cual puede contribuir
a un entendimiento de la epidemiología y patogénesis, de esta forma se desarrollan estrategias de
prevención de enfermedades.99
ELECTROFORESIS DE CAMPOS PULSANTES BIDIMENSIONAL
Los cambios en la secuencia de bases de las moléculas de ADN cromosomal de organismos
eucariotas unicelulares, que provocan diferencias de unas pocas kb o que no varían el tamaño de
los cromosomas, no pueden ser detectados mediante la obtención del cariotipo electroforético de
dichos organismos en una sola electroforesis o 1D. Por lo que se necesitaría una segunda
electroforesis o 2D, para el análisis de estas moléculas, técnica conocida como 2D-ECP.27
La 2D-ECP consiste en la obtención del cariotipo electroforético del microorganismo (1D), la
escisión de la carrilera del gel que contiene el patrón de bandas y la aplicación de la misma en
otro gel, el cual se somete a ECP (2D) en condiciones de electroforesis diferentes a las empleadas
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en la 1D. Las moléculas contenidas en la carrilera del gel pueden ser digeridas o no con enzimas
de restricción.27
El análisis bidimensional, a diferencia del realizado en una sola dimensión, ha permitido explorar
mayores regiones del genoma de eucariotas y detectar variaciones pequeñas en el tamaño de los
cromosomas de estos organismos.27 Además, la 2D-ECP, combinada con la restricción en el
propio gel de las moléculas de ADN, ha facilitado el mapeo de genes en los cromosomas de
organismos eucariotas unicelulares como el parásito intracelular Encephalitozoon cuniculi34 y la
construcción del mapa físico de cromosomas circulares en especies bacterianas como Micoplasma
mobile,100 Pseudomonas aeruginosa PAO101 y Anabaena spp.102
Los procedimientos de 2D-ECP involucran la transferencia de las moléculas de ADN a soportes
sólidos y experimentos de hibridación molecular con sondas marcadas radiactivamente para
visualizar los patrones de restricción en la 2D. Estas técnicas de marcaje radiactivo de las
moléculas, encarecen y dificultan la realización de la metodología.27,33
Los procedimientos de 2D-ECP, poseen además las limitantes de la metodología de ECP como
fue descrita originalmente. Es decir, se necesitan largos tiempos de electroforesis, que varían
desde 24 a 40 horas para S. cerevisiae en cada dimensión27,33 y debido al tamaño de los geles [12,7
x 14 cm (largo x ancho) (CHEF DR II, BioRad, EUA, 1988)], se requiere de gran cantidad de
moléculas de ADN para visualizar las bandas del patrón.27,33
Las limitantes en cuanto a los tiempos de separación y la cantidad de muestra biológica fueron
resueltas por la tecnología de miniECP la cual permite la obtención de cariotipos y pulsotipos
moleculares de microorganismos aproximadamente entre cuatro y cinco horas.28
La realización de 2D-miniECP, además de resolver los problemas asociados con los largos
tiempos de electroforesis, permitiría detectar las moléculas de ADN en la 2D por métodos de
tinción rutinarios sin necesidad de utilizar técnicas de hibridación molecular, radiactivas o de
southern blot, que hacen más lenta y cara la obtención de los resultados, debido a que esta
variante de ECP emplea minigeles que requieren menor cantidad de ADN en la muestra para que
sean visualizadas las bandas.27 No obstante, para determinar los regímenes de tiempos de pulsos
necesarios para obtener los patrones de bandas en la 1D y la 2D, es necesario realizar una cantidad
considerable de experimentos. A esto se añade, que si se requiere digerir las moléculas con
enzimas de restricción, es necesaria una cantidad adicional de experimentos para seleccionar las
enzimas útiles que permitan caracterizar adecuadamente el genoma de los microorganismos que
se estudien.
Las ecuaciones que describen la migración de moléculas de ADN en el CHEF han sido empleadas
para generar las condiciones de corridas en cámaras miniCHEF y para elaborar programas de
computación que simulan los patrones de bandas de moléculas de ADN en esa minicámara.16,103 Si
se utilizan esos programas, combinados con procedimientos bioinformáticos para digerir in sílico
las moléculas de ADN, se podrían seleccionar a priori las condiciones experimentales que mejor
resuelvan los cariotipos electroforéticos y los macrofragmentos de restricción de los cromosomas
de S. cerevisiae, u otro organismo eucariota unicelular, en los miniequipos de ECP. De igual
forma se podría seleccionar a priori, el mejor conjunto de enzimas de restricción para analizar el
genoma de estos organismos mediante 2D-miniECP. En consecuencia la utilización de
procedimientos bioinformáticos para la simulación de los experimentos de ECP facilitaría el
diseño y el análisis de los resultados de la 2D-ECP.
Este método además permitiría la reclasificación de las cepas de organismos eucariotas
unicelulares en distintos subtipos o subgrupos de forma similar a como se realiza la subtipación
bacteriana mediante ECP. Este procedimiento cobra importancia para el análisis de
microorganismos patógenos que infectan a hombres y animales, por ejemplo parásitos
unicelulares causantes de enfermedades endémicas en el mundo como la amebiasis, el paludismo
y la tripanosomiasis, así como hongos y levaduras responsables de enfermedades del sistema
nerviosos central, como es el caso del Cryptococcus neoformans,104 que provoca una de las
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micosis infectivas oportunistas más serias asociadas al síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA).105
Los resultados del cariotipaje de este microorganismo, así como los de otros patógenos, han
demostrado la necesidad de estudiar el genotipo con métodos sensibles y robustos que surtan de
información a los sistemas de vigilancia epidemiológica, sobre todo en países en vías de
desarrollo. Por esta razón sería oportuno proponer un método de subtipación mediante 2DminiECP, que incorpore las ventajas de la miniaturización y que permita la detección de
variaciones en el genoma que puedan ser responsables de cambios fenotípicos como
patogenicidad o resistencia a antibióticos. Esta metodología que ya ha sido utilizada para la
construcción del mapa físico de cromosomas circulares bacterianos, no se ha implementado con el
propósito de la tipificación de organismos eucariotas unicelulares, por lo que sería de gran
utilidad, en la detección de polimorfismos de los cromosomas individuales, así como de
contaminantes entre colonias de una misma cepa de estos organismos, como por ejemplo las
levaduras.
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Desde el punto de vista científico, las levaduras destacan por ser un sencillo y versátil sistema de
transformación de las moléculas de ADN, por lo que se han empleado como modelos simples de
la célula eucariota y más utilizados en el estudio de problemas biológicos. Esto se debe a una serie
de ventajas como la facilidad de su cultivo y aislamiento de mutantes, la rápida velocidad de
división celular (aproximadamente 2 horas) y no patogenicidad, lo que permite su manipulación
con las mínimas precauciones, aunque actualmente cobra importancia su papel oportunista, en
sepsis, enfermos de leucemia y otras infecciones oportunistas en enfermos de SIDA.106-109 El
estudio de estos microorganismos es de gran utilidad en la tipificación de ceparios de laboratorios
de investigaciones, microbiológicos, clínicos y biotecnológicos de la industria alimenticia. Así
como en el estudio del origen de las contaminaciones en la industria biotecnológica y en estudios
epidemiológicos moleculares de enfermedades infecciosas como por ejemplo las que afectan al
Sistema Nervioso Central.
Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de
su genoma, contiene 16 cromosomas que varían en tamaño de 200 a 2400 kb y se mantiene en
constante revisión.110 Ello ha permitido la manipulación genética de los casi 6600 genes que
codifica el genoma de levadura, el uso extensivo de micromatrices de moléculas de ADN para
investigar el transcriptoma y estudios a escala genómica de otros aspectos como la expresión
génica, localización de proteínas y la organización funcional del genoma y el proteoma. La
maquinaria molecular de muchos procesos celulares se encuentra conservada en las levaduras,
rutinariamente se han introducido en su genoma, genes de eucariotas superiores para el análisis
sistemático de su función, lo cual resultaría muy complicado o costoso en organismos
multicelulares.106-108
CONCLUSIONES
La ECP se considera el “estándar de oro” de los métodos de tipificación molecular. Los sistemas
de ECP son de gran utilidad en la tipificación de ceparios de laboratorios microbiológicos,
clínicos, de la industria alimenticia y farmacéutica así como en el estudio y control de
enfermedades infecciosas. Entre los sistemas de ECP más empleados se encuentran los de
configuración CHEF y TAFE. Las limitaciones de estos sistemas son superados por la tecnología
miniECP. El empleo de procedimientos bioinformáticos en cámaras miniCHEF permite la
simulación de los experimentos de ECP y facilita el diseño y el análisis de los resultados de la 2DECP. La tecnología miniECP permite analizar en poco tiempo, cantidades de muestras variables
con uso eficiente de reactivos mediante el uso de la cámara Multi-miniTAFE, que permite en la
metodología 2D-miniECP, obtener mayor información del genoma en estudio y analizar un alto
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formato de muestra. No existe un método de subtipación mediante 2D-miniECP, que incorpore las
ventajas de la miniaturización y que permita la detección de variaciones en el genoma de
microorganismos en estudio y que conste además, con un molde de preparación de muestras de
ADN, que permita inmovilizar las células y tratarlas en el interior del mismo.
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